CN105462872A - 一种复合微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要针对目前水产养殖中池塘水质差的问题，应用现代生物工程技术，提供一种水产用改水肥水功能的复合活菌制剂及其制备方法。本发明的复合微生态制剂为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和酿酒酵母通过混菌液体深层发酵制备而成。在该液体制剂中微生物处于休眠状态，稳定而易保存，投放到水体后，休眠菌株能够很快复苏，迅速分解水中的有害物质如：亚硝酸氮、氨氮等，同时，促进优良藻类生长，抑制有害藻类繁殖，从而达到改善养殖水体水质的目的。

Description

一种复合微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于水产微生态制剂技术领域，具体涉及一种微生态制剂及其制备方法。

背景技术

近年来，高密度、集约化水产养殖模式极易打破了池塘原有的生态平衡：有害耐药细菌及有害藻类大量繁殖；池塘中分解氨氮、亚硝酸盐及硫化氢等有害物质的微生物不足，水体中氨氮、亚硝酸盐等有害物质积累，最终会影响水体中的养殖动物健康和生长品质。因此，养殖环境中的菌相、藻相平衡以及水中有害物质含量是养殖生产中亟待解决的三大问题。养殖生产中需要养殖水体中益生菌比例得到提高，氨氮、亚硝酸盐等有害物质含量降低，同时，通过促进绿藻、硅藻等有益藻类的生长繁殖，维持藻相平衡，有害藻类过度繁殖得到抑制。而使用功能全面的微生态制剂能够达到目的。又因其安全、无污染和无残留的特点受到青睐和重视。

目前，市场上已有众多的同类产品但还存在许多不足，比如产品中微生物菌株功能不高效；包含菌株种类多但不乏滥竽充数；菌株环境适应范围小；产品中菌株间的协作关系不好，协同效应不好；液体深层发酵技术不稳定，产品一致性差；后处理不当，产品维持性差等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种复合微生态制剂。该制剂不仅能够降低养殖水体中氨氮和亚硝态氮等有害物质，还能够促进有益藻的生长，另外，还提供了多种有益微生物以及分泌有益因子。

本发明的另一目的在于提供一种复合微生态制剂的制备方法。

本发明提供的复合微生态制剂，其为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和酿酒酵母通过混菌液体深层发酵制备而成。

其中，芽孢杆菌的活菌数为1×10^9-10CFU/mL，乳酸菌活菌数为1×10^9-10CFU/mL，酵母菌的活菌数为1×10^6-8CFU/mL。

其中，所述的枯草芽孢杆菌优选保藏号为CGMCCNo.9356的枯草芽孢杆菌。

其中，所述的屎肠球菌优选保藏号为CGMCCNo.9134的屎肠球菌。

本发明提供的所述的复合微生态制剂的制备方法，包括如下步骤：

1）种子液制备：分别制备所述菌株的一级和二级种子液；

2）种子罐发酵：将步骤1）的制备的所述菌株的种子液混合均匀后接入种子罐进行混合发酵，发酵温度33℃，转速60-100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，pH值为4.3-7.0，发酵时间8-10h；

3）发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，全部接入发酵罐进行发酵罐发酵，发酵温度33℃，转速60-100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，pH值为4.3-7.0，发酵时间8-10h。

其中，芽孢杆菌种子液的制备方法如下：

将所述的芽孢杆菌的单菌落分别接种至MNB培养基中，180rpm，33℃培养12-16h至OD600为0.9~1.1；按照1.0-2.0%的接种量将制备的一级种子液接种至MNB培养基中，180rpm，33℃培养10-12h至OD600为0.7~1.0。

其中，乳酸菌种子液的制备方法如下：

将所述的乳酸菌的单菌落分别接种至MRS培养基中，37℃培养16-24h至OD600为0.8~1；将制备好的一级种子液按照1.0-2.0%的接种量接种至MRS培养基中，37℃培养16-20h至OD600为0.7-1.0。

其中，酿酒酵母种子液的制备方法如下：

将酿酒酵母接种至YPD培养基中，180rpm30℃培养12-16h至OD600为0.8-1.0；将制备好的一级种子液按照0.5-1.0%的接种量接种至YPD培养基中，180rpm30℃培养10-12h至OD600为0.8-1.0。

其中，种子罐发酵和发酵罐发酵所用培养基含有：种子罐发酵和发酵罐发酵所用培养基含有：可溶性淀粉5-10g/L；蛋白胨15-20g/L；酵母膏2-4g/L；葡萄糖15-20g/L；磷酸二氢钾2-4g/L；氯化钠3-5g/L；碳酸钙0.5-1g/L。

本发明所用的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）H8-1，其显著区别于现有的枯草芽孢杆菌，为申请人从福建虾高位池池水中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面光滑，半透明，呈污白色，菌落圆形，边缘成锯齿状；菌落形态为杆状，大小为0.8~1.2×1.5~4.0um，芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

本发明中的枯草芽孢杆菌H8-1对浓度为2.5mg/L的氨氮、亚硝态氮降解率分别为81.72%、99.70%，能有效降解水体的氨氮和/或亚硝态氮水平。与现有的枯草芽孢杆菌区别于可以在0‰、3‰、15‰盐浓度条件下均生长良好，可以耐受10-15℃低温生长良好。本发明的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）H8-1已于2014年6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9356。

本发明屎肠球菌分离自猪肠道，并经过紫外诱变筛选获得。

屎肠球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134的特征为：

（1）屎肠球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液80℃处理5min，存活率为0.18%，相对出发菌株提高22倍。

（2）屎肠球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.3%的猪胆盐处理3h，存活率为20.80%，相对出发菌株提高3.04倍。

（3）屎肠球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.6%的猪胆盐处理3h，存活率为21.6%，相对出发菌株提高27.69倍。

将本发明的屎肠球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，登记号：CGMCCNo.9134。本发明的屎肠球菌新菌株经过10次以上的传代培养不退化，具有遗传稳定性，且抗逆性远远比出发菌株提高很多。

本发明的复合微生态制剂的优点和有益效果是：本发明复合微生态制剂中的菌种都是安全、优良菌种；生长特性不同，菌株间协作共生效应好：芽孢杆菌和酵母菌可为乳酸菌的生长提供无氧环境，且发酵过程中，不同菌株的代谢过程各异，相互调节共同达到一个稳态，为发酵液的保存提供了有利条件；不同菌种各司其职，功能全面：芽孢杆菌降解水中的有害物质、剩余饵料及杂质；乳酸菌产生有机酸，提高养殖动物免疫活性；酵母菌的生长能够分解利用碳水化合物合成微生物蛋白，为有益藻生长提供原料；菌种丰富，产品稳定性好，防污染能力强。

附图说明

图1为EM10发酵液样品肥水功效测定结果。配制统一肥水功效测定培养基，灭菌，实验前同时加入同比例的小球藻液体。在光照条件下，室温，放置培养72h，培养过程中每隔4h进行摇晃15次。实验分为阴性对照组（CK）、阳性对照组(市售产品组)以及试验组（EM10组），重复数为3，EM10和市售产品组接种菌浓度终为10⁵CFU/mL，分别从瓶中取样10mL进行叶绿素-a含量的测定，EM10组和市售产品组样品的叶绿-a含量分别比CK组样品叶绿素-a含量提高了42.12%和34.48%。

图2为EM10发酵液样品亚硝态氮降解率测定结果。起始亚硝氮浓度为2.5mg/L，实验前试验组添加EM10产品，菌浓度为10⁴CFU/mL；对照组为（CK）空白，培养温度为30℃，转速180rpm，培养1、2、3天后取样进行测定。亚硝氮降解率分别为：71%、84%、88%，对照组为：0%、1.5%、2.3%。

图3为EM10发酵液样品氨氮降解率测定结果。起始亚硝氮浓度为2.5mg/L，实验前试验组添加EM10产品，菌浓度为10⁴CFU/mL；对照组为（CK）空白，培养温度为30℃，转速180rpm，培养1、2、3天后取样进行测定。添加EM10培养3天，氨氮降解率分别为71%、83%，92%，对照组为：0%、1%、1%。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1共生菌种组合的获得

将以下所有菌株作为微生态制剂研究的候选菌株：（1）本实验室新保藏功能优异的菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）CGMCCNo.9356和屎肠球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134；（2）实验室已保藏优秀菌株包括：地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNo.7030；酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.6921；短小乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CGMCCNo.4756；约氏乳杆菌（Lactobacillusjohnsonii）CGMCCNo.4926，嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）CGMCCNo.6499；乳酸片球菌（Pediococcusacidilactic）CGMCCNo.6500；（3）市售菌株：从市售单菌株菌粉中分离得到如下菌株：1株乳酸乳球菌，分离自MG1614乳酸乳球菌菌粉；1株植物乳杆菌，分离自购自于北京和美科盛生物技术有限公司的P8植物乳杆菌菌粉；1株干酪乳杆菌，分离自芯来旺生物科技（南京）有限公司干酪乳杆菌菌粉；1株解淀粉芽孢杆菌，分离自汕头市富耕源农业科技有限公司解淀粉芽孢杆菌菌粉；1株巨大芽孢杆菌，分离自沧州旺发生物技术研究所(普通合伙)菌粉；1株放线菌，分离自沧州旺发生物技术研究所有限公司菌粉。将以上株菌采用同一培养基YH分别培养后，取浓度相同的菌株种子液各1mL，接入一定体积的液体培养基YH液体培养基中进行混合培养，发酵温度33℃，摇床转速100rpm，起始pH值为7.0，连续培养5d，将获得的混合菌液梯度稀释，分别在LB、MRS、YPD和高氏一号固体培养基上进行涂布，挑取所有不同单菌落进行鉴定。

鉴定结果为：1株枯草芽孢杆菌、1株巨大芽孢杆菌、1株解淀粉芽孢杆菌、1株地衣芽孢杆菌、1株屎肠球菌、1株短小乳杆菌、1株植物乳杆菌、1株乳酸乳球菌、1株酿酒酵母菌共9株菌，在发酵液中共生存在。

所用的发酵培养基配方如下：可溶性淀粉，10g/L；蛋白胨20g/L；酵母膏4g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾4g/L；氯化钠5g/L；碳酸钙1g/L。

实施例29株菌液体混合培养

筛选得到9株菌的共生菌种组合，将9株菌采用同一培养基YH分别培养后，取浓度相同的菌株种子液各1mL，接入一定体积的液体培养基YH中进行混合培养，发酵温度33℃，摇床转速100rpm，起始pH值为7.0，连续培养4d，记录0、3、4d活菌数，结果如表1所示：9株菌混合培养4d后，芽孢杆菌总浓度达到1.4×10 ¹² CFU/mL以上，乳酸菌总浓度为6.08×10 ¹¹ CFU/mL以上，酵母菌浓度为6.52×10 ⁸ CFU/mL以上，说明9株菌协同生长情况良好。

表1

实施例39株菌种子液制备

（1）4株芽孢杆菌种子液的制备

将枯草芽孢杆菌H8-1，保藏编号为CGMCCNo.9356；巨大芽孢杆菌；地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）CGMCCNo.5094；解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.7030单菌落分别接种至装有100mlMNB培养基的250mL锥形瓶中，摇床转速为180rpm，33℃恒温摇床中培养16h；将制备好的一级种子液，OD600为0.9左右，按照1.0%的接种量接种至装有500mLMNB培养基的1L锥形瓶中，33℃恒温摇床中培养12h，摇床转速为180rpm，OD600为0.8左右；

（2）4株乳酸菌种子液的制备

将屎肠球菌，保藏编号为CGMCCNo.9134；短小乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CGMCCNo.4756；植物乳杆菌；乳酸乳球菌单菌落分别接种至装有100mlMRS培养基的250mL锥形瓶中，37℃恒温厌氧培养20h；将制备好的一级种子液，OD600为1.0，按照2.0%%的接种量接种至装有500mLMRS培养基的1L锥形瓶中，37℃恒温厌氧培养20h，OD600为1.0。

（3）1株酿酒酵母种子液的制备

将酿酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.6921接种至装有100mlYPD培养基的250mL锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养12h，摇床转速为1800rpm；将制备好的一级种子液，OD600为0.8；按照0.5%的接种量接种至装有500mlYPD培养基的1L锥形瓶中，30℃恒温摇床中培养12h，摇床转速为180rpm，OD600为0.8。

实施例4种子罐液体混菌发酵

分别取500mL的各菌株二级种子液，共4.5L种子液，在发酵前混合均匀后接入装液量为70L的100L种子罐中进行混菌发酵，发酵温度33℃，转速100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，初始pH值为6.7，发酵时间8h，镜检菌落形态种类齐全，且比例均匀。

所用的发酵培养基YH配方如下：可溶性淀粉，10g/L；蛋白胨20g/L；酵母膏4g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾4g/L；氯化钠5g/L；碳酸钙1g/L。

实施例5发酵罐液体混菌发酵制备微生态液体制剂

种子罐发酵完成后，全部接入装液量为1.2t的1.5t发酵罐，在一定条件下进行发酵罐发酵，发酵温度33℃，转速100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，pH值为4.3-7.0，发酵时间9h，镜检菌落形态种类齐全，且比例均匀。

所用的发酵培养基YH配方如下：可溶性淀粉，10g/L；蛋白胨20g/L；酵母膏4g/L；葡萄糖20g/L；磷酸二氢钾4g/L；氯化钠5g/L；碳酸钙1g/L。

实施例6发酵液肥水功效测定

取10mL配制的肥水膏到1000mL水中组成功效测定培养基。配制统一肥水功效测定培养基，灭菌，实验前同时加入同比例的小球藻液体。在光照条件下，室温，放置培养72h，培养过程中每隔4h进行摇晃15次。实验分为阴性对照组（CK）、阳性对照组(市售产品组)（一种全效稳水剂，产品组成菌种分类与EM10相似，现广泛应用于水产养殖中。）以及试验组（EM10组，实施例5制备的微生态液体制剂，下同），重复数为3，EM10和市售产品组接种菌浓度终为10⁵CFU/mL，分别从瓶中取样10mL样品进行叶绿素-a含量的测定，如图1可见，EM10组和市售产品组样品的叶绿-a含量分别比CK组叶绿素-a含量提高了42.12%和34.48%。

肥水膏配方为：糖蜜，78%；硝酸铵，5%；腐植酸钠，7%；硅酸钠，5%；过磷酸钙，3%；磷酸二氢钾，0.2%；硫酸锰，0.6%；硫酸铜，0.25%；七水硫酸亚铁，0.5%；钼酸铵，0.1%；硼酸，0.1%；硫酸锌，0.25%；

叶绿素测定方法：

试剂配制：配制80%丙酮备用；二甲基亚砜与80%丙酮按照体积比1:2的比例配制溶剂(现用现配)。

滤膜的制备：将孔径为0.45um的醋酸纤维滤膜浸泡于1‰HCl中24h，浸泡后用蒸馏水涮洗干净，用小镊子置于玻璃平皿上，50℃烘干；烘干后放于干燥器内冷却，冷却后称重，选取重量差距较小的一批备用。

仪器设备：4℃恒温冰箱、分光光度计（能同时测定663、645两个波段的吸光值）、离心机（6000转）、量筒（25ml）、塑料离心管（10ml）、真空泵、0.45um微孔醋酸纤维滤膜、干燥器、小镊子、玻璃平皿、10ml离心管架。

测定步骤：1）取待测液，摇匀，量取25ml，放入真空泵抽滤，将藻类过滤置滤膜上，以小镊子轻取滤膜，置于10ml离心管备用；2）取配制好的二甲基亚砜与80%丙酮混合液10ml，加入上一步离心管中，迅速摇匀，将滤膜溶解（如果摇匀不及时，滤膜将粘贴在离心管上，影响实验效果；3）将离心管置于离心管架，放入4℃恒温冰箱内，静置提取24h；4）经过静置提取后，测定样品吸光值，测定波长分别为663nm、645nm，按照公式带入，即可得到叶绿素-a吸光值；5）测定过程中，每个水样要求测定双样，以保证数据的稳定性，同时，要求测定CK，即：水样，不经过藻类过滤，其余步骤与测定方法相同。

计算公式：叶绿素-a含量（ug/L）=(12.7×A663纯吸光值-2.69×A645纯吸光值)×萃取液体积（ml）/水样体积（L）。

实施例7微生态液体制剂降氮功能测定

配制亚硝、氨氮降解能力测定培养基，亚硝氮、氨氮浓度分别为2.5mg/L，灭菌。实验前试验组添加EM10产品，菌浓度为10⁴CFU/mL；对照组为空白，分别培养1、2、3天后取样进行测定。

测定方法：在超净台中，将待测菌株菌液接入相应的测定培养基中，接种终浓度为5×10⁵CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180r/min；均匀取样到1.5mL离心管中，12000rpm离心3min，取上清200μL加入96孔板；

测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定；测定氨氮时每孔加入纳氏试剂20μL，于450nm比色测定。

筛选培养基为两种：氨氮筛选培养基和亚硝酸氮筛选培养基；

氨氮筛选培养基为每50mL由(NH₄)2SO₄母液50ul，市售粉碎虾料0.05mg和余量的水（0‰、3‰、15‰盐浓度）组成，铵态氮浓度为：2.5mg/l；

亚硝酸氮筛选培养基为每50mL由NaNO₂母液50ul，市售粉碎虾料0.05mg和余量的水（0‰、3‰、15‰盐浓度）组成，亚硝态氮浓度为：2.5mg/l；

硫酸铵母液为称取9g(NH₄)₂SO₄加入1L模拟虾池水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l；

亚硝酸钠母液为称取3.75gNaNO₂加入1L模拟虾池水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。

如图2、3所示：添加EM10培养3天，氨氮降解率分别为71%、83%，92%，对照组为：0%、1%、1%；亚硝氮降解率分别为：71%、84%、88%，对照组为：0%、1.5%、2.3%，3天后氨氮、亚硝氮降解率都达到了80%以上，EM10发挥了非常理想的降氮功效。

本发明复合微生态制剂中的菌种都是安全、优良菌种；菌种丰富，功能全面：不仅能够降解养殖水体中的有害物质、剩余饵料及杂质；且含有有机酸等有益因子，提高养殖动物免疫活性；发酵生产过程中能够合成微生物蛋白，为有益藻生长提供原料；产品稳定性好，防污染能力强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种复合微生态制剂，其特征在于，其为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、屎肠球菌、短小乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和酿酒酵母通过混菌液体深层发酵制备而成。

2.如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于，芽孢杆菌的活菌数为1×10^9-10CFU/mL，乳酸菌活菌数为1×10^9-10CFU/mL，酵母菌的活菌数为1×10^6-8CFU/mL。

3.如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏号为CGMCCNo.9356。

4.如权利要求1所述的复合微生态制剂，其特征在于，所述的屎肠球菌的保藏号为CGMCCNo.9134。

5.权利要求1-4任一项所述的复合微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）种子液制备：分别制备所述菌株的一级和二级种子液；

2）种子罐发酵：将步骤1）的制备的所述菌株的种子液混合均匀后接入种子罐进行混合发酵，发酵温度33℃，转速60-100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，pH值为4.3-7.0，发酵时间8-10h；

3）发酵罐发酵：种子罐发酵完成后，全部接入发酵罐进行发酵罐发酵，发酵温度33℃，转速60-100rpm，灌压0.5Mpa，通风比是1:0.4-0.8，pH值为4.3-7.0，发酵时间8-10h。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，芽孢杆菌种子液的制备方法如下：

将所述的芽孢杆菌的单菌落分别接种至MNB培养基中，180rpm，33℃培养12-16h至OD600为0.9~1.1；按照1.0-2.0%的接种量将制备的一级种子液接种至MNB培养基中，180rpm，33℃培养10-12h至OD600为0.7~1.0。

7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，乳酸菌种子液的制备方法如下：

将所述的乳酸菌的单菌落分别接种至MRS培养基中，37℃培养16-24h至OD600为0.8~1；将制备好的一级种子液按照1.0-2.0%的接种量接种至MRS培养基中，37℃培养16-20h至OD600为0.7-1.0。

8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，酿酒酵母种子液的制备方法如下：

将酿酒酵母接种至YPD培养基中，180rpm30℃培养12-16h至OD600为0.8-1.0；将制备好的一级种子液按照0.5-1.0%的接种量接种至YPD培养基中，180rpm30℃培养10-12h至OD600为0.8-1.0。

9.如权利要求6-8任一项所述的制备方法，其特征在于，种子罐发酵和发酵罐发酵所用培养基含有：可溶性淀粉5-10g/L；蛋白胨15-20g/L；酵母膏2-4g/L；葡萄糖15-20g/L；磷酸二氢钾2-4g/L；氯化钠3-5g/L；碳酸钙0.5-1g/L。