CN105441348B - 一株枯草芽孢杆菌新菌株，微生态制剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水产微生态制剂技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌新菌株，微生态制剂及应用。本发明公开的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8‑1保藏号为CGMCC No.9356，以无污染和无残留的方式降低水中有害物质如氨氮和亚硝态氮，提高养殖品质，提高养殖经济效益，具有推广价值。本发明中的枯草芽孢杆菌H8‑1对浓度为2.5mg/L的氨氮、亚硝态氮降解率分别为81.72%、99.70%。
Description
技术领域
本发明属于水产微生态制剂技术领域，具体涉及枯草芽孢杆菌新菌株，微生态制剂及应用。
背景技术
近年来，高密度、集约化水产养殖逐步取代传统散养模式，极大的提高了水产养殖的产量和经济效益。但人们在不断提高养殖密度以追求养殖产量的同时，也造成了一系列常见的问题。过度投饵，造成配合饵料利用率降低，致使水中有机物增加；施肥量加大，导致水中氮、磷猛增；大量粪便等有机物污染养殖水体；水体透明度下降，水质恶化。水体中过量的有机质分解不仅消耗水体中的溶解氧，水体处于缺氧状态，释放出许多有害物质，如氨氮、亚硝态氮和硫化氢等，直接或间接地影响水中生物的多样性，优质水产品种的养殖受到水质和饵料生物的限制。控制养殖池塘水体生态环境已是我国池塘水产养殖健康发展的关键问题，水产养殖池塘水质的控制和净化迫在眉睫。
目前，国内外学者进行了深入研究，而微生态制剂以其无污染、无残留以及多功能性等特点，而枯草芽孢杆菌产品以内生孢子的形式存在，对高温、低温、高盐度等不良环境的抵抗力很强，具有显著地降解氨氮和亚硝态氮的能力以及产酶活性。目前，芽孢杆菌作为降氮菌的技术问题主要存在于生产阶段，还有产品实际应用功效上。虽然菌株已经很多，但是菌株的效果差别大，实际有效的却很少。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一株枯草芽孢杆菌新菌株及微生态制剂。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8-1，为申请人从福建虾高位池池水中分离得到，其生物学特征如下：菌落表面光滑，半透明，呈污白色，菌落圆形，边缘成锯齿状；菌落形态为杆状，大小为0.8~1.2×1.5~4.0um，芽孢形态为椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。本发明中的枯草芽孢杆菌与现有的枯草芽孢杆菌区别于可以在0‰、3‰、15‰盐浓度条件下均生长良好，可以耐受10-15℃低温，生长良好。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8-1，其明胶反应阳性，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S、V-P反应阳性，淀粉实验阳性，葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适于25~37℃生长。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8-1，其16S rRNA核酸序列如SEQID No.1所示。放入Genbank中进行比对，结果显示与Bacillus subtilis的16S rRNA序列的相似性达99%。结合细菌形态特征、生理生化特性、生长条件，确定芽孢杆菌（Bacillus sp.）H8-1为枯草芽孢杆菌。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8-1，已于2014 年 6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9356。
本发明还提供含有所述菌株的微生态制剂。
本发明的菌株可制备成饲料添加剂，也可以添加到常规的饲料添加剂中，因此，本发明还提供一种含有所述菌株的饲料添加剂。
本发明的所述的饲料添加剂可以添加到常规的预混料，如维生素矿物质预混料中，因此，本发明还提供一种含有所述饲料添加剂的预混料。
本发明还提供所述菌株或所述的微生态制剂在改良养殖水体中的应用。
具体地，本发明所述菌株或所述的微生态制剂用于降解水体的氨氮和/或亚硝态氮水平。
本发明中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）H8-1为养殖水体改良微生态制剂提供了种源，以无污染和无残留的方式降低水中有害物质如氨氮和亚硝态氮，提高养殖品质，提高养殖经济效益，具有推广价值。本发明中的枯草芽孢杆菌H8-1对浓度为2.5mg/L的氨氮、亚硝态氮降解率分别为81.72%、99.70%。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
取来自于天津武清、福建、江苏鱼塘和虾塘的水样和泥样124个，取1mL水样或泥样1g于18ml试管的9mL LB液体培养基中，85℃水浴处理10min。
将高温处理后的试管放在温度为30℃，180rpm的好氧条件下恒温振荡培养16h后得到富集培养液。
采用倍比稀释法将富集培养液进行梯度稀释，涂布于LB固体培养基上，放置于30℃恒温箱中进行培养20h，挑取平板上所生长的不同单菌落进行划线，并纯化两次，获得活的单菌落，共获得275株菌。
将纯化两次后的单菌落，用牙签点种在新鲜的溶血板上，放置于30℃恒温箱中观察24h、48h、72h，是否出现溶血圈，根据使血细胞琼脂溶血的能力分类：1）α溶血：草绿色溶血，菌落周围培养基出现1~2mm的草绿色环，为高铁血红蛋白所致；2）β溶血：完全溶血，菌落周围形成一个完全清晰透明的溶血环，是细菌产生的溶血素使红细胞完全溶解所致；3)γ溶血：不溶血。将有溶血圈菌株淘汰。
将无溶血性菌株在选择性固体培养基上划线，生长良好的菌株用LB液体培养，在30℃恒温扩大培养16h。
固体选择性培养基为两种：以NH4 +-N为唯一氮源的氨氮选择性培养基和以NO2 --N为唯一氮源的亚硝态氮培养基；
氨氮选择性固体培养基为每L由(NH4)2SO4 0.5g，琥珀酸钠2.17g，维氏盐溶液50mL，琼脂20g和余量的水组成，pH7.0-7.2，115℃高压灭菌20min，所述维氏盐溶液为每L由K2HPO4 5.0g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·4H2O 0.05 g和余量的水组成；
亚硝态氮选择性固体培养基为每L由NaNO20.5g，琥珀酸钠2.17g，维氏盐溶液50mL，琼脂20g和余量的水组成，pH7.0-7.2，115℃高压灭菌20min，所述维氏盐溶液为每L由K2HPO4 5.0g，MgSO4·7H2O 2.5g，NaCl 2.5g，FeSO4·7H2O 0.05 g，MnSO4·4H2O 0.05 g和余量的水组成。
最终获得无溶血圈且在氨氮和亚硝态氮选择性固体培养基上生长良好的63株芽孢杆菌。
实施例2 高通量测定菌株降氮功能，筛选高效菌株
在超净台中，将63株待测菌株菌液接入相应的筛选培养基中，接种终浓度为5×105CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180 r/min，培养48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000 rpm离心3min，取上清200μL加入96孔板；
测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定；测定铵态氮时，每孔加入纳氏试剂20μL，于450nm比色测定；
筛选培养基为两种：氨氮筛选培养基和亚硝态氮筛选培养基；
氨氮筛选培养基为每50mL由(NH4)2SO4母液50μl，市售粉碎虾料0.05g和余量的水组成，铵态氮浓度为：2.5mg/l；
亚硝态氮筛选培养基为每50mL由NaNO2母液50μl，市售粉碎虾料0.05g和余量的水组成，亚硝态氮浓度为：2.5mg/l。
硫酸铵母液为称取9 g (NH4)2SO4加入1L模拟虾池水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l；
亚硝酸钠母液为称取3.75 g NaNO2加入1L模拟虾池水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
选取氨氮降解率高于30%的10株菌（编号为A1-A10）或亚硝酸氮降解率高于70%的10株菌（编号为Y1-Y10），以不接种任何菌株为阴性对照（CK），进行重复测定。
测定方法：在超净台中，将待测菌株菌液接入相应筛选培养基中，接种终浓度为5×105CFU/mL，重复数为3；放入摇床中进行培养30℃，180 r/min，培养24h、48h；均匀取样到1.5mL离心管中，12000 r/min 离心3min，取上清200μL加入96孔板。
测定亚硝态氮时，在96孔板中加入待测样上清液200μL后，每孔先后加入格里斯试剂A、B各20μL，于550nm比色测定；测定氨氮时每孔加入纳氏试剂20μL，于450nm比色测定。
定性测定：测定亚硝态氮时，溶液变为粉红色、玫瑰红色、橙色 或棕色等表示有亚硝酸盐还原，反应为阳性，即颜色越浅说明降解效果越佳；测定铵态氮时，溶液变为橙色、黄色等为阳性反应，浅为佳。
定量测定：制定亚硝态氮浓度（Y1）与测定OD值（X1）之间参考标准曲线及氨氮浓度（Y2）与测定OD值（X2）之间参考标准曲线。
筛选培养基包括氨氮筛选培养基和亚硝态氮筛选培养基；
氨氮筛选培养基：(NH4)2SO4母液50μl，虾料0.05g，蒸馏水50mL，氨氮浓度约为：2.5mg/L，121℃灭菌。硫酸铵母液：称取9 g (NH4)2SO4加入1L蒸馏水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l。
亚硝氮筛选培养基：NaNO2母液50μl，虾料0.05g，蒸馏水50mL，亚硝氮浓度约为：2.5 mg/l，121℃灭菌。亚硝酸钠母液：称取3.75 g NaNO2加入1L蒸馏水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
格里斯氏试剂(Griess)A：对氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10%左右)150mL，棕色瓶避光，4℃保存。格里斯氏试剂B：α萘胺0.1g，蒸馏水20mL, 稀醋酸(10%左右)150 mL，棕色瓶避光4℃保存。
纳氏试剂：现购即可，4℃保存。
结果如表1和表2所示，H8-1的平均氨氮降解率为81.72%，平均亚硝降解率为99.70%，降氮能力最高。
表1 10株优选菌株氨氮降解率比较测定（A10号为H8-1）
| 菌株号 | A1 | A2 | A3 | A4 | A5 | A6 | A7 | A8 | A9 | A10 | ck |
| 24h氨氮 | 34.096 | 30.000 | 19.789 | 45.702 | 37.728 | 39.985 | 59.574 | 21.277 | 75.487 | 79.572 | 0.011 |
| 48h氨氮 | 45.897 | 35.786 | 38.931 | 56.971 | 40.302 | 44.818 | 31.405 | 40.626 | 61.079 | 83.873 | 0.441 |
表2 10株优选菌株亚硝态氮降解率比较测定（Y10号为H8-1）
| 菌株号 | Y1 | Y2 | Y3 | Y4 | Y5 | Y6 | Y7 | Y8 | Y9 | Y10 | ck |
| 24h亚硝 | 83.121 | 74.374 | 90.671 | 92.332 | 75.629 | 74.506 | 90.467 | 95.714 | 92.196 | 99.603 | 0.002 |
| 48h亚硝 | 83.018 | 74.508 | 90.128 | 93.671 | 75.457 | 70.165 | 92.467 | 96.541 | 94.467 | 99.806 | 2.443 |
将筛选到的枯草芽孢杆菌H8-1于2014 年 6月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9356。
实施例3 不同盐浓度条件下H8-1生长情况比较
使用盐度分别为0‰、3‰、15‰的水配制LB固体培养基，用灭菌后的牙签点种H8-1在不同盐度的平板上，放置于30℃培养箱中培养16h，观察平板上菌落生长情况。培养后发现，点种在三种盐度不同的平板上的菌落生长均良好，生长完成后的菌落大小较一致，说明H8-1耐盐性能强。
LB培养基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉15g/L。用盐度计配制盐度分别为0‰、3‰、15‰的水，进行培养基的配制。
实施例4 不同盐浓度条件下H8-1降氮性能测定
结果见表3，如表所示，在0‰、3‰、15‰盐度下，H8-1的降氮性能有所差别，但受盐度的影响很小。
表3在不同盐度下测定H8-1的降氮性能
氨氮筛选培养基：(NH4)2SO4母液50μl，虾料0.05mg，分别使用不同盐度的水（0‰盐度的水：蒸馏水；3‰和15‰盐度的水:添加海盐到蒸馏水中，用盐度计测定，达到盐度分别为3‰和15‰）50mL，氨氮浓度约为：2.5mg/L，121℃灭菌。硫酸铵母液：称取9 g (NH4)2SO4加入1L蒸馏水，此时铵态氮浓度约为：2.5g/l。
亚硝氮筛选培养基：NaNO2母液50μl，虾料0.05mg，不同盐度的水50mL，亚硝氮浓度约为：2.5 mg/l，121℃灭菌。亚硝酸钠母液：称取3.75 g NaNO2加入1L蒸馏水，此时亚硝态氮浓度约为：2.5g/l。
测定方法同实施例2。
实施例5 在低温条件下H8-1生长情况
用灭菌后的牙签点种H8-1单菌落在LB固体平板上，分别放置在温度为10℃、15℃、30℃培养箱中24h，观察平板上菌落生长情况。培养后发现，在10℃和15℃培养箱中生长的平板上菌落大小相似，均为生长在30℃培养箱中平板上菌落大小的1/2，这说明H8-1在温度较低的养殖环境中也能够正常生长而发挥降氮功能。
LB固体培养基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化钠10g/L；琼脂粉15g/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大北农科技集团股份有限公司
福建大北农水产科技有限公司
天津昌农科技有限责任公司
<120> 一株枯草芽孢杆菌新菌株，微生态制剂及应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1424
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
<400> 1
cttggcggct gctctaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt 60
gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 120
ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt 180
tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgtccatt gtagcacgtg 240
tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 300
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tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 540
ccgtcaattc ctttgagttt cagtcttgcg accgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc 600
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catcagggag caagctccca tctgtccgct cgactgcatg atac 1424
Claims (5)
1. 一株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.9356。
2.含有权利要求1所述菌株的微生态制剂。
3.含有权利要求1所述菌株的饲料添加剂。
4.含有权利要求3所述饲料添加剂的预混料。
5.权利要求1所述的菌株在改良养殖水体中的应用，其特征在于，用于降解水体的氨氮和/或亚硝态氮水平。
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