CN105463041A - 一种氨基葡萄糖的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵工程，特别涉及一种氨基葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：(1)将氨基葡萄糖生产菌按接种量0.4～0.6％接入种子培养基并培养至对数期；(2)将步骤(1)得到的产物按接种量5～10％接入发酵培养基，控制溶氧为20～40％、pH为7±0.2，在温度为37±0.5℃的条件下进行发酵，待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为59～61％的葡萄糖溶液，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为0.5～1.6％，维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.8g/L至发酵终点。本发明提供的制备方法，使得氨基葡萄糖的含量以及转化率得到显著提高。

Description

一种氨基葡萄糖的制备方法
技术领域
本发明涉及发酵工程，特别涉及一种氨基葡萄糖的制备方法。
背景技术
氨基葡萄糖是葡萄糖的一个羟基被一个氨基取代的化合物，分子式为C6H13O5N，俗称氨基糖，简称氨糖。广泛存在于自然界中，氨基葡萄糖通常以N-乙酰基衍生物(如甲壳素)或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-O-乳酸醚(胞壁酸)形式存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。
氨基葡萄糖是形成软骨细胞的重要营养素，是健康关节软骨的天然组织成份。随着年龄的增长，人体内氨基葡萄糖的缺乏会越来越严重，进而造成关节软骨的不断退化和磨损。美国、欧洲和日本的大量医学研究表明：氨基葡萄糖可以帮助修复和维护软骨，并能刺激软骨细胞的生长。
目前，氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法的废液对环境污染较为严重，而且利用该种方法得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏人群服用。相对于甲壳素水解法，微生物发酵法生产不受资源限制，对环境污染小，产品无鱼腥味，不存在过敏效应。
经检索发现，公开号为CN102031232的发明专利申请公开了一种生产氨基糖的方法及专用菌株。生产氨基糖的专用菌株其保藏编号为CGMCCNo.4218。生产氨基糖的方法，包括以下步骤：将生产氨基糖的专用菌株在产酶发酵培养基中28～37℃发酵培养，获得含氨基糖的复合产物；通过非专一性转化酶水解所述含氨基糖的复合产物，过滤、浓缩、干燥得到氨基糖粉末。
另外，现在常用的菌株还包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌，其中由于大肠杆菌具有遗传特性清楚、易培养、发酵周期短并能事先目的基因的高效表达等特性，得到了广泛应用。但是，大肠杆菌生长时会产生乙酸，尤其是在重组菌高密度培养中，乙酸和谷氨酸产生和积累不仅会影响菌体的生长，还会抑制产物的合成。因此，减少发酵过程中的乙酸的产生不但有利于事先大肠杆菌的高密度培养，而且对于提高氨基葡萄糖产量和实现氨基葡萄糖的工业化极为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种氨基葡萄糖的制备方法。
为达到上述目的，具体采用如下的技术方案：
一种氨基葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将氨基葡萄糖生产菌接入种子培养基并培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的产物按接种量5～10％接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧为20～40％、pH为7±0.2，在温度为37±0.5℃的条件下进行发酵，待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为59～61％(m/m)的葡萄糖溶液，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为0.5～1.6％，维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.8g/L至发酵终点。
在本发明的技术方案中，氨基葡萄糖生产菌选用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中的一种，优选为大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌可选有市售的所有产品，本发明对此不作特殊限定。
在本发明的技术方案中，步骤(1)具体的操作步骤为：将氨基葡萄糖生产菌按接种量0.4～0.6％接入种子培养基，在37±0.5℃、pH为7±0.2、溶氧20～30％的条件下培养至对数期，步骤(1)一般需要培养12～14h才能达到对数期。
步骤(1)优选地，将氨基葡萄糖生产菌按接种量0.5％接入种子培养基，在37℃、pH为7、溶氧20～30％的条件下培养至对数期。
步骤(1)中当将氨基葡萄糖生产菌培养至对数期后，种子罐的OD值(660nm)一般为2.0～2.5。
在步骤(2)中当氨基葡萄糖的含量不增加时即达到发酵终点，一般需要发酵35～42h才能达到发酵终点。
在本发明的技术方案中，具体的，所述种子培养基包括葡萄糖1.9～2.1g/L、KH2PO40.5～0.7g/L、K2HPO4·3H2O3.1～3.2g/L、柠檬酸钠·2H2O0.09～0.11g/L、硫酸铵0.9～1.1g/L、MgSO4·7H2O0.05～0.07g/L、CaCl2·2H2O0.002～0.004g/L、微量元素母液0.009～0.011g/L。
优选地，所述种子培养基包括葡萄糖2g/L、KH2PO40.6g/L、K2HPO4·3H2O3.145g/L、柠檬酸钠·2H2O0.1g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.06g/L、CaCl2·2H2O0.003g/L、微量元素母液0.01g/L。
具体的，所述发酵培养基包括葡萄糖0.4～0.6g/L、KH2PO40.6～0.7g/L、一水柠檬酸0.3～0.4g/L、MgSO4·7H2O0.2～0.3g/L、CaCl2·2H2O0.002～0.003g/L，消泡剂0.02～0.03g/L，微量元素母液0.009～0.011g/L。
优选地，所述发酵培养基包括葡萄糖0.5g/L、KH2PO40.667g/L、一水柠檬酸0.355g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、CaCl2·2H2O0.0025g/L、消泡剂0.025g/L、微量元素母液0.01g/L。
在发酵培养基中所述消泡剂的选择为本领域的常规技术手段，例如可选用聚醚消泡剂、有机硅消泡剂等。
微生物对Fe2+、Mn2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Zn2+等微量元素需求量很少，但微量元素对微生物的生长起很大作用，在本发明的技术方案中，在种子培养基、发酵培养基以及步骤(2)流加的葡萄糖溶液中均含有微量元素母液，具体的，所述微量元素母液包括：FeSO4·7H2O4～6g/L、H3BO30.09～0.11g/L、CoCl2·6H2O0.09～0.11g/L、MnSO4·H2O0.3～.04g/L、ZnSO4·7H2O3.7～3.9g/L、NaMoO4·2H2O0.09～0.11g/L、CoSO40.09～0.11g/L。
优选地，微量元素母液包括FeSO4·7H2O5g/L、H3BO30.1g/L、CoCl2·6H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.33g/L、ZnSO4·7H2O3.8g/L、NaMoO4·2H2O0.1g/L、CoSO40.1g/L。
步骤(2)中接种量过大或者过小，均会影响发酵，接种量过大会引起溶氧不足，影响产物合成，而且会过多移入代谢废物；接种量过小则会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。在本发明的技术方案中，步骤(2)的接种量优选为10％。
氨基葡萄糖生产菌在生产过程中需要大量氧气参与代谢，溶氧浓度过高或过低，都会影响菌体生长和产物生成。氧气对好氧微生物有潜在的毒副作用，氧浓度过高会产生Crabtree效应；过低的溶氧浓度则导致乙酸的大量生成，使菌体生长和比生长速率受到抑制，甚至会使菌体发生自溶，严重影响产物合成。因此，维持一定水平的溶氧浓度，不仅有利于菌体生长，还有利于提高氨基葡萄糖水平。在本发明的技术方案中，优选地，步骤(2)中控制溶氧为25～30％，葡萄糖溶液的最大流加速度为1.3～1.6％，更优选地，葡萄糖溶液的最大流加速度为1.6％，此时可以有利于菌体生长，降低乙酸的生成，提高氨基葡萄糖转化率。
在本发明的技术方案中，步骤(2)中流加葡萄糖的方式为本领域的常规技术手段，本发明对此不作特殊限定。
优选地，步骤(2)中维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.2g/L至发酵终点。
本发明进一步提供了氨基葡萄糖的制备方法的最佳实施方式，具体包括以下步骤：
(1)将氨基葡萄糖生产菌按接种量0.5％接入种子培养基，在37℃、pH为7±0.2、溶氧20～30％的条件下培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的产物按接种量10％接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧为25～30％、pH为7±0.2，在温度为37±0.5℃的条件下进行发酵，待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为60％的葡萄糖溶液，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为1.6％，维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.2g/L至发酵终点。
本发明提供了一种氨基葡萄糖的制备方法，并通过控制溶氧水平、发酵罐接种量、葡萄糖限制流加、添加微量元素等措施，使得氨基葡萄糖的含量和转化率得到显著提高。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例一种氨基葡萄糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将大肠杆菌接入种子培养基，接种量为0.5％，在37℃，pH为7.0和溶氧20～30％条件下于5L自动控制发酵罐中培养12～14h至对数期，OD值(660nm)为2.0～2.5；
(2)将步骤(1)得到的产物接入发酵培养基中，接种量为10％，初始通气量为0.8L/min，搅拌转速300～800rpm，溶氧水平为25～30％，通过流加氨水控制pH为7±0.2，培养温度为37±0.5℃，以泡敌消泡(发酵过程中防止起泡逃液，利用外接泡敌瓶消泡)待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为60％的葡萄糖溶液进行补糖，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为0.5～1.6％(即补糖速率小于每小时12g/L，)维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.2g/L，发酵至40h停止。
其中，种子培养基包括葡萄糖2g/L、KH2PO40.6g/L、K2HPO4·3H2O3.145g/L、柠檬酸钠·2H2O0.1g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.06g/L、CaCl2·2H2O0.003g/L、微量元素母液0.01g/L。
发酵培养基包括葡萄糖0.5g/L、KH2PO40.667g/L、一水柠檬酸0.355g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、CaCl2·2H2O0.0025g/L，消泡剂0.025g/L。
微量元素母液包括：FeSO4·7H2O5g/L、H3BO30.1g/L、CoCl2·6H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.33g/L、ZnSO4·7H2O3.8g/L、NaMoO4·2H2O0.1g/L、CoSO40.1g/L。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为90.5g/L，乙酸含量1.8g/L，谷氨酸含量4.8g/L，氨基葡萄糖与糖转化率36.9％。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中残糖浓度、补糖速度和发酵时间不同，在本实施例中，在控制残糖0.2～0.8g/L的条件下，维持最大补糖速度1.6％，发酵积累氨基葡萄糖，发酵培养35h。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为62g/L，乙酸含量8.9g/L，谷氨酸含量16.1g/L，氨基葡萄糖与糖转化率21.2％。
实施例3
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中的接种量、发酵时间不同。在本实施例中，步骤(2)中的接种量为5％，发酵培养时间为42h。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为85g/L，乙酸含量1.9g/L，谷氨酸含量5.1g/L，氨基葡萄糖与糖转化率29％。
实施例4
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中的溶氧的控制条件、补糖速度和发酵时间不同。在本实施例中，步骤(2)在控制溶氧20～25％的条件下，维持补糖速率1.3％，发酵周期37h。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为78g/L，乙酸含量3.7g/L，谷氨酸含量6.6g/L，氨基葡萄糖与糖转化率26.6％。
实施例5
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中的溶氧的控制条件和发酵时间不同。在本实施例中，步骤(2)在控制溶氧30～40％的条件下，发酵培养36.5h。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为85.1g/L，乙酸含量3.7g/L，谷氨酸含量5.6g/L，氨基葡萄糖与糖转化率29％。
实施例6
本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中在流加葡萄糖时不添加微量元素，同时发酵时间也不同。在本实施例中，步骤(2)在流加葡萄糖时不添加微量元素，发酵培养41h。
发酵终点时的产物如下：氨基葡萄糖为89.7g/L，乙酸含量5.1g/L，谷氨酸含量5.7g/L，氨基葡萄糖与糖转化率29.5％。
由实施例1～实施例6的发酵终点的产物可以看出：
实施例1与实施例2相比，氨基葡萄糖产量提高46.7％，乙酸含量降低79.8％，谷氨酸含量降低70.2％，氨基葡萄糖与糖转化率提高74.1％。
实施例1与实施例3相比，氨基葡萄糖产量提高6.5％，乙酸含量降低5％，谷氨酸含量降低5.9％，氨基葡萄糖与糖转化率提高27.2％。
实施例1与实施例4相比，氨基葡萄糖产量提高16％，乙酸含量降低51.3％，谷氨酸含量降低27.3％，氨基葡萄糖与糖转化率提高38.7％。
实施例1与实施例5相比，氨基葡萄糖产量提高6.3％，乙酸含量降低51.3％，谷氨酸含量降低2％，氨基葡萄糖与糖转化率提高27.2％。
实施例1与实施例6相比，氨基葡萄糖产量基本相同，乙酸含量降低64.7％，谷氨酸含量降低15.8％，氨基葡萄糖与糖转化率提高25.1％。
由此可见，实施例1具有最佳的实施效果。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种氨基葡萄糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨基葡萄糖生产菌接入种子培养基并培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的产物按接种量5～10％接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧为20～40％、pH为7±0.2，在温度为37±0.5℃的条件下进行发酵，待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为59～61％的葡萄糖溶液，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为0.5～1.6％，维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.8g/L至发酵终点。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖1.9～2.1g/L、KH2PO40.5～0.7g/L、K2HPO4·3H2O3.1～3.2g/L、柠檬酸钠·2H2O0.09～0.11g/L、硫酸铵0.9～1.1g/L、MgSO4·7H2O0.05～0.07g/L、CaCl2·2H2O0.002～0.004g/L、微量元素母液0.009～0.011g/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括葡萄糖2g/L、KH2PO40.6g/L、K2HPO4·3H2O3.145g/L、柠檬酸钠·2H2O0.1g/L、硫酸铵1g/L、MgSO4·7H2O0.06g/L、CaCl2·2H2O0.003g/L、微量元素母液0.01g/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖0.4～0.6g/L、KH2PO40.6～0.7g/L、一水柠檬酸0.3～0.4g/L、MgSO4·7H2O0.2～0.3g/L、CaCl2·2H2O0.002～0.003g/L，消泡剂0.02～0.03g/L，微量元素母液0.009～0.011g/L。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖0.5g/L、KH2PO40.667g/L、一水柠檬酸0.355g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、CaCl2·2H2O0.0025g/L、消泡剂0.025g/L、微量元素母液0.01g/L。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素母液包括：FeSO4·7H2O4～6g/L、H3BO30.09～0.11g/L、CoCl2·6H2O0.09～0.11g/L、MnSO4·H2O0.3～.04g/L、ZnSO4·7H2O3.7～3.9g/L、NaMoO4·2H2O0.09～0.11g/L、CoSO40.09～0.11g/L。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素母液包括FeSO4·7H2O5g/L、H3BO30.1g/L、CoCl2·6H2O0.1g/L、MnSO4·H2O0.33g/L、ZnSO4·7H2O3.8g/L、NaMoO4·2H2O0.1g/L、CoSO40.1g/L。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中控制溶氧为25～30％，葡萄糖溶液的流加速度为0.3～1.6％。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.2g/L至发酵终点。
10.根据权利要求1～9任一项所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨基葡萄糖生产菌按接种量0.5％接入种子培养基，在37℃、pH为6～8、溶氧20～30％的条件下培养至对数期；
(2)将步骤(1)得到的产物按接种量10％接入发酵培养基，通入氧气，控制溶氧为25～30％、pH为7±0.2，在温度为37±0.5℃的条件下进行发酵，待葡萄糖的浓度减少到0.01～0.2g/L时，开始流加浓度为60％的葡萄糖溶液，并在葡萄糖溶液中添加微量元素母液，葡萄糖溶液的最大流加速度为1.6％，维持发酵液中残糖浓度为0.05～0.2g/L至发酵终点。
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