CN105505395B - 一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用，涉及重金属生物修复。甲壳低聚糖重金属生物修复剂的组成为甲壳低聚糖溶液5～70、地衣芽孢杆菌发酵液10～30、胶冻样芽孢杆菌发酵液10～50。制备方法：制备改性甲壳低聚糖溶液；制备地衣芽孢杆菌发酵液；制备胶冻样芽孢杆菌发酵液；制备甲壳低聚糖重金属生物修复剂。所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂可在制备土壤淋洗剂、植物修复剂、土壤生物修复剂等中应用。能吸附土壤中的重金属，利用土壤淋洗技术能有效去除土壤中重金属含量，或施于土壤强化植物吸收重金属，达到修复土壤的目的，有利于土壤微生物活动，有效改良土壤结构，促进植物根系发育，调节植物生长代谢，提高作物产量。

Description

一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及重金属生物修复，尤其是涉及一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用。
背景技术
随着工业快速发展以及人类活动逐渐加强，土壤重金属污染的问题也日益严重，其中土壤Cd污染范围最广、污染程度最严重。其中Cd是造成耕地土壤重金属污染的最主要来源。2013年2月，南方日报刊发了《湖南问题大米流向广东餐桌》的文章，耕地土壤受重金属Cd的污染引起广泛关注。福州除了滨海岛屿区外，其他几类区域都出现Cd含量超标现象，近郊区菜地土壤中Cd含量超标率最高，其超标率为40％(丁玉娟,林昌虎,何腾兵,等.蔬菜重金属污染现状及研究进展[J].贵州科学,2012,5:78-83)。
我国受重金属污染严重，微生物修复技术通过改变重金属的生物有效性，来降低其毒性或提高其超积累植物富集量，减少重金属对食物链的污染，兼具成本低和促进土壤可持续生产的优越性和科学性，土壤淋洗技术也是去除土壤重金属的有效方法，利用淋洗剂溶解土壤中的重金属使其随淋洗液流出，然后对淋洗液进行后续处理，从而达到修复土壤污染的目的。中国专利CN201110334587.6提供一种重金属污染土壤的化学淋洗修复方法，该方法使用Na2EDTA溶液淋洗重金属污染土壤，有效去除土壤中的有效态镉和铅，但EDTA存在价格昂贵且在自然环境体系中难以降解。
壳聚糖具有较强的金属离子配位能力，其分子中的氨基和与氨基相邻的羟基基与许多金属离子(如Hg2+、Ni2+、Cu2+、Pb2+、Cd2+等)能形成稳定的鳌合物(李增新,梁强,孟韵,等.壳聚糖对污染土壤中吸附态Pb(Ⅱ)的解吸作用[J].生态环境,2008,(03):1049-1052)。相关研究人员根据壳聚糖分子链中含有大量氨基和羟基，对壳聚糖进行酰化、酯化和醚化等化学改性，生成一系列壳聚糖衍生物，可改善其水溶性、生物活性及力学性能，拓展壳聚糖对水体、土壤环境中重金属的修复功能(武娜娜.壳聚糖改性吸附剂的制备及其在重金属污染的污水和土壤处理中的应用[M].华南理工大学,2014)。甲壳低聚糖(chitooligosaccharides，缩写为COS)是由甲壳素(chitin)和壳聚糖(chitosan)经水解后产生的一类低聚合度、可溶于水的氨基糖类化合物，是甲壳素低聚物(chitinoligosaccharides)和壳寡糖(chitosan oligosaccharides)的总称，具有较高水溶性，能够改善土壤的微生物体系以及土壤团粒结构。由于甲壳低聚糖分子量小，所以甲壳低聚糖与重金属螯合后，容易被植物吸收。中国专利CN201410078241.8提供一种亚磷酸盐-壳寡糖复合生物药肥的制备方法，该亚磷酸盐-壳寡糖复合生物药肥，既是一种生物肥料，又是一种生物农药，同时还是一种重金属污染土壤原位修复剂；亚磷酸能使重金属形成难溶性的磷酸盐沉淀，但壳寡糖与重金属结合后容易被植物吸收，造成植物重金属超标。中国专利CN201110413145.0提供一种修复重金属镉污染土壤的方法，采用壳聚糖、微生物联合植物修复重金属污染，但壳聚糖水溶性差，需要溶解在浓盐酸溶液中，一定程度上限制了其应用。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供不仅制备方法简单、环境友好，而且能够促进土壤有效态镉含量的增加，提高土壤淋洗效果或强化植物对镉吸收的一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂及其制备方法与应用。
所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂按质量比的组成为甲壳低聚糖溶液5～70、地衣芽孢杆菌发酵液10～30、胶冻样芽孢杆菌发酵液10～50。
所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂按质量比的组成优选为甲壳低聚糖溶液30～60、地衣芽孢杆菌发酵液10～20、胶冻样芽孢杆菌发酵液10～40。
所述甲壳低聚糖是利用淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种为发酵菌，以虾蟹壳粉为原料，通过微生物发酵生产得到的发酵上清液经过阴离子表面活性剂改性得到的。所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种已于2010年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2010165。
所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.10741。
所述胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌株，已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.3995。
所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备改性甲壳低聚糖溶液
配制PDA培养基，将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子培养基中培养得种子液；再将种子液接种至发酵培养基中发酵培养48～72h得淡紫拟青霉发酵液；将淡紫拟青霉发酵液离心去除菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10％～15％的甲壳低聚糖溶液；在制得的甲壳低聚糖溶液中加入等摩尔质量浓度为20～100mmol/L的阴离子表面活性剂溶液，振荡2～48h，制得改性甲壳低聚糖溶液；
2)制备地衣芽孢杆菌发酵液
配制营养琼脂培养基，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10接种在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)三炬-10用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得地衣芽孢杆菌发酵液；
3)制备胶冻样芽孢杆菌发酵液
配制无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)三炬01号菌株接种在无氮固体培养基平板上进行划线培养，从无氮固体培养基平板上将活化好的胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌株转接至无氮固体培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得胶冻样芽孢杆菌发酵液；
4)制备甲壳低聚糖重金属生物修复剂
将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比(5～70):(10～30):(10～50)混合，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂。
在步骤1)中，所述PDA培养基的组成可为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值；所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28～32℃下培养72～120h；所述种子培养基的组成可为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L，、磷酸二氢钾1g/L、硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比可为8％～15％，稀释至OD600为0.2；所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件可于28～32℃，150～200rpm下培养72～96h；所述发酵培养基的组成可为：虾蟹壳粉25g/L、蛋白胨2g/L；所述种子液可按5～10％接种量接入发酵培养基中；所述发酵培养的条件可为：接种后通风量为1.0vvm，在发酵过程中，根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量；发酵中、后期时，分三次逐步流加10％的虾蟹壳粉混合悬浮液；所述阴离子表面活性剂可选自十二烷基磺酸钠(SDS)、直链十二烷基苯磺酸钠(LAS)、鼠李糖脂等中的至少一种，优选鼠李糖脂。
在步骤2)中，所述营养琼脂培养基的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3；所述种子培养基的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的10％，菌悬液OD600＝0.2；所述种子培养基中培养的条件可于28℃，180rpm条件下培养24～48h；所述发酵培养基的组成可为葡萄糖20g/L、豆粕粉9g/L、硫酸铵15g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的8％～15％；所述发酵的条件可为：转速控制在180～200rpm，发酵温度控制在28～30℃，发酵时间为48～72h。
在步骤3)中，所述无氮固体培养基的组成可为：蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、碳酸钙1.0g/L、琼脂20g/L，灭菌前pH为7.5；所述发酵培养基组成可为：酵母膏1.579g/L、淀粉5.5g/L、豆粕粉5.76g/L、硫酸镁1.4g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8.5g/L、氯化钠0.2g/L，灭菌前pH为7.3；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的8％～15％；所述发酵的条件可为：转速控制在180～200rpm，发酵温度控制在28～30℃，发酵时间为48～72h。
在步骤4)中，所述步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液的质量比优选为(30～60):(10～20):(10～40)。
所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂可在制备土壤淋洗剂、植物修复剂、土壤生物修复剂等中应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明所用地衣芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对多种重金属具有较强耐受性，适应范围广；同时能够对溶液中的Cd2+有很强的吸附能力。
2、本发明所用改性甲壳低聚糖结构中带有氨基、羧基、羟基，能够络合重金属离子。地衣芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌可通过离子交换、络合作用、沉淀作用、主动运输等方式富集重金属离子，改变土壤中重金属离子的存在形态。
3、本发明所用胶冻样芽孢杆菌能够分泌有机酸，有较好的矿解作用，能将土壤中的K、Si、Mn、Mg、Ca等元素释放出来，这些阳离子将与Cd2+竞争吸附点位，且由于K+浓度增加使得土壤离子强度增加，降低土壤对镉的吸附，显著提高土壤中有效态镉含量。
4、本发明提供的一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂能促进土壤重金属活化，可做土壤淋洗剂，降低土壤重金属含量，或施于土壤协助植物吸收重金属，提高植物修复效率。
5、本发明的甲壳低聚糖重金属生物修复剂制备简单，对土壤重金属修复效果好，且对环境不会造成二次污染，安全环保，具有很好的推广价值。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备
1)制备改性甲壳低聚糖溶液
配制PDA培养基，将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子培养基中培养得种子液；再将种子液接种至发酵罐培养基中发酵48h；将淡紫拟青霉发酵液离心去除菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10％～15％。甲壳低聚糖溶液，加入等质量浓度为100mmol/L的鼠李糖脂溶液，振荡24h，制得改性甲壳低聚糖溶液。
在步骤1)中，所述PDA培养基的组成可为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值；所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种，已于2010年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO：M 2010165；所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件可于28℃条件下培养72h；所述种子培养基的组成可为：蔗糖15g/L，大豆粉10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比可为10％，稀释至OD600为0.2；所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件可于28℃，180rpm下培养72h；
所述发酵培养基组成可为：虾蟹壳粉25g/L，蛋白胨2g/L。所述种子液可按5～10％接种量接入发酵培养基中。所述培养条件可为：接种后通风量为1.0vvm，在发酵过程中，根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量；发酵中、后期时，分三次逐步流加10％的虾蟹壳粉混合悬浮液。
2)制备地衣芽孢杆菌发酵液
配制营养琼脂培养基，将地衣芽孢杆菌接种在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的地衣芽孢杆菌用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵罐培养基中发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；
在步骤2)中，所述营养琼脂平板的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.10741；
所述种子培养基的组成可为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述菌悬液接种的接种量按体积百分比可为菌悬液的10％，菌悬液OD600＝0.2；所述种子培养基中培养的条件可于28℃，180rpm条件下培养48h；
所述发酵培养基的组成可为葡萄糖20g/L、豆粕粉9g/L、硫酸铵15g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的12％；所述发酵的条件可为：转速控制在180rpm，发酵温度控制在28℃，发酵时间为48h。
3)制备胶冻样芽孢杆菌发酵液
配制无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌接种在无氮固体培养基平板上进行划线培养，从无氮固体培养基平板上将活化好的胶冻样芽孢杆菌转接至无氮液体培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，得胶冻样芽孢杆菌发酵液；
在步骤3)中，所述无氮培养基的组成可为：蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、碳酸钙1.0g/L，灭菌前pH为7.5，固体培养基加20g/L琼脂；所述胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01，已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.3995；
所述发酵培养基组成可为：酵母膏1.579g/L、淀粉5.5g/L、豆粕粉5.76g/L、硫酸镁1.4g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8.5g/L、氯化钠0.2g/L，灭菌前pH为7.3；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比可为种子液的8～15％；所述发酵的条件可为：转速控制在180rpm，发酵温度控制在28℃，发酵时间为48h。
4)制备甲壳低聚糖重金属生物修复剂
甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ：将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比60∶20∶30，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ。
甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ：将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比45∶15∶20，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ。
甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ：将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比30∶15∶20，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ。
甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅳ：将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比15∶15∶20，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅳ。
实施例2甲壳低聚糖重金属生物修复剂用于水体Cd2+静态吸附
试验设计7个试验组，分别为：
CK，阴性对照组：水；
A，阳性对照组1：改性甲壳低聚糖溶液；
B，阳性对照组2：微生物菌剂(地衣芽孢杆菌发酵液与胶冻样芽孢杆菌发酵液混合物)；
C，实验组1：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ；
D，实验组2：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ；
E，实验组3：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ；
F，实验组4：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅳ；
分别取上述7个试验组重金属生物修复剂(10g/L)于50mL锥形瓶中，加入重金属溶液(先灭菌处理)，控制溶液的最终体积为10mL，Cd2+的终浓度为100mg/L和200mg/L，在28℃、160rpm恒温振荡2h。取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，再经过膜过滤，用火焰原子吸收分光光度法检测溶液中剩余的Cd2+浓度，并计算溶液中Cd2+的吸附率。
所得不同试验组对水体中Cd2+的静态吸附结果如表1所示：1)改性甲壳低聚糖、微生物菌剂、甲壳低聚糖重金属生物修复剂对溶液中Cd2+均有一定的吸附能力，随着Cd2+浓度的升高，Cd2+的吸附率出现下降。2)甲壳低聚糖重金属生物修复剂对Cd2+的吸附率均高于两个阳性对照组。3)随着甲壳低聚糖重金属生物修复剂中改性甲壳低聚糖含量的降低，重金属生物修复剂对Cd2+的吸附率也出现下降趋势，当改性甲壳低聚糖、地衣芽孢杆菌发酵液、胶冻样芽孢杆菌发酵液质量比为60∶20∶30时，Cd2+的吸附率达到86.34％。由此可见，甲壳低聚糖重金属生物修复剂对Cd2+具有较强的吸附能力。
表1
实施例3甲壳低聚糖重金属生物修复剂用于实验室土壤淋洗
(1)试验设计7个试验组，分别为：
CK，阴性对照组：水；
A，阳性对照组1：改性甲壳低聚糖溶液；
B，阳性对照组2：微生物菌剂(地衣芽孢杆菌发酵液与胶冻样芽孢杆菌发酵液混合物)；
C，实验组1：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ；
D，实验组2：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ；
E，实验组3：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ；
F，实验组4：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅳ；
将上述试验组中的改性甲壳低聚糖溶液、微生物菌剂和甲壳低聚糖重金属生物修复剂分别用水稀释300倍。
供试土壤样品总Cd含量为4.20mg/kg，有效态Cd含量为1.27mg/kg。称取供试土壤样品2g于50mL锥形瓶中。淋洗剂选用上述稀释300倍的改性甲壳低聚糖溶液、微生物菌剂或甲壳低聚糖重金属生物修复剂。用1mol/L HCl和NaOH调节pH值，使之达到5。按液固比10∶1向各锥形瓶分别投加不同的淋洗剂。在室温条件下，100rpm振荡2h，每个处理重复3次。振荡后，取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，用火焰原子吸收分光光度法检测第一次淋洗后溶液中Cd浓度。往淋洗过一次的土壤中按液固比10∶1继续加入淋洗剂，淋洗时间为2h。振荡后，取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，用火焰原子吸收分光光度法检测第二次淋洗后溶液中Cd浓度，计算累计Cd累计去除率。
土壤淋洗对重金属洗脱浓度及淋洗效率的影响结果如表2所示，从表2可以看出：
1)以改性甲壳低聚糖溶液、微生物菌剂、甲壳低聚糖重金属生物修复剂为土壤淋洗剂时，Cd的去除率远远高于以水作为淋洗剂，尤其是甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ；
2)以微生物菌剂稀释液为土壤淋洗剂时，虽然离心后菌体混于土壤中，但是因为地衣芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌对土壤重金属Cd具有一定的活化作用，从结果也可以看出，洗脱溶液中Cd的浓度高于对照组。
3)随着淋洗次数的增加，淋洗溶液中Cd的含量比第一次淋洗有不同程度下降；使用甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ淋洗2次后，土壤中Cd的累计去除率最高为54.52％，比第一次淋洗增加了44.00％。一次淋洗不能取得去除土壤中重金属的最佳效果，需要通过增加淋洗次数实现淋洗效率的提高。
表2
(2)在上述实验的基础上设计另一实验，以甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ、Ⅱ为土壤淋洗剂，稀释300倍后，用1mol/L HCl和NaOH调节pH，使pH值达到3、5、7、9、11。供试土壤样品总Cd含量为4.20mg/kg，有效态Cd含量为1.27mg/kg。称取供试土壤样品2g于50mL锥形瓶中。按液固比10:1向各锥形瓶分别投加不同的淋洗剂。在室温条件下，100rpm振荡2h，每个处理重复3次。振荡后，取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，用火焰原子吸收分光光度法检测第一次淋洗后溶液中Cd浓度。往淋洗过一次的土壤中按液固比10∶1继续加入淋洗剂，淋洗时间为2h。振荡后，取出样品，在6000rpm下振荡离心10min。将上清液转移至干净的离心管中，用火焰原子吸收分光光度法检测第二次淋洗后溶液中Cd浓度，计算Cd累计去除率。
pH值对土壤重金属淋洗效果的影响结果如表3所示：
1)甲壳低聚糖重金属生物修复剂在不同pH值条件下对土壤重金属洗脱能力有差异，在pH＝5条件下有利于土壤中Cd的洗脱。
2)甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ和Ⅱ对土壤重金属Cd的去除率差不多，前者略好。甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ使用的改性甲壳低聚糖含量较少，从经济角度上看，选择甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ用于实际土壤重金属淋洗更经济实惠。
表3
实施例4甲壳低聚糖重金属生物修复剂用于盆栽试验
供试土壤样品特征如表4所示，将供试土壤风干研磨过2mm筛，试验每盆装土2kg，混入CaCO3和喷洒CdSO4溶液，制成2mg/kg Cd单一污染土壤，混匀后，平衡3个月。
试验设计7个试验组，分别为：
CK，阴性对照组：水；
A，阳性对照组1：改性甲壳低聚糖溶液；
B，阳性对照组2：微生物菌剂(地衣芽孢杆菌发酵液与胶冻样芽孢杆菌发酵液混合物)；
C，实验组1：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅰ；
D，实验组2：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅱ；
E，实验组3：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ；
F，实验组4：甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅳ；
将上述试验组中的改性甲壳低聚糖溶液、微生物菌剂和甲壳低聚糖重金属生物修复剂分别用水稀释300倍。取200mg/kg上述稀释过的改性甲壳低聚糖溶液、微生物菌剂和甲壳低聚糖重金属生物修复剂施入土壤中。常规施肥：尿素0.3g/kg、磷酸二氢钾0.5g/kg、氯化钾0.085g/kg。选择长势一致的油麦菜油麦进行盆栽试验，每盆5株，保持田间持水量60％，在人工气候室培养，种植40d后采收。
结果如下：
1)不同试验组对土壤理化性质的影响结果如表4所示，在单一Cd污染(2mg/kg)土壤中试验组A、B、C、D、E、F都能使土壤有机质、全氮、有效磷、有效钾含量有不同程度的提高，说明土壤重金属修复剂施用可提高土壤养分含量。而施用地衣芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌能使土壤pH值一定程度降低，可能是因为地衣芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌能够分泌有机酸导致的。根据GB/T 23739-2009检测土壤中有效态镉的含量。在Cd污染浓度为2mg/kg的土壤中，试验组A外，其他试验组均能使土壤中有效态Cd含量增加。而试验组A，即单独施用改性甲壳低聚糖溶液，因甲壳低聚糖极易被植物吸收，所以改性甲壳低聚糖与重金属结合后被植物大量吸收，使得土壤中有效态Cd含量略有下降。试验组B，即单独施用微生物菌剂，能够使土壤中有效态Cd含量增加109.5％，说明地衣芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌对土壤中Cd活化效果明显。当改性甲壳低聚糖溶液与微生物菌剂混合后施用，因微生物活化Cd能力以及改性甲壳低聚糖吸附Cd的复合物容易被植物吸收，造成土壤中总Cd含量的降低。
表4
2)油麦菜种植40d采收，并计算植物株高、根长、鲜重。不同试验组对油麦菜生长的影响结果如表5所示。不同试验组均能促进油麦菜的生长，其株高、根长和鲜重都有不同程度的提高。其中试验组E的促生效果最好，油麦菜株高提高了25.76％，根长提高了77.65％，鲜重提高了65.40％。
表5
试验组 株高(cm) 根长(cm) 鲜重(g)
CK 13.2 8.5 4.22
A 15.4 14.3 5.61
B 14.5 13.2 5.32
C 15.2 13.7 6.12
D 15.9 14.5 6.03
E 16.6 15.1 6.98
F 16.3 15.0 6.54
3)油麦菜种植40d采收，根据GB 5009.15-2014检测油麦菜的Cd含量。不同试验组对油麦菜内Cd含量的影响结果如表6所示，不同试验组对油菜吸收重金属Cd的影响有差异，但与空白对照相比，油麦菜茎叶、根中的Cd含量有了较大的增加。其中，试验组E的效果最明显，可以使油麦菜茎叶中Cd含量提高了96.88％，使根部中Cd含量提高了61.80％。由此可见，甲壳低聚糖重金属生物修复剂能够明显的提高植物中Cd含量，从而降低土壤中总Cd含量。
表6
综合考虑，本发明优选甲壳低聚糖重金属生物修复剂Ⅲ作为土壤重金属生物修复剂进行施用。
此外，本发明各种不同实施方式中间可以任意组合，只要不违背本发明的思想，应视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种甲壳低聚糖重金属生物修复剂，其特征在于其按质量比的组成为甲壳低聚糖溶液5～70、地衣芽孢杆菌发酵液10～30、胶冻样芽孢杆菌发酵液10～50；
所述甲壳低聚糖是利用淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种为发酵菌，以虾蟹壳粉为原料，通过微生物发酵生产得到的发酵上清液经过阴离子表面活性剂改性得到的；所述淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种已于2010年6月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2010165；
所述地衣芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10，已于2015年4月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.10741；
所述胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌株，已于2010年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.3995。
2.如权利要求1所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂，其特征在于按质量比的组成为甲壳低聚糖溶液30～60、地衣芽孢杆菌发酵液10～20、胶冻样芽孢杆菌发酵液10～40。
3.如权利要求1所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)制备改性甲壳低聚糖溶液
配制PDA培养基，将淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)三炬03号种孢子液，涂布于营养琼脂平板上培养，再用无菌生理盐水将营养琼脂平板上的淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)三炬03号种孢子液的孢子洗涤，制成孢子悬液；将孢子悬液接入种子培养基中培养得种子液；再将种子液接种至发酵培养基中发酵培养48～72h得淡紫拟青霉发酵液；将淡紫拟青霉发酵液离心去除菌体，获得上清液，浓缩，制得含量10％～15％的甲壳低聚糖溶液；在制得的甲壳低聚糖溶液中加入等质量浓度为20～100mmol/L的阴离子表面活性剂溶液，振荡2～48h，制得改性甲壳低聚糖溶液；
所述发酵培养基的组成为：虾蟹壳粉25g/L、蛋白胨2g/L；所述种子液按5％～10％接种量接入发酵培养基中；所述发酵培养的条件为：接种后通风量为1.0vvm，在发酵过程中，根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量；发酵中、后期时，分三次逐步流加10％的虾蟹壳粉混合悬浮液；所述阴离子表面活性剂选自十二烷基磺酸钠、直链十二烷基苯磺酸钠、鼠李糖脂中的至少一种；
2)制备地衣芽孢杆菌发酵液
配制营养琼脂培养基，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)三炬-10接种在营养琼脂平板上进行划线培养，从营养琼脂平板上将活化好的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)三炬-10用无菌生理盐水洗涤，制成菌悬液，将菌悬液接种至种子培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得地衣芽孢杆菌发酵液；
3)制备胶冻样芽孢杆菌发酵液
配制无氮固体培养基，将胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)三炬01号菌株接种在无氮固体培养基平板上进行划线培养，从无氮固体培养基平板上将活化好的胶冻样芽孢杆菌为胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)三炬01号菌株转接至无氮固体培养基中培养，得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中发酵，制得胶冻样芽孢杆菌发酵液；
4)制备甲壳低聚糖重金属生物修复剂
将步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液按质量比(5～70):(10～30):(10～50)混合，即得甲壳低聚糖重金属生物修复剂。
4.如权利要求3所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述PDA培养基的组成为：去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L，自然pH值；所述涂布于营养琼脂平板上培养的条件是于28～32℃下培养72～120h；所述种子培养基的组成为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸锌0.1g/L，灭菌前pH值为6.0；所述将孢子悬液接入种子培养基的接种量按体积百分比为8％～15％，稀释至OD600为0.2；所述将孢子悬液接入种子培养基中培养的条件是于28～32℃，150～200rpm下培养72～96h。
5.如权利要求3所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于步骤1)中，所述阴离子表面活性剂为鼠李糖脂。
6.如权利要求3所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述营养琼脂培养基的组成为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，灭前pH值为7.3；
所述种子培养基的组成为牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述菌悬液接种的接种量按体积百分比为菌悬液的10％，菌悬液OD600＝0.2；所述种子培养基中培养的条件是于28℃，180rpm条件下培养24～48h；
所述发酵培养基的组成为葡萄糖20g/L、豆粕粉9g/L、硫酸铵15g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠5g/L、硫酸镁0.5g/L，灭菌前pH值为7.0；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比为种子液的8％～15％；所述发酵的条件为：转速控制在180～200rpm，发酵温度控制在28～30℃，发酵时间为48～72h。
7.如权利要求3所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述无氮固体培养基的组成为：蔗糖10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钠0.2g/L、碳酸钙1.0g/L、琼脂20g/L，灭菌前pH为7.5；
所述发酵培养基组成为：酵母膏1.579g/L、淀粉5.5g/L、豆粕粉5.76g/L、硫酸镁1.4g/L、磷酸氢二钾2g/L、碳酸钙8.5g/L、氯化钠0.2g/L，灭菌前pH为7.3；所述种子液接种至发酵培养基中发酵的接种量按体积百分比为种子液的8％～15％；所述发酵的条件为：转速控制在180～200rpm，发酵温度控制在28～30℃，发酵时间为48～72h。
8.如权利要求3所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂的制备方法，其特征在于在步骤4)中，所述步骤1)所得的改性甲壳低聚糖溶液、步骤2)所得的地衣芽孢杆菌发酵液、步骤3)所得的胶冻样芽孢杆菌发酵液的质量比为(30～60):(10～20):(10～40)。
9.如权利要求1所述甲壳低聚糖重金属生物修复剂在制备土壤淋洗剂、植物修复剂、土壤生物修复剂中应用。
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