CN105492023A - Tspan 33是用于治疗b细胞霍奇金淋巴瘤的抗体靶向疗法的候选物 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种治疗与表达四旋蛋白33(TSPAN33/BAAM)的活化的B淋巴细胞相关的疾病的方法。所述疾病可为例如淋巴瘤或免疫性疾病。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗所述疾病的量的抗TSPAN33/BAAM抗体。本发明还提供了将活化的B细胞纯化以及鉴定活化和/或病变的B细胞的方法。

Description

TSPAN 33是用于治疗B细胞霍奇金淋巴瘤的抗体靶向疗法的候选物

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在政府支持下根据美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的资助号R21AI096278做出的。政府享有本发明的某些权利。

背景

技术领域

本发明涉及在活化的B细胞中表达的蛋白质TSPAN33。

背景技术

B细胞是协调适应性免疫***的体液反应的淋巴细胞(1)。不同于在胸腺中成熟的T细胞，B细胞在骨髓中产生，其中它们成熟而成为成熟的初始B细胞(1)。B细胞仅负责分泌识别外来抗原的抗体或在自身免疫性疾病的情况下分泌自身抗原。抗体分为多种亚型，这些亚型决定了它们的位置和功能这两者，如参与保护粘膜表面的IgA。某些类型的淋巴瘤具有B细胞起源。B细胞淋巴瘤在历史上已经被分成两种主要的类型：霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)。以托马斯霍奇金(ThomasHodgkin)命名并且在1832年被首次描述(2)的霍奇金氏淋巴瘤的特征在于存在李-施二氏细胞(ReedSternbergcell)、脾、***或身体其他免疫组织的肿大，以及可以波及到淋巴组织以外的异常生长。术语‘非霍奇金氏淋巴瘤’已经被用于描述不伴有标志性HL症状的所有类型的淋巴瘤。现行的淋巴瘤分类已经将HL或NHL分组体系替代为在4大类中含有80种类型的分组体系(2)。本发明的一些实施方案涉及使用在活化B细胞的膜或B细胞淋巴瘤中表达的新颖生物标志物来鉴定特定的病变B细胞或实现对表达也被称为BAAM抗原的四旋蛋白33(TSPAN33)的病变B细胞或T细胞淋巴瘤的特异性消除，这是因为已知一些T细胞淋巴瘤异常地表达B细胞抗原，如CD20(3)。因此，使用BAAM作为治疗性靶标不受淋巴瘤类型的限制，但是受到在淋巴细胞的表面上由TSPAN33/BAAM基因编码的蛋白质的存在所限制。

癌症免疫疗法已经由于治疗性单克隆抗体的发展而发生转变。这些抗体靶向在肿瘤细胞中特异性表达的细胞表面分子。存在允许同时对数千种基因的表达进行集体筛选的技术，如基因阵列。生物信息学的应用允许对基因阵列数据进行分析以鉴定编码细胞表面蛋白的基因，这些细胞表面蛋白代表了用于研发单克隆抗体的靶标。然后这些抗体可以被用作治疗剂以减缓肿瘤生长或直接杀灭肿瘤细胞。抗体靶向疗法已经日益普及，这是因为保罗·欧立希(PaulEhrlich)最初在1908年将抗体设想为可以向微生物或肿瘤递送毒素的“魔术弹(magicbullet)”(4)。在1981年，Gaffar,S.A.等(5)使用针对人类癌胚抗原(CEA)的放射性标记的抗体以可能经由诱导DNA损伤来向人类结肠癌异种移植物递送特异性细胞毒性。在1988年，DeNardo等(6)报道了10名患有B细胞恶性肿瘤的患者中有4名在接受放射性标记的抗体靶向疗法的施用后完全或部分缓解。不久之后，其他人已经报道了“裸”(未标记的)抗体经由补体介导的细胞毒性(CMC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的类似的抗肿瘤活性(7)。

治疗性抗体与靶分子结合可以触发通常由该靶分子控制的信号转导通路。这可以引起肿瘤细胞命运的改变。它可以引起细胞凋亡、坏死、细胞周期停滞、增强的增殖、或分化。这些发生改变的细胞行为中的一些在癌细胞的情况下是理想的，特别是引起细胞死亡或增殖停滞的那些(坏死、细胞凋亡)。本领域技术人员可以确定给定的抗体是否在肿瘤细胞中诱导这些效应中的任一种(8-9)。

由小鼠细胞产生的单克隆抗体需要‘人源化’以降低它们的免疫原性以用于人类中。存在多种实现这样的方式。一种是通过产生人源化抗体，其中抗体的小鼠区域(可结晶片段或Fc)被人类Fc序列置换(9)。这可以使用多种分子生物学技术来完成(8-9)。或者，可通过对转基因小鼠进行免疫接种来产生抗体，所述转基因小鼠的免疫***已经通过使用分子生物学技术用人类免疫球蛋白基因置换小鼠免疫球蛋白基因而被改变。已经产生了多种这样的小鼠(7)。

鉴于上述可能性，治疗性单克隆抗体已经变成治疗各种癌症的优选方法(10)。基于FDA批准的抗体的疗法，如利妥昔单抗(rituximab)(一种抗CD20抗体)已经被用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)以及自身免疫性病症，如类风湿性关节炎(RA)(11)。因此，针对在疾病细胞/组织上表达的独特的生物标志物的抗体靶向疗法已经被证实有效治疗人类癌症或自身免疫性病症。其他实例包括赫赛汀(Herceptin)，即一种靶向乳腺癌细胞中的Her-2抗原的人源化单克隆抗体(12)；或阿瓦斯汀(Avastin)，即一种靶向结肠直肠癌的血管内皮生长因子的人源化抗体(13)。这些实例代表了在某些人类癌症中具有显著的(积极的)治疗作用的非常成功的抗体。

靶向B细胞的抗体已经被证实在治疗上是重要的，这是因为许多淋巴瘤和白血病表达B细胞抗原(11)。一个实例是利妥昔单抗(14)，即一种靶向CD20的治疗性抗体，所述CD20是在某些人类淋巴瘤中表达的蛋白质。然而，正常的B细胞也表达CD20，因此尽管靶向CD20的抗体疗法消除了大部分的肿瘤细胞，但是这种治疗也除去了它们也表达CD20的正常B细胞(15)。这是在人类中施用利妥昔单抗的严重副作用。尽管如此，消除肿瘤细胞的益处仍证明在患有CD20阳性淋巴瘤的患者中使用利妥昔单抗是合理的(11)。

发明内容

在一个方面，提供了一种治疗其中TSPAN33上调的淋巴瘤或白血病的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗淋巴瘤或白血病的量的抗TSPAN33抗体。

在所述方法中：

a)所述淋巴瘤可为霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、伯基特氏淋巴瘤、非特指性外周T细胞淋巴瘤(peripheralT-celllymphoma-Not-Otherwise-Specified)、霍奇金淋巴瘤的结节硬化形式、或霍奇金淋巴瘤的混合细胞亚型；

b)所述淋巴瘤可为霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤；

c)所述施用可以引起患者的TSPAN33+B细胞的数目减少；

d)所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合；或

e)a-d的组合。

在另一个方面，提供了一种治疗其中TSPAN33上调的免疫性疾病的方法。所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗免疫性疾病的量的抗TSPAN33抗体。

在所述方法中：

a)所述免疫性疾病可为过敏或自身免疫性疾病；

b)所述疾病可为类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征(Sjogren'ssyndrome)、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn'sdisease)、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(hashimotothyroiditis)、格雷夫斯氏病(Graves'disease)、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性紫癜、混合型***病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天疱疮、颞动脉炎、白斑病、或全身性红斑狼疮；

c)所述疾病可为类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮；

d)所述施用可以引起患者的TSPAN33+B细胞的数目减少；

e)所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合；或

f)a-e的任何组合。

在另一个方面，提供了一种将活化的B淋巴细胞纯化的方法。所述方法包括将抗TSPAN33抗体与含有淋巴细胞的细胞制备物混合，以及分离由所述抗体结合的淋巴细胞。在所述方法中，所述抗TSPAN33抗体可为单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合；和/或所述分离可通过荧光活化细胞分选来进行。

在另一个方面，提供了一种鉴定活化和/或病变的B淋巴细胞的方法。所述方法包括检测淋巴细胞中TSPAN33的表达上调。

在所述方法中：

a)所述检测可以包括：将抗TSPAN33抗体添加到包含所述淋巴细胞的蛋白质的样品中；当在所述样品中存在TSPAN33时所述抗体与TSPAN33之间形成免疫复合物；以及检测所述免疫复合物；

b)所述检测可以包括：由所述淋巴细胞的RNA制备cDNA；使用对TSPAN33基因中的核苷酸序列具有特异性的引物扩增所述cDNA，或使所述cDNA与TSPAN33基因的核苷酸序列杂交；以及检测所述扩增反应的扩增产物或检测所述cDNA与TSPAN33核苷酸序列之间的杂交体；

c)所述淋巴细胞可以来自于患者，并且所述方法还可以包括当检测到TSPAN33的表达上调时向所述患者施用抗TSPAN33抗体；或

d)a)和c)、或b)和c)的任何组合。

在另一个方面，提供了一种对涉及活化和/或病变的B淋巴细胞的淋巴瘤或免疫性疾病进行诊断的方法。所述方法包括针对活化和/或病变的B淋巴细胞的存在分析患者的样品，这是通过检测所述样品的淋巴细胞中TSPAN33的表达上调来进行，当检测到活化和/或病变的B淋巴细胞时，将所述患者诊断为患有所述淋巴瘤或免疫性疾病。

在所述方法中：

a)所述疾病可为霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、非特指性外周T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤的结节硬化形式、或霍奇金淋巴瘤的混合细胞亚型；

b)所述疾病可为类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性紫癜、混合型***病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天疱疮、颞动脉炎、白斑病、或全身性红斑狼疮；

c)所述疾病可为霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮；

d)检测所述样品的淋巴细胞中TSPAN33的表达上调可通过本文所述的检测TSPAN33表达上调的任何方法来进行。

附图说明

为了更完全了解本发明，现在结合附图参考以下说明，在附图中：

图1是人类TSPAN33的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。

图2是人类TSPAN33(SEQIDNO:1)和小鼠TSPAN33(SEQIDNO:2)的氨基酸序列比较。还示出了共有序列(SEQIDNO:3)。

图3是示出了在正常人类组织中TSPAN33表达限于活化的B细胞的图表。由基因表达的人体指数(humanbodyindex)数据库汇编的Affymetrix基因阵列(U133plus2.0)数据观测到TSPAN33在正常的人类组织(n＝8)和免疫细胞中的表达。X轴由器官***构成：CNS(中枢神经***)、Gut(胃肠***)、Struct(结构***)、Vasc(脉管***)、Resp(呼吸***)、Endo(内分泌***)、Ur(泌尿***)、Rep(生殖***)、Imm_T(免疫组织)、Imm_C(免疫细胞)、以及Dev(发育***)。

图4是示出了在小鼠和人类中TSPAN33表达限于活化的B细胞的图。4A)与人类骨髓相比，由人类血液纯化的休止的和活化的(抗CD40+IL-4)人类B淋巴细胞中TSPAN33表达的qRT-PCR(n＝3)。4B)使用肌动蛋白作为上样对照，在休止状态和活化状态(使用CpG+美洲商陆有丝***原(PWM)+pansorbin)下PBMC的TSPAN33表达的蛋白质印迹。还示出了光密度分析。4C)在人类2E2B细胞(黑色条柱)中在抗CD40mAb+IL-4刺激下以及在人类JurkatT细胞(白色条柱)中在未刺激、抗CD3+抗CD28mAb、或PMA+离子霉素(ionomycin)刺激下在12小时内随时间推移TSPAN33表达的qRT-PCR，n＝3。4D)休止的人类2E2B细胞相比于使用抗CD40mAb+IL-4活化的人类2E2B细胞中TSPAN33表达的蛋白质印迹。还示出了光密度分析。4E)在休止状态以及使用0.1、1或10ng/mL的LPS+IL-4的活化状态下Tspan33A20-2JB细胞的qRT-PCR。4F)由C57BL/6脾脏富集的休止的B细胞或被刺激(使用10ng/mL的LPS+IL-4)12小时的B细胞的qRT-PCR，n＝3，*p≤0.05，**p≤0.01以及***p≤0.001表示根据斯氏t检验(Student'sttest)具有统计显著性。数据代表三次独立实验。误差棒表示标准偏差(SD)。

图5是示出了TSPAN33在人类霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤中表达的图。5A)对多种人类NHL细胞系进行qRT-PCR并且测量TSPAN33(黑色条柱)相比于MS4A1/CD20(白色条柱)表达。针对GAPDH将样品归一化。5B)与GAPDH相比，在人类伯基特氏淋巴瘤细胞系Raji、Ramos以及Daudi中相对于在BaF3(一种小鼠祖B细胞系)中对应于TSPAN33的大细胞外环区33(LEL)的RT-PCR表达分析。5C)使用兔抗TSPAN33多克隆抗体对Raji、Ramos、Daudi、以及BaF3细胞的TSPAN33表达进行的蛋白质印迹分析。数据代表三次独立实验。

图6是示出了TSPAN33在人类淋巴瘤中表达的一组图像。将淋巴瘤活检切片并且使用苏木精/伊红和抗TSPAN33抗体染色，继而使用同种型或抗兔IgG-HRP染色。白色箭头指示李-施二氏细胞并且黑色箭头指示TSPAN33染色呈阳性的细胞。取自被诊断患有HL(n＝6)、DLBCL(n＝6)以及套细胞淋巴瘤(n＝2)的患者的活检的代表性图像。

图7是示出了TSPAN33在B细胞相关的自身免疫中上调的图。7A)针对CD19表达归一化的取自MRL/faslpr/lpr小鼠的总脾细胞的Tspan33表达的qRT-PCR。比较9周大(无可检测出的病变)、24周大(伴有或不伴有轻度耳部病变的***病)以及36周大(伴有耳部和面部病变的***病)的小鼠的Tspan33表达，n＝5。7B)来自11.5周大的雌性(***病)和12.5周大的雄性(无病变)MRL/faslpr/lpr小鼠的CD19+CD138-和CD19-CD138+脾细胞中Tspan33表达的qRT-PCR，n＝2。7C)对来自人类SLE患者或健康对照的PBMC进行的TSPAN33表达分析的qRT-PCR，n＝9。7D)对来自健康人和RA患者的滑膜中TSPAN33表达相比于MS4A1/CD20表达的微阵列分析。如所述(H.Soto,P.Hevezi,R.B.Roth,A.Pahuja,D.Alleva,H.M.Acosta,C.Martinez,A.Ortega,A.Lopez,R.Araiza-Casillas,A.Zlotnik,Genearrayanalysiscomparisonbetweenratcollagen-inducedarthritisandhumanrheumatoidarthritis,ScandJImmunol,68(2008)43-57)，从对照或RA患者分离滑膜。将RNA从膜中分离并且使用Affymetrix基因阵列U133plus2.0分析MS4A1/CD20和TSPAN33表达，健康人的n＝9并且RA患者的n＝5，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001(斯氏t检验)。数据代表至少三次独立实验(A-C)。误差棒表示标准偏差(SD)。

图8是示出了TSPAN33在近曲小管、远曲小管以及集合管中表达，但不在肾脏肾小球中表达的一组图像。对肾脏活检进行染色以在组织阵列中进行IHC。将样品用苏木精/伊红和抗TSPAN33或兔IgG同种型对照染色，继而用抗兔IgG-HRP染色。8A)示出了淋巴细胞(黑色箭头)和神经(白色箭头)的40倍放大图。8B)示出了近曲小管(黑色箭头)和肾脏肾小球(白色箭头)的40倍放大图。8C)示出了远曲小管(黑色箭头)和集合管(白色箭头)的40倍放大图。8D)示出了顶面(黑色箭头)和颗粒(白色箭头)的近曲小管的100倍放大图。

具体实施方式

要求2012年12月21日提交的美国临时申请号61/740,946的优先权，该临时申请于以引用的方式并入本文。

四旋蛋白33是膜蛋白的四旋蛋白家族的成员(16)并且被定位到人类染色体7(7q31.2-q32)(17)，即为骨髓发育异常综合征和急性骨髓性白血病中缺失的热点的区域(17)。四旋蛋白33最初被表征为涉及红细胞生成的新四旋蛋白(17-18)。

四旋蛋白33还被命名为Penumbra，即Pen(17)(对于原成红细胞(Proerythroblast)nu(新)膜(membrane))，这是因为带有Pen基因靶向缺失的小鼠(Pen^-/-)产生伴有贫血和脾肿大的异常更大的嗜碱性RBC(18)。在小鼠的骨髓中，在包括所有的成红细胞的TER119⁺部分当中发现最高的Penumbra表达，而在中性粒细胞、休止的T细胞、休止的B细胞、单核细胞、或自然杀伤细胞中，Penumbra表达是低的或不可检出的(18)。尽管该后一项的研究发现TER119+B细胞是骨髓中最高表达Tspan33的细胞，但本文所包括的我们自己的数据表明活化B细胞中四旋蛋白33的表达是总骨髓中表达的40倍。后者的观测结果引导我们得出结论，即活化的B细胞代表了在人体内具有最高的Tspan33/BAAM表达的细胞。这使得Tspan33/BAAM成为一种作为治疗性抗体研发的靶标的独特的候选物以治疗淋巴瘤或某些人类自身免疫性疾病，其中B细胞涉及它们的发病。

人类四旋蛋白33(由TSPAN33编码)已经使用超过90种不同的组织和器官的基因表达谱的综合数据库(基因表达的身体指数)被鉴定为一种存在于B细胞淋巴瘤上的生物标志物(19)。人类四旋蛋白33是与鼠类四旋蛋白33具有97％同源性的四跨膜蛋白超家族的成员并且涉及造血作用(18)。小鼠BAAM基因与人类BAAM基因之间的高度保守性使得小鼠模型适用于涉及抗体靶向疗法的临床前研究。

人类四旋蛋白33蛋白质序列提供于图1中。人类TSPAN33蛋白质相比于小鼠TSPAN33蛋白质的比对示于图2中。人类TSPAN33核苷酸序列的登录号是NM_178562(以引用的方式并入本文)，而人类TSPAN33蛋白质序列的登录号是NP_848657(以引用的方式并入本文)。

已经使用基因表达的综合数据库(基因表达的身体指数：BIGE(19))在人体的105种组织和细胞中对Tspan33的表达进行定位。BIGE数据库表明Tspan33的表达具有高度特异性并且最高水平的表达在活化的B细胞中(图3)。本申请的发明人因此决定将这种分子重新命名为BAAM或B细胞活化相关分子(BcellActivationAssociatedMolecule)，这个名称更好地反映了它在人类中的表达模式。具有显著水平的BAAM表达的另一个部位是肾脏(图3)。使用人类RNA的qRT-PCR确认了BAAM表达的这种模式(图4)，在肾脏中检测到高水平的BAAMmRNA。包括一级淋巴器官(骨髓和胸腺)和二级淋巴器官(脾脏)在内的所有其他组织以及休止的B细胞的BAAM表达呈阴性。

在BAAM表达的淋巴外部位当中，在肾脏中的表达引起了对在体内可能治疗性使用抗BAAM抗体的担忧。为了评估针对BAAM的治疗性单克隆抗体在肾脏中脱靶部位靶向的可能性，使用抗BAAM多克隆抗体进行免疫组织化学(图8)。这些结果揭示BAAM在肾脏的近曲小管和远曲小管中表达，而淋巴细胞、神经、肾脏集合管以及肾小球不表达BAAM。近曲小管和远曲小管衬有上皮刷状缘细胞，这些细胞涉及在尿液滤过期间分泌和吸收蛋白质、离子以及有机溶质。BAAM在肾脏中的表达因此与B细胞活化无关并且可能涉及这些细胞中的囊泡运输或信号转导，这是因为四旋蛋白作为一个家族已经与这些功能相关联(16)。重要的是，只有低分子量的蛋白质可以从血流的输入血管穿过肾小球囊腔并且进入曲小管中，其中尿液将被集合以转移至膀胱中。因此，靶向BAAM的治疗性单克隆抗体应当不会触及到它们的靶标并且影响肾脏功能，这是因为抗体不会进入这个囊腔中。此外，已经报道，肾脏上皮细胞对于基于生物的细胞毒性剂是无感受性的并且还据报道，肾细胞癌对ADCC具有抗性(20)。综上所述，这些数据表明Tspan33/BAAM的肾脏表达应当不会引起对在人类中治疗性使用抗BAAM抗体的担忧。

由于TSPAN33是高度保守的(21)并且在活化的B细胞中高度上调，因此它预期会参与B细胞的活化。因此，在一个实施方案中，使用抗体来调节B细胞活化并且治疗自身免疫性或过敏性免疫性疾病。术语“表达上调”意指与对照相比表达增加。举例来说，相对于对照基因，TSPAN33的表达可以增加，或相对于对照细胞中的表达，表达可以增加。

B细胞活化标志物作为诊断工具是重要的，这是因为B细胞活化标志物的水平升高已经被证实与癌症风险相关，如非霍奇金淋巴瘤(NHL)(22-23)。为此，本申请的发明人的理由是BAAM应在人类淋巴瘤中表达，这是因为其他B细胞抗原(特别是CD19和CD20)也在这些肿瘤中高表达(24)。为了评估TSPAN33在NHL中的表达，对若干种弥漫性B细胞淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)进行RT-PCR并且结果表明BAAM表达与CD20表达相当。还对若干种人类伯基特氏淋巴瘤细胞系(非霍奇金淋巴瘤)进行RT-PCR和蛋白质印迹并且TSPAN33在mRNA和蛋白质水平这两者上均容易被检测到。此外，对来自患有侵袭性NHL、套细胞淋巴瘤(NHL)以及含有李-施二氏细胞的霍奇金淋巴瘤的患者的活检进行免疫组织化学。结果表明后者呈BAAM高度阳性。套细胞淋巴瘤呈BAAM阴性。BAAM表达可能与B细胞淋巴瘤的活化状态有关。李-施二氏细胞被认为源自于已经获得不利的体细胞超突变并且未能进行细胞凋亡的生发中心B细胞，并且因此它们是淋巴瘤的活化形式(25)。另一方面，套细胞淋巴瘤是含有11q13上的细胞周期蛋白-D1基因向14q32上的免疫球蛋白重链基因座的启动子的易位的一种类型的成熟CD5+B细胞淋巴瘤(26)。所述细胞被认为源自于初始的生发中心前淋巴细胞，因此是未活化的B淋巴细胞的一种形式(26)。因此，在TSPAN33作为针对淋巴瘤的治疗性抗体的靶标的有用性方面的差异可能与它们的活化状态有关。

B细胞活化的标志物还与某些自身免疫性疾病相关。举例来说，血清免疫球蛋白，即IL-6和IL-21水平在被新诊断患有类风湿性关节炎(RA)的患者中均显著升高(27-28)。为了进一步探究活化B细胞在RA中的作用以及作为RA的潜在生物标志物的BAAM的表达水平，使用来自对9名正常人和5名分别接受膝关节重建或置换手术的RA患者的滑膜进行的全基因表达分析的微阵列数据(29)。BAAM(p＝0.0019)和CD20(p＝0.0008)这两者的mRNA的水平在从类风湿性关节炎患者获得的样品中均升高。此外，在RA样品中升高的前25个探针组代表B细胞活化的标志物，包括免疫球蛋白轻链和重链基因，这与活化的B细胞在RA中的作用一致(29)。得出的结论是，BAAM是人类的RA病变中存在的活化B细胞的生物标志物。这些数据表明抗BAAM抗体将从这些病变中消除活化的B细胞并且因此将改善RA患者的病况。这些观测结果被扩展到其中涉及活化B细胞的其他自身免疫性疾病，包括(但不限于)银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性紫癜、混合型***病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天疱疮、颞动脉炎、白斑病以及全身性红斑狼疮。

本发明的一些实施方案是基于以下发现：BAAM是活化的B细胞和某些类型的淋巴瘤的标志物。在一个方面，本发明提供了治疗性抗体治疗诸如BAAM阳性淋巴瘤和白血病类型以及自身免疫性疾病之类的涉及活化B细胞的疾病的新型和特异性用途。在另一个方面，本发明提供了BAAM作为B细胞活化的生物标志物用于诊断涉及这种蛋白质的存在的过敏、自身免疫性疾病或淋巴瘤的用途。因此，本发明的一些实施方案提供了由本领域技术人员制备的针对作为靶标的TSPAN33的治疗性抗体治疗涉及活化B细胞的TSPAN33阳性淋巴瘤或自身免疫性疾病的新型和特异性用途。并且，本发明的一些实施方案提供了TSPAN33作为活化B细胞的生物标志物用于诊断涉及活化B细胞的疾病，如TSPAN33阳性淋巴瘤、自身免疫性疾病、或过敏的用途。

一些实施方案是基于对TSPAN33/BAAM的鉴定和表征以及以下发现：它在活化的B淋巴细胞和某些淋巴瘤中上调。这些实施方案提供了治疗性单克隆“负载型”或“裸”抗体治疗包括淋巴瘤或自身免疫性病症的呈TSPAN33/BAAM阳性的任何疾病的新型和特异性用途。词语“负载型”和“裸”指的是抗体是否与细胞毒性剂，如放射剂、自由基、或毒素缀合，其中所述抗体将被称为负载型。词语“裸”指的是治疗性抗体没有与细胞毒性剂缀合。在本领域中很容易理解的是，缀合细胞毒性剂可以经由使用抗体作为寻的导弹(homingmissile)向特异性靶标递送细胞毒性剂来提高抗体的“效力”而潜在地增进单克隆抗体的治疗用途。

抗TSPAN33抗体可以靶向表达TSPAN33的活化的和/或病变的B淋巴细胞并且经由补体介导的细胞毒性(CMC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或更直接通过改变细胞行为来使得它们耗竭。此外，抗TSPAN33抗体可以抗体-药物缀合物的形式使用以提高抗体针对表达TSPAN33的细胞的杀灭能力。使用抗体使B细胞耗竭已经被证实是一种有效的疗法，例如正如抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗那样。

由小鼠细胞产生的单克隆抗体需要人源化以在人类中使用。存在多种实现这样的方式。一种是通过产生人源化抗体，其中抗体的小鼠区域(可结晶片段或Fc)被人类Fc序列置换。这可以由本领域技术人员使用分子生物学技术以多种方式来完成(7-8)。或者，可通过对小鼠进行免疫接种来产生抗体，所述小鼠的免疫***已经通过使用分子生物学技术从小鼠的免疫***变成人类的免疫***。已经产生了多种这样的小鼠(7)。在某些实施方案中，人源化或完全人类单克隆抗体的新型和特异性用途是经由针对作为治疗性抗体(负载型或裸)的靶标的TSPAN33/BAAM以治疗涉及TSPAN33/BAAM阳性的病变B细胞的任何疾病的这些已知的方法产生的。

对涉及TSPAN33/BAAM阳性的病变B细胞的任何疾病的治疗是基于以下发现：TSPAN33/BAAM被确定是活化B细胞和某些类型的淋巴瘤的生物标志物。病变的B细胞被考虑延展到涉及TSPAN33/BAAM阳性的病变B细胞(如在分别针对过敏原和类风湿性关节炎产生抗体中)的过敏性免疫相关疾病和自身免疫性疾病。

在一个实施方案中，提供了一种通过使用所述生物标志物作为治疗性单克隆抗体的靶标来治疗呈TSPAN33/BAAM阳性的任何淋巴瘤或白血病的方法。这包括表达这种分子的任何淋巴瘤类型，如霍奇金淋巴瘤或多种非霍奇金淋巴瘤，包括可能表达TSPAN33/BAAM的某些T细胞淋巴瘤。用于治疗的其他淋巴瘤包括：前体T细胞白血病/淋巴瘤；滤泡性淋巴瘤；弥漫性大B细胞淋巴瘤；套细胞淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤；MALT淋巴瘤；伯基特氏淋巴瘤；伯基特氏淋巴瘤；非特指性外周T细胞淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤的结节硬化形式；霍奇金淋巴瘤的混合细胞亚型。在另一个实施方案中，提供了一种用于治疗含有表达所述生物标志物的病变B淋巴细胞的任何免疫性疾病，包括过敏和自身免疫性疾病的方法。可以使用TSPAN33作为治疗性抗体的靶标以使具有针对过敏原的抗体的超敏感的过敏性B淋巴细胞耗竭。同样，可以使用之前提到的任何方法以类似方式使具有针对自身抗原的自身抗体的自身反应性B淋巴细胞耗竭。

在另一个实施方案中，提供了一种通过使用中和抗体阻断TSPAN33/BAAM来调节B细胞活化或向T细胞的呈递的手段。这是基于以下发现：TSAN33/BAAM在人类和小鼠中是超过97％保守的，因此可以在B细胞功能、活化、增殖或运输中起作用。因此，由本领域技术人员研发的中和抗体可以用于阻断B细胞的功能。这还可以用于调节体液免疫的免疫反应以通过抑制B细胞的活化或呈递(如果TSPAN33/BAAM确实实际上在这种功能中起作用的话)来治疗多种疾病，如过敏或自身免疫。可以使用测定来对中和抗体进行筛选，其中抗体与TSPAN33分子的大细胞外环(LEL)区结合。举例来说，可通过将对应于TSPAN33的LEL部分的核苷酸序列克隆到表达载体中，然后将所述表达载体转染到适当的宿主细胞中来使可溶性LEL表达。抗TSPAN33抗体结合LEL的能力可通过蛋白质印迹来测定。

抗体是免疫结合剂，如IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的。用于制备和表征抗体的手段也是本领域公知的(参见例如Harlow和Lane,“Antibodies:ALaboratoryManual”,ColdSpringHarborLaboratory,1988，其以引用的方式并入本文)。单克隆抗体(mAb)被认为具有某些优势，例如再现性和大规模生产。因此，人类、鼠类、猴、大鼠、仓鼠、兔以及甚至鸡来源的单克隆抗体被考虑供使用。在一些实施方案中，具有抗原结合区的抗体样分子可为适当的。这些抗体样分子的实例包括但不限于抗体片段，如Fab'、Fab、F(ab')₂、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。

可以在广泛的动物物种中制备多克隆抗体。通常，用于产生抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。为了增加免疫原性，使用佐剂以及与诸如但不限于匙孔血蓝蛋白或牛血清白蛋白的载体蛋白缀合是公知的程序。

单克隆抗体可以容易地经由使用公知的技术来制备，所述技术如美国专利号4,196,265中所举例说明的那些，该美国专利以引用的方式并入本文。通常，这种技术涉及使用所选择的免疫原组合物，例如纯化或部分纯化的多肽、肽或结构域对合适的动物进行免疫接种。以有效刺激抗体产生细胞的方式施用免疫接种组合物(31-33)。

举例来说，在数次免疫接种之后，可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)对血清进行测试来测定小鼠的血清中抗TSPAN33抗体的存在。在给定的小鼠的血清中确认抗TSPAN33抗体的存在之后，可以使用如PEG驱动的融合或电融合技术等多种技术将它的脾脏与适用于产生单克隆抗体的骨髓瘤细胞融合。可以将所得的杂交瘤在HAT培养基中进行选择并且通过ELISA针对抗TSPAN33抗体的产生进行筛选。

如果需要的话，可以将多克隆抗体或单克隆抗体使用过滤、离心以及各种色谱法(如HPLC或亲和色谱)进一步纯化。

人源化单克隆抗体是动物来源的抗体，所述抗体已经使用遗传工程技术加以修饰以使恒定区和/或可变区框架序列被人类序列置换，同时仍保持原始的抗原特异性。这些抗体通常源自于对人类抗原具有特异性的啮齿动物抗体。这些抗体一般可用于体内治疗应用。这种策略减少了宿主对外来抗体的反应并且允许选择人类效应功能。因此，在一些实施方案中，包括针对TSPAN33的人源化抗体，所述人源化抗体是带有人类恒定区和/或可变区结构域的来自小鼠、大鼠或其他物种的嵌合抗体、双特异性抗体、重组和工程抗体以及其片段。用于产生人源化免疫球蛋白的技术是本领域技术人员公知的(34-39)。举例来说，美国专利号5,693,762公开了用于产生具有一个或多个互补决定区(CDR)的人源化免疫球蛋白的方法以及所述人源化免疫球蛋白的组合物。当被组合成完整抗体时，所述人源化免疫球蛋白在人类中基本上无免疫原性，并且对抗原保持与供体免疫球蛋白基本上相同的亲和力，所述抗原诸如含有表位的蛋白质或其他化合物。在这一领域中其他教导的实例包括美国专利号6,054,297；5,861,155；以及6,020,192，它们均以引用的方式明确地并入本文。用于研发为患者的疾病“量身定制”的抗体的方法同样是已知的并且这些量身定制的抗体也被涵盖在内。

可以使用抗体的不同制剂或药物组合物(无菌、缓冲、缓慢释放、受控释放、稳定剂、软膏剂等)进行治疗性处理，这取决于最佳的施用途径。参见例如NiaziS.K.HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulationsInformaHealthcare2012。此外，可以将一种或多种化合物与其他治疗剂组合用于单一制剂策略中。可以使用药理学变体来获得所需的药物代谢动力学结果(分泌、半衰期、溶解度或优化***途径)。

抗体的确切剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域技术人员使用已知的技术来确定。参见例如Ansel等,PharmaceuticalDosageFormsandDrugDelivery；Lieberman(1992)PharmaceuticalDosageForms(第1-3卷),Dekker,ISBN0824770846,082476918X,0824712692,0824716981；Lloyd(1999)TheArt,ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding；以及Pickar(1999)。如本领域已知的那样，针对蛋白质降解、全身递送相比于局部递送、和新蛋白酶合成的速率以及年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况的严重程度进行调整可能是必要的，并且将可由本领域技术人员使用一定的实验来确定。

各种药学上可接受的赋形剂是本领域公知的并且可以被包括在制剂或药物组合物中。如本文所用的“药学上可接受的赋形剂”包括在与组合物的活性成分组合时允许所述成分保持生物活性并且不会引起与受试者的免疫***的破坏性反应的物质。这可以包括稳定剂、防腐剂、盐或糖复合体或晶体等。参见例如NiaziS.K.HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulationsInformaHealthcare2012。

可以被包括在制剂或药物组合物中的示例性药学上可接受的载体包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液以及乳液。实例包括但不限于标准药物赋形剂，如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、以及各种类型的湿润剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，以及可注射有机酯如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖(Ringer'sdextrose)、右旋糖以及氯化钠、乳酸林格氏液(lactatedRinger's)或不挥发性油。静脉内媒介物包括体液和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。在其他实施方案中，所述组合物将被并入固体基质中，所述固体基质包括缓慢释放颗粒、玻璃珠、绷带、眼睛上的***物、以及局部形式。施用途径可以包括以下：局部、全身性、静脉内、腹膜内、呼吸道、口服、眼睛、植入、经***、***、栓剂、使用控制释放的装置等。

用于在本申请中别处所述的适应症的现有治疗剂可以与抗TSPANN33抗体组合使用或相继使用以优化治疗结果。

另一个实施方案提供了一种使用检测这种生物标志物的存在的测定来筛选病变的B淋巴细胞的手段。实例包括但不限于ELISA、聚合酶链反应(PCR)、或荧光活化细胞分选(FACS)测定，可以使用这些测定针对作为活化的B淋巴细胞或病变的B淋巴细胞的生物标志物的TSPAN33/BAAM的表达进行筛选。TSPAN33/BAAM的表达高于“正常”水平可以指示淋巴瘤或如在过敏中所见到的过度活跃的免疫反应。

用于检测TSPAN33的免疫检测方法可以包括ELISA、放射免疫测定(RiA)、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、蛋白质印迹、以及免疫组织化学。在这些方法中，使样品与对靶蛋白具有亲和力的一抗接触以形成免疫复合物，然后例如通过附接至一抗的标记(如放射性标记、荧光标记或酶标记)或借助于对一抗具有亲和力的二级结合分子(如二抗)来检测所述免疫复合物。二级分子可以与标记连接以进行检测。

核酸检测方法包括基于PCR和基于杂交的方法。基于PCR的方法包括但不限于逆转录PCR(RT-PCR)、逆转录定量PCR(RT-qPCR)或标准PCR。在基于PCR的方法中，使来自细胞或组织样品的RNA逆转录成cDNA，然后使用引物扩增。基于杂交的方法的实例包括但不限于DNA微阵列、Northern印迹法以及原位杂交。在基于杂交的方法中，使来自细胞或组织样品的RNA逆转录成标记的cDNA(例如荧光标记)，然后将所述标记的cDNA用于探测例如DNA微阵列、Northern、或被制备用于原位杂交的组织切片。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种利用细胞分离、纯化柱或FACS分选，使用生物标志物TSPAN33/BAAM作为活化B淋巴细胞的标志物将活化的B淋巴细胞分选或纯化的手段。

针对TSPAN33/BAAM的抗体靶向疗法治疗疾病的用途

在一些实施方案中，针对TSPAN33/BAAM的抗体靶向疗法可以用作用于TSPAN33/BAAM阳性淋巴瘤的治疗。举例来说，从患有套细胞淋巴瘤(NHL)、侵袭性非霍奇金淋巴瘤以及含有李-施二氏细胞的霍奇金淋巴瘤的患者获取活检。将组织切片并且使用与HRP缀合的抗小鼠IgG以苏木精/伊红染色(H&Estain)为背景对TSPAN33进行染色。霍奇金淋巴瘤和侵袭性非霍奇金淋巴瘤被认为源自于活化的B淋巴细胞(25)，而套细胞淋巴瘤被认为源自于初始的生发中心前B淋巴细胞(26)，因此代表未活化的B淋巴瘤的一种形式。只有霍奇金淋巴瘤和侵袭性非霍奇金淋巴瘤的切片是TSPAN33阳性的。因此，TSPAN33/BAAM预期是治疗性单克隆抗体在TSPAN33/BAAM阳性淋巴瘤中有效的靶标。

在一些实施方案中，针对TSPAN33/BAAM的抗体靶向疗法可以用于治疗涉及TSPAN33/BAAM阳性的并且分泌自身抗体的B淋巴细胞的自身免疫性疾病。因此，提供了对包括TSPAN33/BAAM阳性的并且产生自身抗体的自身免疫性疾病的自身免疫性疾病的治疗，所述自身免疫性疾病包括但不限于类风湿性关节炎、银屑病、舍格伦综合征以及红斑狼疮。

在一些实施方案中，针对TSPAN33/BAAM的中和抗体可以用于治疗涉及病变B淋巴细胞的免疫性疾病。这些实施方案是基于以下发现：TSPAN33/BAAM在小鼠和人类中是超过97％保守的。四旋蛋白家族在脑、免疫***中、在肿瘤上以及别处具有多种功能，包括调节细胞形态、运动、侵袭、融合以及信号转导(30)。因此，TSPAN33/BAAM可以涉及B细胞的信号转导、活化、增殖、或呈递或它们向T细胞的信号转导。因此，使用中和抗体阻断TSPAN33/BAAM信号转导被考虑用于以有利的方式调节免疫反应以治疗涉及B细胞失调的免疫性疾病。

TSPAN33/BAAM作为筛选工具的用途

在一些实施方案中，TSPAN33/BAAM作为活化的和病变的B淋巴细胞的生物标志物用作诊断测试。这些实施方案是基于以下发现：TSPAN33/BAAM在休止的B细胞中是阴性的，但在使用抗CD40+IL-4活化后在12小时之后转录增加到超过40倍。举例来说，使用0.1μg/mL的抗CD40(G28.5mAb)和4ng/mL的IL-4刺激10⁶个细胞/毫升的纯化的人类B细胞和2E2人类B细胞系。将细胞溶解并且使用QiagenRNeasy试剂盒收集RNA。使用500μg以使用QIAGEN-QuantiTect逆转录试剂盒来制备具有随机六聚体的cDNA。使用RocheLightcycler480***对细胞溶解产物进行RT-qPCR。使用lightcycler引物设计程序用正向引物5'-caacatgctcttctgggtga-3'(SEQIDNO:4)和反向引物5'-attagccgagcgtagacacc-3'(SEQIDNO:5)使用UPL引物#9研制Tspann33引物。使用正向引物5'-aacaaaatctctactttgatggaactt-3'(SEQIDNO:6)和反向引物5'-gcaaggcctactgctgagtt-3'(SEQIDNO:7)以UPL引物#60扩增CD20。使用18S和GAPDH表达的平均值将表达归一化。因此，由本领域技术人员制备的结合TSPAN33/BAAM的抗体或蛋白质被考虑用作使用测定针对活化的B细胞或病变的B细胞的筛选工具，所述测定包括但不限于ELISA、流式细胞术或ELISPOT。一些实施方案还扩展到使用基于PCR的方法，如RT-PCR、RT-qPCR或PCR来检测作为筛选工具的TSPAN33以检测活化的B细胞或病变的B细胞。

TSPAN33/BAAM作为分选工具以分离或鉴定病变的B淋巴细胞的用途

在一些实施方案中，TSPAN33/BAAM在细胞分选中用作活化的和病变的B淋巴细胞的生物标志物。这些实施方案是基于本申请中活化的B细胞表达TSPAN33/BAAM的实施例。因此，结合TSPAN33/BAAM的抗体或蛋白质被考虑用于细胞分选、分离或FACS分析中以纯化或标记细胞。

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可通过参考所附的实施例更好地了解本发明，所述实施例仅旨在用于说明的目的而不应当在任何意义上被视为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

我们已经将Tspan33鉴定为编码表现出限制性表达模式的跨膜蛋白的基因，所述表达模式包括在活化的B细胞中的表达。TSPAN33是四旋蛋白家族的成员。TSPAN33不在休止的B细胞中表达，但是在活化后的初级人类B细胞中被强烈地诱导。人类2E2细胞是活化和分化的伯基特氏淋巴瘤衍生的B细胞模型，在活化后也使TSPAN33上调。TSPAN33在包括霍奇金氏淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤在内的多种淋巴瘤中表达。TSPAN33还在其中B细胞参与病变的一些自身免疫性疾病中表达，包括类风湿性关节炎患者、全身性红斑狼疮(SLE)、以及来自MRL/Fas^lpr/lpr小鼠(小鼠SLE模型)的脾脏B细胞中。我们得出的结论是TSPAN33可以用作诊断性生物标志物或治疗性抗体的靶标以治疗某些B细胞淋巴瘤或自身免疫性疾病。

在实施例中使用以下缩写：BCMA：B细胞成熟抗原；BIGE：基因表达的身体指数(数据库)；TSPAN33：四旋蛋白33；BL：伯基特氏淋巴瘤；RA：类风湿性关节炎；NHL：非霍奇金氏淋巴瘤；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；HL：霍奇金氏淋巴瘤；SLE：全身性红斑狼疮。

实施例2

引言

对谱系特异性标志物的发现和表征已经有助于鉴定构成免疫***的复杂性的基础的细胞子集。常规地使用细胞表面标志物，如CD3ε(全T细胞标志物)、CD4(辅助性T细胞)、CD8(细胞毒性T细胞)、以及B220/CD45R(B细胞)来使淋巴细胞群体分化[1-2]。流式细胞术标记技术的进步使得能够基于对谱系特异性转录因子的检测来对CD4亚型(Th1、Th2、Th17以及Treg细胞)进行表征[3]。调节性‘B10细胞’的发现是基于对CD1d^hiCD5⁺并且分泌IL-10的B细胞的一个小的子集的鉴定[4-6]。此外，谱系特异性表面标志物(如B细胞标志物CD20)代表用于研发治疗性mAb的有用的靶标，所述治疗性mAb已经被证实经由它们将病原性B细胞除去的能力而有效对抗各种淋巴瘤以及自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(RA¹)[7-8]。

TSPAN33是一种新型B细胞活化标志物

我们试图鉴定人类白细胞的新型标志物。为此，我们分析了来自包括免疫***的细胞在内的105种不同的人类组织的人类基因表达的综合数据库(被称为基因表达的身体指数(BIGE)数据库)[9-10]。这个数据库可用于鉴定与特定的器官或细胞相关的新型基因[11]。我们鉴定出编码先前并非与B细胞相关的跨膜蛋白的基因(Tspan33)。四旋蛋白超家族由保守的域结构(Pfam00335)限定，所述保守的域结构具有含有高度保守的半胱氨酸-半胱氨酸-甘氨酸(CCG)基序的富含半胱氨酸的长细胞外环区(LEL)[12]。这些特征有助于与诸如整合素或其他四旋蛋白之类的其他蛋白质的大分子复合体的形成并且介导包括增殖、粘附、运动以及分化在内不同的功能。一些四旋蛋白广泛地表达于成人组织中，而其他四旋蛋白(包括CD82、CD151以及CD37)表现出更受限的表达谱并且高表达于免疫***的特定细胞谱系中[13]。

先前有关TSPAN33的报道

TSPAN33先前被报道为Penumbra(原成红细胞nu膜)，这是因为它最初是在鼠类骨髓中红细胞祖细胞的亚群中被检测到的，这表明它参与造血[14]。Tspan33在小鼠骨髓中的表达是在骨髓细胞的TER119+部分(成红细胞)中被检测到，但是没有在中性粒细胞、T细胞、单核细胞、NK细胞、或(休止)B细胞中检测到[14]。实际上，它在小鼠CFU前红系细胞以及小鼠骨髓中表达[15]。这些结果可通过这些Tspan33+红细胞祖细胞对总骨髓RNA所造成的小的影响来解释。有趣的是，Heikens等[14]产生了Tspan33-/-小鼠，并且这些小鼠中的一些在3个月内表现出异常的红细胞生成并且在1岁时表现出脾肿大。然而，如我们在此所证实，TSPAN33在正常的人类骨髓中的表达是非常低的(图3)并且相反，由活化的B淋巴细胞特异性地并且强烈地表达。

方法

我们已经确认TSPAN33在小鼠B细胞和人类B细胞这两者中表达。综上所述，这些结果表明TSPAN33是活化B细胞的新型标志物。与在休止B细胞和活化B细胞这两者上存在的其他B细胞特异性抗原(即CD20、CD19)对比，TSPAN33仅由活化的B细胞表达。我们随后试图确定TSPAN33是否还在涉及活化的恶性B细胞的人类疾病中表达。为此，我们测量了TSPAN33在霍奇金氏淋巴瘤(HL)、各种类型的非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)以及两种自身免疫性疾病，即全身性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎(RA)中的表达。

实施例3

方法

微阵列分析

基因表达的身体指数数据库(BIGE)的产生已经有所描述[9-10]。简单地说，在死后3-5小时之间从4名男性和4名女性人类供体获得总RNA，或使用可商购获得的人类组织RNA(加利福尼亚州帕洛阿尔托的Clontech公司(Clontech,PaloAlto,CA))扩充总RNA。使用Affymetrix人类基因组U133Plus2.0基因阵列(加利福尼亚州圣克拉拉的Affymetrix公司(Affymetrix,SantaClara,CA))获得全基因组基因表达数据，并且在阵列辅助软件(ArrayAssistsoftware)(加利福尼亚州拉霍亚的IobionLabs公司(IobionLabs,LaJolla,CA))中进行数据归一化和汇总。

qRT-PCR

使用试剂盒，根据制造商的说明书(加利福尼亚州的快而精公司(Qiagen,CA))从人类细胞系/细胞或组织中分离RNA。使用逆转录(加利福尼亚州的快而精公司)使RNA转化成cDNA。使用Roche480实时PCR***，用被设计成检测TSPAN33、CD19、CD20、CD138以及GAPDH的探针(加利福尼亚州普莱森顿的罗氏公司(Roche,Pleasanton,CA))进行qPCR。使用具有SEQIDNO:4至5中的序列的TSPAN33的引物。

对TSPAN33蛋白质的检测

使用针对人类β肌动蛋白(加利福尼亚州圣克鲁斯的圣克鲁斯生物科技公司(SantaCruzbiotech,SantaCruz,CA))、β微管蛋白(加利福尼亚州圣安娜的MPBiomedicals公司(MPBiomedicals,SantaAna,CA))以及Tspan33/TSPAN33(马萨诸塞州剑桥的Abcam公司(Abcam,Cambridge,MA))的多克隆兔抗体进行蛋白质印迹。

细胞系

人类B细胞系2E2已经有所描述[16]。从ATCC(弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA))获得人类T细胞系Jurkat。鼠类细胞系A20-2J已经有所描述[17]。所有的DLBCL细胞系均是DavidFruman(加州大学欧文分校免疫研究所(UCIrvineInstituteforImmunology))的惠赠。通过菲科尔密度梯度(Ficolldensitygradient)分离来自人类供体的PBMC。使用菲科尔密度梯度分离富集小鼠脾脏B细胞，继而使用涂有抗CD3mAb(加利福尼亚州圣地亚哥的Biolegend公司(Biolegend,SanDiego,CA))和抗CD11cmAb(Biolegend公司)的培养板淘选。简单地说，在37℃下，将10cm的组织培养板涂布以抗CD3和抗CD11c，持续2小时。将通过菲科尔密度梯度分离所分离的脾细胞在经过涂布的培养板上孵育2小时并且收集未贴壁细胞并且使所述细胞通过第二轮富集。

试剂

使用LPS(密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich,StLouis,MO))+小鼠或人类rIL-4(西格玛公司(Sigma))、抗CD40mAb克隆G38.5(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))+rIL-4或CpG+美洲商陆有丝***原(PWM)+pansorbin(西格玛公司)刺激B细胞。使用抗CD3mAb+抗CD28mAb(Biolegend公司)或佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)+离子霉素(西格玛公司)刺激T细胞。

小鼠

从杰克逊实验室公司(JacksonLaboratory，缅因州的巴港(BarHarbor,ME))获得C57Bl/6j(种群编号：000664)和MRL/fas^lpr/lpr小鼠(种群编号：000485)。所有的动物方案得到了加州大学欧文分校(UniversityofCalifornia,Irvine)的实验动物护理和使用委员会(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee，IACUC)的批准。

人类样品

从通过静脉穿刺来自狼疮患者或正常受试者的外周血液中获得人类PBMC。这个方案得到了INNCMSZ的伦理审查委员会(InstitutionalReviewBoard，IRB)的批准并且遵循知情同意书获得样品。狼疮患者满足至少四条1982年美国风湿病协会(AmericanRheumatismAssociation)修订的SLE标准[18]。使用SLE疾病活动指数或SLEDAI对临床疾病活动进行评分[19]。对照有非活动性疾病(SLEDAI<3)并且指数高于3的患有活动性疾病的患者被认为患有活动性疾病。使用M-MLV逆转录酶，根据制造商的说明书(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)制备cDNA。

组织阵列

由尸体解剖获得用于免疫组织化学的人类组织样品并且所述样品代表来自UANL的大学医院(UniversityHospital)的解剖和病理科(AnatomyandPathologyService)的存档样品。在使用蛋白酶和/或热处理进行抗原修复(暴露)之后，对正常的人类肾脏或人类淋巴瘤活检进行组织阵列，包括6名HL患者、6名滤泡性淋巴瘤患者、6名DLBCL患者、以及2种套细胞淋巴瘤，如所述[20]。然后将切片使用抗TSPAN33抗体染色，继而使用二级驴抗兔IgG酶缀合物(Abcam公司)染色。

统计分析

使用斯氏T检验计算统计显著性。p<0.05的值被认为具有统计显著性。误差棒表示标准偏差(SD)。

实施例4

TSPAN33在活化的B细胞中高表达

我们经由在BIGE数据库中对TSPAN33的表达进行的分析(图3)将TSPAN33鉴定为B细胞活化特异性标志物。它的表达谱表明特异性的和限制性的表达，其中在用抗CD40和IL-4活化的外周血液B细胞中观测到最高的水平，其次是肾脏(表I列出了Tspan33表达排名前十的部位；完整清单示于补充信息(SI1)中)。使用对人类RNA进行的qRT-PCR(SI2A)来确认来自BIGE数据库的Tspan33表达模式，其中在包括骨髓、胸腺以及脾脏在内的大部分的其他组织中有低表达或不可检出的表达。

表1：在人类中TSPAN33表达排名前十的部位。

上表示出了从最高平均强度向最低平均强度排序的TSPAN33表达前十名的部位。数据源自于图3中所示的BIGE数据库。

为了确认微阵列数据，我们对从PBMC分离的处在休止或活化(抗CD40+IL-4)状态下的人类B细胞以及人类骨髓进行Tspan33mRNA的qRT-PCR(图4A)。尽管Tspan33最初被鉴定为在小鼠骨髓中的红细胞祖细胞的子集中表达[14]，但我们没有在人类骨髓中检测到显著的Tspan33表达(图4A)。活化B细胞中的Tspan33水平是休止B细胞(p＝0.0204)或整个骨髓中的Tspan33水平的超过40倍。由于直到最近才对Tspan33进行研究，因此没有很多可供使用的试剂(包括抗体)。然而，我们获得了抗TSPAN33多克隆抗体(Abcam公司)，所述抗体在蛋白质印迹和免疫组织化学(IHC)(在表位修复后)中起作用，但没有用于FACS分析(数据未示)。使用这种抗体，我们观测到在活化的人类PBMC中TSPAN33蛋白质表达显著增加(图4B)。光密度分析揭示在受到刺激的PBMC样品中，相比于在未受刺激的PBMC样品中，TSPAN33蛋白质表达增加到约5倍。

人类2E2B细胞系是可诱导的B细胞活化和分化的模型[16]。它在未受刺激的状态下表达IgM和IgD并且在用抗CD40mAb+IL-4刺激后，它容易使活化诱导的胞苷脱氨酶(Aicda)上调以诱导类别转换成下游同种型(活化的量度)[21-22]。使用qRT-PCR，我们观测到与未受刺激的2E2细胞相比，在用抗CD40+IL-4刺激12小时之后Tspan33mRNA水平显著增加(p＝0.013)(图4C)，并且升高的Tspan33转录物水平在刺激之后长达120小时内保持很高。相反，Tspan33表达在休止的抗CD3+抗CD28或PMA+离子霉素刺激的Jurkat细胞(人类T细胞白血病)中不可检测出。通过蛋白质印迹确认Tspan33在2E2细胞中增加的表达，在使用多克隆抗Tspan33抗体时观测到增加到>3倍(通过光密度测定法)(图4D)。还在小鼠组织中使用qRT-PCR测量Tspan33表达(SI2B)并且结果确认人类表达谱。我们还观测到在鼠类B细胞系A20-2J中在用递增浓度的LPS+IL-4刺激后并且通过qRT-PCR所测量Tspan33mRNA表达呈剂量依赖性增加(图4E)。在A20-2J中在0.1ng/mLLPS+IL-4刺激的情况下Tspan33转录增加到超过50倍(p＝0.0014)并且在1ng/mL或10ng/mlLPS+IL-4下增加到超过100倍(p＝0.011和p＝0.045)。此外，将小鼠脾脏B细胞通过菲科尔密度梯度分离而分离并且通过用抗CD3和抗CD11c淘选来富集[23]。将富集的B细胞用10ng/mL的LPS+IL-4刺激12小时并且通过qRT-PCR分析Tspan33的表达。如图4F中所示，与休止状态相比，在LPS刺激后，Tspan33转录增加到约4倍(p＝0.00003)。我们应当指出的是，我们还在各种刺激条件下对总小鼠脾细胞进行qRT-PCR并且在用CD40L+IL-4或用抗IgD+IL-4刺激脾细胞时观测到Tspan33表达的显著上调，但在用抗CD3+抗CD28(其刺激T细胞)刺激时没有观测到(数据未示)。综上所述，这些结果表明TSPAN33是小鼠和人类这两者中活化的B细胞的新型标志物。

TSPAN33由恶性B细胞表达

B细胞活化标志物作为诊断工具是重要的，这是因为这些分子中的一些的水平，如sCD23、sCD27、sCD30、sCD44、CXCL13、IL-6以及IL-10[24-25]的血清水平升高已经被报道与癌症(例如NHL)有关。其他已知的B细胞抗原(即CD19和CD20)也在NHL中高表达[26]。我们因此假设TSPAN33也将在人类淋巴瘤中表达。为了对此进行测试，我们在11种细胞系中进行了Tspan33表达的qRT-PCR并且将它与ms4a1(CD20)比较，这11种细胞系包括被表征为DLBCL的NHL细胞系(OCI-LY1、OCI-LY7、OCI-LY8、RC-K8、SU-DHL-2、SU-DHL4、SU-DHL-5、SU-DHL-6、SU-DHL-7和SU-DHL-8以及VAL)、以及未受刺激或受刺激(抗CD40mAb+IL-4)的2E2细胞(图5A)。DLBCL是侵袭性NHL的最常见的类型并且代表具有大B细胞弥漫性增殖的共同特征的一组异质的淋巴瘤，所述大B细胞具有是正常淋巴细胞的尺寸的至少两倍的核[27]。DLBCL可以包括生发中心母细胞(centroblast)、免疫母细胞、或退行性变体(类似于HL的高度活化的李-施二氏细胞)并且具有>90％的增殖指数[28]。还在这些淋巴瘤细胞系中测量了ms4a1/CD20mRNA水平以将它的表达与Tspan33比较。在所有DLBCL细胞系中检测ms4a1/CD20和Tspan33这两者。实际上，在DLBCL中，Tspan33表达水平与CD20相当。

与DLBCL对比，伯基特氏淋巴瘤(BL)具有生发中心表型[21]，包括具有圆形、中等大小形态的CD10⁺、BCL6⁺以及BCL2⁺不同的表型，具有100％的增殖指数[29]并且可以表达CD20[28]。为了研究TSPAN33在伯基特氏淋巴瘤中的表达，我们对包括Raji、Ramos以及Daudi在内的多种伯基特氏淋巴瘤细胞系以及作为对照的小鼠Baf3细胞(祖B细胞系)进行RT-PCR和蛋白质印迹(图5B和5C)。在所有的伯基特氏淋巴瘤细胞系中在mRNA水平和蛋白质水平这两者上均检测到TSPAN33表达，但在BaF3细胞中没有检测到。我们得出的结论是，TSPAN33也在人类伯基特氏淋巴瘤中表达。

为了进一步表征TSPAN33在其他B细胞淋巴瘤中的表达，我们试图对由被诊断患有DLBCL(n＝6)、套细胞淋巴瘤(另一类型的NHL，n＝2)、滤泡性淋巴瘤(第二最常见类型的惰性NHL，n＝6)以及HL(n＝6)的患者的活检制备的组织阵列进行免疫组织化学(IHC)。表2和图6示出了来自患有HL、DLBCL或套细胞淋巴瘤的患者的***的代表性图像。在HL中，Tspan33在李-施二氏细胞(霍奇金氏淋巴瘤的特征性细胞)中高表达，而DLBCL的TSPAN33染色也均一地呈阳性，这与图5中所示的qPCR数据一致。套细胞淋巴瘤的TSPAN33染色呈阴性。李-施二氏细胞被认为源自于已经发生体细胞超突变并且未能进行细胞凋亡的生发中心B细胞，并且因此可以代表淋巴瘤的活化形式[30]。DLBCL已经在上文有所描述。另一方面，套细胞淋巴瘤是被认为源自于初始的生发中心前淋巴细胞的成熟CD5⁺B细胞淋巴瘤的一种类型，并且可以代表未活化的B淋巴细胞的形式[31]。在TSPAN33水平上的这些差异可以反映每一种B细胞淋巴瘤的活化或分化状态。另一方面，TSPAN33在每一种淋巴瘤中的表达表明它可以代表可以反映每一种淋巴瘤的侵袭性或可以用作预后因子的另一种生物标志物[32-33]。

表2：TSPAN33在人类淋巴瘤中的表达。

上表示出了取自被诊断患有HL(n＝6)、DLBCL(n＝6)、以及套细胞淋巴瘤(n＝2)的单个患者的人类活检的组织阵列上TSPAN33表达的IHC染色的结果。还指示了患者的总数和染色模式。

TSPAN33在全身性红斑狼疮和类风湿性关节炎病变中表达

B细胞活化的标志物还与某些自身免疫性疾病相关。举例来说，CD25、HLA-DR、CD38、以及BLyS在临床SLE中均升高并且与自身抗体的产生相关[34-35]。在新诊断患有RA的患者中，血清免疫球蛋白水平和B细胞相关的细胞因子IL-6、IL-21以及BLyS均显著升高[36-38]。阻断BLyS使得MRL/fas^lpr/lpr小鼠(可溶性TACI)的疾病症状减轻[39]并且还在人类中提供治疗益处(抗BLySmAb：贝利单抗(Benlysta))[40]。为了阐明Tspan33在自身免疫性疾病中的作用，我们测量了来自SLE患者的PBMC中、RA滑膜病变中或小鼠SLE模型中Tspan33mRNA的表达。

MRL/fas^lpr/lpr小鼠产生自发的并且进行性的全身性自身免疫性综合征，所述综合征与人类SLE和RA共有许多特征，包括B细胞活化失调、抗体和自身抗体产生升高、炎症、以及免疫复合物沉积在肾脏中，这会引起致命的肾小球肾炎[39-40]。MRL/fas^lpr/lpr小鼠和人类SLE中B细胞的异常活化引起Aicda表达升高，从而产生病原性类别转换和超突变的抗体，所述抗体介导组织和器官损伤[39,41]。MRL/fas^lpr/lpr小鼠到16周大时产生高滴度的自身抗体和严重的肾脏损伤[42]。因此，B细胞在狼疮发病中经由抗体依赖性和非抗体依赖性这两种机制而起重要的作用[43]。

我们测量了来自9周、24周以及36周大的MRL/fas^lpr/lpr小鼠的脾细胞中Tspan33mRNA的表达，并且将它针对CD19归一化以探究B细胞的作用(图7A)。我们发现24周大的MRL/fas^lpr/lpr小鼠已经表现出广泛的狼疮症状，包括皮肤病变、自身抗体、以及肾脏病变，它们的Tspan33mRNA表达在与它们的9周大的对应小鼠相比时增加到约10倍(p＝0.016)，所述9周大的对应小鼠尚未显示出明显的病理体征(尽管一些B细胞可能在9周时已经活化，但MRL/fas^lpr/lpr到30周大时表现出90％的死亡率，其中少数存活的小鼠表现出细胞因子和趋化因子水平的显著失调)[42]。36周大的MRL/fas^lpr/lpr小鼠的Tspan33转录物表达进一步增加(与24周大的小鼠相比)，尽管这种增加不具统计显著性(p＝0.062)。综上所述，这些观测结果强烈地表明TSPAN33在SLE的发病中的重要作用。

由于狼疮发病并不仅仅由B细胞导致，因此我们试图确定在MRL/fas^lpr/lpr小鼠中在狼疮疾病期间的TSPAN33上调是否与浆细胞有关。为了解决这个问题，我们对来自12周大的雄性和雌性MRL/fas^lpr/lpr小鼠的脾细胞针对CD19⁺CD138^-B细胞和CD19^-CD138⁺浆细胞进行FACS分选并且通过qRT-PCR分析Tspan33表达(图7B)。在来自12周大的雌性MRL/fas^lpr/lpr小鼠的CD19⁺B细胞中，相对于它们的雄性对应小鼠，Tspan33表达显著上调(p＝0.004)(类似于人类疾病，在MRL/fas^lpr/lpr小鼠中，雌性比雄性更易患狼疮样疾病，更早发病)。此外，Tspan33不在CD138⁺细胞中表达，这表明它的表达限于活化的B细胞，但没有扩展到终末分化的B细胞(浆细胞)。对这一结论的进一步支持来自于BIGE数据库中浆细胞特异性标志物的表达。举例来说，B细胞成熟抗原(BCMA)是由浆细胞表达的BLyS和APRIL的受体[44]。在BIGE数据库中，BCMA在人类扁桃体、支气管以及气管中强烈地表达，这表明这些组织含有显著数目的浆细胞(数据未示)；相比之下，在这些组织中TSPAN33表达低或不存在(图11和SI1)。我们得出的结论是TSPAN33不可能由浆细胞表达。这与在分化成浆细胞/记忆细胞后降低的其他B细胞活化标志物一致[45-47]。

为了确认TSPAN33活化在人类SLE中的可能的作用，我们通过qRT-PCR在来自9名健康受试者或9名SLE患者的PBMC中测量了Tspan33mRNA的表达(图7C)。来自SLE患者的PBMC的Tspan33mRNA的表达增加到>3倍(p＝0.038)。这些结果表明TSPAN33在人类SLE中升高。

我们随后试图研究活化B细胞在RA中可能的作用。为此，我们分析了由患有这种疾病的患者的滑膜产生的RA微阵列数据库中TSPAN33mRNA的表达[48]。在RA患者中，TSPAN33(p＝0.0019)和CD20(p＝0.0008)这两者的转录物的水平均升高(图7D)。已经报道，在RA关节滑膜中升高的最高基因包括多种B细胞活化标志物，包括免疫球蛋白轻链和重链基因，以及靶向B细胞的基因，如BLyS和CXCL13[48]。这些观测结果与先前已经证实了活化的B细胞在RA病变中的作用[49-50]以及抗CD20(利妥昔单抗)是一种有效的RA治疗的事实[51-52]的报道一致。

肾脏中的TSPAN33表达

如图3和SI2A中所示，TSPAN33mRNA还可通过微阵列和qPCR这两者在肾脏中检测出。鉴于肾脏的重要生理作用，我们试图确定肾脏内TSPAN33表达的位置。为此，我们进行免疫组织化学以在正常的人类肾脏切片中检测TSPAN33(图8A-8D)，所述切片包括其中存在淋巴浸润的肾脏组织切片(图8A)。在近曲小管、远曲小管以及集合管(图8B-8C)中检测到TSPAN33染色，但在浸润的淋巴细胞(结果与先前的实验一致)或肾小球中没有检测到。更高的放大倍数揭示TSPAN33在近曲小管的上皮刷状缘细胞的顶膜和颗粒处表达(图8D)。这些结果支持了TSPAN33作为治疗性抗体研发的靶标，这是因为这些部位通常不易由抗体到达。

讨论

概述

我们已经发现四旋蛋白家族的一个成员(TSPAN33)是B细胞活化标志物，这是因为它强烈地表达于活化的B细胞中，并且还在多种淋巴瘤和涉及病原性B细胞的自身免疫性疾病(包括SLE和RA)中表达。

TSPAN33作为新型B细胞活化生物标志物

许多标志物，包括CD72、CD20、CD19以及CD24当前被用于鉴定和跟踪B细胞[53]。据报道，活化的生发中心B细胞表达多种基因，包括GL7[54]、CD10以及BCL6[55]。其他B细胞活化标志物，如MUM1/IRF4和FOXP1以及CD23、CD69和全身性B细胞活化标志物CXCL13、sCD23、sCD27、sCD30、sCD44在NHL和RA的诊断和风险评估中已经被用作标志物[25,32,56]。重要的是，这些活化标志物中没有一种是仅在活化的B细胞上表达的，这是因为它们还与外周中的其他免疫细胞类型有关。因此，TSPAN33代表可以用作涉及B细胞活化的疾病的诊断工具的B细胞特异性活化标志物。在淋巴瘤和自身免疫性疾病这两者中使用TSPAN33表达作为潜在的预后生物标志物的可能性值得进一步研究[57-59]。

TSPAN33作为针对恶性B细胞的治疗性mAb的靶标

除了使用TSPAN33作为B细胞活化标志物之外，TSPAN33还是四旋蛋白家族的第33个成员(TSPAN33)，并且因此是跨膜蛋白。这使得TSPAN33成为用于产生抗TSPAN33mAb以实现治疗目的的合适的候选物。CD20是现在归属于跨膜结构域4超家族(MS4A1)的密切相关的蛋白，是用于产生治疗性单克隆抗体的重要靶标的实例，所述治疗性单克隆抗体已经被证实有效治疗B细胞恶性肿瘤，如NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及某些自身免疫性疾病，包括RA[51-52,60]。然而，由于CD20在休止的B细胞和活化的B细胞这两者上表达，因此抗CD20mAb疗法会引起外周血液中所有的B细胞以及骨髓中70％的B细胞耗竭[25,36,61]。因此，对限于活化的B细胞的B细胞标志物(如TSPAN33)的鉴定可以代表用于研发治疗B细胞相关病变的“第二代”mAb的一种替代性策略[32]。其他四旋蛋白(CD151)正在作为可能的治疗性抗体靶标而被研究[62]。我们的数据强烈地表明抗TSPAN33治疗性mAb将具有避免所治疗的患者体内大多数的休止B细胞耗竭的重要优势。

TSPAN33表达的其他部位

TSPAN33先前被报道为Penumbra(原成红细胞nu膜)，这是因为它最初被鉴定为在骨髓中的小红细胞祖细胞群体中表达的分子[14]。鉴于这种表达模式，它被描述成在造血中起作用。Tspan33^-/-小鼠已有所描述[14]并且它们中的一些在3个月大时产生异常的红细胞。获得性纯红细胞再生障碍性贫血是人类的一种相关的病况，其中患者缺少成红细胞并且根据病因，可能是自限性的[63]。这些观测结果表明在人类中暂时抑制TSPAN33可能有受限的或可管理的副作用。

在使用抗TSPAN33mAb作为人类治疗剂时另一可能的并发症是它在肾脏中的表达。然而，它在那里的表达模式表明这将不构成显著的障碍，这是因为Tspan33不在肾小球中表达(图8B)，而相反由近曲小管和远曲小管中的上皮细胞表达(图8B-8C)。通常由于尺寸排阻而阻止抗体到达这些部位，这是因为只有更小分子量的蛋白质(如白蛋白(约67KD)或血红蛋白(约68KD))可渗透穿过肾小球屏障[64]。在肾脏的上皮细胞的顶面和颗粒中观测到TSPAN33蛋白质的表达并且这些细胞涉及分泌和吸收小蛋白质、离子、以及有机溶质(葡萄糖和氨基酸)，这表明TSPAN33在尿液滤过期间可能参与囊泡运输和/或信号转导[12]。此外，已经报道，肾脏上皮细胞对基于生物的细胞毒性剂无感受性并且肾细胞癌还对ADCC(抗体依赖性细胞毒性)具有抗性[65]。最终，已经报道，Tspan33^-/-小鼠是可存活的并且能繁殖的[14]，这表明Tspan33的不存在对肾脏功能造成有限的生理影响。

Tspan33在B细胞活化中的功能

尽管Tspan33在B细胞中的功能当前是未知的，但是在B细胞活化后Tspan33表达被强烈地诱导则有力地表明它可能涉及B细胞信号转导/活化(即CD9和CD81)、成熟/存活(即CD37)、或抗原呈递(即CD63)，这是因为其他B细胞表达的四旋蛋白已知参与这些过程[66-69]。

总结

我们得出的结论是TSPAN33代表活化和恶性B细胞的一种潜在重要的生物标志物以及研发用于治疗多种类型的B细胞淋巴瘤(DLBCL、BL、HL)以及与病原性B细胞相关的显示出活化B细胞表型的一些自身免疫性疾病(SLE和RA)的治疗性mAb的潜在靶标。

实施例5

在实施例中所提到的以下出版物以引用的方式并入本文：

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除非上下文另外明确规定，否则在权利要求书和说明这两者中，单数形式“一个/种”和“所述”的使用包括多个指代物。

尽管已经结合优选的实施方案描述了本发明，但应当了解的是，可以利用改动方案和变化方案而不背离本发明的原理和范围，这是因为本领域技术人员将容易理解。因此，这些改动方案可以在本发明和以下权利要求书的范围内被实施。

Claims (20)

1.一种治疗其中TSPAN33上调的淋巴瘤或白血病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗所述淋巴瘤或白血病的量的抗TSPAN33抗体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前体T细胞白血病/淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病/淋巴瘤、MALT淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、非特指性外周T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤的结节硬化形式、或霍奇金淋巴瘤的混合细胞亚型。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述施用引起所述患者的TSPAN33+B细胞的数目减少。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述抗TSPAN33抗体是单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合。

6.一种治疗其中TSPAN33上调的免疫性疾病的方法，所述方法包括向需要这种治疗的患者施用有效治疗所述免疫性疾病的量的抗TSPAN33抗体。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述免疫性疾病是过敏或自身免疫性疾病。

8.如权利要求6所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎、银屑病、特应性皮炎、舍格伦综合征、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、硬皮病、过敏性肺炎、自身免疫性甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、强直性脊柱炎、乳糜泻、特发性血小板减少性紫癜、混合型***病、多发性硬化、多发性骨髓瘤、寻常天疱疮、颞动脉炎、白斑病、或全身性红斑狼疮。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述疾病是类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮。

10.如权利要求6所述的方法，其中所述施用引起所述患者的TSPAN33+B细胞的数目减少。

11.如权利要求6中任一项所述的方法，其中所述抗TSPAN33抗体是单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合。

12.一种将活化的B淋巴细胞纯化的方法，所述方法包括将抗TSPAN33抗体与含有淋巴细胞的细胞制备物混合，以及分离由所述抗体结合的淋巴细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述抗TSPAN33抗体是单克隆抗体、中和抗体、或人源化抗体、或其组合。

14.如权利要求12所述的方法，其中所述分离是通过荧光活化细胞分选来进行。

15.一种鉴定活化和/或病变的B淋巴细胞的方法，所述方法包括检测所述淋巴细胞中TSPAN33的表达上调。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述检测包括

将抗TSPAN33抗体添加到包含所述淋巴细胞的蛋白质的样品中，

在所述样品中存在TSPAN33时所述抗体与TSPAN33之间形成免疫复合物，以及

检测所述免疫复合物。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述检测包括

由所述淋巴细胞的RNA制备cDNA，

使用对所述TSPAN33基因中的核苷酸序列具有特异性的引物将所述cDNA扩增，或使所述cDNA与所述TSPAN33基因的核苷酸序列杂交，以及

检测所述扩增反应的扩增产物或检测所述cDNA与所述TSPAN33核苷酸序列之间的杂交体。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述淋巴细胞来自于患者，并且所述方法还包括在检测到TSPAN33的表达上调时向所述患者施用抗TSPAN33抗体。

19.一种诊断涉及活化和/或病变的B淋巴细胞的淋巴瘤或免疫性疾病的方法，所述方法包括

分析患者的样品中活化和/或病变的B淋巴细胞的存在，所述分析是通过根据权利要求15所述的方法检测所述样品的淋巴细胞中TSPAN33的表达上调来进行，

其中在检测到所述活化和/或病变的B淋巴细胞时，将所述患者诊断为患有所述淋巴瘤或免疫性疾病。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述疾病是霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、类风湿性关节炎或全身性红斑狼疮。