CN1054881C

CN1054881C - 含虫光素酶基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法

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Publication number: CN1054881C
Application number: CN93117156A
Authority: CN
Inventors: 金振华; 陆建荣; 杨建�
Original assignee: Institute of Developmental Biology of CAS
Current assignee: Shenyang Zhongke Liangma Bioengineering Co ltd
Priority date: 1993-09-11
Filing date: 1993-09-11
Publication date: 2000-07-26
Anticipated expiration: 2013-09-11
Also published as: CN1083529A

Abstract

本发明属基因工程领域，涉及含虫光素酶重组基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法：将取自P^SV-luc20虫光素酶基团整合到带信号肽的表达质粒P^{IN-III-compA3}，构建成新型重组DNA并将其转化大肠杆菌JM101，获得能产生有催化活性的虫光素酶基因的新型菌株Escherichia coli JM101 Lus-J-1，保藏号CGMCC NO.0199，利用该菌株经发酵培养法可生产虫光素酶，此法具有生产周期短，培养基成分简单，可诱导高产，酶蛋白能分泌到细胞周质区，且生产成本低，易制备、纯化等优点。

Description

含虫光素酶基因的新型菌株及虫光素酶的生产方法

本发明属基因工程领域，涉及一种含虫光素酶重组基因的新型菌株及虫光酶的生产方法。

虫光素酶是一种能将化学能转变为光能的高效生物催化剂，以荧光素、三磷酸腺苷(ATP)和氧为作用底物。它所催化的化学反应如下：

(O₂为氧气，Mg⁺⁺为二价镁离子，AMP为一磷酸腺苷，CO₂为二氧化碳)

ATP既是所有生物的能量来源又是虫光素酶的必需底物。在有过量底物的情况下，发射光强度与反应***中的酶量成正比。因此，虫光素酶是生物医学，分子生物学，法医学中超微量定量检测ATP的重要工具，具有广泛的应用价值。

1985年美国加州大学圣迭哥分校Jeffrey和Marlene曾经构建了含虫光素酶基因的重组体DNA，pkw101。Maluda等申请的欧洲专利(88112233.7)中指出，他们曾构建造了含虫光索酶基因的重组体DNA，P^ALF3和p^GLF1。他们都从含有上述重组体DNA的大肠杆菌转化体中分离到能生产虫光素酶的菌株。前者在细菌的培养过程中，要经过45℃热诱导30分钟的处理，再转到37℃培养才能产酶。但二者都只能形成胞内酶，要采用不同方法破碎细胞才能将酶提取出来，1989年日本专利(PCT/JP89/00811)的申请者曾从海洋甲壳类动物中获得荧光素酶基因，并构建了重组体DNA，p^MT-CLP，在大肠杆菌中同样只能形成胞内酶。只有将重组DNA，P^MFE3引入酵母后才得到能产生分泌酶的菌株，但培养基成分较大肠杆菌的复杂，而且，不是虫光索酶。

本发明目的在于提供一种用取自P^SV-LUC20的萤火虫荧光素酶(也称虫光素酶)基因克隆到分泌型表达质粒p^IN-III-ompA3中，构建成新型的重组体DNA，将该重组体DNA转化大肠杆菌JM101，获得能高产有催化活性的虫光素酶，并将产物分泌到细胞周质区的基因工程菌株，以及用该基因工程菌株生产虫光素酶的新方法。

与上述已有产荧光素酶菌株比较，利用本发明的新型基因工程菌株(CGMCC NO.0199)，除了具有高产活性虫光素酶，酶产物能在信号肽ompA作用下，分泌到细胞周质区两大优点外，同时具备生产周期短，培养基成份简单，酶的制备和纯化容易等优点。

本发明实施方案如下：

本发明提供的含虫光素酶重组基因的新型菌株，其特征在于：为Escherichia coliJM101改造菌株Lus-J-1，该菌株1993年8月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0199；

用取自P^SV-luc20(金振华、陆德裕等，萤火虫荧光素酶基因在瓜蟾***中的表达，《生物工程学报》7(4)：P318-322，1991)的虫光素酶基因整合到含信号肽的分泌型表达质粒p^IN-III-ompA3(Ghrayeb，J.，Kimura，H.，et.al，EMBO J，3：2437-2442，1984)，构成新型重组DNA，并将其转化大肠杆菌JM101(购自美国promega公司)获得能经发酵培养产生有催化活性的虫光素酶并将产物分泌到细胞周质区的基因工程菌株。

本发明以大肠杆菌JM101为转化受体，大肠杆菌系细菌基因工程中应用最广泛的无毒肠道杆菌，属革兰氏阴性，在LB固体培养基中，37℃生长能形成乳白带黄，周边平滑、略有光泽的菌落，并敏感氨苄青霉素等抗菌素，不能产生虫光素酶。本发明所提供的被命名为Lus-J-1或Lus-J-2的产虫光素酶基因工程菌株，除具上述特性外，还具备抗氨苄青霉素，能在上述培基中产生大量具有催化活性的虫光素酶。由于，虫光素酶基因处于乳糖操纵子Lacz的控制之下，因此，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)能促进虫光素酶基因的转录，从而明显提高虫光素酶的产量，同时由于在虫光素酶基因上游含有编码信号肽ompA的DNA序列，所以，虫光素酶能在信号肽作用下，通过细胞质膜分泌到周质区。

本发明提供的用上述含虫光素酶重组基因的新型菌株生产虫光素酶的生产方法，其特征在于步骤如下：

1)构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒

2)将重组质粒DNA转化大肠杆菌，分离抗氨苄青霉素转化体

3)通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落

4)从杂交阳性菌落制备重组质粒，鉴定虫光素酶基因的连接位向

5)含虫光素酶基因工程菌株生长和诱导

6)虫光素酶制品的制备

其中：

1)构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒：

(1)取1-3μg的P^IN-III-ompA3质粒DNA，用限制酶EeoRI(购自美国promega公司)消化，贮存备用；

(2)取上述质粒DNA，在有dNTP(四种脱氧核糖核苷酸)的条件下，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow(购自美国promega公司)片段处理上述质粒，使其填补成平末端，低温存放备用；

(3)取1-2μg的p^sv-luc20质粒DNA，用限制酶BsmI(购自美国promega公司)消化，经琼脂糖凝胶电泳分离取得2137bp的虫光素酶基因，在有dNTP(四种脱氧核糖核苷酸)的条件下，用T4 DNA聚合酶(购自美国promega公司)将其删除成2133bp的平末端片段，离心收集，贮存备用；

(4)在T4连接酶(购自美国promega公司)作用下，将经上述处理得到的虫光素酶基因与P^IN-III-ompA3连接，得到含虫光素酶重组基因的分泌型表达质粒；

2)将上述质粒转化大肠杆菌JM101感受态细胞(购自美国promega公司)，用含氨苄青霉素的LBA培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，PH7.3，补充终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素平皿，分离抗氨苄青霉素(Amp^R)的转化体；

3)通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落：

(1)制备³²P-标记的杂交探针，即通过随机引物标记步骤，用随机引物DNA标记试剂盒(购自德国Boehringer公司)，以³²P-dCTP(购自美国Dupout NEN公司)标记0.2μg虫光素酶基因2.1kb作为杂交探针，其比强＞7×10⁶cpm；

(2)用尼龙膜(Amersham公司产品Hybond-N)膜上印迹杂交步骤进行原位杂交，选出杂交阳性菌落；

4)由杂交阳性菌落制备重组质粒，鉴定虫光素酶基因的连接位向：

采用硷法快速抽提步骤，从杂交阳性菌落中制备质粒，经限制酶XbaI(购自美国promega公司)消化，经琼脂糖凝胶电脉鉴定，两种转化体的重组质粒中均出现9.4kb和0.2kb两种带，证明它们的虫光素酶基因拥有正确位向，分别被命名为大肠杆菌Lus-J-1和Lus-J-2，这是两个独立的，但性能相同的菌株；

5)含虫光素酶的基因工程菌株的生长和诱导：

挑取Lus-J-1或Lus-J-2的单菌落作为种子，按1％的接种量接种到新鲜的LBA培养基中，37℃振荡培养2.5小时后，即进入对数生长期，此时，再加入终浓度为2mM的IPIG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的诱导，促进虫光素酶产量显著提高。

6)虫光素酶制品的制备：

(1)上述对数生长期的含虫光素酶基因的工程菌株Lus-J-1或Lus-J-2培养物，于离心管中，5000rpm下离心2分钟，细胞沉淀置碎冰浴；

(2)用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后重新悬浮在蔗糖溶液中；

(3)于上述悬浮液中加入一定量的0.5MEDTA，pH8.0，再置冰浴若干分钟，于5000rpm下，离心5分钟，弃去上清；

(4)将沉淀的细胞再悬浮于冰冷的蒸溜水中，激烈振荡，再置冰浴若干分钟，10000rpm下，离心5分钟，取出上清部分，即为周质区提取物；

(5)将剩下的沉淀细胞悬浮于高盐溶液中若干分钟后，继续提取附着于周质区的分泌蛋白，离心所收集的上清液与前一周质区抽提物合并，即获得虫光素酶制品。

下面结合附图及实施例进一步详细描述本发明：

附图1本发明重组质粒pLus-1构建的流程图：Lus：虫光素酶基因；Amp^R：抗氨苄青霉素；E：EcoRI；Bs：BsmI(购自Boehringer公司)；X：XbaI(购自promega公司)；ompA：信号肽编码序列；DNA polymerase I klenow fragment：DNA聚合酶I klenow片段；T4DNA polymerase：T4 DNA聚合酶；T4 DNA ligase：T4 DNA连接酶。

附图2所示曲线为Lus-J-1菌株(保藏号：CGMCC NO.0199)的细胞生长及IPTG诱导对虫光素酶形成的影响。用紫外光分光光度计检测不同培养时间的细胞O.D值。

Δ表示经IPTG诱导的菌体生长。

O表示未经IPTG诱导的菌体生长。

x表示虫光素酶的相对活性值。

1.构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒：

(1)取1μg P^IN-III-ompA3的质粒DNA，用限制酶EcoRI消化，使其呈线性，贮存备用；

(2)取上述质粒DNA，在有dNTP四种脱氧核糖核苷酸的条件下，用大肠杆菌DNA聚合酶I klenow片段处理，使其填补成平末端，低温存放备用；

取1μg的P^sv-luc20质粒DNA，用限制酶BsmI消化，经琼脂糖凝胶电泳分离取得2137bP的虫光酶基因，在有dNTP四种脱氧核糖核苷酸的条件下，用T4DNA聚合酶将其删除成2133bP的平末端片段，电泳收集，贮存备用；

(3)在T4连接酶作用下，将经上述处理得到的虫光素酶基因与P^IN-III-ompA3连接，以得到连接产物，即含虫光素酶基因的分泌型表达质粒。

2.将上述连接产物转化大肠杆菌JM101感受态细胞，用含氨苄青霉素(50μg/ml)的LBA培养基平皿，分离抗氨苄青霉素(Amp^R)的转化体。

3.通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落：

(1)制备³²P-标记杂交探针；即通过随机引物标记步骤(随机引物DNA标记试剂盒(购自德国Boehringer公司)，以^-32P-dCTP(购自美国Dupout NEN公司)标记0.2μg虫光素酶基因(2.1kb)作为杂交探针(比强＞7×10⁶cpm)；

(2)按尼龙膜膜上印迹杂交步骤进行原位杂交并选出杂交阳性菌落。

4.由杂交阳性菌落制备重组质粒，鉴定虫光素酶基因的连接位向：

采用碱法快速抽提步骤，从杂交阳性菌落中制备质粒。经限制酶XbaI消化、琼脂糖凝胶电泳鉴定，两个转化体的重组质粒中出现9.4kb和0.2kb两种带，它们的虫光素酶基因拥有正确位向，分别被命名为大肠被命名为大肠杆菌Lus-J-1和Lus-J-2，这是两个独立的，但性能相同的菌株。

5.含虫光素酶的基因工程菌株的生长和诱寻：

挑取Lus-J-1的单菌落接种到LB培养基中，37℃振荡培养过夜，以此为种子，按1％的接种量接到新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养2.5小时后即进入对数生长期，其生长情况见附图3。此时，如再加入终浓度为2mM的IPIG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导，可以促进虫光素酶产量提高。

6.虫光素酶制品的制备：

(1)取上述对数生长期的含虫光素酶基因的工程菌株Lus-J-1培养物，于离心管中，5000rpm下离心数分钟，细胞沉淀置碎冰浴，

(2)用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后重新悬浮在蔗糖溶液中。

(3)于上述悬浮液加入一定量的0.5MEDTA(pH8.0)，再置冰浴若干分钟，于5000rpm下，离心5分钟，弃去上清，

(4)将沉淀的细胞再悬浮于冰冷的蒸馏水中，激烈振荡，再置冰浴若干分钟，10000rpm下，离心5分钟，取出上清部分，即为周质区提取物，

(5)将剩下的沉淀细胞悬浮于高盐溶液中若干分钟后，继续提取附着于周质区的分泌蛋白，离心所收集的上清物并与前一周质区抽提物合并，即获得虫光素酶制品。

实施例1：

用本发明提供的含虫光素酶重组基因的新型菌株及方法制备虫光素酶。

1.构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒；

(1)取1μg的P^IN-III-ompA3(7.5kb)质粒DNA，用限制酶EcoRI消化，然后用浓度为0.8％的琼脂糖凝胶电泳，分离线性的质粒DNA，贮存备用；

(2)取上一步骤所得的质粒DNA，在有四种dNTP(脱氧核糖核苷酸)的条件下，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段，于37℃处理质粒使其填补成平末端。置于1.5ml塑料离心管内离心，收集此DNA，4℃存放备用。

(3)取3μg的5.9kb的P^sv-luc20质粒DNA，用限制酶Bsml消化，经琼脂糖凝胶电泳分离，取得2137bp的虫光素酶基因。该质粒DNA在有四种dNTP的条件下，用T4DNA聚合酶将其删削成2133bp的平末端片段、离心收集贮存备用。

(4)按虫光素酶基因分子数相对P^IN-III-ompA3分子数为2∶1的比例，即取0.4μg经步骤(3)处理的虫光素酶基因和0.7μg经步骤(1)(2)处理的P^IN-III-ompA3质粒DNA，在T4连接酶作用下于12℃，反应2小时，并保存此连接反应混合物，然后，约取0.3μg连接混合物，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现9.6kb的重组体DNA带，则表明连接成功。保留其余连接产物，用于转化。

用重组质粒DNA转化大肠杆菌，分离抗氨苄青霉素的转化体。

约取0.2μg从上一步骤得到的连接产物，转化大肠杆菌JM101感受态细胞，用LBA培养基(1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，PH7.3，补充终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素平皿、分离抗氨苄青霉素(AMP^R)的转化体。

3.通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落。

(1)³²P标记杂交探针的制备。通过随机引物标记步骤(随机引物DNA标记试剂盒购自德国Boehringer公司)，以^-32P-dCTP(购自美国Du pont NEN公司)标记0.2μg虫光素酶基因(2.1kb)作为杂交探针(比强＞7×10⁶cpm)。

(2)菌落原位杂交平皿的制备。将上述步骤得到的Amp^R菌落用牙签分别转移到两个平行的LBA培养基平皿上，37℃培养过夜。其中一皿用于尼龙膜印影，另一皿作为主平皿于4℃冰箱保存备用。

(3)通过影印将菌落转移到尼龙膜，并经菌落裂解使DNA吸附于尼龙膜，预杂交及杂交，淋洗膜去除非杂交同位素，用X光胶片与杂交膜作曝光处理，最后选出杂交阳性菌落。

4.从杂交阳性菌落制备重组质粒，鉴定虫光素酶基因的连接位向。

采用碱法快速抽提步骤，从杂交阳性菌落中制备质粒。取1μg质粒DNA，经限制酶XbaI消化，用1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在两个菌落转化体的重组质粒中，其虫光素酶基因以其5’端连接于启动区下游，即拥有正确位向。它们分别被定名为大肠杆菌Lus-J-1和Lus-J-2(二个独立但性能相同的菌株)。

5.含虫光素酶基因工程菌株的生长和诱导。挑取Lus-J-1(或Lus-J-2)的单菌落接种到20ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜。以此为种子，按1％的接种量接种到新鲜的LBA培养基中，37℃振荡培养2.5小时即进入对数生长期。

此时，加入终浓度为2mM的IPTG即可诱导转录并促进虫光素酶产量的提高，但不加诱导物也能产生活性虫光素酶(详见图3)。

6.虫光素酶的制备

(1)取对数生长期的含虫光素酶基因的工程菌株Lus-J-1培养物1ml，置1.5ml

小塑料离心管中，5000rpm，离心2分钟，细胞沉淀置碎冰浴，

(2)用PBS缓冲液洗涤细胞两次。然后，重新悬浮在0.15ml蔗糖溶液(20％蔗糖，10mM Tris.Cl，pH7.5)的溶液中，

(3)于上述悬液中加入5ml的0.5MEDTA(PH8.0)再置冰浴10分钟，于5000rpm离心5分钟，弃上清，

(4)沉淀的细胞重新悬浮于0.1ml冰冷的蒸馏水中，激烈振荡，再置冰浴10分钟，于10000rpm离心5分钟，取出上清部分即为周质区抽提物。

(5)剩下的沉淀细胞悬浮在0.1ml高盐溶液(1M Tris.cl，pH7.8∶1 mMEDTA)中，持续10分钟，继续抽提附着于周质区的分泌蛋白，离心收集上清并与前一周质区抽提物合并，即获得虫光素酶制品。

实施例2：

用上述实施例1所述工艺步骤，转化大肠杆菌DH5α(购自美国promega公司)、制备虫光素酶制品。

实施例3：

用上述实施例1、2所列工艺步骤，转化大肠杆菌HB101、制备虫光素酶制品。7.检测实施例1，2，3所制备的虫光素酶活性：

(1)取底物混合物100μL(含荧光素和ATP的液体)(购自美国promega公司，产品编号E1500)加入1.5ml的小塑料离心管内，平衡至室温(约20℃)。

(2)于上述离心管内加入制备好的虫光素酶制品1-5μL(视酶活性而定)用手指拍打小管混合均匀，置于液体闪烁仪(Beckman Ls6000IC)检测反应后第二分钟时(可在1至10分钟内选定检测时间)的Cpm(每分钟发射的光量子值)。以cpm值作为相对酶活性值。

(3)基因工程菌株及对照菌株的虫光素酶活性数值如下表：菌株虫光素酶活性(cpm)基因工程菌株(CGMCC No.0199) 4×10⁵-1.2×10⁶对照菌株(大肠杆菌JM101) 20-40

Claims

1.一种含虫光素酶重组基因的新型菌株，其特征在于：为Escherichia coli JM101改造菌株Lus-J-1，该菌株1993年8月4日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC NO.0199。

2.按权利要求1所述的含虫光素酶重组基因的新型菌株，其特征在于：

用取自P^SV-luc20的虫光素酶基因整合到含信号肽的分泌型表达质粒p^IN-III-ompA3，构成新型重组DNA，并将其转化大肠杆菌JM101获得

基因工程菌株。

3.一种用权利要求1所述的含虫光素酶重组基因的新型菌株生产虫光素酶的生产方法，其特征在于步骤如下：

1)构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒

2)将重组质粒DNA转化大肠杆菌，分离抗氨苄青霉素转化体

3)通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落

5)含虫光素酶基因工程菌株生长和诱导

6)虫光素酶制品的制备

其中：

1)构建含虫光素酶基因的分泌型重组质粒：

(1)取1-3μg的P^IN-III-ompA3质粒DNA，用限制酶EcoRI消化，贮存备用；

(2)取上述质粒DNA，在有dNTP四种脱氧核糖核苷酸的条件下，用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段处理上述质粒，使其填补成平末端，低温存放备用；

(3)取1-2μg的p^sv-luc20质粒DNA，用限制酶BsmI消化，经琼脂糖凝胶电泳分离取得2137bp的虫光素酶基因，在有dNTP的条件下，用T4 DNA聚合酶将其删除成2133bp的平末端片段，离心收集，贮存备用；

(4)在T4连接酶作用下，将经上述处理得到的虫光素酶基因与P^IN-III-ompA3连接，得到含虫光素酶重组基因的分泌型表达质粒；

2)将上述质粒转化大肠杆菌JM101感受态细胞，用含氨苄青霉素的LBA培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％氯化钠，pH7.3，补充终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素平皿，分离抗氨苄青霉素Amp^R的转化体；

3)通过菌落原位杂交筛选杂交阳性菌落：

(1)制备³²P-标记的杂交探针，即通过随机引物标记步骤，用随机引物DNA标记试剂盒，以³²P-dCTP标记0.2μg虫光素酶基因2.1kb作为杂交探针，其比强＞7×10⁶cpm：

(2)用尼龙膜膜上印迹杂交步骤进行原位杂交，选出杂交阳性菌落；

采用硷法快速抽提步骤，从杂交阳性菌落中制备质粒，经限制酶XbaI消化、琼脂糖凝胶电脉鉴定，两种转化体的重组质粒中均出现9.4kb和0.2 kb两种带，证明它们的虫光素酶基因拥有正确位向，分别被命名为大肠杆菌Lus-J-1和Lus-J-2，这是两个独立的，但性能相同的菌株；

5)含虫光素酶的基因工程菌株的生长和诱导：

挑取Lus-J-1或Lus-J-2的单菌落作为种子，按1％的接种量接种到新鲜的LBA培养基中，37℃振荡培养2.5小时后，即进入对数生长期，此时，再加入终浓度为2mM的IPIG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导，促进虫光素酶产量显著提高。

6)虫光素酶制品的制备：

(2)用PBS缓冲液洗涤细胞两次，然后重新悬浮在蔗糖溶液中：