CN105445478B - 活化部分凝血活酶时间测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒及其制备方法,该活化部分凝血活酶时间测定试剂盒免去了配制过程中的分装和冻干等步骤,避免了因冻干和复溶过程造成的试剂的瓶间差异,从而导致测定结果之间的较大差异。本发明试剂无需冻干,即可保证试剂的稳定性,确保了开瓶后试剂的最优有效性持续至少一个月,避免了实验结果间的较大差异,同时节约了试剂的用量,开瓶即用,操作起来更加快捷简便。
Description
技术领域
本发明涉及一种体外诊断试剂盒及其制备方法,尤其涉及一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒及其制备方法,属于生物技术领域。
背景技术
机体的止血功能是由血小板、凝血***、纤溶***和血管内皮***等的共同作用来完成的。过去我们曾用出血时间作为止血功能缺陷的筛检试验,但因其操作标准化程度不高,敏感性不好,且无法反映凝血因子的含量及活性,故目前已为凝血功能检查所取代。凝血功能检查主要是凝血四项——凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和纤维蛋白原含量。凝血四项是检验科的重要临检项目,也是手术前必须检测的项目之一,凝血四项检测对了解检查对象的凝血功能有重要意义。
活化部分凝血活酶时间(APTT)测定是内源性凝血因子缺乏最可靠的筛选试验,是用来证实先天性或获得性凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ的缺陷或是否存在它们相应的抑制物。APTT延长见于:(1)因子Ⅷ、Ⅸ和Ⅺ血浆水平减低,如血友病。(2)严重的凝血酶原(因子Ⅱ)因子Ⅴ、Ⅹ和纤维蛋白原缺乏,如肝脏疾病、阻塞性黄疸、新生儿出血症、肠道灭菌综合征、吸收不良综合征、口服抗凝剂、应用肝素以及低(无)纤维蛋白原血症。(3)纤容活力增强,如继发性或原发性纤溶以及血循环中有纤维蛋白(原)降解物(FDP)。(4)血循环中有抗凝物质,如抗因子Ⅷ或Ⅸ抗体、SLE等。APTT缩短见于:(1)高凝状态,如DIC的高凝血期,促凝物质进入血流以及凝血因子的活性增高等。(2)血栓性疾病,如心肌梗塞、不稳定性心绞痛、脑血管病变、糖尿病伴血管病变、肺梗死、深静脉血栓形成、妊娠高血压综合征和肾病综合征等。
由于市售的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒种类繁多且质量参差不齐,使得同个患者在不同的实验室中测定的结果差别较大,使得检测结果不准确,从而影响医生对疾病的正确诊断与治疗。因此,活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂的质量成了准确的测定结果及正确诊断治疗的关键性因素。同时,由于很多干粉试剂需复溶后使用,而复溶后的试剂稳定性又较差,又会给APTT测定的操作带来麻烦并且造成不必要的浪费,因此,研制一种有效可靠、使用方便的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂无疑是相当必要的。
发明内容
为了克服上述现有背景技术中的不足,本发明提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒及其制备方法,该活化部分凝血活酶时间测定试剂盒免去了配制过程中的分装和冻干等步骤,避免了使用过程中复溶所导致试剂稳定性和测定效果变差的问题,保证了试剂的稳定性,同时也避免了试剂的浪费,进一步得到准确性、重复性及稳定性等总体性能更好且操作更简便的活化部分凝血活酶时间测定试剂。
为了实现上述目的,本发明提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;
所述磷脂试剂由固体激活剂、磷脂和缓冲体系混合而成,所述固体激活剂的含量为0.01~2g/L,所述固体激活剂选自鞣花酸、皂土、高岭土、硅藻土、硅酸镁铝其中一种或几种的混合物;所述磷脂的含量为2.5~8wt%,所述缓冲体系的pH为6.0~8.0,所述缓冲体系中各组分含量为包括:0.1~1M的缓冲剂、0.01~0.2wt%的稳定剂、0.1~1.0wt%的聚乙二醇、其余为水;所述缓冲剂选自于:Tris-Hcl、Hepes、PBS、MPOS;所述稳定剂选自于:叠氮钠、Kathon、Proclin、甘氨酸、牛血清白蛋白、硫柳汞、硝酸汞苯、氯仿、石炭酸;
所述氯化钙试剂的工作浓度为15~40mM。
优选地,在上述技术方案中,所述固体激活剂的含量为0.05~1g/L。
优选地,在上述技术方案中,所述磷脂含量为5~7wt%。
优选地,在上述技术方案中,所述磷脂为兔脑磷脂。
优选地,在上述技术方案中,所述缓冲剂在缓冲体系中的含量为0.4~0.75M。
优选地,在上述技术方案中,所述稳定剂在缓冲体系中的含量为0.05~0.1wt%,更优选地,所述稳定剂为Kathon、甘氨酸、血清白蛋白的1:0.86:1.1的混合物。
优选地,在上述技术方案中,所述稳定剂选自于:叠氮钠、Kathon、Proclin、甘氨酸、牛血清白蛋白、硫柳汞、硝酸汞苯、氯仿、石炭酸。
优选地,在上述技术方案中,所述聚乙二醇在缓冲体系中的含量为0.3~0.8wt%。
优选地,在上述技术方案中,所述氯化钙试剂的工作浓度为20~35mM。
本发明还提供一种制备上述所述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒的方法,包括如下步骤:首先(1)配制缓冲体系,pH调至6.0~8.0,加入固体激活剂后混匀,得到初始混合溶液;(2)向初始混合溶液中加入不同浓度的磷脂混匀,配合氯化钙溶液在凝血仪上进行质控测定,测定结果最接近该机型凝血仪的质控范围中间值的试剂比例就是最终的配比;(3)按照最终的试剂配比,向初始混合溶液中加入磷脂,搅拌混匀后加入聚乙二醇和稳定剂,混匀后即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的磷脂试剂;(4)称量氯化钙固体溶解于一级水中,混匀即为即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的氯化钙试剂;(5)将磷脂试剂和氯化钙试剂分别包装后得到活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。
本发明的有益效果:提供一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒及其制备方法,该活化部分凝血活酶时间测定试剂盒免去了配制过程中的分装和冻干等步骤,避免了因冻干和复溶过程造成的试剂的瓶间差异,从而导致测定结果之间的较大差异。本发明试剂无需冻干,即可保证试剂的稳定性,确保了开瓶后试剂的最优有效性持续至少一个月,避免了实验结果间的较大差异,同时节约了试剂的用量,开瓶即用,操作起来更加快捷简便。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
本发明的活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同的容器中;
磷脂试剂由固体激活剂、磷脂和缓冲体系组成,固体激活剂的含量为0.01~2g/L,磷脂的含量为2.5~8wt%,缓冲体系的pH为6.0~8.0,缓冲体系中各组分含量为:0.1~1M的缓冲剂、0.01~0.2wt%的稳定剂、0.1~1.0wt%的聚乙二醇、其余为水;所述缓冲剂选自于:Tris-Hcl、Hepes、PBS、MPOS;所述稳定剂选自于:叠氮钠、Kathon、Proclin、甘氨酸、牛血清白蛋白、硫柳汞、硝酸汞苯、氯仿、石炭酸;
氯化钙试剂的工作浓度为15~40mM。
制备上述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒的方法,包括如下步骤:(1)配制缓冲体系,pH调至6.0~8.0,加入固体激活剂后混匀,得到初始混合溶液;(2)向初始混合溶液中加入不同浓度的磷脂混匀,配合氯化钙溶液在凝血仪上进行质控测定,测定结果最接近该机型凝血仪的质控范围中间值的试剂比例就是最终的配比;(3)按照最终的试剂配比,向初始混合溶液中加入磷脂,搅拌混匀后加入聚乙二醇和稳定剂,混匀后即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的磷脂试剂;(4)称量氯化钙固体溶解于一级水中,混匀即为即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的氯化钙试剂;(5)将磷脂试剂和氯化钙试剂分别包装后得到活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。
实施例1
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;磷脂试剂由鞣花酸、磷脂和缓冲体系组成,鞣花酸的含量为2g/L,磷脂的含量为2.5wt%,缓冲体系中各组分含量为:1M的Tris-Hcl、0.01wt%的Kathon、1.0wt%的聚乙二醇、其余为水,缓冲体系的pH为6.0;氯化钙试剂的工作浓度为15mM。使用本发明试剂盒时,待测血浆与磷脂试剂用量的体积比为1:0.85~1.1。
制备上述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒的方法,包括如下步骤:(1)配制缓冲体系,pH调至6.0~8.0,加入固体激活剂后混匀,得到初始混合溶液;(2)向初始混合溶液中加入不同浓度的磷脂混匀,配合氯化钙溶液在凝血仪上进行质控测定,测定结果最该机型凝血仪的质控范围中间值的试剂比例就是最终的配比;(3)按照最终的试剂配比,向初始混合溶液中加入磷脂,搅拌混匀后加入聚乙二醇和稳定剂,混匀后即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的磷脂试剂;(4)称量氯化钙固体溶解于一级水中,混匀即为即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的氯化钙试剂;(5)将磷脂试剂和氯化钙试剂分别包装后得到活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。
应用本实施例得到的试剂盒借助半自动血凝仪测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法为:先将磷脂试剂平衡至室温,氯化钙试剂温浴至37℃,再将待测血浆与磷脂试剂按照体积比为1:0.85~1.1的比例混匀,置于37℃温浴3min,再加入氯化钙试剂,使其终浓度为15~40mM,立刻混匀计时,记录凝血酶原时间。做十次平行实验,记录数据,分析本实施例试剂的重复性,本实施例中试剂重复性如表1。
实施例2
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;所述磷脂试剂由皂土、兔脑磷脂和缓冲体系组成,皂土的含量为0.05g/L,兔脑磷脂的含量为7wt%,缓冲体系中各组分的含量为:0.4M的MPOS、0.1wt%的叠氮钠、0.8wt%的聚乙二醇、其余为水;缓冲体系的pH为7.8,氯化钙试剂的工作浓度为20mM。
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒制备方法同实施例1。
应用本实施例得到的试剂盒在半自动血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法同实施例1,做十次平行实验,记录数据,分析本实施例试剂的重复性,本实施例中试剂重复性如表1。
实施例3
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;磷脂试剂由固体激活剂、兔脑磷脂和缓冲体系组成,固体激活剂的含量为1.0g/L,兔脑磷脂的含量为5wt%,缓冲体系中各组分的含量为:0.75M的Hepes、0.05wt%的稳定剂、0.3wt%的聚乙二醇、其余为水;缓冲体系的pH为6.0,氯化钙试剂的工作浓度为35mM;其中,固体激活剂为鞣花酸、高岭土及硅酸镁铝质量为1:0.5:2的混合物,稳定剂为Kathon、甘氨酸、血清白蛋白的1:0.86:1.1的混合物。
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒制备方法同实施例1。
应用本实施例得到的试剂盒在半自动血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法同实施例1,做十次平行实验,记录数据,分析本实施例试剂的重复性,本实施例中试剂重复性如表1。
实施例4
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;磷脂试剂由硅藻土、兔脑磷脂和缓冲体系组成,硅藻土的含量为1.5g/L,兔脑磷脂的含量为3wt%,缓冲体系中各组分的含量为:0.25M的PBS、0.03wt%的Proclin、0.9wt%的聚乙二醇、其余为水;缓冲体系的pH为7.0,氯化钙试剂的工作浓度为18mM。
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒制备方法同实施例1。
应用本实施例得到的试剂盒在半自动血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法同实施例1,做十次平行实验,记录数据,分析本实施例试剂的重复性,本实施例中试剂重复性如表1。
实施例5
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;磷脂试剂由硅酸镁铝、兔脑磷脂和缓冲体系组成,硅酸镁铝的含量为1.5g/L,兔脑磷脂的含量为8wt%,缓冲体系中各组分的含量为:0.1M的Tris-Hcl、0.2wt%的石炭酸、0.1wt%的聚乙二醇、其余为水;缓冲体系的pH为8.0,氯化钙试剂的工作浓度为40mM。
活化部分凝血活酶时间测定试剂盒制备方法同实施例1。
应用本实施例得到的试剂盒在半自动血凝仪上测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法同实施例1,做十次平行实验,记录数据,分析本实施例试剂的重复性,本实施例中试剂重复性如表1。
实验例
实验例1
应用实施例1~5得到的试剂盒借助半自动血凝仪测定待测血浆的凝血酶原时间,测定方法为:先将磷脂试剂平衡至室温,氯化钙试剂温浴至37℃,再将待测血浆与磷脂试剂按照体积比为1:1的比例混匀,置于37℃温浴3min,再加入氯化钙试剂,使其终浓度为25mM,立刻混匀计时,记录凝血酶原时间。每个实施例的试剂盒做十次平行实验,记录数据。用市售试剂测定同样的血浆样本,记录下凝血酶原时间,本发明试剂与市售试剂重复性比较结果如表1。
表1:本发明试剂与市售试剂重复性比较
表1表明,本发明试剂与市售试剂相比,变异系数(CV)值较小,重复性好
实验例2
比较本发明试剂与市售试剂的稳定性,将本发明试剂和市售试剂同时开瓶,市售试剂为冻干粉复溶后使用,本发明试剂直接使用,在相同的凝血仪上做质控测试,记录随开瓶后日期的变化本发明试剂和市售试剂的质控结果,二者稳定性比较如表2。
表2:本发明试剂与市售试剂稳定性比较
试剂 | 1天 | 3天 | 7天 | 15天 | 20天 | 30天 | 40天 |
实施例3 | 32.0 | 31.8 | 31.7 | 31.8 | 31.8 | 32.7 | 32.9 |
市售试剂 | 34.7 | 33.6 | 36.2 | 37.3 | 38.9 | 40.2 | 42.6 |
表2表明,本发明试剂的凝血酶原时间值在40天内均无明显变化,而市售试剂的凝血酶原时间值从第7天就发生了变化,且随着天数的增加,其凝血酶原时间值呈明显变大的趋势,说明本发明试剂的稳定性较好。
Claims (2)
1.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒,其特征在于:包含磷脂试剂和氯化钙试剂,两种试剂储存在不同容器中;
所述磷脂试剂由固体激活剂、兔脑磷脂和缓冲体系组成;
所述固体激活剂的含量为1.0g/L,为鞣花酸、高岭土及硅酸镁铝质量为1:0.5:2的混合物;
所述兔脑磷脂的含量为5wt%;
所述缓冲体系中各组分的含量为:0.75M的Hepes、0.05wt%的稳定剂、0.3wt%的聚乙二醇、其余为水;缓冲体系的pH为6.0,其中,稳定剂为Kathon、甘氨酸、血清白蛋白的1:0.86:1.1的混合物;
所述氯化钙试剂的工作浓度为35mM。
2.制备权利要求1所述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒的方法,其特征在于:包括如下步骤:(1)配制缓冲体系,pH调至6.0~8.0,加入固体激活剂后混匀,得到初始混合溶液;(2)向初始混合溶液中加入不同浓度的兔脑磷脂混匀,配合氯化钙溶液在凝血仪上进行质控测定,测定结果最接近该机型凝血仪的质控范围中间值的试剂比例就是最终的配比;(3)按照最终的试剂配比,向初始混合溶液中加入兔脑磷脂,搅拌混匀后加入聚乙二醇和稳定剂,混匀后即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的磷脂试剂;(4)称量氯化钙固体溶解于一级水中,混匀即为即为活化部分凝血活酶时间测定试剂盒中的氯化钙试剂;(5)将磷脂试剂和氯化钙试剂分别包装后得到活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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