CN105483190B - 酿酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸产量的方法 - Google Patents
酿酒酵母基因工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸产量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酿酒酵母基因工程改造提高S‑腺苷‑L‑蛋氨酸产量的方法,先利用一步基因置换法将酿酒酵母菌株染色体上一条GLC3(糖原支链酶基因)等位基因替换成G418抗性基因,然后通过孢子分离方法得到只含有GLC3基因被替换的单倍体,从而得到GLC3基因突变了的纯合子。通过10L和500L发酵罐发酵验证,突变菌株生产腺苷蛋氨酸产量分别达到了7.93g/L和8.35g/L,比原始菌株提高了15.1%和24.7%。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术、代谢工程领域,涉及一种通过代谢途径改造来提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸能力的方法。
背景技术
S-腺苷-L-蛋氨酸,简称SAM,广泛存在于动物、植物和微生物细胞中,是一种重要的代谢中间产物。作为胞内甲基供体,SAM在核酸、蛋白质以及脂类等分子的甲基化修饰中扮演重要角色。同时,SAM还参与胞内的转硫基反应以及聚胺的合成等重要生化反应。SAM也是一种非常有价值的医药分子,在治疗肝病、抑郁症和风湿性关节炎中发挥重要作用。
SAM在胞内是经过腺苷蛋氨酸合成酶催化,由蛋氨酸和三磷酸腺苷(ATP)结合生成的。研究标明,胞质内过量的SAM对细胞毒害作用非常强,SAM不能在细胞液中大量贮存。然而,酵母一类微生物却能在富含蛋氨酸的环境中大量合成并积累SAM,这是因为酵母细胞的液泡中含有大量的带负电荷的聚磷酸盐,这些聚磷酸盐能固定住带正电荷的SAM。因此,酵母成为了工业生产SAM的首选宿主。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有遗传背景清楚、食品级安全、抗逆性强以及发酵条件容易控制等许多优良特性,因此被广泛用作食品、医药以及化工工业的生产菌株。尽管天然的酿酒酵母生产腺苷蛋氨酸能力已经很强,但还是不能满足市场日益增长的需求,寻求更多途径继续提高腺苷蛋氨酸的产量的任务迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是为满足腺苷蛋氨酸日益增长的工业生产需求,提供一种酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法。为此,针对工业中经常采用的双倍体菌株,本发明采用以下技术方案:
酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,对酿酒酵母菌株糖原合成途径进行了敲除。
进一步地,所述对酿酒酵母菌株糖原合成途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染色体上糖原支链酶基因GLC3来实现的。
进一步地,所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株,对所述酿酒酵母双倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤:
步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物,以质粒pUG6为模版进行PCR,PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框;
步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中,通过G418平板筛选以及PCR验证,得到一条GLC3等位基因被置换的杂合子;
步骤3:将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生,收集孢子,溶解孢子子囊壁后,分离孢子;
步骤4:将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成,挑取单菌落进行PCR验证。
进一步地,所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株,对所述酿酒酵母单倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤:
步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物,以质粒pUG6为模版进行PCR,PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框;
步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中,通过G418平板筛选,挑取单菌落进行PCR验证。
进一步地,所述步骤1中设计含有GLC3基因同源臂的引物,该引物序列为:
上游引物GLC3-up:
CCCTGATAACTTCCTGTTACTATTTAAGAACACCAAACCAAGTATAAAGACAGCTGAAGCTTCGTACGC,
下游引物GLC3-down:
TATTGAGTCTTGATTTTCAGTAAGCAATATAGTATAGAGTTCATTCTTTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG。
进一步地,所述步骤2中通过G418平板筛选以及PCR验证,该PCR验证的引物序列为:
上游引物GLC3-A:5’-CCCTGATAACTTCCTGTTAC-3’
下游引物GLC3-D:5’-GAGTCTTGATTTTCAGTAAG-3’
进一步地,所述步骤3中溶解孢子子囊壁后,分离孢子,具体为:400微升孢子悬浮液中加入10微升蜗牛酶溶液,37℃下水浴3h,然后用100w超声振荡处理5s,间歇7s,振荡5个周期;显微镜下确认孢子充分分离。
为实现上述目的,本发明所提供的提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸的方法,采用将GLC3基因敲除菌株进行发酵罐分批补料发酵生产SAM。
进一步地,其发酵培养基成分具体为:10g/L 葡萄糖, 3g/L 酵母粉, 5g/L 硫酸铵, 10g/L 磷酸二氢钾, 3g/L 硫酸镁,0.1g/L 七水硫酸锰, 0.6 g/L 七水硫酸锌,0.55g/L 硫酸亚铁, 0.5g/L 氯化钠, 0.5g/L 氯化钙, 1.6mg/L 硫酸铜, 4.84mg/L 钼酸铵, 0.3mg/L 生物素, 3.6mg/L 泛酸钙, 3.6mg/L 微生物B1, 3.6mg/L 维生素B6。
腺苷蛋氨酸合成的直接底物只有蛋氨酸和ATP,添加外源蛋氨酸能快速加剧酿酒酵母合成SAM,是最直接最有效率的提高SAM产量的方法。已有大量研究报道,过量表达腺苷蛋氨酸合成酶也是提高SAM合成效率的有效手段。然而,通过代谢改造使ATP更多流入SAM合成途径这一块的研究报道却很少。事实上,减少胞内ATP不必要的消耗,提高胞内ATP活性,对提高酿酒酵母胞合成SAM效率也是十分重要的。
研究表明,酿酒酵母会在稳定期大量合成糖原,消耗碳源并且降低了胞内ATP活性。而在SAM工业生产中却是在稳定期加入外源蛋氨酸,促使酿酒酵母来合成SAM;因此,糖原合成途径对于工业生产SAM来讲是一条浪费资源的途径。而GLC3基因编码的糖原支链酶GBE是糖原合成途径的关键酶,已经有报道指出,GLC3基因的突变缺失能直接导致宿主糖原合成途径的缺失。因此,敲除GLC3这一个基因能达到敲除糖原合成途径,而糖原途径的去除有望提高酿酒酵母的碳源利用率,提高胞内ATP的活性,进而促使SAM的合成与积累。
由于采用本发明的技术方案,本发明取得的优点和有益效果是:本发明能够适用于各种酿酒酵母菌株。本发明从一个新角度对该菌株进行了代谢途径的改造,结果表明,糖原途径缺失突变菌株的腺苷蛋氨酸产量达到了7.93g/L,比原始菌株提高了15.1%,从而可以提高SAM的工业生产效率。另外,本发明采用了孢子分离技术来得到纯合的二倍体敲除菌株,可以避免先单倍体分开敲除再融合的繁琐过程,提高了二倍体的敲除效率,且其为酿酒酵母工业菌株,其本身具有的强腺苷蛋氨酸积累能力、优良的发酵特性以及食品安全的生物性能,都是其它微生物不能比拟的,具有更好的技术效果。
附图说明
图1为验证GLC3基因敲除过程的核酸凝胶电泳图。以GLC3-A和GLC3-D为引物,分别对HD、HD-glc3杂合子、HD-glc3纯合子进行PCR验证。
图2为10L发酵过程中HD与HD-glc3的SAM产量对比图。SAM concentration即为SAM浓度;Time为时间。底物蛋氨酸加入后开始计时,比较原始菌株HD与糖原合成途径缺失菌株HD-glc3的SAM生产能力。
具体实施方式
实施例1:以双倍体酿酒酵母菌株HD为例,构建GLC3基因敲除的杂合子。
1、PCR构建敲除框。方法如下:以质粒pUG6为模版,用引物对GLC3-up和GLC3-down进行PCR反应,PCR产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收,经过DNA电泳确认,最终作为GLC3基因敲除用的敲除框。
2、LiAC转化。方法如下:挑原始菌株HD单菌落置于20mL YPD摇瓶中,转速200rpm,30℃过夜培养,然后转接2mL到50mL YPD摇瓶中继续培养3-4个小时,OD600大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次,离心,去掉上清;再用0.1 M LiAC洗涤一次,离心,去掉上清;用1mL 0.1M LiAC重悬菌体,转移到2mL离心管,再加入0.5mL 0.1M LiAC重悬菌体;分装为每管50 μL,取两管,分别离心去上清,得到感受态细胞;按顺序加入240μL PEG、36μL1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL GLC3敲除框,然后混匀,放置室温15min,再进行42℃热激20min;离心,去上清,再加入1mL YPD培养基,30℃预培养2h;离心,去上清,加入2mL无菌水重悬,取50-100μL涂布到200μg/mL G418 YPD平板上,30℃培养36-48h。
3、PCR验证。方法如下:在上述G418平板上挑菌落4-6个,进行PCR验证。如附图1,DNA凝胶电泳得到双条带的菌株即为敲除杂合子。
实施例2:以双倍体酿酒酵母菌株HD为例,分离孢子单倍体并得到敲除纯合子。
方法如下:将实施例1所得敲除杂合子涂布到麦氏产孢培养基(葡萄糖1g/L、KCl1.8g/L、醋酸钠8.2 g/L以及琼脂15 g/L)上培养3-4天,显微镜下确认孢子产率超过95%;收集少量孢子,加入400μL蜗牛酶反应液(来自上海生工酵母基因组提取试剂盒),悬浮孢子,再加入10微升蜗牛酶溶液,37℃下水浴3h;离心,用500μL无菌水重悬,再100W超声振荡处理5s,间歇7s,振荡5个周期;最后,显微镜下确认孢子比较充分地分离(分离率大于80%),用接种环取少量菌液划线到200μg/mL的G418 YPD平板上,30℃下培养36-48h。挑取4-6个菌落,用引物对GLC3-A和GLC3-D进行PCR验证。如附图1,DNA凝胶电泳只得到一条含敲除框大小的条带的菌株即为敲除纯合子,命名为HD-glc3。
实施例3:以双倍体酿酒酵母菌株HD和GLC3基因突变的HD-glc3菌株为例,发酵生产SAM。方法如下:
1、将HD和HD-glc3分别接种到50mL YPD液体培养基,在200rpm、30℃恒温摇床培养18小时后,分别转接到若干个50mL YPD摇瓶,每个摇瓶转接3mL,继续培养12小时,作为发酵罐的种子液。
2、10L发酵罐经过空消确定发酵罐性能良好以后,加入7L产SAM发酵培养基,115℃实消灭菌30min,然后冷却控温到30℃;产SAM发酵培养基成分如下:10g/L 葡萄糖、 3g/L酵母粉、5g/L (NH4)2SO4、10g/L KH2PO4、3g/L MgSO4、0.1g/L MnSO4·7H2O、0.6 g/L ZnSO4·7H2O、 0.55g/L FeSO4、 0.5g/L NaCl、0.5g/L CaCl2、1.6mg/L CuSO4、4.84mg/L (NH4)2MoO4、0.3mg/L 生物素、3.6mg/L 泛酸钙、3.6mg/L 维生素B1、3.6mg/L 维生素B6。
3、按照5%接种量将上述种子液分别接种到发酵罐中;整个过程中温度控制在30℃,用氨水调节pH为5,调节搅拌速率控制溶氧在20%以上,调节流加速率控制葡萄糖浓度小于5g/L;整个过程中每隔两小时取样测定一次,记录溶氧、pH、搅拌速率、OD600、葡萄糖浓度等,反应阶段分别保存菌液离心后的上清和菌体,用于测定乙醇浓度、细胞干重以及SAM产量等;培养8-10个小时后,葡萄糖耗尽,开始流加葡萄糖和酵母粉混合液;继续培养22-24个小时后,OD600趋于稳定,分四次添加蛋氨酸粉末,每次20g;反应20个小时后,发酵结束。
4、从上述保存菌体中萃取出SAM,并测定其含量:按每克湿菌体加入乙酸乙酯和水各0.24mL,剧烈震荡处理30min;然后加入1.12mL 0.35M H2SO4,继续处理1.5h;萃取结束后,离心收集上清,过滤后用于HPLC检测;HPLC检测条件为:安捷伦C18柱,检测波长为256nm,流动相由40mM 磷酸二氢铵、2mM 庚烷磺酸钠、18%甲醇组成。HD和HD-glc3发酵过程中生产SAM的比较如图2。
5、最终,在500 L的发酵罐上进行了腺苷蛋氨酸的中试生产,HD-glc3生产SAM的量也能达到8.35g/L,比原始菌株HD提高了24.7%,为工业化发酵生产腺苷蛋氨酸奠定了基础。
实施例4:在模式菌株BY4741中进行GLC3基因的敲除,并验证其产量。方法如下:
1、PCR构建敲除框。方法如下:以质粒pUG6为模版,用引物对GLC3-up和GLC3-down进行PCR反应,PCR产物利用DNA纯化试剂盒纯化回收,经过DNA电泳确认,最终作为GLC3基因敲除用的敲除框。
2、LiAC转化及PCR验证。方法如下:挑原始菌株BY4741单菌落置于20mL YPD摇瓶中,转速200rpm,30℃过夜培养,然后转接2mL到50mL YPD摇瓶中继续培养7-8个小时,OD600大约为1的时候离心收集菌体。用20mL无菌水洗涤一次,离心,去掉上清;再用0.1 M LiAC洗涤一次,离心,去掉上清;用1mL 0.1M LiAC重悬菌体,转移到2mL离心管,再加入0.5mL 0.1MLiAC重悬菌体;分装为每管50 μL,取两管,分别离心去上清,得到感受态细胞;按顺序加入240μL PEG、36μL 1 M LiAC、50μL ssDNA和 34μL GLC3敲除框,然后混匀,放置室温30min,再进行42℃热激90min;离心,去上清,再加入1mL YPD培养基,30℃预培养4h;离心,去上清,加入2mL无菌水重悬,取50-100μL涂布到200μg/mL G418 YPD平板上,30℃培养48h;挑取4-6个单菌落,用引物对GLC3-A和GLC3-D进行PCR验证得GLC3敲除菌株BY4741-glc3。
3、摇瓶发酵生产SAM。方法如下:挑BY4741-glc3单菌落到50mL YPD培养基,200rpm,30℃下培养24h;然后转接到50mL 产SAM培养基,每瓶接种3mL,同样条件下培养24h;每瓶加入L-蛋氨酸粉末0.1g,摇匀,继续培养24h,离心,收集菌体,测量菌体干重并萃取SAM,测量其浓度。其中产SAM培养基组分包括:30g/L 葡萄糖、5g/L酵母粉、5g/L (NH4)2SO4,、5g/L K2HPO4,、10g/L KH2PO4、0.1g/L MnSO4·7H2O、0.1g/L ZnSO4·7H2O、0.2g/LMgCl2、0.1g/L CaCl2和0.1g/L C6H5Na3O7·2H2O。
4、BY4741与BY4741-glc3生产SAM能力的比较。如下表格
菌株 | SAM浓度(g/L) | SAM胞含量(mg/g DCW) |
BY47471 | 0.051 | 25.8 |
BY4741-glc3 | 0.060 | 32.9 |
由上表可见,BY4741-glc3比BY4741生产SAM能力提高了17.6%,进一步说明了本发明公布的提高腺苷蛋氨酸的方法行之有效。
<110> 山东金城生物药业有限公司
浙江大学
<120> 酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctgataac ttcctgttac tatttaagaa caccaaacca agtataaaga cagctgaagc 60
ttcgtacgc 69
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tattgagtct tgattttcag taagcaatat agtatagagt tcattctttt gcataggcca 60
ctagtggatc tg 72
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccctgataac ttcctgttac 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagtcttgat tttcagtaag 20
Claims (8)
1.酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,对酿酒酵母菌株糖原合成途径进行了敲除;
所述对酿酒酵母菌株糖原合成途径的敲除是通过敲除酿酒酵母菌株染色体上糖原支链酶基因GLC3来实现的。
2.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母双倍体菌株,对所述酿酒酵母双倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤:
步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物,以质粒pUG6为模版进行PCR,PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框;
步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母双倍体菌株中,通过G418平板筛选以及PCR验证,得到一条GLC3等位基因被置换的杂合子;
步骤3:将步骤2得到的杂合子置于产孢培养基上培养至孢子大量产生,收集孢子,溶解孢子子囊壁后,分离孢子;
步骤4:将步骤3得到的分离孢子置于G418平板上培养至菌落生成,挑取单菌落进行PCR验证。
3.如权利要求1所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,所述酿酒酵母菌株采用酿酒酵母单倍体菌株,对所述酿酒酵母单倍体菌株实施所述敲除包括以下步骤:
步骤1:设计含有GLC3基因同源臂的引物,以质粒pUG6为模版进行PCR,PCR产物经过纯化得到GLC3基因的敲除框;
步骤2:通过醋酸锂(LiAC)转化法将步骤1中所得敲除框导入酿酒酵母单倍体菌株中,通过G418平板筛选,挑取单菌落进行PCR验证。
4.如权利要求2或3所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,所述步骤1中设计含有GLC3基因同源臂的引物,该引物序列为:
上游引物GLC3-up:
CCCTGATAACTTCCTGTTACTATTTAAGAACACCAAACCAAGTATAAAGACAGCTGAAGCTTCGTACGC,
下游引物GLC3-down:
TATTGAGTCTTGATTTTCAGTAAGCAATATAGTATAGAGTTCATTCTTTTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG。
5.如权利要求2或3所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,所述步骤2中通过G418平板筛选以及PCR验证,该PCR验证的引物序列为:
上游引物GLC3-A:5’-CCCTGATAACTTCCTGTTAC-3’
下游引物GLC3-D:5’-GAGTCTTGATTTTCAGTAAG-3’。
6.如权利要求2所述的提高酿酒酵母菌株生产S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,所述步骤3中溶解孢子子囊壁后,分离孢子,具体为:400微升孢子悬浮液中加入10微升蜗牛酶溶液,37℃下水浴3h,然后用100w超声振荡处理5s,间歇7s,振荡5个周期;显微镜下确认孢子充分分离。
7.酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,将糖原支链酶基因GLC3基因敲除的酿酒酵母菌株进行发酵罐分批补料发酵生产SAM。
8.如权利要求7所述的酿酒酵母基因工程改造提高S-腺苷-L-蛋氨酸产量的方法,其特征在于,该发酵培养基成分具体为:10g/L葡萄糖,3g/L酵母粉,5g/L硫酸铵,10g/L磷酸二氢钾,3g/L硫酸镁,0.1g/L七水硫酸锰,0.6g/L七水硫酸锌,0.55g/L硫酸亚铁,0.5g/L氯化钠,0.5g/L氯化钙,1.6mg/L硫酸铜,4.84mg/L钼酸铵,0.3mg/L生物素,3.6mg/L泛酸钙,3.6mg/L微生物B1,3.6mg/L维生素B6。
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强化表达SAM合成酶促进SAM在毕赤酵母中累积;余志良等;《生物化学与生物物理学报》;20030228;第35卷(第2期);第127-132页 |
高产S-腺苷蛋氨酸的酿酒酵母发酵条件的响应面法优化;朱靖博等;《大连工业学学报》;20120930;第31卷(第5期);第10-13页 |
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Publication number | Publication date |
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CN105483190A (zh) | 2016-04-13 |
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