CN101934074B - 猪圆环病毒ⅱ型疫苗及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法，包括如下技术步骤：(1)制苗用细胞高密度培养；(2)制苗毒液的繁殖；(3)加入佐剂制备灭活疫苗。与现有技术相比，本发明具有病毒产量高、毒价高、生产规模大、单批次产量高、生产成本相对较低、产品质量高且稳定等优点。本发明灭活疫苗具有较好安全性，并可以诱导猪体产生免疫保护效果，完全符合国家兽医生物制品标准。

Description

猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，涉及一种猪圆环病毒Ⅱ型疫苗及其生产方法。 

背景技术

猪圆环病毒Ⅱ型(简称PCV2)感染引起的断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)等多种疾病(总称为猪圆环病毒病，PCVDs)，其临床特征为体重逐渐减轻，以及体征例如呼吸急促、呼吸困难和黄疸。从病理学观点来看，其表现为淋巴细胞或肉芽肿浸润，***病以及较罕见的肝炎和淋巴细胞或肉芽肿性肾炎。(Clark E.G.(1997)Proc.Am.Assoc.Swine Prac.499-501；La Semaine Veterinaire No.26，supplement to La Semaine Veterinaire 1996(834)；La Semaine Veterinaire 1997(857)：54；Nayar等人(1997)Can.Vet.J.38：385-387)。该病最早于1991年在加拿大西部发现(Clark EG.Post-weaning multisystemic wasting syndrome.Proc Am Assoc Swine Pract，1997，28：499-501)，随后，该疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国或地区出现(Daft B等.Interstitial pneumonia and lymphadenophathy associated with circoviral infection in a six week-old pig.Proc Am Assoc Yet Lab Diag，1996，39：32；Kennedy S等.Porcine circovirus infection in Northern Ireland.vet Rec，1998，142：495并96；LeCann P等.Piglet wasting disease.Tlet Rec，1997，141：660；Segales J等.First report of post-weaning multisystemic wasting syndrome in pigs in Spain.Vet Rec，1997，141：600-660)。在国内，郎洪武等(郎洪武等.断奶猪多***衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000，30：3-5)和曹胜波等(曹胜波等.猪Ⅱ型圆环病毒豫A株的全基因组克隆与序列分析.病毒学报，2000，18：137-141)分别通过血清学 和病原学调查表明，我国已有PCV2的流行。目前，PCV2已在世界各地广泛存在并流行，给全球养猪业造成了相当大的经济损失。 

目前还没有治疗和预防这种疾病的方法。然而，多项证据指出猪圆环病毒是PMWS(断奶仔猪多***衰竭综合征)的病原体(Ellis等人(1998)Can.Vet.J.39：44-51)。圆环病毒已从患有PMWS的猪回收，并且针对猪圆环病毒的抗体已在患有该疾病的猪体内证实。由于该病毒是一种DNA病毒，病毒变异率低，同时在世界范围内的致病只有PCV2一型。而PCV2的生物学特性比较特殊，它在细胞上增殖滴度很低，而且不引起细胞病变，因此研制PCV2的灭活疫苗和弱毒疫苗的难度很大。 

目前国内外生产疫苗主要有两种工艺：(1)生物反应器：规模较小，一般是实验室用，不能规模化生产；其有搅拌浆，以载体为依托培养细胞。这种方法的缺点是：搅拌产生剪切力，并且有气泡生成，影响细胞生长，规模化生产存在技术瓶颈。(2)转瓶技术：目前工业化生产基本都采用这种技术，生产细胞和病毒时劳动强度大、占地大、批间差异大、生产成本高、单批产量低，难以进行标准化生产的质量控制。 

在我国还未有确实有效并经过农业部批准的PCV2疫苗，主要原因还在于，PCV2在细胞中的生长滴度较低，一般仅为10^4.0TCID₅₀/ml左右。因此提高病毒毒价，保证良好的临床效果是解决猪圆环病毒Ⅱ型疫苗产业化的当务之急。 

发明内容

本发明主要目的是提供一种猪圆环病毒Ⅱ型疫苗的生产方法，包括如下步骤： 

1)微载体生物反应器中，微载体密度为60～80g/L，每克载体加入1.4×10⁷～2.6×10⁷个传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞； 

2)上述传代细胞培养至5.0×10⁹cells/L～8×10¹⁰cells/L时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I.＝0.001～1接种猪圆环病毒Ⅱ型，启动 病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培养猪圆环病毒Ⅱ型； 

3)病毒培养24～36h后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入孵育剂孵育30～45min，弃去孵育剂，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入细胞维持液继续培养； 

4)收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒II型病毒液。 

5)病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒II型疫苗。 

优选地，本发明所述的生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。 

更优选地，本发明所述的生物反应器为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。 

优选地，本发明所述的微载体为球形、网状或片状微载体。 

更优选地，本发明所述的微载体为聚酯、明胶或多糖。 

优选地，本发明所述方法步骤1)中所述细胞生长液为含3％～10％牛血清的DMEM培养基。 

更优选地，本发明所述的牛血清的含量为5％～7％ 

最优选地，本发明所述的牛血清的含量为6％ 

优选地，本发明所述的细胞维持液为含1％～5％牛血清的DMEM培养基。 

更优选地，本发明所述的牛血清的含量为2％～3％ 

最优选地，本发明所述的牛血清的含量为2％ 

优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。 

更优选地，本发明所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖。 

优选地，本发明所述生物反应器中的培养条件为温度37℃，CO2浓度为5％，培养液pH值为7.0～7.6。。 

优选地，本发明所述方法步骤4)中所述猪圆环病毒II型病毒液的体积为2.5L～1000L。 

本发明的另一方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒Ⅱ型病 毒液。 

本发明的又一方面为使用本发明方法制备的猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。 

技术效果 

与现有技术相比，本发明的猪圆环病毒Ⅱ型疫苗的生产方法，具有以下有益效果： 

(1)毒价高：传统的转瓶工艺生产的PCV2病毒毒价仅为10^4.0TCID₅₀/ml，而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养生产的病毒毒价可以达到10^6.0TCID₅₀/ml～10^7.0TCID₅₀/ml，其毒价要高出100-1000倍。 

(2)生产规模大、单批次产量高：目前国内采用搅拌式悬浮培养工艺培养动物细胞，单台生物反应器最大规模不超过100L；而本发明采用新的技术参数，运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养动物细胞，单台生物反应器规模达500L，最大可达1000L，单台规模提高5-10倍。 

(3)连续式封闭式生产、收获病毒：本发明的方法可以全封闭生产，自动换液，连续收获方式收集病毒液，减少了污染的机率，产品质量均一稳定，批间差异小。解决了传统工艺仅能控制温度和转速，不同批次质量差异大、批间差异大的问题。本发明方法，可直接线性放大用于生产。 

(4)生产成本相对较低、产品质量高且稳定：传统转瓶生产工艺生产的PCV2病毒毒价仅为10^4.0TCID₅₀/ml，要达到兽用生物制品规程要求的10^5.0TCID₅₀/ml，需要进行浓缩处理，每ml的生产成本为3元，而本发明工艺生产的PCV2病毒毒价平均可达10^6.5TCID₅₀/ml，每ml的生产成本为0.5元，产品成本下降6倍，质量提高提高100倍(以毒价计)。不同培养***增殖猪圆环病毒比较结果见表1。 

表1  不同培养***增殖猪圆环病毒的相关比较 

备注：载体贴壁面积1g＝2400cm²，1个微载体悬浮培养***加入载体的量按1600g计算。 

附图说明

图1为细胞接种0天时微载体上的显微照片； 

图2为病毒接种5天时微载体上的显微照片； 

图3为病毒接种10天时微载体上的显微照片； 

图4为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图。 

具体实施方式

实施例中使用了潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，其他类型的微载体悬浮培养生物反应器，如：搅拌式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器，均可以使用本发明之方法大规模生产PCV2病毒 或疫苗。优选地，本发明使用潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，可以提高培养时的培养基和溶解氧的供应，无气泡并且剪切力小，对细胞伤害小。 

本发明实施例中采用的生物反应器为潮汐式生物反应器。结构示意图如图4所示。其中，各个标记分别为：恒温搅拌***1，培养基恒温备料槽体2，自动馈料***3，恒温培养箱4，传代细胞5，微载体6，DO检测器及pH控制器7，收集器8。较优地，本发明实施例中采用了依据潮汐原理而设计的潮汐式生物反应器***，培养***分为两部份；一个是载体瓶，另一个是培养基搅拌袋(槽)。细胞固定在载体瓶，培养基流动于载体瓶与搅拌槽之间，造成间歇性的暴露与淹没载体。在本发明实施例中，所用反应器的载体瓶体积为5L、10L、20L、50L、100L，均能对温度、pH值、溶解氧、二氧化碳浓度自动控制。 

本发明实施例中，传代细胞使用了PK15，其他本领域常用的传代细胞如PKK细胞(PK15克隆细胞)、RK细胞(兔肾细胞)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)、ST细胞(猪睾丸细胞)、Dulac细胞(猪肾细胞)，也可用于本发明之方法大规模生产PCV2病毒或疫苗。 

本发明所述方法中，在细胞吸附微载体阶段与细胞培养阶段，启动了细胞吸附程序与细胞培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞的目的。 

本发明所述方法中，在病毒吸附微载体阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序与病毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相应的参数，达到病毒与细胞及微载体充分结合后，大量扩增病毒的目的。 

本发明实施例中，使用了孵育剂为D-氨基葡萄糖，其他类型的孵 育剂，如IFN(干扰素)、LPS(脂多糖)，也可用于病毒收获前的孵育。 

本发明试验了微载体密度为60～80g/L，每克微载体加入1.4×10⁷2.6×10⁷cells的传代细胞，更优地，本发明实施例中使用的微载体密度为80g/L，细胞密度为2.0×10⁷cells/g微载体。 

本发明试验了当传代细胞的密度达到5.0×10⁹cells/L～8.0×10¹⁰cells/L时，即密度达到初始密度的5～40倍时，换用细胞维持液，起始病毒吸附与培养程序为佳。 

本发明试验了按照感染复数为M.O.I.＝0.001～1接种PCV2，收获的猪圆环病毒Ⅱ型毒价最高，优选地，本发明实施例中使用了M.O.I.＝0.1接种病毒，启动病毒吸附程序与病毒培养程序，扩增猪圆环病毒Ⅱ型。 

本发明细胞生长液使用了含3％～10％牛血清的DMEM培养基；更优选地，本发明使用了牛血清的含量为5％～7％；最优选地，本发明实施例中使用的DMEM培养基的牛血清的含量为6％ 

本发明细胞维持液使用了含1％～5％牛血清的DMEM培养基；更优选地，本发明使用了牛血清的含量为2％～3％；最优选地，本发明实施例中选用了牛血清的含量为2％的DMEM培养基。 

本发明试验了病毒培养时间为24～36h后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞；优选地，本发明实施例中使用了24h的病毒培养时间，用PBS冲洗传代细胞。 

本发明试验了孵育剂的孵育时间为30～45min，优选地，本发明实施例中孵育时间为30min。 

本发明冲洗传代细胞的缓冲溶液为常规PBS，优选地，本发明实施例使用了0.01mol/L的PBS缓冲液。优选地，本发明实施例中采用反复冻融的方法，使细胞完全脱落、分散，从而获得病毒液。本发明还可使用其他本领域常用的破碎细胞的方法，获得病毒液。 

本发明实施例中疫苗的制备方法为加入甲醛灭活剂，灭活后加入油性佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒Ⅱ型疫苗。其他常用的灭活方法 或灭活剂，如β-丙内脂、二甲亚胺，也可用于制备本发明所述疫苗。本领域其他常用的疫苗制备的佐剂，如白油、其他水性佐剂等，也可用于制备本发明所述疫苗。 

本发明实施例方法包括下列操作步骤： 

(1)将制苗用宿主细胞接种到含有细胞生长用培养液与微载体的载体罐内，并将上述细胞与微载体混合均匀，使细胞贴附在微载体上；在适当培养环境下，提供上述细胞生长足够的养分及气体环境，使细胞在上述微载体上生长至接种浓度的5～40倍； 

(2)将细胞生长液更换为维持用培养液，并同步加入猪圆环病毒Ⅱ型种毒，先使其吸附在细胞上，然后进行培养，增殖病毒； 

(3)培养24h后将细胞维持液弃去，接种病毒的细胞用0.01mol/L的PBS充分洗涤，加入D-氨基葡萄糖孵育30min； 

(4)弃去D-氨基葡萄糖，将细胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤，加入细胞维持液继续培养细胞； 

(5)连续培养10天后，收获病毒液，于-20℃冷冻，20℃融解，反复两次，得到猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒液； 

(6)病毒液经检验合格后，加入甲醛灭活，灭活后的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)加入常规油性佐剂或双相佐剂，搅拌混匀，制得油乳剂疫苗或双相疫苗。 

上述技术方案中，所述的宿主细胞为可增殖猪圆环病毒病毒Ⅱ型(PCV2)的细胞系，如PK15细胞系等。 

上述技术方案中，所述的载体为网状(或球形、或片状)的聚酯(或明胶、或多糖)微载体。 

上述技术方案中，步骤(1)中所述微载体用量为80g/L、细胞的初始接种量为1.4×10⁷～2.6×10⁷cells/g微载体较好。 

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时细胞密度为5.0×10⁹cells/L～8.0×10¹⁰cells/L。 

上述技术方案中，细胞培养的环境为温度37℃，CO₂浓度为5％，培养液pH值为7.0-7.6。 

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时按病毒感染复数(M.O.I.)为0.01～1的比例。 

上述技术方案中，步骤(1)中所述细胞培养时一般贴附4h后开始培养程序。 

上述技术方案中，步骤(2)中所述接种病毒时一般吸附4h后开始病毒培养程序。 

本发明方法中培养细胞和病毒，可在生物反应器中进行。生物反应器主要包括载体瓶、储液罐、pH控制器、DO监测器、输入和输出***。工作过程如下：细胞贴附在载体瓶中载体上生长，当储液罐的培养液被泵入载体瓶时，培养液液面上升向细胞供给养分并促进细胞新陈代谢产物的去除；当载体瓶的培养液泵入储液罐时，培养液面随之下降，使细胞进行通风，促进呼吸，减小细胞切向压力，无O₂供应限制，无泡沫烦恼。这个重复的运动使载体上的细胞能够得到足够的营养和O₂，同时产生的代谢废物像CO₂能够有效的被排出去，从而能够大量的扩增细胞并增殖病毒，此种技术称之为潮汐式微载体悬浮培养技术。 

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。 

实施例1潮汐式微载体悬浮生物反应器大规模生产猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2) 

本实施例中所使用的生物反应器为潮汐式微载体生物反应器，所使用的微载体为聚酯纤维。宽5mm，长10mm，1g载体提供2,400cm²的贴壁面积，可提供1.0×10⁹以上数量的细胞生长。 

(1)将PK15细胞3.2×10¹⁰cells接种于20L载体罐中并添加载体聚酯纤维1600g，以及工作体积为500L的含6％牛血清的DMEM生长用培养液，潮汐式微载体悬浮培养技术培养至细胞总数达到 1.28×10¹²cells；培养细胞时先启动贴附程序，4h后换成培养程序；细胞贴附程序为：Up：2500m l/min；Hold 1min；Down：2500ml/min；Hold  30s，设定最大换液量18.5L；细胞培养程序：Up：1900ml/min；Hold lmin；Down 1900ml/min；Hold 1min，设定最大换液量18L。 

(2)将细胞生长用培养液全部更换为含2％牛血清的维持用DMEM培养液，并同步(M.O.I.＝0.1)加入猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)，于37℃培养，控制二氧化碳浓度5％，pH值7.2；接种病毒时先启动病毒吸附程序，4h后换成病毒培养程序；病毒吸附程序为：Up：1600ml/min；Hold  1min；Down：1600ml/min；Hold  30s、设定最大换液量18.5L；病毒培养程序：Up：1000ml/min；Hold 1min；Down 1000m1/min；Hold 1min、设定最大换液量18L。其中，Up为培养液通过微载体的上升速度，Down为培养液通过载体的下降速度，Hold为微载体浸泡在培养液中的时间； 

(3)培养24h后将载体罐内维持液弃去，细胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤，加入300mmol/L D-氨基葡萄糖孵育30min(D-氨基葡萄糖添加量以刚好淹没载体为准，孵育期间设备程序暂停，静止孵育)； 

(4)弃去D-氨基葡萄糖，将细胞用0.01mol/L的PBS(pH7.4)充分洗涤以除去载体上残留的D-氨基葡萄糖，加满细胞维持液继续培养细胞； 

(5)连续培养10天后收获病毒液，于-20℃冷冻、20℃融解，反复两次后，进行病毒液检验： 

(a)纯净性检验：按《中华人民共和国兽药典》2005版附录15、19、20页相关规定进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。 

(b)病毒含量测定：将病毒液用含300mmol/L D-氨基葡萄糖和2％牛血清细胞维持液作10倍梯度系列稀释，从10^-1到10^-6。每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性不接毒对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养48～72h，80％丙酮固定，用免疫荧光抗体(IFA)方法测定每个稀释 度含有PCV2阳性细胞(绿色荧光)的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒液TCID₅₀，每1.0ml含病毒≥10^6.5TCID₅₀； 

(c)特异性：用间接免疫荧光抗体(IFA)方法测定。将病毒液接种于96孔细胞板PK15细胞，每个样品4孔，每孔200μl，同时设立阴性对照，放入5％CO₂温箱中37℃培养48～72h；弃去生长液，用0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤细胞2次，然后加入100μl预冷的80％丙酮溶液，4℃固定30min。然后用PBS洗涤3次；弃掉维持液，PBS洗涤3次后，每孔加入100μl用PBS1∶100稀释的猪抗PCV2血清，37℃作用1h；用PBS洗涤3次，每次3min后；加入用PBS1∶100稀释的荧光标记的兔抗猪IgG的二抗(IgG-FITC)，每孔100μl，37℃作用1h；用PBS洗涤3次，每次3min，在荧光显微镜下观察。细胞对照孔应无特异性荧光出现，而病毒接种细胞孔应有大量特异性荧光出现。 

实施例2猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)灭活疫苗的制备及免疫效力评价 

1.材料与方法 

1.1疫苗 

实施例1得到的猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)病毒液按1∶1比例加入206佐剂(法国SEPPIC公司产品)，充分混合均匀即得(批号为：0803、0804、0805、0806和0807)。 

1.2.试验动物 

PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性仔猪，购自河南洛阳。 

1.3.安全性试验 

1.3.1.最小免疫日龄仔猪一次单剂量接种 

取7日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第l～5组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量2ml/头；第6组为空白对照组，编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1～7天每天测量体温(直肠温度)。 

1.3.2.仔猪单剂量重复接种 

取15～18日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第1～5组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量2ml/头，接种后2周，再用相同剂量免疫一次；第6组为空白对照组。编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1～7天每天测量体温(直肠温度)。 

1.3.3.仔猪一次超剂量接种 

取15～18日龄哺乳仔猪30头，分成6组，每组5头，第1～5组肌肉注射5个批次疫苗，接种剂量4ml/头；第6组为空白对照组，编号并称体重后隔离饲养30天，观察仔猪有无临床症状。接种后1～7天每天测量体温(直肠温度)。 

1.4.抗体检测与攻毒保护试验： 

选择35头15～18日龄PCV2ELISA抗体和PCV2抗原阴性断奶仔猪，随机分成7组，5头/组，第1、2、3、4、5组免疫0803、0804、0805、0806和0807批灭活苗，颈部肌肉注射免疫，2ml/头，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第6组为攻毒对照组；第7组为空白对照组，只接种钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA)和巯基乙酸培养基。二免后3周用PCV2病毒攻击，肌肉注射，3×10^5.0TCID₅₀/头，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分四点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，4mL/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19天仅腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。检测指标：(1)分别于首免后14、21、35天采血，测定ELISA抗体和中和抗体效价，观察抗体产生动态。(2)攻毒后1～20天测量体温，观察临床症状。(3)组织病理学观察。 

1.5.ELISA抗体检测 

用大肠杆菌表达的PCV2-ORF2蛋白作为抗原，通过方阵滴定试验确定抗原的最佳包被浓度。将抗原稀释到最佳包被浓度后包被酶标板，100μl/孔，37℃作用2h后4℃包被过夜；洗涤3次，每次3-5min；每孔加200μl的0.15％BSA封闭液封闭板子，37℃作用2h；洗涤；将待检血清用PBS倍比稀释，每个样品一行，每孔加100μl，37℃作用1h；洗涤；然后加入酶标的SPA(1∶10000倍稀释)，100μl/孔，37℃作 用1h；洗涤；加底物液TMB(3′，3′，5′，5′，-四甲基联苯胺)显色，最后用2mol/L的H₂SO₄终止反应。结果判定：待检血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀值≥2.1为阳性。 

1.6.血清中和试验 

采用固定病毒稀释血清法。待检血清56℃加热30min，10000rpm离心5min，小心吸出上清，做1∶2稀释后进行倍比稀释；分别与等量100TCID₅₀PCV2病毒液混合，37℃1h，接种于含PK15细胞单层的96孔板内，100μl/孔，每一稀释度接种4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔。37℃培养12h，用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，37℃继续培养48h，80％丙酮固定细胞，用间接免疫荧光法测定每个稀释度含有荧光的孔数。以能够抑制50％特异性荧光细胞数的细胞孔的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价，并计算每组平均值。 

1.7.病理学检查 

按常规方法进行病理解剖，观察脏器病理变化，并采集肺脏、脾脏、***等脏器4％***固定后，制备石蜡切片，HE染色，显微镜观察组织病变。 

2.结果 

2.1.疫苗安全性 

5批疫苗分别做最小日龄仔猪一次单剂量接种以及仔猪单剂量重复接种和仔猪一次超剂量接种后均表现发育良好，精神状态、食欲正常，无体温升高和其他不良反应。证明该疫苗安全性良好。结果见表2～4。 

表2  7日龄仔猪一次单剂量接种安全性试验结果 

表3  仔猪单剂量重复接种安全性试验结果 

表4  一次超剂量接种安全性试验结果 

2.2.免疫猪PCV2抗体检测 

免疫后14天，免疫组均能检测到PCV2抗体；首免疫后35天，疫苗免疫组ELISA抗体和中和抗体效价分别达1∶3200和1∶32以上，而且，ELISA抗体和中和抗体水平基本一致。结果见表5。 

表5仔猪攻毒保护试验抗体检测结果 

2.3.攻毒保护试验 

2.3.1.临床症状 

攻毒对照组所有猪攻毒后第1～3周体温升高(＞40℃)，持续3～6天，攻毒后第10天出现被毛粗乱、食欲减退现象，第11天有1头死亡；空白对照猪在整个攻毒期中体温始终保持正常，无异常临床表现。0803、0804、0805、0806和0807批疫苗免疫的猪，攻毒后第1周均有2～3头猪出现体温超过40℃，持续1～2天，但均未见到明显异常临床表现。5批疫苗保护效率分别100％、100％、100％、100％和100％。结果见表6。 

2.3.2.体重变化 

为了评价疫苗对猪体的保护效果，我们分别在攻毒前及宰杀时对猪体进行称重，计算各组平均相对日增重，利用统计学软件SPSS17.0 进行统计分析，结果表明疫苗免疫组猪相对日增重与空白对照组相似(P＝0.5＞0.05)，但明显高于非免疫攻毒对照组(P＝0.02＜0.05)，证明疫苗均有较好免疫保护作用。 

2.3.3.病理变化 

攻毒后第11天，攻毒对照猪1头死亡，病理剖解表现为肺脏出血、弹性变低，腹股沟、髂下、颌下、肠系膜***肿胀、出血，脾脏边缘轻微出血等。攻毒后第20天，即试验结束时，扑杀所有试验猪，进行病理解剖和组织病理学检查。试验结果表明非免疫攻毒对照组猪有明显肉眼病理变化，***组织中淋巴细胞缺失、巨噬细胞浸润、包涵体病变；肺脏组织有单核细胞浸润；而免疫猪病理变化很不明显。具体结果见表7。 

表6攻毒后20天内猪临床症状统计结果 

※：被毛粗乱，皮肤苍白，食欲减退，有死亡现象。 

表7攻毒猪病理变化统计结果 

3.结论 

本研究用5批猪圆环病毒Ⅱ型灭活疫苗接种仔猪，结果均无异常临床表现，安全性很好；仔猪免疫后14天产生ELISA抗体和中和抗体，首免后35天攻毒，无异常临床表现和病理变化，免疫保护效率达100％，免疫效果良好。且以本发明采用新的工艺参数运用潮汐式微载体细胞悬浮培养***生产猪圆环病毒灭活疫苗无论是抗原含量、产量还是生产成本等指标，远优于常用转瓶培养***。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (16)

1.一种猪圆环病毒II型疫苗的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)微载体生物反应器中，微载体密度为6080g/L，每克载体加入1.4×10⁷～2.6×10⁷个传代细胞及细胞生长液，启动细胞吸附程序使微载体与传代细胞充分结合后，启动细胞培养程序，培养传代细胞；

2)上述传代细胞培养至5.0×10⁹cells/L～8.0×10¹⁰cells/L时换用细胞维持液，按照感染复数为M.O.I.＝0.001～1接种猪圆环病毒II型，启动病毒吸附程序，使病毒与传代细胞充分接触，换用病毒培养程序，扩增培养猪圆环病毒II型；

3)病毒培养24～36h后，弃去细胞维持液，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入孵育剂孵育30～45min，弃去孵育剂，用缓冲溶液冲洗传代细胞，加入细胞维持液继续培养；

4)收获培养液，经细胞破碎处理，获得猪圆环病毒II型病毒液；

5)病毒液加入灭活剂，灭活后加入佐剂、乳化剂，制得猪圆环病毒II型疫苗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为微载体悬浮培养生物反应器。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器为为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体为球形、网状或片状微载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微载体为聚酯、明胶或多糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述细胞生长液为含3％～10％牛血清的DMEM培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述牛血清的含量为5％～7％。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述牛血清的含量为6％。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述细胞维持液为含1％～5％牛血清的DMEM培养基。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的牛血清的含量为2％～3％。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的牛血清的含量为2％。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的孵育剂为D-氨基葡萄糖、干扰素或脂多糖。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反应器的培养条件为温度37℃，CO₂浓度为5％，培养液pH值为7.0～7.6。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中所述猪圆环病毒II型病毒液的体积为2.5L～1000L。

15.一种由权利要求1-14任意一项方法制备的猪圆环病毒II型病毒液。

16.一种由权利要求1-14任意一项方法制备的猪圆环病毒II型疫苗。

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