CN102094061B - 一种利用微藻生产叶黄素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速积累微藻胞内叶黄素的方法，该方法包括异养培养、稀释、光诱导培养、微藻采收以及叶黄素提取等步骤。采用本发明方法可充分发挥异养培养所获得的微藻细胞在光诱导阶段叶黄素快速积累的优势，为解决源于微藻的叶黄素产业化提供重要的技术手段。

Description

一种利用微藻生产叶黄素的方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种微藻培养生产叶黄素的方法。

背景技术

叶黄素(Lutein)又名“植物黄体素”，是广泛存在于蔬菜、花卉、水果等植物和藻类中的一种天然活性物质。因其对人体具有保护视力、延缓动脉硬化、抗癌、抗氧化、保护皮肤等多个重要生理功效，所以叶黄素目前广泛作为食品和饲料添加剂，同时叶黄素鲜亮的橙黄色使其作为家禽畜、水产养殖动物和动物组织的增色剂。

叶黄素在医药和保健品、食品和饲料、化妆品及水产养殖行业等方面广泛的应用前景，使许多国内外研究机构和公司对叶黄素的生物合成、分离提取、生理生化功能等进行研究。目前，叶黄素主要从万寿菊、金盏花等植物中提取获得，但是利用这些植物生产叶黄素存在着某些缺点。首先，叶黄素在这些植物中主要是酯化形式存在，因此从万寿菊、金盏花等植物中提取叶黄素时需要进行皂化处理，该步骤不但降低了效率和收率，同时残余的皂化剂容易污染叶黄素产品，给纯化过程增加了难度。其次，种植万寿菊、金盏花等植物需要大量的土地，这些植物的生长周期一般为3～4个月(相对于可快速生长的微藻而言，周期太长)。

相比较而言，利用微藻来生产叶黄素具有某些优势。首先叶黄素在微藻中主要是以游离的形式存在，因此在生产过程中不需要皂化步骤；其次，微藻的生长周期短、生产设备占地面积小，同时利用微藻生产叶黄素不受季节、气候及地域条件限制，产品质量和产量相对稳定；最后，微藻(如小球藻等)本身就是一种高价值的产品，含有大量的蛋白质、油脂、多糖等活性成分，可以分离提取这些物质，实现微藻细胞的综合利用。

至今，利用微藻产叶黄素的培养模式主要有光自养和异养两种。微藻光自养培养的缺点是微藻细胞生长速度慢、细胞密度及叶黄素产率低。目前光自养培养微藻的叶黄素最高体积产率为Sanchez J F等在2L圆柱式光生物反应器中培养Scenedesmus almeriensis所获得的4.8mg/L/d(Sanchez J F，Fernandez-Sevilla J M，Acien F G.，et al.Biomass and lutein productivity ofScenedesmus almeriensis：influence of irradiance，dilution rate and temperature.Appl Microbiol Biotechnol，2008，79：719～729)，叶黄素的最高面积产率为Fernandez等在4000L管道式反应器中培养Scenedesmus almeriensis所达到的290mg/m²/d(Del Campo J A，Mercedes Garcia González，Guerrero M G.Outdoorcultivation of microalgae for carotenoid production：current state and perspectives.Appl Microbiol Biotechnol，2007，74：1163～1174)。

微藻异养培养的优点是微藻能够在生物反应器中进行高密度培养，细胞生长速率快，但存在细胞内叶黄素、叶绿素等色素和蛋白质含量低等缺点。异养培养能够获得高细胞密度和高细胞生长速度，从而使得叶黄素的产率相对于光自养培养有很大提高。

微藻除异养培养和光自养培养模式外，还有一种不常用的培养模式即混合营养培养。迄今，微藻培养产叶黄素的最高体积产率(145mg/L/d)和胞内叶黄素的最高含量(7.6mg/g)均是在连续光照的混合营养培养条件下获得的(Martin，Lucia.Process for obtaining lutein from algae.EP180843A1，2007)。但该培养模式只能在可蒸汽灭菌的封闭式光生物反应器中进行，且培养过程必须保证绝对的无菌，同时需要光源的合理配置，这在实际生产中无法实现。因此，利用混合营养模式培养微藻生产叶黄素不具有产业化价值。

由上述可见，无论是采用光自养培养模式还是异养培养模式，较低的胞内叶黄素含量和叶黄素产率，同时加上微藻大规模培养较高的成本，制约了应用微藻培养来生产叶黄素的产业化进程。因此，有必要探索新的微藻培养工艺或方法使叶黄素产率及含量大幅度提高，同时又使微藻大规模培养的成本大幅度下降，这样才能够满足利用微藻培养产叶黄素的产业化要求。

综合上述几种产叶黄素微藻培养模式的优缺点，本发明设计了一种用于产叶黄素微藻培养的“异养-稀释-光诱导串联培养”模式，其流程如下：首先利用生物反应器异养培养产叶黄素微藻以获得高密度细胞，待培养液中有机碳源消耗完毕后，用不含有机碳源的培养基稀释藻液，经短时间内(8～24h)的光照诱导，使藻细胞内的叶黄素快速大量积累。该模式中的异养阶段是在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行，目的是为了在短时间内获得较高密度的藻细胞；光诱导阶段可在任何可用于微藻光自养培养的***中进行，目的是通过光诱导作用提高胞内叶黄素含量；异养阶段与光诱导阶段分别独立进行，异养阶段放出的藻液先用光诱导培养基进行稀释后再转入光诱导培养阶段。过程中需确保进入光诱导阶段的藻液中不含有机碳源，这样可避免光诱导阶段滋生过多的杂菌；而通过稀释作用可以确保光诱导阶段的藻细胞能获得充足的光照，实现胞内叶黄素含量的快速提高。

本发明将微藻培养法生产叶黄素分成藻体生长和产物(叶黄素)积累两个阶段，即异养培养和光诱导培养。通过异养培养可在短时间内获得大量的可产叶黄素的微藻细胞，藻液稀释后转入光诱导培养，藻体内叶黄素含量迅速提升至初始的两倍甚至两倍以上。本发明具有如下优势：(1)光诱导的藻细胞密度很高(2～10g/L)，是常规光自养培养藻细胞密度(约0.2～1g/L)的10倍左右；(2)光诱导时间很短(约1d～2d)，而微藻光自养培养时间很长(约7d～14d)，因此，叶黄素的生产效率大为提高；(3)相对于微藻光自养培养，光诱导时较高的藻细胞密度使得光诱导所需的占地面积很小，同时高细胞密度使得采收成本大幅度降低；(4)异养培养几乎不受气候、天气的影响，光诱导培养可以在玻璃房内，自然光照或人工光照条件下进行，因而，采用本发明的方法可以实现叶黄素的连续生产；(5)分离提取叶黄素后的剩余藻体的综合利用，可获得额外的产品和经济效益，降低了叶黄素的综合生产成本。

综述所述，本发明的培养模式合理地结合了异养和光自养培养两种方式的各自优势，与其它模式相比，具有生产效率高、培养***的组合方式灵活和生产成本低等优点，可充分发挥异养模式可获得高密度藻液和光诱导阶段叶黄素快速积累的优势，为解决源于微藻的叶黄素产业化问题提供重要的技术手段。

发明内容

本发明一方面提供一种快速积累微藻胞内叶黄素的方法，该方法包括微藻的异养培养步骤，将所获得的微藻异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细胞采收、叶黄素分离提取的步骤。

本发明另一方面提供一种源于微藻的叶黄素生产方法，该方法包括微藻异养的步骤，将微藻的异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及藻细胞采收、叶黄素分离提取的步骤。

本发明的方法能够实现胞内叶黄素的快速积累，大大提高了生产效率，降低了生产成本，且提供了高品质的叶黄素。

在一个具体实施方式中，所述的微藻选自：蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、海水小球藻(Marine chlorella)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、Chlorella zofingiensis、Chlorella regularis、Chlorella sorokina、Spongiococcumexcentricum和Chlamydomonas agloeformis。

在一个具体实施方式中，所述微藻异养培养的步骤包括：在生物反应器中加入pH为4.0～9.0的培养基，按工作体积的0.1～30％接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、半连续培养或连续培养，培养温度为10～40℃，控制pH小于9.0，控制溶氧在1％以上。

在一个具体实施方式中，所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱导装置中进行光诱导，连续光照或间歇光照，培养温度为5～50℃，光照强度为0.1～150klx，光诱导培养周期为1～150小时。

在一个具体实施方式中，异养培养基由氮源、有机碳源以及少量无机盐、微量元素和水组成；光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。

在一个具体实施方式中，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器或薄膜立袋与吊袋光生物反应器等任何可用于微藻光自养培养的装置中进行，光源为自然光或各种人工光。

在一个具体实施方式中，当产叶黄素藻种为普通小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：KNO₃ 5～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH₂PO₄0.3～0.9克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0克/升、CaCl₂0.05～0.3克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05克/升、微量元素0.5～4ml和水，其中微量元素的组成为H₃BO₃ 5～15克/升、ZnSO₄·7H₂O 5.0～10.0克/升、MnCl₂·H₂O1.0～2.0克/升、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.5～1.5克/升、CuSO₄·5H₂O 1.0～2.0克/升和Co(NO₃)₂·6H₂O 0.1～0.9克/升。

在一个具体实施方式中，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用的培养基基本上由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升、尿素2～8克/升、KH₂PO₄ 1～2克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O 1～2克/升、CaCl₂ 0.05～0.1克/升、柠檬酸三钠0.1～2.0克/升、Fe-EDTA溶液0.5～1mL、A5溶液1～5mL和水；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 20～30克/升和EDTA 20～40克/升；A5溶液配方为H₃BO₃ 2.5～4.0克/升、MnCl₂·4H₂O 1.0～2.0克/升、ZnSO₄·7H₂O0.1～0.6克/升、CuSO₄·5H₂O 5～10克/升和Na₂MoO₄ 0.01～0.05克/升。

在一个具体实施方式中，采用超临界CO₂萃取法、有机溶剂提取法或超声辅助溶剂提取法提取叶黄素。

在一个具体实施方式中，本发明的方法还包括：将提取叶黄素后的藻体与其他色素混合进行喷雾干燥制成藻粉，或对藻体中的生物活性物质进行分离提取。

在一个具体实施方式中，所述其他色素包括叶绿素。在一个具体实施方式中，所述生物活性物质包括蛋白质、叶绿素和多糖。

附图说明

图1和图2显示5L生物反应器/3L平板式光生物反应器串联***中采用异养-稀释-光诱导串联培养蛋白核小球藻生产叶黄素的过程。其中，图1显示蛋白核小球藻在5L生物反应器异养培养过程；图2显示蛋白核小球藻在3L平板式光生物反应器内光诱导培养过程。

图3和图4显示50L生物反应器/10L圆柱式光生物反应器串联***中采用异养-稀释-光诱导串联培养蛋白核小球藻生产叶黄素的过程。其中，图3显示蛋白核小球藻在50L生物反应器异养培养过程；图4显示蛋白核小球藻在10L圆柱式光生物反应器内光诱导培养过程。

图5和图6显示50L生物反应器/30L平板式光生物反应器串联***中采用异养-稀释-光诱导串联培养普通小球藻生产叶黄素的过程。其中，图5显示普通小球藻在50L生物反应器中异养培养过程；图6显示普通小球藻在户外30L平板式光生物反应器内光诱导培养。

图7和图8显示5L生物反应器/3L平板式生物光生物反应器串联***中采用异养-稀释-光诱导串联培养椭圆小球藻生产叶黄素的过程。其中，图7显示椭圆小球藻在5L生物反应器异养培养过程；图8显示椭圆小球藻在3L平板式光生物反应器中光诱导过程。

具体实施方案

适用于本申请的微藻包括但不限于蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、海水小球藻(Marine chlorella)、原壳小球藻(Chlorella protothecoides)、椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)、Chlorellazofingiensis、Chlorella regularis、Chlorella sorokina、Spongiococcum excentricum和Chlamydomonas agloeformis。

在优选的实施方式中，本发明采用蛋白核小球藻、普通小球藻和椭圆小球藻来生产叶黄素。

1.微藻在生物反应器中的高密度异养培养

此步骤的目的是为了快速获得大量藻细胞，以供光诱导阶段快速合成积累叶黄素。

可采用本领域熟知的各种培养基来进行微藻异养培养。通常，异养培养基含有氮源、有机碳源、少量无机盐、微量元素和水。

这类培养基包括HA-SK培养基(中国专利ZL 200610024004.9)、Endo培养基(Ogbonna J.C.，Masui.H.，Tanaka.H.Sequential heterotrophic：autotrophiccultivation-an efficient method of producing Chlorella biomass for health foodand animal feed.J.Appl.Phycol.1997，9，359～366)等。

本发明所用的HA-SK培养基基本上由KNO₃、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水组成。在所述技术方案中，所述微量元素宜选自H₃BO₃、ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·H₂O，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O和Co(NO₃)₂·6H₂O中的一种、多种或全部。

本文所用的术语“基本上由……组成”表示本发明的组合物中除了含有主要组分KNO₃、葡萄糖以及少量无机盐、微量元素和水外，还可包含一些对于组合物的基本特性或新的特性(即可维持微藻在较短的培养周期内细胞密度达到较高的水平，同时活性物质含量与常规异养培养相比有较大幅度提高)没有实质上影响的组分。本文所用的术语“由……组成”表示本发明的组合物由所指出的具体组分组成，没有其他组分，但是可以带有含量在通常范围内的杂质。

在该培养基中，培养基的各组分可在一定范围内变化而不会对微藻细胞密度和品质有很大的实质影响。因此，这些组分的用量不应受实施例的严格限制。如本领域技术人员所熟知的，培养基中还可加入少量无机盐，例如硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和磷酸盐等，以及少量微量元素如Mn、Zn、B、I、M、Cu、Co等。

在本发明中，较佳的微量元素组分宜选自H₃BO₃、ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂·H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、CuSO₄·5H₂O和Co(NO₃)₂·6H₂O中的一种或多种。无机盐和微量元素的用量可根据常规知识确定。

本发明所采用的HA-SK培养基基本上由以下成分组成：KNO₃ 5～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH₂PO₄ 0.3～0.9克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0克/升、CaCl₂ 0.05～0.3克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05克/升；微量元素0.5～4ml，其中微量元素的组成为H₃BO₃ 5～15克/升、ZnSO₄·7H₂O5.0～10.0克/升、MnCl₂·H₂O 1.0～2.0克/升、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.5～1.5克/升、CuSO₄·5H₂O 1.0～2.0克/升和Co(NO₃)₂·6H₂O 0.1～0.9克/升；水。

本发明所用的Endo培养基基本上由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升、尿素2～8克/升、KH₂PO₄ 1～2克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O1～2克/升、CaCl₂ 0.05～0.1克/升、柠檬酸三钠0.1～2.0克/升、Fe-EDTA溶液0.5～1mL，A5溶液1～5mL；其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 20～30克/升和EDTA 20～40克/升；A5溶液配方为H₃BO₃ 2.5～4.0克/升、MnCl₂·4H₂O 1.0～2.0克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.6克/升、CuSO₄·5H₂O 5～10克/升和Na₂MoO₄ 0.01～0.05克/升；水。

在根据上述配方配制培养基后，可用常规手段如酸或碱将所述培养基的pH调为4.0～9.0，并在115～120℃下高压灭菌15～20分钟。可采用分批、补料分批、半连续和连续培养等多种方式实施异养培养。

当异养培养采用补料分批培养方式时，将相应配制好的培养基加入到生物反应器中，补加水至工作体积，通常装料系数为0.6～0.8，然后蒸汽灭菌(121℃，维持约20分钟)，当温度降至30～35℃时，按工作体积的1～15％接入微藻藻种开始异养培养。

在异养培养一段时间后，当培养基中葡萄糖被消耗完(通常为27～45小时)时需要进行补料，补加碳源(如葡萄糖)、氮源(如，培养普通小球藻的氮源为KNO₃、培养蛋白核小球藻的氮源为尿素)和无机盐等营养盐，补加的营养盐是经浓缩后的上述相应培养基，促使微藻继续生长。可每隔5～8小时补料，葡萄糖的补加浓度可为15～25克/升，氮源溶液的补加浓度可为2～5克/升。当补加一定次数(一般为4～7次)的营养盐后，微藻细胞密度达到最高时，异养培养阶段结束。

无论采用何种培养方式，在培养过程中，须控制适合的培养条件使微藻正常生长。通常，控制温度为20～35℃，例如28～30℃，溶氧不低于5％的空气饱和浓度，pH不高于9.0。在优选的实施例中，溶氧不低于10％的空气饱和浓度，pH不高于8.5。

通常，当采用分批培养、补料分批培养时，异养培养阶段结束时生物反应器中有机碳源需完全消耗完。当采用半连续培养方式时，带放操作是在生物反应器中有机碳源完全消耗完时进行。

异养可以在摇瓶、机械搅拌式、气升式、鼓泡式等可异养培养的生物反应器中进行。

2.高浓度藻液的稀释

此步骤的目的是为了使转入光诱导培养的产叶黄素微藻高效地吸收光能，提高光能利用效率，同时降低藻细胞的死亡率。因为光强在藻液中呈“时、空、非线性”衰减，所以在高细胞密度下，反应器中藻细胞大部分处于暗区，几乎接受不到光照，这样藻细胞很容易死亡而且会影响光诱导的效率。

异养培养获得的高密度藻液应进行稀释操作，用水和不含有机碳源的培养基对高密度的藻液进行稀释，使细胞密度维持在0.1～10克/升，调节pH至5.0～8.0。在其它实施例中，稀释藻液，使细胞密度维持在1～8克/升。在优选的实施例中，使细胞密度维持在1.0～5.0克/升。

可采用各种已知的稀释培养基来稀释藻液。通常，光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成，相对于异养培养基不含有有机碳源。在优选的实施方案中，所述培养基的氮源浓度为2～10克/升，较佳为2～8克/升。所述氮源可以与异养培养步骤中所用的氮源相同或不同。

在一个优选的具体方案中，异养培养获得的高密度藻细胞宜用不含有机碳源、氮源浓度为2～10克/升的初始培养基(例如，培养普通小球藻时采用不含葡萄糖的HA-SK培养基，培养蛋白核小球藻时采用不含葡萄糖的Endo培养基)进行适当稀释。

稀释采用的培养基无需高压灭菌，配制好后调节pH至5.0～8.0即可使用。

在具体实施方式中，对普通小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组成：KNO₃ 1～8克/升、MgSO₄·7H₂O、0.5～1.0克/升、CaCl₂ 0.01～0.06克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.06克/升、EDTA 0.020～0.052克/升。

对蛋白核小球藻，稀释培养基(光诱导培养基)由以下成分组成：尿素0.1～2.0克/升、MgSO₄·7H₂O、0.5～1.0克/升、CaCl₂ 0.01～0.06克/升、FeSO₄·7H₂O0.01～0.06、EDTA 0.020～0.052克/升、柠檬酸钠0.08～0.5克/升。

3.光诱导培养

该步骤的目的是让产叶黄素微藻接受充足的光照，通过光诱导使藻细胞快速大量合成积累叶黄素。

如上所述高密度微藻培养液经稀释后，将所得稀释液转入光诱导装置中进行光诱导培养。温度控制在5～50℃，光照强度为0.11～150klx，连续光照或间歇光照，光诱导培养周期为1～150小时，通气量为0.1～2.0vvm。其中所述的光生物反应器包括所有的封闭式光生物反应器(摇瓶、管道式、平板式、柱式、薄膜立袋与吊袋等)和所有的开放式光生物反应器(跑道池、圆池和鼓泡式大盆等)。

通常，培养温度可控制在15～35℃的范围内，例如18～35℃、20～35℃、20～30℃等。通常，光照强度为1～70klx，例如，1～60、1～50、1～40、1～30、1～20、1～10klx等，可视具体生产情况而定。通常，如通过气体造成藻液充分混合，则通气量可控制为0.15～2.0vvm，例如，0.2～1.8、0.5～1.5、0.8～1.5、1.0～1.5vvm等。在其它实施方式中，培养温度控制在10～50℃，光照强度为1～10klx，通气量为0.05～2.0vvm。

在其它实施例中，光诱导培养周期为8～100小时，例如，根据实际的天气情况，光诱导培养周期可以为8～90小时、8～80小时、8～60小时、8～48小时、8～24小时不等；或者，光诱导培养周期可以为12～72小时、12～60小时、12～48小时、12～36小时、12～24小时不等或24～60小时、24～48小时不等。

在本申请中，“光诱导培养周期”包括了整个光诱导培养过程，例如，户外培养时光诱导培养周期包括夜晚没有光照的时间。

在本申请中，“光照时间”指使用本申请所述光照强度对微藻实施光诱导培养的时间，即该时间不包括夜晚没有光照的时间。在一些实施例中，光诱导培养步骤的光照时间为8～48小时，例如8～36小时、8～24小时、8～18小时、8～12小时、12～36小时、12～24小时不等，以及上述范围内的任意时长。

因此，本申请的光诱导培养步骤也包括光照时间为8～48小时范围内的光诱导培养步骤。可采用人工光照的方式进行光诱导培养，也可在户外利用自然光照的方式进行光诱导培养。

在具体实施方式中，当培养液中叶黄素浓度达到最高时，结束光诱导培养，收获藻细胞进行叶黄素的分离提取或直接采收藻细胞进行藻粉制备。

4.藻细胞采收、叶黄素分离提取及藻体综合利用

光诱导培养结束后，对小球藻进行离心采收，获得湿藻体。藻细胞的采收方法包括但不限于高速离心、絮凝，气浮或过滤等技术；藻细胞破壁方法包括但不限于藻体自溶、高压匀浆、酶水解、水相热解等湿法破壁方法。

采用传统的有机溶剂提取法对小球藻进行叶黄素的提取。首先将有机溶剂加入到藻泥中进行萃取，然后进行搅拌离心获得上清液和藻体沉淀，对上清液进行减压浓缩、搅拌加水、过滤获得叶黄素晶体。

上清液中的其他成分可逐步分离提取获得脂肪酸、叶绿素等，或直接将上清液中的所有成分与藻体沉淀混合喷雾干燥获得小球藻粉。

在一个较佳的方案中，采用超临界CO₂萃取技术对小球藻进行叶黄素的分离提取。在一个更佳的方案中，将获得的小球藻液浓缩后直接喷雾干燥获得小球藻粉。

本发明中，可对培养所得的微藻进行综合利用，提取其中的多不饱和脂肪酸、蛋白质、叶绿素、多糖等各种活性成分。活性成分的提取顺序并无特殊限制，但通常要满足先提取的步骤不能导致后提取的成分损失这一前提。

本文中涉及到藻细胞干重和叶黄素含量测定方法如下：

藻细胞干重测定：在微藻(如小球藻)培养过程中取培养液V毫升，8000rpm离心10分钟，将离心后的藻体用去离子水洗涤3次，转移至称量瓶(W₁(克))中，在105℃烘箱中烘干至恒重W₂(克)。藻体干重Cx可根据下式计算：Cx(克/升)＝(W₂-W₁)/V/1000。

叶黄素测定：采用高效液相色谱法(HPLC)，具体操作步骤见文献(ZhengYun Wu，Chun Lei Shi et al.Modeling of lutein production by heterotrophicChlorella in batch and fed-batch cultures.World Journal of Microbiology andBiotechnology，2007，23：1233-1238)。

实施例1

在5L生物反应器中加入下述异养培养基和水至2.8L后进行蒸汽灭菌，然后当温度降到30℃时接入蛋白核小球藻，开始异养培养。

异养培养条件：温度为30±1℃，空气流量为1vvm，pH小于8.0，控制溶氧15％以上。

在接种后53.9h后第一次补料，之后每隔5～8h进行补料，共补加4次，培养至88.40h细胞干重达到132.2g/L(见图1)，此时异养培养结束转入光诱导培养。

将异养培养结束后的高密度藻液稀释到2.55g/L，并加入下述光诱导培养基，转入到3L平板式光生物反应器中进行光诱导培养。光诱导培养条件：温度维持在28～33℃，空气流量为1vvm，双侧光照，每侧光强为15klx。光诱导培养27h后，细胞干重从2.55g/L降低到1.82g/L，叶黄素从1.57mg/gDcw上升至3.64mg/gDcw，光诱导27h时叶黄素的产率为5.88mg/L/d；若光诱导12h时叶黄素的产率可达12.1mg/L/d(为目前微藻光自养生产叶黄素最高产率4.8mg/L/d的2.5倍)(见图2)。

异养及补料培养基：

葡萄糖60.0克    尿素8.0克               MgSO₄·7H₂O 2.0克

KH₂PO₄1.1克     Na₂HPO₄·12H₂O 9.0克    CaCl₂0.02克

柠檬酸三钠1.8克

Fe-EDTA溶液1.0ml    微量元素溶液4.5ml   水1000ml

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 15克/升和EDTA1.4克/升，微量元素溶液配方为H₃BO₃ 2.11克/升，MnCl₂·4H₂O 0.81克/升，ZnSO₄·7H₂O 0.11克/升，CuSO₄·5H₂O 10.0克/升，Na₂MoO₄ 0.05克/升。

光诱导培养基：

尿素0.5克          MgSO₄·7H₂O 1.0克    柠檬酸三钠0.05克

CaCl₂0.01克        Fe-EDTA溶液0.4ml     水1000ml

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 15克/升和EDTA1.4克/升。

实施例2

在50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水至25L后在121℃灭菌20min，然后当温度降至30℃左右时按工作体积的10％接入蛋白核小球藻，开始异养培养。

异养培养条件：温度为30℃，空气流量为1vvm，pH在6.0～8.0，控制溶氧15％以上。在培养过程中，当葡萄糖消耗完后，进行补加碳源，当尿素消耗完时，补加氮源。通过6次补加碳源，3次补加氮源后在98.89h藻细胞密度达130.5g/L(见图3)。

将异养培养结束后的高密度藻稀释到2.01g/L，并加入光诱导培养基，转入到10L圆柱光生物反应器内进行光诱导。

光诱导培养条件：自然温度，温度在30℃，光强在3klx，空气流量为1vvm。光诱导培养30h后，细胞干重从2.01g/L降低到1.66g/L，叶黄素从2.55mg/gDcw上升至3.47mg/gDcw，光诱导30h，叶黄素产率为4.61mg/L/d；若只光诱导24h，叶黄素的产率达5.73mg/L/d(见图4)。培养基与实施例1的培养基一致。

实施例3

在50L生物反应器中加入下述异养培养基和自来水至25L后在121℃灭菌20min，然后当温度降至30℃左右时按工作体积的13％接入普通小球藻，开始异养培养。

异养培养条件：温度为30℃，空气流量为1vvm，pH小于9.0。在培养过程中，当碳源消耗完后，进行补加葡萄糖，当氮源消耗完时，补加硝酸钾。通过5次补加碳源和氮源，58.20h藻细胞密度最高达54.5g/L(见图5)。

将异养培养的高密度藻稀释到3.2g/L左右，并加入光诱导培养基，转入到30L平板式光生物反应器在户外进行光诱导培养。光诱导培养条件：自然温度，自然光照，空气流量为1.0vvm。光诱导28h，叶黄素从初始的1.10mg/gDcw上升至1.82mg/gDcw；光诱导23h时，叶黄素含量为1.67mg/gDcw，叶黄素产率达5.23mg/L/d(见图6)。

异养和补料培养基：

葡萄糖60.0克    硝酸钾10.0克            MgSO₄·7H₂O 0.2克

KH₂PO₄0.3克     Na₂HPO₄·12H₂O 8.8克    CaCl20.02克

Fe-EDTA溶液1.0ml    微量元素溶液3.5ml   水1000ml

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 15克/升和EDTA1.4克/升，微量元素溶液配方为H₃BO₃ 2.86克/升、MnCl₂·4H₂O 0.11克/升、ZnSO₄·7H₂O 9.22克/升、CuSO₄·5H₂O 1.00克/升、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.1克/升和Co(NO₃)₂·6H₂O0.9克/升。

光诱导培养基：

硝酸钾0.5克        MgSO₄·7H₂O 0.6克

CaCl₂0.03克        Fe-EDTA溶液1.5ml    水1000ml

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 8克/升和EDTA 10.4克/升。

实施例4

在5L生物反应器中加入下述异养培养基和水至2.8L后进行蒸汽灭菌，然后当温度降到30℃时按工作体积的8％接入椭圆小球藻，开始异养培养。

异养培养条件：温度为30±1℃，空气流量为1vvm，pH小于8.5，控制溶氧5％以上。

补料两次后在66h，藻细胞密度为53.0g/L(见图7)，此时异养培养结束转入光诱导培养。

将异养培养结束后的高密度藻液稀释到4.0g/L，并加入下述光诱导培养基，转入到3L平板式光生物反应器中进行光诱导培养。光诱导培养条件：温度维持在28～33℃，空气流量为1.0vvm，双侧光照，每侧光强为15klx。光诱导培养48h后，细胞干重从4.0g/L降低到2.8g/L，叶黄素从1.5mg/gDcw上升至3.6mg/gDcw，叶黄素产率为5.04mg/L/d；光诱导24h，叶黄素产率可达9.24mg/L/d(见图8)。培养基与实施例3的培养基一致。

尽管上面已经描述了本发明的具体例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。

Claims (9)

1.一种快速积累微藻胞内叶黄素的方法，其特征在于，该方法包括微藻的异养培养步骤，将所获得的微藻异养培养液稀释后进行光诱导培养的步骤，以及任选的藻细胞采收、叶黄素分离提取的步骤，其中，

所述藻液稀释包括用培养基将异养获得的藻液稀释至细胞密度为0.1～10克/升，所述培养基不含有机碳源，其pH为4.0～9.0；

所述微藻选自：蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)和椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)；

所述光诱导培养包括将稀释后的藻液转入光诱导装置中进行光诱导，培养温度为5～50℃，连续光照或间歇光照，光照强度为0.1～150klx，光诱导培养周期为1～150小时；

所述光诱导培养基由氮源、无机盐和水组成。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微藻异养培养的步骤包括：在生物反应器中加入pH为4.0～9.0的培养基，按工作体积的0.1～30％接入微藻藻种进行分批培养、补料分批培养、半连续培养或连续培养，培养温度为10～40℃，控制pH小于9.0，控制溶氧在1％以上。

3.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述藻液稀释包括用培养基将异养获得的藻液稀释至细胞密度为1.0～5.0克/升，所述培养基不含有机碳源，其pH为4.0～9.0。

4.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养培养基由氮源、有机碳源、无机盐、微量元素和水组成。

5.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述异养步骤在摇瓶、机械搅拌式、气升式或鼓泡式可异养培养的生物反应器中进行，所述光诱导培养步骤在摇瓶或敞开式的跑道池或圆池、封闭式的平板式光生物反应器或管道式光生物反应器或柱式光生物反应器、或用于微藻光自养培养的薄膜立袋与吊袋进行，光源为自然光或人工光。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当小球藻为普通小球藻时，异养所使用的培养基由以下成分组成：KNO₃5～15克/升、葡萄糖10～60克/升、KH₂PO₄0.3～0.9克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O 0.2～1.0克/升、CaCl₂0.05～0.3克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.05克/升、微量元素0.5～4ml和水，其中微量元素的组成为：H₃BO₃5～15克/升、ZnSO₄·7H₂O 5.0～10.0克/升、MnCl₂·H₂O 1.0～2.0克/升、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.5～1.5克/升、CuSO₄·5H₂O1.0～2.0克/升和Co(NO₃)₂·6H₂O 0.1～0.9克/升。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当小球藻为蛋白核小球藻时，异养所使用的培养基由以下成分组成：葡萄糖10～60克/升、尿素2～8克/升、KH₂PO₄1～2克/升、Na₂HPO₄·12H₂O 1.0～10.0克/升、MgSO₄·7H₂O 1～2克/升、CaCl₂0.05～0.1克/升、柠檬酸三钠0.1～2.0克/升、Fe-EDTA溶液0.5～1mL、A5溶液1～5mL和水；

其中Fe-EDTA溶液配方为FeSO₄·7H₂O 20～30克/升和EDTA 20～40克/升；

A5溶液配方为H₃BO₃2.5～4.0克/升、MnCl₂·4H₂O 1.0～2.0克/升、ZnSO₄·7H₂O 0.1～0.6克/升、CuSO₄·5H₂O 5～10克/升和Na₂MoO₄0.01～0.05克/升。

8.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将提取叶黄素后的藻体与其他色素混合进行喷雾干燥制成藻粉，或对藻体中的生物活性物质进行分离提取。

9.如权利要求1－2中任一项所述的方法，其特征在于，当微藻为对普通小球藻或椭圆小球藻时，光诱导培养基由以下成分组成：KNO₃1～8克/升、MgSO₄·7H₂O、0.5～1.0克/升、CaCl₂0.01～0.06克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.06克/升、EDTA 0.020～0.052克/升；

当微藻为蛋白核小球藻，光诱导培养基由以下成分组成：尿素0.1～2.0克/升、MgSO₄·7H₂O、0.5～1.0克/升、CaCl₂0.01～0.06克/升、FeSO₄·7H₂O 0.01～0.06、EDTA 0.020～0.052克/升、柠檬酸钠0.08～0.5克/升。