CN105400713A

CN105400713A - 一种混合乳酸菌发酵方法

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Publication number: CN105400713A
Application number: CN201510649363.2A
Authority: CN
Inventors: 胡晓珂; 陈庆彩; 李敬龙
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS; Qilu University of Technology
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS; Qilu University of Technology
Priority date: 2015-10-09
Filing date: 2015-10-09
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2035-10-09
Also published as: CN105400713B

Abstract

一种混合乳酸菌发酵方法，包括如下步骤：将瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌种分别进行活化处理，得到瑞士乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液；将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，发酵22h-24h，其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:1-1:2，接种量为5％-7％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.6-7.0，发酵温度为30℃-37℃，得到发酵后的混合乳酸菌。上述混合乳酸菌发酵方法，瑞士乳杆菌有较强的蛋白水解能力，可将培养基中的大分子蛋白水解成小分子，给共同发酵的鼠李糖乳杆菌提供一定的小分子蛋白，从而充分利用培养基中的营养成分，从而同时获得较多的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活菌数。

Description

一种混合乳酸菌发酵方法

技术领域

本发明涉及乳酸菌发酵领域，尤其涉及一种混合乳酸菌发酵方法。

背景技术

近年来，乳酸菌成为人们研究的热点，并且在食品、药品等行业中广泛应用。乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。其对机体的调节作用是其它肠道菌群不可替代的，这种活的微生物，需要摄入充足的数量，才可对宿主产生一种或多种益处。乳(培养基)中含有丰富的蛋白质、乳糖、脂肪、维生素和矿物质，但其中游离的氨基酸和小肽的含量很低。这就需要乳酸菌来降解乳中的大分子蛋白来维持其持续增长，而大部分乳酸菌的蛋白水解能力较弱，甚至需要在乳中添加小分子的多肽来促进生长。

瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均是食品工业中常用的乳酸菌。与其它乳酸菌相比，瑞士乳杆菌具有较强的蛋白水解能力。鼠李糖乳杆菌仅可代谢单糖和小分子蛋白，耐酸性良好，肠道定植能力强。传统的乳酸菌发酵方法中没有将这两种乳酸菌混合发酵的方法。

发明内容

鉴于此，有必要提供一种瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)QC-1和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)QC-2混合发酵的方法。

一种混合乳酸菌发酵方法，包括如下步骤：

将瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌种分别进行活化处理，得到瑞士乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液；

先将所述瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养2h-4h后，再将所述鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至所述改良的番茄汁肉汤培养基，在30℃-37℃的恒温条件下静置培养22h-24h，其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:1-1:2，所述瑞士乳杆菌和所述鼠李糖乳杆菌的总接种量为5％-7％，所述改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.6-7.0，得到发酵后的混合乳酸菌菌液。

在其中一个实施例中，将瑞士乳杆菌进行活化处理包括如下步骤，按照8％-10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种接种至第一液体培养基中培养17h-19h，接着，按照3％-6％的接种量，取所述第一液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第二液体培养基中培养17h-19h，然后，按照3％-6％的接种量，取所述第二液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第三液体培养基中培养17h-19h，得到所述瑞士乳杆菌种子液；

将鼠李糖乳杆菌进行活化处理包括如下步骤，按照8％-10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种接种至第四液体培养基中培养17h-19h，接着，按照3％-6％的接种量，取所述第四液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至第五液体培养基中培养17h-19h，然后，按照3％-6％的接种量，取所述第五液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至第六液体培养基中培养17h-19h，得到所述鼠李糖乳杆菌种子液。

在其中一个实施例中，所述第一液体培养基、所述第二液体培养基、所述第三液体培养基、所述第四液体培养基、所述第五液体培养基和所述第六液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

在其中一个实施例中，

将瑞士乳杆菌进行活化处理还包括如下步骤，取所述第三液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液涂布到第一平板固体培养基，培养至有菌落长出，接着挑取所述第一平板固体培养基中的单菌落至第七液体培养基，培养17h-19h，然后按照3％-6％的接种量，取所述第七液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第八液体培养基，培养17h-19h后得到所述瑞士乳杆菌种子液；

将鼠李糖乳杆菌进行活化处理还包括如下步骤，取所述第六液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液涂布到第二平板固体培养基，培养至有菌落长出，接着挑取所述第二平板固体培养基中的单菌落至第九液体培养基，培养17h-19h，然后按照3％-6％的接种量，取所述第九液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液至第十液体培养基，培养17h-19h后得到所述鼠李糖乳杆菌种子液。

在其中一个实施例中，所述第七液体培养基、所述第八液体培养基、所述第九液体培养基和所述第十液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

在其中一个实施例中，所述改良的番茄汁肉汤培养基的组分为：

在其中一个实施例中，所述固体培养基的组分为：

在其中一个实施例中，所述瑞士乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015539。

在其中一个实施例中，所述鼠李糖乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015540。

上述混合乳酸菌发酵方法，采用的瑞士乳杆菌与其它乳酸菌相比有较强的蛋白水解能力，它可将培养基中的大分子蛋白水解成小分子，给共同发酵的鼠李糖乳杆菌提供一定的小分子蛋白，从而充分利用培养基中的营养成分，从而同时获得较多的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活菌数。

附图说明

图1为一实施方式的混合乳酸菌发酵方法的流程图；

图2为将瑞士乳杆菌进行活化处理的流程图；

图3为将鼠李糖乳杆菌进行活化处理的流程图；

图4为实施例1中两种乳酸菌混合发酵的吸光值与对比例1和2中两种乳酸菌单独发酵的吸光值的对比图；

图5为实施例4中两种乳酸菌混合发酵的吸光值随温度变化图；

图6为实施例5中两种乳酸菌混合发酵的吸光值随pH值变化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，如下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1所示，一实施方式的混合乳酸菌发酵方法，包括如下步骤：

S10、将瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌种分别进行活化处理，得到瑞士乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液。

瑞士乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015539。保藏单位地址：武汉，中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。邮编：430072。

鼠李糖乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015540。保藏单位地址：武汉，中国典型培养物保藏中心(武汉大学)。邮编：430072。

瑞士乳杆菌菌株和鼠李糖乳杆菌菌株具有生长快、起发早、发酵时间短、对酸耐受力强、稳定性好等特点。

请参考图2，将瑞士乳杆菌进行活化处理包括如下步骤：

S111、按照8％-10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种接种至第一液体培养基中培养17h-19h。

S112、接着，按照3％-6％的接种量，取第一液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第二液体培养基中培养17h-19h。

S113、然后，按照3％-6％的接种量，取第二液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第三液体培养基中培养17h-19h，得到瑞士乳杆菌种子液。

第一液体培养基、第二液体培养基和第三液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

请参考图3，将鼠李糖乳杆菌进行活化处理包括如下步骤：

S121、按照8％-10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种接种至第四液体培养基中培养17h-19h。

S122、接着，按照3％-6％的接种量，取第四液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至第五液体培养基中培养17h-19h。

S123、然后，按照3％-6％的接种量，取第五液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至第六液体培养基中培养17h-19h，得到鼠李糖乳杆菌种子液。

第四液体培养基、第五液体培养基和第六液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

上述瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在分别经过三级液体种子培养后，所制得的瑞士乳杆菌发酵液和鼠李糖乳杆菌发酵液，菌体密度数量级可达10⁹cfu/mL，可直接用于瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌高活菌数混合发酵方法的研究。

在其他实施方式中，将瑞士乳杆菌进行活化处理还可以包括如下步骤：

S114、取第三液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液涂布到第一平板固体培养基，培养至有菌落长出。

具体的，取第三液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液按照稀释涂布平板法稀释到10^-7后，取100μL液体涂布到第一平板固体培养基中，然后在30℃-37℃的恒温培养箱中倒置培养直至第一平板上有菌落长出(约48h)。

S115、接着挑取第一平板固体培养基中的单菌落至第七液体培养基，培养17h-19h。

S115中，培养条件为：在30℃-37℃的恒温培养箱中静置培养。

S116、然后按照3％-6％的接种量，取第七液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第八液体培养基，培养17h-19h后得到瑞士乳杆菌种子液。

S116中，培养条件为：在30℃-37℃的恒温培养箱中静置培养。

第七液体培养基和第八液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

在其他实施方式中，将鼠李糖乳杆菌进行活化处理还可以包括如下步骤：

S124、取第六液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液涂布到第二平板固体培养基，培养至有菌落长出。

具体的，取第六液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液按照稀释涂布平板法稀释到10^-7后，取100μL涂布到第二平板固体培养基，然后在30℃-37℃的恒温培养箱中倒置培养直至第二平板上有菌落长出(约48h)。

S125、接着挑取第二平板固体培养基中的单菌落至第九液体培养基，培养17h-19h。

S125中，培养条件为：在30℃-37℃的恒温培养箱中静置培养。

S126、然后按照3％-6％的接种量，取第九液体培养基中的鼠李糖乳杆菌菌液至第十液体培养基，培养17h-19h后得到鼠李糖乳杆菌种子液。

S126中，培养条件为：在30℃-37℃的恒温培养箱中静置培养。

第九液体培养基和第十液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

固体培养基的组分为：

S20、先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养2h-4h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基，在30℃-37℃的恒温条件下静置培养22h-24h，其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:1-1:2，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的总接种量为5％-7％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.6-7.0，得到发酵后的混合乳酸菌。

上述混合乳酸菌发酵方法中，改良的番茄汁肉汤培养基的组分为：

下面讨论发酵时间，发酵温度，接种量，初始pH值以及瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种体积比、接种时间差对两种乳酸菌混合发酵的影响。

发酵时间的影响：在发酵条件为：温度37℃，接种量3％，培养基初始pH值6.8时，将瑞士乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、体积比为1：1的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的混合乳酸菌分别在改良的番茄汁肉汤培养基中静置发酵。接着分别在发酵12h、18h、24h、30h、36h后取样，进行吸光值测定、活菌计数和pH值测定。将混合乳酸菌、单独发酵的瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的活菌数进行对比，确定接下来实验中菌体最佳收集时间，实验结果表明，菌体的最佳收集时间为24h。

以两种乳酸菌混合发酵24h后的活菌数为指标，来确定双菌发酵培养的最适发酵温度、最佳接种量、最适初始PH值、两株菌的最佳接种比例以及接种顺序。以_OD540值及平板活菌数量来评定乳酸菌混合发酵的最适生长条件。

最适发酵温度的确定：在瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种体积比为1:1，接种比例为3％，培养基初始pH值为6.8，发酵温度分别为20℃，25℃，30℃，37℃，42℃的条件下，研究温度对发酵液活菌数的影响，并且分别以_OD540值和活菌数作为实验指标，进行涂平板活菌计数。实验结果显示，当瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵时，37℃条件下发酵液吸光值_OD540最大，并且活菌数量最多。

最佳接种量的确定：其它发酵条件不变，最适温度为上一步确定的最适温度，研究不同接种量2％，4％，6％，8％，10％对发酵液活菌数影响，并且以_OD540值和平板计数总活菌数为指标。实验结果显示，当瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵的接种量为6％时，测得的发酵液吸光值_OD540最大，并且活菌数量最多。

最适初始pH的确定：其他发酵条件不变，温度和接种量为以上确定的最适条件，研究发酵液初始pH分别为6.2，6.6，6.8，7.0，7.4时，发酵液活菌数和产酸量。以_OD540值和活菌数作为实验指标，进行涂板活菌计数。实验结果显示，当瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌混合发酵的初始pH值为6.8时，测得的发酵液吸光值_OD540最大，并且活菌数量最多。

瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种体积比的确定：在其他发酵条件不变，温度、接种量和初始pH值为以上确定的最适值，研究瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种体积比1:1，1:2，1:3，2:1，3:1对发酵液活菌数的影响。以每种发酵条件下的_OD540和活菌数为指标。实验结果显示，当瑞士乳杆菌与鼠李糖乳杆菌的接种体积比为1:2时，测得的发酵液吸光值_OD540最大，并且活菌数量最多。

瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌最佳接种时间的确定：在其他发酵条件不变，接种量、初始pH、接种体积比为以上确定的最佳值，研究瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种顺序和接种时间间隔对发酵液活菌数和产酸量的影响。并且以每种发酵条件下的_OD540和活菌数为指标。实验结果显示，当鼠李糖乳杆菌比瑞士乳杆菌早接种3±1h时，测得的发酵液吸光值_OD540最大，并且活菌数量最多。

上述混合乳酸菌发酵方法，得到的活菌数数量级可达10⁹cfu/mL。

在两种乳酸菌混合发酵的过程中，采用在不同时间段，不同体积接种比例的方法，从而让两种乳酸菌充分繁殖，获得更大数量的活菌数。

下面为具体实施例部分。

实施例1

制备瑞士乳杆菌种子液：按8％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养18h。接着，按4％的接种量取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养18h。然后，按4％的接种量再取锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养18h，得到瑞士乳杆菌种子液。

制备鼠李糖乳杆菌种子液：按8％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养18h。按4％的接种量取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养18h。然后，按4％的接种量再取锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养18h，得到鼠李糖乳杆菌种子液。

先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养3h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，静置发酵23h。其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:2，接种量为6％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.8，发酵温度为37℃，得到发酵后的混合乳酸菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540请参考图4，并同时涂平板活菌计数，得到活菌数为6.8×10⁹cfu/mL。

吸光值的测定方法为：将30mL发酵液用60mL无菌水稀释，混匀后，在4℃，8000×g的条件下，离心10min，弃去上清液后再用无菌生理盐水洗涤沉淀1-2次，最后将洗涤干净的菌体重悬于30mL的生理盐水中。以生理盐水为空白，在540nm下测定样品的吸光度值，每个样品做3个平行对照实验，取平均值，得到吸光度值。

活菌数的计算方法为：采用梯度稀释法用无菌生理盐水将发酵液稀释，取10^-7稀释度的菌液100μL涂平板，然后将平板放入37℃培养箱中倒置培养，待菌落长出后计数，每个样品做3个平行对照实验，取平均值，得到活菌数。然后计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。

实施例2

制备瑞士乳杆菌种子液：按10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养17h。接着，按6％的接种量取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养17h。然后，按6％的接种量再取锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养17h，得到瑞士乳杆菌种子液。

制备鼠李糖乳杆菌种子液：按10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养17h。按6％的接种量取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养18h。然后，按6％的接种量再取锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养17h，得到鼠李糖乳杆菌种子液。

先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养2h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，静置发酵22h。其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:1，接种量为5％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.6，发酵温度为30℃，得到发酵后的混合乳酸菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540为0.993为xx，并同时涂平板活菌计数，计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。得到活菌数为5.2×10⁹cfu/mL。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。

实施例3

制备瑞士乳杆菌种子液：按9％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养19h。接着，按5％的接种量取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养19h。然后，按5％的接种量再取锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养19h。取上一步锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液按照稀释涂布平板法稀释到10^-7后，取100μL液体涂布到第一平板固体培养基，在30℃恒温培养中倒置培养至有菌落长出。接着挑取第一平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中，在30℃的恒温培养箱中静置培养19h。然后取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养19h后得到瑞士乳杆菌种子液。

制备鼠李糖乳杆菌种子液：按9％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种，接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养19h。按5％的接种量取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养19h。然后，按5％的接种量再取锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养19h。取上一步锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液按照稀释涂布平板法稀释到10^-7后，取100μL液体涂布到第二平板固体培养基，在30℃恒温培养中倒置培养至有菌落长出。接着挑取第二平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中，在30℃的恒温培养箱中静置培养19h。然后取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养19h后得到鼠李糖乳杆菌种子液。

先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养4h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基中静置发酵24h。其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:2，接种量为7％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为7.0，发酵温度为37℃，得到发酵后的混合乳酸菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540为1.083为xx，并同时涂平板活菌计数，计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。得到活菌数为6.2×10⁹cfu/mL。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。

实施例4

制备瑞士乳杆菌种子液：将在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种，取0.5mL接种至装有5mL的改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养17h。接着，按3％的接种量取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养17h。然后，按3％的接种量再取锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养17h。取上一步锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液，按照梯度稀释法稀释至10^-7，取液体涂布到第一平板固体培养基，在37℃恒温培养中倒置培养至有菌落长出。接着挑取第一平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中，在37℃的恒温培养箱中静置培养17h。然后取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养17h后得到瑞士乳杆菌种子液。

制备鼠李糖乳杆菌种子液：将在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种，取0.5mL接种至装有5mL的改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养17h。按3％的接种量取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养17h。然后，按3％的接种量再取锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养17h。取上一步锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液，按照梯度稀释法稀释至10^-7，取液体涂布到第二平板固体培养基，在37℃恒温培养中倒置培养至有菌落长出。接着挑取第二平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中，在37℃的恒温培养箱中静置培养17h。然后取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养17h后得到鼠李糖乳杆菌种子液。

先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养3h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，静置发酵23h。其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:2，接种量为6％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.8，发酵温度分别为20℃、30℃、35℃、37℃和40℃，得到发酵后的混合乳酸菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540，并同时涂平板活菌计数。计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。吸光值_OD540请参考图5。在30℃、35℃和37℃条件下，得到的活菌数量在5.6×10⁹cfu/mL左右。20℃时得到的活菌数量为3.6×10⁹cfu/mL。40℃时活菌数仅为2.3×10⁹cfu/mL。

实施例5

制备瑞士乳杆菌种子液：将在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种，取0.5mL接种至装有5mL的改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养19h。接着，按5％的接种量取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养19h。然后，按5％的接种量再取锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养19h。取上一步锥形瓶中的瑞士乳杆菌菌液，按照梯度稀释法稀释至10^-7，取液体涂布到第一平板固体培养基。接着挑取第一平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中。然后取试管中的瑞士乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养19h后得到瑞士乳杆菌种子液。

制备鼠李糖乳杆菌种子液：将在-80℃的甘油中保存的鼠李糖乳杆菌菌种，取0.5mL接种至装有5mL的改良的番茄汁肉汤培养基的试管中培养19h。按5％的接种量取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中培养19h。然后，按5％的接种量再取锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有改良的番茄汁肉汤培养基的另一锥形瓶培养19h。取上一步锥形瓶中的鼠李糖乳杆菌菌液，按照梯度稀释法稀释至10^-7，取液体涂布到第二平板固体培养基。接着挑取第二平板固体培养基中的单菌落至装有5mL改良的番茄汁肉汤培养基的试管中。然后取试管中的鼠李糖乳杆菌菌液接种至装有30mL改良的番茄汁肉汤培养基的锥形瓶中，培养19h后得到鼠李糖乳杆菌种子液。

先将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，培养2h后，再将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌也接种至改良的番茄汁肉汤培养基中静置发酵22h。其中，瑞士乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的体积比为1:2，接种量为6％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值分别为6.0、6.6、6.8、7.0、7.4，发酵温度为37℃，得到发酵后的混合乳酸菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540，并同时涂平板活菌计数。计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。吸光值_OD540请参考图6。在初始pH值为6.6、6.7和6.8时，得到的活菌数量最多，在4.1×10⁹cfu/mL。当初始pH为6时，得到的活菌数为3.2×10⁹cfu/mL。初始pH为7时，得到的活菌数为5.6×10⁹cfu/mL。因此，在初始pH为6.6-7.0发酵时，可获得较多数量的乳酸菌活菌数。

对比例1

制备瑞士乳杆菌种子液，制备方法同实施例1。

将瑞士乳杆菌种子液中的瑞士乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，静置发酵22h。其中，接种量为6％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.8，发酵温度为37℃，得到发酵后的瑞士乳杆菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540。并同时涂平板活菌计数，计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。吸光值_OD540请参考图4。得到活菌数为3.8×10⁹cfu/mL。

对比例2

制备鼠李糖乳杆菌种子液，制备方法同实施例1。

将鼠李糖乳杆菌种子液中的鼠李糖乳杆菌接种至改良的番茄汁肉汤培养基中，静置发酵22h。其中，接种量为6％，改良的番茄汁肉汤培养基的初始pH值为6.8，发酵温度为37℃，得到发酵后的鼠李糖乳杆菌。

发酵结束后，将发酵液洗涤离心，测量发酵液的吸光值_OD540。并同时涂平板活菌计数，计算出原发酵液中菌体密度(活菌数cfu/mL)。其中，吸光值的测定方法和活菌数的计算方法同实施例1。吸光值_OD540请参考图4，得到活菌数为6.7×10⁸cfu/mL。

实验结果表明，两种乳酸菌混合发酵相比于两种乳酸菌单独发酵得到的活菌数更多。当两种乳酸菌混合发酵时，其存在协同作用，能够促进两种乳酸菌共同生长繁殖，获得更大数量的活菌数。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于,

将瑞士乳杆菌进行活化处理包括如下步骤，按照8％-10％的接种量，取在-80℃的甘油中保存的瑞士乳杆菌菌种接种至第一液体培养基中培养17h-19h，接着，按照3％-6％的接种量，取所述第一液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第二液体培养基中培养17h-19h，然后，按照3％-6％的接种量，取所述第二液体培养基中的瑞士乳杆菌菌液接种至第三液体培养基中培养17h-19h，得到所述瑞士乳杆菌种子液；

3.如权利要求2所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述第一液体培养基、所述第二液体培养基、所述第三液体培养基、所述第四液体培养基、所述第五液体培养基和所述第六液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

4.如权利要求2所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，

5.如权利要求4所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述第七液体培养基、所述第八液体培养基、所述第九液体培养基和所述第十液体培养基均为改良的番茄汁肉汤培养基。

6.如权利要求1、3、5中任意一项所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述改良的番茄汁肉汤培养基的组分为：

7.如权利要求1所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述固体培养基的组分为：

8.如权利要求1所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述瑞士乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015539。

9.如权利要求1所述的混合乳酸菌发酵方法，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌菌株的保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月15日，保藏号为CCTCCM2015540。