CN105441576A - 一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重pcr方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，该方法包括如下步骤：提取亲本和子代DNA；使用18个微卫星位点及带荧光标记的M13（-21）通用引物，对提取的DNA样本进行多重PCR扩增；对扩增产物的荧光信号进行检测，获得亲本和子代基因型数据；对亲本和子代进行亲缘关系鉴定。经验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100%的鉴定成功率。本发明为长牡蛎提供了一套经济有效、准确度高的基于DNA标记的亲子鉴定技术。通过微卫星标记鉴定获得的系谱关系记录，可以将长牡蛎个体追溯到其产出地，从而建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，为解决当今社会人们日益关注的食品安全问题提供有力的技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及一种水产动物亲子鉴定的方法，具体涉及了一种采用微卫星多重PCR方法进行长牡蛎亲子鉴定的方法。
背景技术
微卫星标记方法具有多态性丰富、高度杂合、稳定性好、遵循孟德尔分离定律、共显性遗传、易于PCR扩增等特点，是当今最流行的分子标记之一。在亲子鉴定中，相比于SNP标记，使用微卫星标记所需位点数少，但相对鉴定力可达5倍以上；微卫星标记方法不需特殊仪器，具有操作便捷、易于检测、省时高效以及准确度高的特点。
利用微卫星标记进行亲子鉴定，传统的分析方法是将PCR扩增产物在变性或者非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上进行分型，利用银染的方式对电泳结果进行显色，进而获得所需要的目的条带。这种方法存在许多不足之处，如判读误差较大、分辨率不高、操作无法自动化及存在有害物质、处理通量低等问题，不适合于大量样本的分析，也满足不了亲子鉴定对基因型分型的精度要求。
微卫星多重PCR方法是指在同一反应体系里加入多对引物，同时进行多个扩增反应，得到多个产物，因而具有提高反应效率，避免样品浪费，节约实验成本等优点。微卫星多重PCR在大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)，大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，斑节对虾(Penaeusmonodon)，以及虾夷扇贝(Patinopectenyessoensis)、皱纹盘鲍(Haliotisdiscushannai)等的亲权分析及系谱认证中均有应用。
长牡蛎(Crassostreagigas)是世界上养殖范围最广、产量最大的经济贝类，素有“海中牛奶”之美誉，深受消费者青睐。为了确保食品安全和增强消费者对养殖牡蛎产品的信赖，建立牡蛎产品的跟踪与溯源技术，以实现从苗种到餐桌的全程质量控制至关重要。长期以来，养殖水产品大都采用物理方法进行标记，但是物理标记容易丢失和改变，可靠性较低。使用DNA标记进行跟踪具有标记稳定、可靠，且易于检测的优势。
因此，开发精确的适用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR技术体系对于开展养殖牡蛎产品的DNA鉴定具有重要意义。此外，牡蛎亲子鉴定技术在牡蛎种质资源保护、优良品种选育等方面也具有重要的应用前景。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种高通量、鉴定准确率高的长牡蛎亲子鉴定的多重PCR方法，该方法采用加尾引物，能够快速、准确的对未知亲缘关系的长牡蛎亲本与子代间进行亲子鉴定，以弥补现有技术的不足。
为达到上述目的，本发明采取的具体技术方案如下：
一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA，其中长牡蛎子代选取的是D形幼虫，这是由于在海洋贝类中，经常会出现偏分离的微卫星等位基因，因此利用幼虫进行家系分析可以减少或排除偏分离位点的影响；
(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；
(3)对步骤(1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增：对步骤(2)中筛选得到的引物首先两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构建；然后优化退火温度、引物浓度和反应体系，最终将18个微卫星位点组成了6组最佳多重PCR体系，这使微卫星标记基因分型的工作量降低了2/3，节省了大量的时间、人力和物力；
(4)获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据：对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进行荧光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据；
(5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，从而对长牡蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。
上述步骤(2)中筛选得到的引物序列如下：
该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列。
所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在单独合成的M13(-21)通用引物序列的5’端，所述荧光标记为FAM、VIC、NED其中的一种；本发明使用了加尾引物，相比于直接在正向引物5’端添加荧光标记，本发明不仅大大降低了在每个位点添加荧光标记的昂贵费用，同时也避免了只进行了10～30个反应的带荧光标记的正向引物的浪费。
根据步骤(2)中得到的引物序列，步骤(3)中所述的6个多重PCR组合如下：
上述步骤(3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50℃～60℃，的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度；优选的，前35个循环6组中退火温度为58℃、50℃、54℃。
上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法，毛细管电泳采用荧光标记的方式对位点进行区分，不同的荧光染料在被激光激发后，会释放出不同波长的荧光信号，利用虚拟滤镜技术，可使得不同荧光获得区分，在同一根毛细管中可以同时混合多个位点，大大增加了处理通量。
所述的基因序列分析软件为Genemapperv4.0和Cervus3.0。
本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明利用多重PCR的方法，使用荧光标记通用引物，结合毛细管电泳技术，可以提高分析精度和实验效率。经过已知遗传背景的家系实际验证，使用本发明2组多重PCR组合对12个长牡蛎全同胞家系进行亲子鉴定，即可达到100％的鉴定成功率。
为保证养殖牡蛎产品的食品安全，进行牡蛎产品溯源具有重要意义。传统的物理标记容易改变或者丢失，缺乏足够高的可信度和准确度。本发明的方法是基于DNA微卫星标记的长牡蛎亲子鉴定技术，采用亲本重建法对养殖个体进行家系分析，可以将长牡蛎个体成功追溯到其产出地，为确保其食品安全、建立消费者的信赖提供强有力的技术支持。
附图说明
图1在95％置信水平下，长牡蛎家系模拟和实际的累积鉴定成功率结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详细阐述。
实施例：
(1)选取性腺成熟好的1龄长牡蛎亲贝进行人工催产，建立12个全同胞单对交配家系；收集各个家系的全部亲本个体(共24个)和部分子代个体(每个家系40个D形幼虫)；
(2)使用苯酚氯仿法提取每个亲本的DNA，使用螯合树脂法提取每个幼虫的DNA；
(3)根据前述筛选的18种引物序列以及通用引物序列合成引物；
(4)使用前述的6种引物组合方式进行多重PCR扩增，多重PCR的反应体系如表1所示；
多重PCR的反应程序为：94℃3min；94℃变性30s，退火温度退火60s，72℃延伸75s，35个循环；94℃变性30s，53℃退火60s，72℃延伸75s，8个循环；72℃延伸10min，12℃保存。
表1用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星标记多重PCR反应体系
其中，反应体系中3对上下游引物的浓度和组分见前述6种多重PCR组合表所示；
(5)PCR扩增产物经适当稀释后，与分子量内标混合，在ABI3130测序仪上进行毛细管电泳分析；
(6)使用Genemapperv4.0软件分析电泳结果，得到每个个体微卫星标记的基因型数据；混合12个全同胞家系的480个子代个体的基因型数据，以检验微卫星多重PCR在亲子鉴定中的效率；使用Cervus3.0软件对亲本和子代个体进行亲缘关系分析，计算每个子代最可能的父母本个体；根据分析结果，将置信度最高的雄性和雌性个体确认为子代个体亲本。
结果显示，在全部的504个个体(24个亲本和480个子代)中，在95％置信水平下，运用两组多态性最高的多重PCR(6个位点)即可达到100％的亲子鉴定成功率，如图1所示。
家系鉴定的成功率不仅与微卫星的多态性和标记数量有关，而且也与所选择群体可能配对的亲本数有关。BentsenandOlesen(2002)建议在群体选择育种中使用50对亲本可以有效的避免近交并获得长期的选择反应。根据Cervus3.0软件模拟结果，当亲本数达到400对时，使用本发明3组多态性最高的多重PCR组合仍可达到100％鉴定成功率。因此，在实际生产中进行大批量材料分析时，本发明6组多重PCR仍是可靠的分析工具。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
<110>中国海洋大学
<120>一种用于太平洋牡蛎家系鉴定的多重PCR方法
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<170>PatentInversion3.5
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Claims (9)
1.一种用于长牡蛎亲子鉴定的微卫星多重PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取长牡蛎亲本和子代个体的DNA；
(2)长牡蛎多态性微卫星引物的筛选：根据引物筛选软件以及现有文献记载的长牡蛎引物序列，合成引物，并通过对长牡蛎个体进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、特异性强的引物，所述引物包括正向引物、反向引物以及通用引物，所述通用引物上带有荧光标记；
(3)对步骤(1)得到的长牡蛎亲本和子代个体的DNA进行多重PCR扩增：对步骤(2)中筛选得到的引物进行组合，并通过优化PCR反应条件得到6组多重PCR组合；
(4)获得长牡蛎亲本和子代的基因型数据：对步骤(3)得到的多重PCR扩增产物进行荧光信号检测，从而获得亲本和子代的基因型数据；
(5)通过基因序列分析软件对上述得到的基因型数据进行分析对比，以对长牡蛎亲本和子代进行亲缘关系鉴定。
2.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(2)中筛选得到的引物序列如下：
该引物序列包括18种正、反向引物以及1种带有荧光标记的通用引物序列。
3.如权利要求2所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述正向引物的5’端添加M13(-21)通用引物序列，荧光标记添加在M13(-21)通用引物序列的5’端。
4.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，根据步骤(2)中得到的引物序列，步骤(3)中所述的6组多重PCR组合如下：
5.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的多重PCR扩增的反应程序分为两步：前35个循环使用50℃～60℃的退火温度，后8个循环使用53℃的退火温度。
6.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(3)中的引物组合和优化PCR条件具体操作为：首先将所述各引物两两组合，选出扩增清晰的组合再进行3个位点的多重PCR体系的构建；通过优化退火温度、引物浓度、反应体系最终得出6组多重PCR组合。
7.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，上述步骤(4)中荧光信号检测采用毛细管荧光电泳方法。
8.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的基因序列分析软件为Genemapperv4.0和Cervus3.0。
9.如权利要求1所述的微卫星多重PCR方法，其特征在于，所述的长牡蛎子代DNA提取选取的实验材料是D形幼虫。
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|---|---|---|---|---|
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