CN105462885B - 一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用 - Google Patents

一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用。一株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069，于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.11163。本发明所述新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069对引起苹果连作障碍的根皮苷等酚酸类物质具有显著降解效果，对果树植株生长具有极显著的促进作用，并可有效缓解生产中苹果连作障碍问题。

Description

一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用
技术领域
本发明涉及一株酚酸类物质降解菌及其生物有机肥与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
目前我国苹果产量已经跃居世界首位，但是随着现有果园陆续进入老树新树更替期，果树也面临着严重的连作障碍问题。主要表现为新植幼株(苗)生长衰弱，植株矮化节间缩短，叶片小，根系发育不良，易染腐烂病，树体抗逆性低等特点。
植物通过茎叶的挥发、淋溶、根系的分泌以及植株残茬的腐解等途径产生的化感物质是影响根际环境的核心问题，研究发现根系分泌物中的酚酸类物质是目前报道的主要化感物质，包括苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、间苯三酚、丁香酸、肉桂酸、根皮苷等。经调查研究，中国黄土高原苹果产区连作土壤中的酚酸类物质主要是根皮苷、绿原酸和苯甲酸(宋卫红等，2012)；中国渤海湾苹果产区连作土壤中的主要酚酸类物质可能是根皮苷、焦性没食子酸和绿原酸(孙海兵等，2011)。造成果园连作障碍的重要因素之一的根皮苷主要是通过根系的分泌以及残体的腐解释放到土壤中的。崔晓敬(2010)研究发现果园中土壤的根皮苷的含量与果园中果树的树龄有关，随着树龄增加根皮苷的含量也增加。现有研究表明果树的连作障碍与果树根际根皮苷的积累浓度有很大的相关性，高浓度的根皮苷的累积会造成下茬苹果树体生长缓慢、产量下降、品质变劣等。
利用功能菌株降解环境中酚酸类物质以缓解植物连作障碍的研究越来越受到关注，一些土著有益微生物能以酚酸类物质为唯一碳源和能源生长，从而达到生物降解的目的。因此运用微生物降解酚酸类物质来缓解连作障碍方案倍受青睐。
中国专利文献CN104099272A(申请号201410325083.1)公开了一株酚酸类化感物质降解菌及其菌剂的制备和应用；该发明涉及的BJS-1-3菌株，来源于泰安多年生杨树根际土壤，经人工富集、筛选及纯化得到；该菌株对苯甲酸具有较强的降解能力；能够分别利用阿魏酸、对羟基苯甲酸、香草醛、肉桂酸、根皮苷等酚酸类化感物质作为唯一碳源生长繁殖；能够在杨树、苹果、黄瓜根际稳定定殖。利用该菌株制备的菌剂可有效防治因酚酸类化感物质积累造成的杨树、苹果、黄瓜等植物的连作障碍。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株能够降酚酸类物质的新鞘氨醇杆菌及其微生物有机肥料，可应用于缓解苹果树连作障碍。
一株新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069，于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.11163。
新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069从山东省栖霞市观里镇山后泊村苹果再植园土壤中分离得到，主要生物学特性为：菌落较小圆形，黄色有光泽，表面光滑湿润，菌落中心半圆形凸起，不产色素，革兰氏阴性菌G-，吲哚试验、V-P试验、硝酸盐还原和明胶液化为阴性，甲基红试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用、3-酮基乳糖、苯丙氨酸脱氨酶为阳性。
该菌对酚酸类物质具有较强的降解能力，液体摇瓶培养12h对根皮苷的降解率达81.78％，培养24h对根皮苷降解率可达96.88％；液体摇瓶培养12h对焦性没食子酸酸、苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、间苯三酚、丁香酸的降解率为85.0％、33.0％、27.0％、24.0％、20.0％、18.0％、15.0％。
上述新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069在制备缓解果树连作障碍的生物有机肥中的应用。
上述应用，包括如下步骤：
(1)对新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069活化后，经扩大培养后，制得活菌浓度为0.5×1010～1.0×1010cfu/ml的菌液；
(2)将步骤(1)制得的菌液与有机肥料按照体积质量比(40～50):1的比例混合均匀，体积质量比单位：L/t，制得有效活菌数2～4×108cfu/g的生物有机肥。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的有机肥料为符合NY 525(有机肥料)标准要求的有机肥料。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化的步骤如下：
将新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株菌株接种到活化培养基中进行活化培养24h，温度为28～30℃、搅拌转速为180～200r/min；
活化培养基每升组分如下：
根皮苷0.96g、MgSO4·7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的扩大培养的步骤如下：
将活化后的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069按体积百分比2％的接种量接种到发酵培养基中，在温度28～30℃、搅拌转速为180～220r/min的条件下，进行发酵培养；
发酵培养基每升组分如下：
根皮苷0.96g、MgSO4·7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min。
有益效果
1、本发明所述新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069对引起苹果连作障碍的根皮苷等酚酸类物质具有显著降解效果，液体摇瓶培养12h对根皮苷的降解率达81.78％，培养24h对根皮苷降解率可达96.88％；液体摇瓶培养12h对焦性没食子酸酸、苯甲酸、绿原酸、咖啡酸、对羟基苯甲酸、间苯三酚、丁香酸的降解率为85.0％、33.0％、27.0％、24.0％、20.0％、18.0％、15.0％；
2、本发明由新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069制得的生物有机肥，高效降解根皮苷等酚酸类物质的功能菌株在生物有机肥料中含量达到2～4×108cfu/g，可有效地在土壤中定植及发挥功效；同时有机肥还可以为果树生长提供丰富的营养，并促进功能菌发挥功效，改善土壤质地的作用。
3、实验结果表明，在连作障碍严重的土壤中使用本发明所述的生物有机肥后，对植株生长具有极显著的促进作用，与对照相比植株生物量增加158.40％(P<0.01)，苹果连作障碍现象得到有效缓解。
附图说明
图1新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的菌落形态及显微形态；
图2新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株对根皮苷的降解能力与菌体生长关系；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为普通市售产品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所述的有机肥料购自烟台市绿源有机肥有限公司；
根皮苷购自南京泽朗医药科技有限公司。
实施例1菌株的分离、鉴定及保藏
一、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的分离
采样时间：2011年9月
采样地点：山东省栖霞市观里镇山后泊村
从环渤海一带苹果连作园根际采集土样中分离筛选出了74株具有降解苹果根皮苷等酚酸类物质能力的菌株，命名其中一株为AMCC100069菌株。
二、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的鉴定
AMCC100069菌株的菌落形态及显微形态见图1。
菌落圆形较小，黄色有光泽，表面光滑湿润，菌落中心半圆形凸起，不产色素，革兰氏阴性菌G-，吲哚试验、V-P试验、硝酸盐还原和明胶液化为阴性，甲基红试验、接触酶试验、柠檬酸盐利用、3-酮基乳糖、苯丙氨酸脱氨酶为阳性。
AMCC100069菌株的16SrDNA序列如序列表的序列1所示。
三、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的保藏
经鉴定，AMCC100069菌株属新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)，已于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.11163。
实施例2、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的降解能力室内测定
一、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的降解能力室内测定
将新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株菌株接种到活化培养基中进行活化培养24h，温度为28～30℃、搅拌转速为180～200r/min；
活化培养基每升组分如下：
根皮苷0.96g、MgSO4·7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min；
将活化后的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069按2％(质量百分比)的接种量接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基(培养基组成及质量：根皮苷0.96g、MgSO4.7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min)，30℃、160r/min摇床培养并测定根皮苷降解率。
结果表明：培养12h后新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株对根皮苷的降解率达81.78％，培养24h后新鞘氨醇杆菌(NovosphingobiumSubarcticum)AMCC100069菌株对根皮苷降解率可达96.88％。对根皮苷具有显著的降解效果。
将活化后的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069按2％(质量百分比)的接种量接种到含2mmol/L的绿原酸、间苯三酚、焦性没食子酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、咖啡酸、苯甲酸七种不同的酚酸液体培养基(培养基组成及质量：酚酸类物质0.96g、MgSO4.7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min)，30℃、160r/min摇床培养12h后测定对不同酚酸类物质降解率。结果表明该菌对七种酚酸类物质均具有一定的降解能力。
表1AMCC100069菌株对不同酚酸的降解谱(12h)
二、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株对根皮苷的降解曲线
将活化后的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069按2％(质量百分比)的接种量接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基(培养基组成及质量：根皮苷0.96g、MgSO4.7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min)，30℃、160r/min摇床培养20h，每隔4h取一次样8000r/min离心10min收集发酵液。用乙酸乙酯跟发酵液(v:v)1:1的比例萃取发酵液中的根皮苷，取有机相进行旋转蒸发最后溶于2mL的甲醇中，13000r/min离心10min去蛋白，上样前用0.45μm的滤膜过滤，然后用高效液相色谱仪(C18柱)测定根皮苷的残余量，计算根皮苷的降解率并测定菌体生长情况。
检测条件为：检测波长为270nm，柱温30℃，进样量为10μL，体积分数0.6％的乙酸水溶液(95％)与乙腈(5％)以流速1mL/min洗脱40min。
结果表明：随着处理时间的增加，处理组的根皮苷的降解率不断增高，且在新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株菌体生长量和根皮苷降解率间呈正相关(图2)。
实施例3、微生物有机肥的制备及盆栽试验
一、微生物有机肥的制备
1.将新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株菌株接种到活化培养基中进行活化培养24h，温度为28～30℃、搅拌转速为180～200r/min；
活化培养基每升组分如下：
根皮苷0.96g、MgSO4·7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g，水定容至1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min；
将活化后的新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069按2％(质量百分比)的接种量接种到发酵培养基中，发酵温度为28～30℃、搅拌转速为180～220r/min，使发酵液中菌体含量不少于1.0×1010cfu/g；
发酵培养基每升组分如下：
根皮苷0.96g、MgSO4.7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g、蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。
2.将40L所述新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的发酵液与1吨有机肥混合均匀，制得有效活菌数2～4×108cfu/g的生物有机肥。
所述有机肥可为符合NY 525(有机肥料)标准要求的有机肥料。所述有机肥具体可为烟台市绿源有机肥有限公司生产的绿霞有机肥料。得到所述生物有机肥料中有效活菌数为2～4×108cfu/g；
二、盆栽试验
在山东农业大学国家苹果工程科技研究中心基地进行盆栽试验。将新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株接种到2mmol/L的根皮苷液体培养基(培养基组成及质量：根皮苷0.96g、MgSO4.7H2O 0.2g、NH4H2PO4 1g、KCl 0.2g、蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，121℃灭菌20min)中30℃、160r/min培养12小时，离心收集菌体，然后用无菌水洗涤重悬使其菌悬液的浓度为1×108CFU/mL，备用。
取已长4～6片真叶的平邑甜茶实生苗进行盆栽，按常规管理进行灌溉及清除杂草，栽培5个月后检测各指标。具体实验设计如下：
表2盆栽实验设计
注：—表示未添加。
结果表明：与CK相比，T1处理地上、地下部鲜重分别减少约31.24％、43.41％(P<0.01)，表明高浓度的根皮苷对植株生长具有极显著的抑制作用；T2处理地上、地下部鲜重分别增加约18.67％、18.81％(P<0.01)；T3处理地上、地下部鲜重分别增加约135.68、93.87％(P<0.01)。表明加入新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌液的处理和加入包含新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium Subarcticum)AMCC100069菌株的生物有机肥的处理都对对植株生长具有极显著的促进作用，并可有效缓解因高浓度根皮苷积累而造成的苹果连作障碍问题。(如表3所示)
表3不同处理植株的生物量
注：在同一行中的平均数据采用多重比较，凡尾部标有不同字母的数值表示它们之间有显著差异(小写字母P<0.05，差异达显著水平；大写字母P<0.01，差异达极显著水平)。

Claims (6)

1.一株新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium Subarcticum）AMCC100069，于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏编号为CGMCC No.11163。
2.权利要求1所述新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium Subarcticum）AMCC100069在制备缓解苹果树连作障碍的生物有机肥中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）对新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium Subarcticum）AMCC100069活化后，经扩大培养后，制得活菌浓度为0.5×1010～1.0×1010cfu/ml的菌液；
（2）将步骤（1）制得的菌液与有机肥料按照体积质量比（40～50）:1的比例混合均匀，体积质量比单位：L/t，制得有效活菌数2～4×108 cfu/g的生物有机肥。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中的有机肥料为符合NY 525标准要求的有机肥料。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的活化的步骤如下：
将新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium Subarcticum）AMCC100069菌株接种到活化培养基中进行活化培养24h，温度为28～30℃、搅拌转速为180～200r/min；
活化培养基每升组分如下：
根皮苷 0.96 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4H2PO4 1 g、KCl 0.2 g，水定容至1000mL，pH7.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中的扩大培养的步骤如下：
将活化后的新鞘氨醇杆菌（Novosphingobium Subarcticum）AMCC100069按体积百分比2%的接种量接种到发酵培养基中，在温度28～30℃、搅拌转速为180～220r/min的条件下，进行发酵培养；
发酵培养基每升组分如下：
根皮苷 0.96 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NH4H2PO4 1 g、 KCl 0.2 g，水定容至1000mL，pH7.0。
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