CN105385661A - 一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用。本发明提供一种简便且不需要额外添加血清的细胞培养基利用生物反应器在微载体上繁殖猪圆环病毒2型的方法，在生物反应器中添加微载体后在搅拌时由于不含血清，可大量减少气泡的生成，降低细胞剪切力。可实现连续收获5天，病毒含量在10^7.5TCID₅₀/ml；用该项技术增殖病毒制备疫苗，获得良好免疫效果的同时，疫苗生产成本也大大降低。同时，本发明方法由于采用了不需要额外添加血清的细胞培养基，意外的解决了猪圆环病毒2型在高滴度培养增殖过程中必须添加D-氨基葡萄糖孵育的问题，有效降低了D-氨基葡萄糖的毒性问题，对疫苗质量的提升提供了解决途径。

Description

一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，更具体涉及一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型(简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，***病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。PCV2感染性疾病引起得死亡率增高、饲料报酬降低，加上我国规模化主场饲养管理水平相对较为落后，因此PCVD也给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。

随着PCV2疫苗的出现，使用PCV2抗原制成的疫苗在对PMWS的预防中初见成效。目前生产猪圆环病毒2型灭活疫苗主要有两种技术：(1)生物反应器技术；(2)转瓶技术。转瓶技术生产细胞和病毒时劳动强度大、占地大、批间差异大、生产成本高、单批产量低；生物反应器技术虽然在一定程度上解决了转瓶技术的部分缺陷，但仍不能摆脱转瓶生产过程中所需要添加血清的缺点，不利于下游工艺分离纯化，制备的疫苗易引起动物副反应；现有技术中无论是采用生物反应器技术还是采用转瓶技术，接毒时均需要添加D-氨基葡萄糖处理，接毒过程复杂、繁琐，减少对细胞的毒副作用。因此，就需要获得一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法，以克服上述缺陷，用于制备安全、有效的猪圆环病毒2型疫苗。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法及其应用。

本发明的主要目的在于提供一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法，所述方法包括：(1)用低血清培养基培养PKK细胞；(2)将步骤(1)形成良好单层的PKK细胞用胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，接种到含有微载体的生物反应器中，并同时接种猪圆环病毒2型进行吸附；(3)病毒吸附之后进行病毒培养；(4)同步接毒72h后进行收毒，每天收获一个体积，连续收获。

优选地，步骤(1)使用的低血清培养基为OptiMEM低血清培养基，不额外添加血清，于37℃5％CO₂的条件下培养48-72h。

优选地，步骤(2)细胞的接种密度为3×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml，微载体的添加量为5g～20g/L。

优选地，步骤(2)微载体为Cytodex-1。

优选地，步骤(2)微载体经过硅化处理，处理程序为用无Ca²⁺，Mg²⁺离子的PBS缓冲液清洗Cytodex-1微载体并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经121℃25min高压灭菌处理，冷却后4℃密封保存备用，使用前用37℃的细胞培养液清洗3遍。

优选地，步骤(2)同步接毒剂量按M.O.I.＝0.2，并同时补加生物反应器工作体积的1/3量的OptiMEM低血清培养基吸附2h。

优选地，步骤(2)接种的猪圆环病毒2型为猪圆环病毒SH株。

优选地，步骤(2)病毒吸附程序为搅拌20-30min，停止15-20min，周期间歇性搅拌。

优选地，步骤(3)病毒吸附之后继续补加无血清无蛋白培养基至生物反应器工作体积，进行病毒培养。

优选地，步骤(3)病毒培养程序为DO为50％～60％，搅拌转速为50～70rpm，采用压缩Air、O₂、N₂和CO₂四气模式条件培养。

优选地，步骤(4)同步接毒72h第一次收毒后补加等体积的OptiMEM低血清培养基，每天收获一次，连续收获至少5天。

优选地，步骤(4)收获的猪圆环病毒2型病毒液滴度为≥10^7.5TCID₅₀/ml。

OptiMEM低血清培养基为一种化学成分限定培养基，本发明使用时，不额外添加任何血清。

本发明还提供了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗大规模培养方法：将本发明制备的猪圆环病毒2型病毒液灭活，加入佐剂制备猪圆环病毒2型灭活疫苗。

利用本发明方法制备的猪圆环病毒2型疫苗具有以下优势：

1利用生物反应器在OptiMEM低血清培养基中培养细胞繁殖猪圆环病毒2型，降低了培养细胞时对血清的依赖性，避免了血清的使用带来的外源性蛋白产生的副反应，而且血清的价格昂贵，存在批次间的差异，并且生产成本有较大的降低；

2利用生物反应器添加微载体培养细胞时用OptiMEM低血清培养基，在搅拌时由于不含血清，可大量减少气泡的生成，降低细胞剪切力，细胞可高密度快速增值；

3利用本发明方法在生物反应器中可实现连续收获5天，病毒含量均达到10^7.5TCID₅₀/ml，提高了病毒收获率，大大提升了生产效率，为规模化生产奠定了基础；

4本发明方法利用OptiMEM低血清培养基培养PKK细胞用于生产猪圆环病毒2型，意外发现，接毒时无需添加D-氨基葡萄糖，依然能得到较高滴度的猪圆环病毒2型病毒液。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用PBS缓冲液如无特别说明，均采用pH7.4的PBS，配制方法：NaCl8.0g，KCl0.2g，KH₂PO₄0.24g，Na₂HPO₄·12H₂O3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。

OptiMEM低血清培养基购自Gibco公司，货号：22600-134，批号：1448571.按说明书进行配置后，pH值为7.1左右，0.2μm正压滤膜过滤除菌。

微载体Cytodex-1：购自AmershampharmaciaBiotchAB，经无Ca²⁺，Mg²⁺离子的PBS缓冲液清洗并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经121℃25min冷却后，4℃密封保存备用。使用前用37℃的细胞培养液清洗3遍。

硅化剂购自sigma公司，货号SL-2。

CeIIiGen生物反应器：购自NewBrunswickScientificCo.LTDUSA生产，实施例中采用生物反应器型号为CeIIiGen310，工作体积10L，溶氧(DO)和pH由压缩Air、O₂、N₂和CO₂4种气体控制，采用斜叶式搅拌桨。

本发明所用的PKK细胞为PK15细胞的克隆细胞，公开于中国专利申请号为201410309694.7。

本发明所用猪圆环病毒2型SH株(PorcineCircovirusType2，strainSH)，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期：2008年3月4日，保藏号为CGMCCNo.2389，公开于中国专利CN101240264A。

本发明实施例中，传代细胞使用了PKK，其他本领域常用的传代细胞如RK细胞(兔肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、Dulac细胞(猪肾细胞)，也可用于本发明之方法大规模生产PCV2病毒或疫苗。

本发明所述方法中，在病毒吸附阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序与病毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞及病毒的目的。

实施例1

大规模高滴度猪圆环病毒2型的增殖

1细胞的培养

复苏PKK细胞，用Gibco公司的OptiMEM低血清培养基不额外添加血清培养PKK细胞，37℃5％CO₂培养箱培养48～72h，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按一定的分散比例进行传代并逐步扩大传代至转瓶中培养，为生物反应器内提供种子细胞。

2病毒的培养

生物反应器工作体积为10L，微载体浓度为10g/L。采用同步接毒法，即PKK细胞在转瓶中培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，接种细胞悬液到已硅化处理过的含微载体的生物反应器中，接种的细胞密度为5×10⁵个/ml。

同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量按M.O.I.＝0.2，补加3000mlOptiMEM低血清培养基。接毒后采用搅拌30min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁与病毒结合，2h后补加OptiMEM低血清培养基至生物反应器工作体积10L。生物反应器设置参数为DO为50％，搅拌转速65rpm，采用压缩Air、O₂、N₂和CO₂四气模式条件培养。

3病毒的收获

同步接毒72h进行收毒，每天收获1个体积，并补加等体积的OptiMEM低血清培养基，连续收获5天。收毒期间每天监测葡萄糖含量。

4病毒滴度的测定

对收获的病毒液分别间接免疫荧光法测定病毒含量:取待测病毒液做十倍系列稀释，接入96孔细胞培养板，100μL/孔，同时接种PKK细胞2.0×10⁴/孔cell，然后让细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养5日，进行荧光染色判定。出现荧光的及判定该孔细胞感染，按R-M法计算TCID₅₀。连续收获5天的病毒液病毒含量均在10^7.5TCID₅₀/ml以上。

5纯净性检验

按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

实施例2

添加D-氨基葡萄糖条件下猪圆环病毒2型增殖情况比较

1细胞的培养

复苏PKK细胞，用Gibco公司的OptiMEM低血清培养基不额外添加血清培养PKK细胞，37℃5％CO₂培养箱培养48～72h，胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按一定的分散比例进行传代并逐步扩大传代至转瓶中培养，为生物反应器内提供种细胞。

2病毒的培养

生物反应器工作体积为10L，微载体浓度为10g/L。采用同步接毒法，即PKK细胞在转瓶中培养形成良好致密单层，胰蛋白酶消化后制备成细胞悬液，接种细胞悬液到已硅化处理过的含微载体的生物反应器中，接种的细胞密度为5×10⁵个/ml。

同步接种圆环病毒PCV-SH株，接毒剂量按M.O.I.＝0.2，补加OptiMEM低血清培养基(以刚好淹没载体为准)。接毒后采用搅拌30min，停止15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁与病毒结合，加入300mmol/LD-氨基葡萄糖静止孵育30min。弃去D-氨基葡萄糖，用PBS充分洗涤以除去载体上残留的D-氨基葡萄糖，补加OptiMEM低血清培养基至生物反应器工作体积10L。生物反应器设置参数为DO为50％，搅拌转速65rpm，采用压缩Air、O₂、N₂和CO₂四气模式条件培养。

3病毒的收获

同步接毒72h进行收毒，每天收获1个体积，并补加等体积的OptiMEM低血清培养基，连续收获5天。收毒期间每天监测葡萄糖含量。

4病毒滴度的测定

对收获的病毒液分别间接免疫荧光法测定病毒含量:取待测病毒液做十倍系列稀释，接入96孔细胞培养板，100μL/孔，同时接种PKK细胞2.0×10⁴/孔cell，然后让细胞培养板置于37℃，5％CO₂培养5日，进行荧光染色判定。出现荧光的及判定该孔细胞感染，按R-M法计算TCID₅₀。连续收获5天的病毒液病毒含量均在10^7.5TCID₅₀/ml左右。

5纯净性检验

按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。

6结论

通过比较在病毒孵育过程中添加D-氨基葡萄糖与否，发现，本发明的猪圆环病毒2型培养方法在不添加D-氨基葡萄糖孵育的情况下，其病毒增殖不受影响，依然能达到较高的滴度。不仅减少了操作步骤，更有利于控制质量，而且，D-氨基葡萄糖本身对细胞有一定毒性，在一定程度上影响着疫苗的质量。本发明方法通过使用OptiMEM低血清培养基有效解决了这一问题，提升了疫苗本身的安全性，更有利于工业化的推广和应用。

实施例3

猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备

1病毒的灭活

将实施例1制备的猪圆环病毒2型病毒液加入0.02％灭活剂BEI灭活37℃灭活72h，然后37℃加入10％V/V(0.1M)硫代硫酸钠终止BEI活性，然后将灭活后的病毒液于-20℃冷冻保存备用。

2疫苗的配制

取上述步骤制备的PCV2病毒液按1:1比例加入206佐剂(法国SEPPIC公司产品)，充分混合均匀即得猪圆环病毒2型灭活疫苗(成品含有灭活前PCV2病毒液10^6.0TCID₅₀/mL)。

3疫苗的效力检验

选择30头15-18日龄PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性断奶仔猪，随机分成3组，10头/组，第1组免疫猪圆环病毒2型灭活疫苗，颈部肌肉注射免疫，2ml/头，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第2组为攻毒对照组；第3组为空白对照组，只接种钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)和巯基乙酸培养基。二免后3周用PCV2病毒攻击，肌肉注射，3×10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分四点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/ml)，4mL/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19天仅腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。检测指标：(1)分别于首免后14、21、35天采血，测定ELISA抗体和中和抗体效价，观察抗体产生动态。(2)攻毒后1-20天测量体温，观察临床症状。(3)组织病理学观察。

ELISA抗体检测用大肠杆菌表达的PCV2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，37℃作用2h后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μL的0.15％BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μL，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1:10000倍稀释)，100μL/孔，37℃作用1h；洗涤；加底物液TMB(3′,3′,5′,5′,-四甲基联苯胺)显色，最后用2mol/L的H₂SO₄终止反应。结果判定：待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性。

血清中和试验采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1:2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID₅₀PCV2病毒液混合，37℃1h，接种于含PKK细胞单层的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养72h，80℅丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。

按常规方法进行病理解剖，观察脏器病理变化，并采集肺脏、脾脏、***等脏器4％***固定后，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织病变。

免疫后14天，免疫组能检测到PCV2抗体；首免疫后35天，疫苗免疫组ELISA抗体和中和抗体效价分别达1:3200和1:32以上，而且，ELISA抗体和中和抗体水平基本一致。结果见表1。

表1仔猪攻毒保护试验抗体检测结果

攻毒对照组所有猪攻毒后第1～3周体温升高(>40℃)，持续3～6天，攻毒后第10天出现被毛粗乱、食欲减退现象，第11天有1头死亡；空白对照猪在整个攻毒期中体温始终保持正常，无异常临床表现。疫苗免疫的猪，攻毒后第1周有2～3头猪出现体温超过40℃，持续1～2天，但均未见到明显异常临床表现。疫苗保护效率100％。结果见表2。

表2攻毒后20天内猪只临床症状统计结果

※:被毛粗乱，皮肤苍白，食欲减退，有死亡现象。

为了评价疫苗对猪体的保护效果，我们分别在攻毒前及宰杀时对猪体进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0进行统计分析，结果表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.41>0.05)，但明显高于非免疫攻毒对照组(P＝0.02<0.05)，证明疫苗均有较好免疫保护作用。

攻毒后第11天，攻毒对照猪1头死亡，病理剖解表现为肺脏出血、弹性变低，腹股沟、髂下、颌下、肠系膜***肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。攻毒后第20天，即试验结束时，扑杀所有试验猪，进行病理解剖和组织病理学检查。试验结果表明非免疫攻毒对照组猪有明显肉眼病理变化，***组织中淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润、包涵体病变；肺脏组织有单核细胞浸润；而免疫猪病理变化很不明显。具体结果见表3。

表3攻毒猪病理变化统计结果

本研究用猪圆环病毒2型灭活疫苗接种仔猪，结果均无异常临床表现，仔猪免疫后14天产生ELISA抗体和中和抗体，首免后35天攻毒，无异常临床表现和病理变化，免疫保护效率达100％，免疫效果良好。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种猪圆环病毒2型大规模培养的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用低血清培养基培养PKK细胞；

2)将步骤1)形成良好单层的PKK细胞经消化制备细胞悬液，接种到含有微载体的生物反应器中，并同时接种猪圆环病毒2型进行吸附；

3)病毒吸附之后进行病毒培养；

4)同步接毒72h后进行收毒，每天收获一个体积，连续收获。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)使用的低血清培养基为OptiMEM低血清培养基，不额外添加血清，于37℃5％CO₂的条件下培养48-72h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)细胞的接种密度为3×10⁵个/ml～2×10⁶个/ml，微载体的添加量为5g～20g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述微载体为Cytodex-1，添加前经过硅化处理，处理程序为用无Ca²⁺，Mg²⁺离子的PBS缓冲液清洗并浸泡3h，所用浸泡的玻璃容器应提前用硅化剂处理，经121℃25min高压灭菌，冷却后4℃密封保存备用，使用前用37℃的细胞培养液清洗3遍。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)同步接毒剂量按M.O.I.＝0.2，并同时补加生物反应器工作体积的1/3量的无血清无蛋白培养基吸附2h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述病毒吸附按照搅拌20-30min，停止15-20min，周期间歇性搅拌程序进行。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)病毒吸附之后继续补加无血清无蛋白培养基至生物反应器工作体积，进行病毒培养。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述病毒培养按照DO为50％～60％，搅拌转速为50～70rpm，采用压缩Air、O₂、N₂和CO₂四气模式条件培养。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)同步接毒72h第一次收毒后补加等体积的无血清无蛋白培养基，每天收获一次，连续收获至少5天。

10.一种使用权利要求1-9所述的方法制备的猪圆环病毒2型病毒液生产的猪圆环病毒2型灭活疫苗。