CN105378096A - 寡糖组合物、糖蛋白以及在原核生物中产生它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了产生多种寡糖组合物和糖蛋白的方法和组合物。通过将糖基化途径引入宿主细胞，在有效产生类人的例如，高甘露糖，混合和复合糖基化模式的条件下培养原核生物宿主细胞。

Description

寡糖组合物、糖蛋白以及在原核生物中产生它们的方法
联邦赞助研究和开发的声明
本发明是由美国国家卫生研究院在政府资助的基金号1R43GM088905-01、2R44GM088905-02和5R44GM088905-03之下做出的。政府享有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请涉及2013年3月14日提交的第61/785,586号美国临时申请，其全文出于所有目的通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经经由EFS-Web提交并且据此通过引用整体并入的序列表。在[日期]创建的所述ASCII拷贝文件以[.txt]命名并且大小为[#######]个字节。
技术领域
本发明总体涉及糖生物学和蛋白质工程领域。更具体地说，本文所述的实施方式涉及原核生物中寡糖组合物和治疗性糖蛋白产生。
背景技术
糖基治疗(Glycotherapeutics)
基于蛋白质的疗法当前占FDA批准的新药物(Walsh,G.,"BiopharmaceuticalBenchmarks,"NatBiotechnol18:831-3(2000)；Walsh,G,"BiopharmaceuticalBenchmarks,"NatBiotechnol21:865-70(2003)；以及Walsh,G,"BiopharmaceuticalBenchmarks,"NatBiotechnol24:769-76(2006))的四分之一。
虽然使用诸如大肠杆菌的原核表达***可产生几种蛋白疗法(例如，胰岛素)，但绝大多数治疗性蛋白质需要另外的翻译后修饰(被认为在原核生物中不存在)以获得其全部生物学功能。具体地，预计N-连接的蛋白质糖基化影响半数以上的所有真核生物蛋白质种类(Apweiler等,"OntheFrequencyofProteinGlycosylation,asDeducedFromAnalysisoftheSWISS-PROTDatabase,"BiochimBiophysActa1473:4-8(1999))并且通常对于大量蛋白质的适当折叠、药代动力学稳定性、组织靶向和功效是必要的(Helenius等,"IntracellularFunctionsofN-linkedGlycans,"Science291:2364-9(2001))。因为大多数细菌不使其自身蛋白质糖基化，所以大多数治疗上相关的糖蛋白(包括抗体)的表达被移交给哺乳动物细胞。然而，哺乳动物细胞培养物具有许多缺点，包括：(i)相对于细菌真核宿主(如CHO细胞)的极高的生产成本和低的容产率；(ii)逆转录病毒污染；(iii)生成稳定细胞系需要较长的时间；(iv)经由基因修饰较不能迅速地生成稳定、“高产的”真核细胞系；以及(v)当使用具有内源性非人糖基化途径的宿主细胞时，如CHO，出现的糖型异质性产生高的产物可变性(Choi等，"UseofCombinatorialGeneticLibrariestoHumanizeN-linkedGlycosylationintheYeastPichiapastoris,"ProcNatlAcadSciUSA100:5022-7(2003))。另一方面，在大肠杆菌中的表达不具有这些局限性。
在大肠杆菌中治疗性蛋白质的表达
许多治疗性重组蛋白质当前使用大肠杆菌作为宿主生物体来表达。其中一个最好的实例为人胰岛素，其在1982年由EliLilly于大肠杆菌中首次产生。从那时以来，依赖大肠杆菌表达的庞大数目的人类治疗性蛋白质已经在美国和欧洲得到批准，所述蛋白质包括人生长激素(hGH)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、***(IGF-1、IGFBP-3)、角质形成细胞生长因子、干扰素(IFN-α、IFN-β1b、IFN-γlb)、白细胞介素(IL-1、IL-2、IL-11)、组织坏死因子(TNF-a)和组织型纤溶酶原激活物(tPA)。然而，几乎所有的糖蛋白在哺乳动物细胞中产生。当正常糖基化的蛋白质在大肠杆菌中表达时，在该宿主中缺乏糖基化可得到功能不全的蛋白质。例如，糖基化的人单克隆抗体(mAb)(例如，抗组织因子IgGl)可在大肠杆菌中以可溶形式和高水平表达(Simmons等，"ExpressionofFull-lengthImmunoglobulinsinEscherichiacoli:RapidandEfficientProductionofAglycosylatedAntibodies,"JImmunolMethods263:133-47(2002))。然而，虽然与哺乳动物来源的抗体相比，大肠杆菌来源的mAb对其同源抗原和新生受体保持紧密结合并表现出循环半衰期，但由于不存在N-聚糖它们不能结合于Clq和FcγRI受体。
真核和原核的N-连接蛋白质糖基化
N-连接的蛋白质糖基化为真核生物的内质网(ER)中发生的重要且保守的过程(Burda等，"TheDolicholPathwayofN-linkedGlycosylation,"BiochimBiophysActa1426:239-57(1999))。其对分泌和膜蛋白的蛋白质折叠、寡聚化、质量控制、分选和运输是重要的(Helenius等，"IntracellularFunctionsofN-linkedGlycans,"Science291:2364-9(2001))。可将真核N-连接的蛋白质糖基化途径分成两个不同的过程：(i)脂质连接的寡糖在内质网膜的装配，以及(ii)寡糖从脂质锚定多萜醇焦磷酸酯转移至新生多肽的选定天冬酰胺残基。N-连接的蛋白质糖基化的特征，即(i)多萜醇焦磷酸酯(Dol-PP)用作寡糖装配的载体，(ii)仅完全装配的Glc3Man9GlcNAc2寡糖转移，以及(iii)识别以序列N-X-S/T为特征的天冬酰胺残基，其中N为天冬酰胺，X为除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且S/T为丝氨酸/苏氨酸(Gavel等,"SequenceDifferencesBetweenGlycosylatedandNon-glycosylatedAsn-X-Thr/SerAcceptorSites:ImplicationsforProteinEngineering,"ProteinEng3:433-42(1990))在真核生物中为高度保守的。寡糖基转移酶(OST)催化来自脂质供体长醇焦磷酸的寡糖转移至受体蛋白质。在酵母菌中，已经鉴别构成体内复合体的八种不同的膜蛋白(Kelleher等，"AnEvolvingViewoftheEukaryoticOligosaccharyltransferase,"Glycobiology16:47R-62R(2006))。STT3被认为代表OST的催化亚基(Nilsson等，"Photocross-linkingofNascentChainstotheSTT3SubunitoftheOligosaccharyltransferaseComplex,"JCellBiol161:715-25(2003)以及Yan等，"StudiesontheFunctionofOligosaccharylTransferaseSubunits.Stt3pisDirectlyInvolvedintheGlycosylationProcess,"JBiolChem277:47692-700(2002))。其为OST复合物中最保守的亚基(Burda等,"TheDolicholPathwayofN-linkedGlycosylation,"BiochimBiophysActa1426:239-57(1999))。
相反地，细菌中糖基化途径的缺乏已经很大地限制原核表达宿主制备治疗性蛋白质的实用性，尤其是自从某些估计“自然界中半数以上的所有蛋白质最终被发现为糖蛋白”以来(Apweiler等，"OntheFrequencyofProteinGlycosylation,asDeducedFromAnalysisoftheSWISS-PROTDatabase,"BiochimBiophysActa1473:4-8(1999))。然而，最近发现病原菌空肠弯曲杆菌的基因组编码N-连接的蛋白质糖基化途径(Szymanski等，"ProteinGlycosylationinBacterialMucosalPathogens,"NatRevMicrobiol3:225-37(2005))。该途径的基因，由Szymanski及同事于1999年首次鉴别(Szymanski等，"EvidenceforaSystemofGeneralProteinGlycosylationinCampylobacterjejuni,"MolMicrobiol32:1022-30(1999))，包括用于蛋白质糖基化的17-kb基因组，被命名为pgl。在发现pgl基因座之后，在2002年，Linton等鉴别了两种空肠弯曲杆菌糖蛋白-PEB3和CgpA，并显示诸如这些的空肠弯曲杆菌-来源的糖蛋白结合于N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-特异性凝集素大豆凝集素(SBA)(Linton等，"IdentificationofN-acetylgalactosamine-containingGlycoproteinsPEB3andCgpAinCampylobacterjejuni,"MolMicrobiol43:497-508(2002))。此后不久，Young等鉴别超过30种潜在的空肠弯曲杆菌糖蛋白(包括PEB3和CgbA)，并使用质谱法和NMR揭示N-连接的聚糖为具有结构GalNAc-αl,4-GalNAc-αl,4-[Glcβ1,3]GalNAc-αl,4-GalNAc-αl,4-GalNAc-αl,3-Bac-β1,N-Asn(GalNAc5GlcBac的七庚糖，此处Bac为杆菌胺或2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧葡萄糖)(Young等，"StructureoftheN-linkedGlycanPresentonMultipleGlycoproteinsintheGram-negativeBacterium,Campylobacterjejuni,"JBiolChem277:42530-9(2002))。分枝的七庚糖通过在内膜的细胞质侧依序加入在脂质载体十一异戊二烯焦磷酸(Und-PP)上的核苷酸-激活糖来合成(Feldman等，"EngineeringN-linkedProteinGlycosylationwithDiverseOAntigenLipopolysaccharideStructuresinEscherichiacoli,"ProcNatlAcadSciUSA102:3016-21(2005))并且，一旦装配，其通过推定的ATP-结合盒(ABC)转运蛋白WlaB翻转出膜(Alaimo等，"TwoDistinctButInterchangeableMechanismsforFlippingofLipid-linkedOligosaccharides,"EmboJ25:967-76(2006)以及Kelly等，"BiosynthesisoftheN-linkedGlycaninCampylobacterjejuniandAdditionOntoProteinThroughBlockTransfer,"JBacteriol188:2427-34(2006))。然后，在周质中七庚糖至底物蛋白质的转移通过被命名为PglB的OST催化，所述OST为单个整合膜蛋白，其与真核生物的OSTSTT3的催化亚基具有显著的序列相似性(Young等，"StructureoftheN-linkedGlycanPresentonMultipleGlycoproteinsintheGram-negativeBacterium,Campylobacterjejuni,"JBiolChem277:42530-9(2002))。PglB将七庚糖连接到基序D/E-X1-N-X2-S/T(其中D/E为天冬氨酸/谷氨酸，X1和X2为除脯氨酸之外的任何氨基酸，N为天冬酰胺并且S/T为丝氨酸/苏氨酸)中的天冬酰胺，所述基序为类似于在真核生物糖基化过程中使用的序列子(N-X-S/T)(Kowarik等，"DefinitionoftheBacterialN-glycosylationSiteConsensusSequence,"EmboJ25:1957-66(2006))。
微生物的糖工程学
当在哺乳动物、酵母或甚至细菌宿主细胞中表达治疗性糖蛋白时遇到的主要问题是非人类聚糖的加入。例如，酵母-产生治疗性糖蛋白的两个最频繁使用的***之一，向重组糖蛋白转移高度免疫原性的甘露聚糖型N-聚糖(含有高达一百个甘露糖残基)。哺乳动物表达***也可用非人类糖残基，如唾液酸的N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)形式(在CHO细胞以及在乳中产生)或末端α(l,3)-半乳糖(Gal)(在鼠科细胞中产生)修饰治疗性蛋白质。重复施用携带非人类糖的治疗性蛋白质可引起不良反应，包括在人中的免疫应答。
作为使用天然的糖基化***产生治疗性糖蛋白的替代方案，糖工程化表达***的利用度可打开定制治疗性蛋白质的糖基化的大门并可导致改善的治疗性糖蛋白的形成。此类***应具有消除不期望聚糖的潜能并以高度同质性进行人糖基化。酵母菌毕赤酵母(Pichiapastoris)已经被糖工程化以提供具有糖基化特定治疗功能能力的表达***(Gerngross,T.U.,"AdvancesintheProductionofHumanTherapeuticProteinsinYeastsandFilamentousfungi,"NatBiotechnol22:1409-14(2004)；Hamilton等，"GlycosylationEngineeringinYeast:TheAdventofFullyHumanizedYeast,"CurrOpinBiotechnol18:387-92(2007)；以及Wildt等，"TheHumanizationofN-glycosylationPathwaysinYeast,"NatRevMicrobiol3:119-28(2005))。
例如，一组糖工程化毕赤酵母菌株被用于产生单克隆抗体利妥昔单抗(抗-CD20IgGl抗体)的各种糖型(Li等，"OptimizationofHumanizedIgGsinGlycoengineeredPichiapastoris,"NatBiotechnol24:210-5(2006))。虽然这些抗体与商购的利妥昔单抗共享相同的氨基酸序列，但特定糖型显示出与相关FcγRIII受体～100倍高的结合亲和力并表现出体外人B-细胞消耗的改善(Li等，"OptimizationofHumanizedIgGsinGlycoengineeredPichiapastoris,"NatBiotechnol24:210-5(2006))。糖工程化毕赤酵母的巨大成功和潜能也具有一些缺点。例如，在酵母和所有其它真核生物中，N-连接的糖基化对于活性是必要的(Herscovics等，"GlycoproteinBiosynthesisinYeast,"FASEBJ7:540-50(1993)和Zufferey等，"STT3,aHighlyConservedProteinRequiredforYeastOligosaccharylTransferaseActivityInvivo,"EMBOJ14:4949-60(1995)).Gerngross及同事***地消除并重新工程化许多不想要的酵母N-糖基化反应(Choi等,"UseofCombinatorialGeneticLibrariestoHumanizeN-linkedGlycosylationintheYeastPichiapastoris,"ProcNatlAcadSciUSA100:5022-7(2003))。然而，消除甘露聚糖型N-聚糖仅为酵母糖基化故事的一半。这是因为酵母也进行O-连接的糖基化，由此O-聚糖连接到糖蛋白的Ser或Thr残基(Gentzsch等，"ThePMTGeneFamily:ProteinO-glycosylationinSaccharomycescerevisiaeisVital,"EMBOJ15:5752-9(1996))。与N-连接的糖基化一样，O-糖基化对于活性是必要的(Gentzsch等，"ThePMTGeneFamily:ProteinO-glycosylationinSaccharomycescerevisiaeisVital,"EMBOJ15:5752-9(1996))，并且因此不能从糖工程化酵母中遗传缺失。因为酵母与人的O-糖基化机制存在差别，所以通过糖工程化酵母菌株可能加入O-聚糖具有诱发不良反应(包括免疫应答)的潜能。
Aebi及其同事将空肠弯曲杆菌糖基化基因座转移至大肠杆菌并赋予这些细胞翻译后修饰具有N-聚糖的蛋白质的特别能力(Wacker等，"N-linkedGlycosylationinCampylobacterjejunianditsFunctionalTransferintoE.coli,"Science298:1790-3(2002))。然而，虽然原核生物与真核生物糖基化机制共享功能相似，但原核生物糖基化机制连接的寡糖链(GalNAc5GlcBac)在结构上不同于真核生物糖基化途径连接的寡糖链(Szymanski等，"ProteinGlycosylationinBacterialMucosalPathogens,"NatRevMicrobiol3:225-37(2005)；Young等，"StructureoftheN-linkedGlycanPresentonMultipleGlycoproteinsintheGram-negativeBacterium,Campylobacterjejuni,"JBiolChem277:42530-9(2002)；和Weerapana等，"Asparagine-linkedProteinGlycosylation:FromEukaryotictoProkaryoticSystems,"Glycobiology16:91R-101R(2006))。已经做出许多尝试(无成功)以用真核生物N-糖基化途径重编程大肠杆菌来表达结构上同源的类似于人聚糖的N-连接的糖蛋白。
最近，Vaderrama-Rincon等"AnengineeredeukaryoticproteinglycosylationpathwayinE.coli"NatChemBio8,434-436(2012)显示原核生物宿主细胞可用真核生物糖基转移酶进行糖工程化。具体地说，原核生物宿主细胞中UDP-GlcNAc转移酶和GDP-甘露糖转移酶的表达显示产生了三甘露糖基核心结构，其为几乎所有真核生物N-连接的寡糖结构的基础。然而，充分阐述类人聚糖仍需要另外的糖工程学。
因此，本发明涉及产生类人聚糖，如高甘露糖型、混合型和复合型。
发明内容
本发明提供在原核生物宿主细胞中产生寡糖组合物和重组糖蛋白的方法和材料。使用本发明的方法产生包含特定N-聚糖的不同糖蛋白组合物。在某些实施方式中，产生期望糖型作为主要种类。
本发明还提供用于产生包含例如特定寡糖组合物的疫苗抗原的方法和材料以诱导对象内免疫力或免疫耐受性(例如，无反应性)。本发明的不同方面涉及能够结合在树突细胞和/或其它抗原呈递细胞表面上可表达的凝集素的抗原-碳水化合物缀合物。
本发明的第一方面涉及产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性(EC2.4.1.101；EC2.4.1.143；EC2.4.1.145；EC2.4.1.155；EC2.4.1.201)，其催化UDP-GlcNAc残基转移至所述末端甘露糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端GlcNAc残基的寡糖组合物的条件下进行。
本发明的第二方面涉及产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养宿主细胞以表达一种或多种半乳糖转移酶酶活性(EC2.4.1.38)，其催化UDP-半乳糖残基转移至所述末端GlcNAc残基，所述培养步骤在有效产生具有末端半乳糖残基的寡糖组合物的条件下进行。
本发明的第三方面涉及产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养宿主细胞以表达一种或多种唾液酸转移酶酶活性(EC2.4.99.4和EC2.4.99.1)，其催化CMP-NANA残基转移至所述末端半乳糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端唾液酸残基的寡糖组合物的条件下进行。
本发明的其它方面涉及表达随溶解度增强的融合蛋白的一种或多种酶。本发明的其它方面包括将聚糖转移至基因编码的目标蛋白，由此宿主细胞产生糖基化蛋白质。
另外的方面包括用于产生主要糖型的另外的酶的培养条件和过表达。本发明的特征方面提供表达不同糖基转移酶活性的原核生物宿主细胞以产生高甘露糖、混合和/或复合的寡糖组合物以及高甘露糖、混合和/或复合的糖基化蛋白质。
在优选方面，本发明使设计、发现和开发糖蛋白疗法和诊断学的技术商业化。具体地说，本发明提供在微生物细胞中开发有效产生真正的人糖蛋白的有效的、低成本策略。在不同方面，本发明的糖工程化细菌能够产生立体特异的N-连接的糖蛋白。在一个实施方式中，用编码新型糖基化途径的基因转化细菌，所述糖基化途径能够有效地使在特定天冬酰胺受***点处的靶蛋白糖基化(例如，N-连接的糖基化)。使用这些特别工程化的细胞系，可表达和糖基化不同的目标重组蛋白。
此外，本发明提供在原核生物中工程化寡糖结构排列的方法，预期该排列改变例如，蛋白质的药代动力学性质并阐明生物现象中糖基化的作用。在不同方面，本发明提供用于研究、工业和治疗应用的治疗性蛋白质、新型糖缀合物、免疫促进剂(例如，疫苗)的生物技术合成。
附图说明
图1.高甘露糖型Man5GlcNAc2糖型的产生。
从GLY02提取的释放脂质的聚糖(A)的MALDI-TOF质谱与预期的Man5GlcNAc2糖型一致(m/z1257.6)以及(B)用αl,2-甘露糖苷酶进一步处理的所述聚糖与预期的Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.4)。
图2.混合GlcNAcMan3GlcNAc2糖型的产生。
从GLY03提取的释放脂质的聚糖(A)的MALDI-TOF质谱与预期的GlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致(m/z1136.5)以及(B)用β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进一步处理所述聚糖与预期的Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.5)。
图3.复合GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的产生。
从GLY06.1提取的释放脂质的聚糖的MALDI-TOF质谱与预期的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致(m/z1339.8)。
图4.混合的、分枝糖型的产生。从GLY05提取的释放脂质的聚糖(A)的MALDI-TOF质谱与预期的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致(m/z1339.7)以及(B)用β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶进一步处理的所述聚糖与预期的Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.5)。
图5.多触角糖型的产生。离体合成的聚糖(A)以及从GLY06.1提取的释放脂质的聚糖(B)的MALDI-TOF质谱与预期的GlcNAc3Man3GlcNAc2一致(m/z1543.1)。
图6.GalGlcNAcMan3GlcNAc2糖型的产生。从GLY04.1提取的释放脂质的聚糖的MALDI-TOF质谱与预期的GalGlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致(m/z1298.7)。
图7.Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的产生。
离体合成的聚糖(A)以及从GLY04.2提取的释放脂质的聚糖(B)的MALDI-TOF质谱与预期的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2一致(m/z1662.2)。
图8.NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2糖型的产生。离体合成的聚糖的阳离子模式的MALDI-TOF质谱与预期的NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2一致(m/z1565.7)。
图9.增加聚糖产量。(A)将Man3GlcNAc2聚糖标准物(M3GN2Std)、具有ManC/B过表达(GLY0l.2)或无ManC/B过表达(GLY0l)的大肠杆菌提取的释放脂质的聚糖进行荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)(左)，显示与Man3GlcNAc2糖型一致以及从具有GlmS过表达(GLY0l.l)或无GlmS过表达(GLY0l.3)的大肠杆菌提取的释放脂质的聚糖进行荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)(右)，显示与GlcNAcMan3GlcNAc2糖型(GNM3GN2)一致。(B)从有ManC/B过表达的GLY0l.2中提取的释放脂质的聚糖与甘油补充物的定量，如所显示的。(C)从GLY0l.2提取的释放脂质的聚糖、加有0.2％甘油或丙酮酸酯补充物的FACE。
图10.增加的产物形成。从菌株(A)GLY0l，(B)GLY02和(C)GLY0l.l，无ManC/B过表达以及(D)GLY0l.4，(E)GLY02.1和(F)GLY0l.5，具有ManC/B过表达中提取的释放脂质的聚糖的MADLI-TOF质谱。加入ManC/B观察到对应于中间物糖型的峰的丧失。
图11.糖基化的胰高血糖素产生。来自不同的糖工程化菌株的连接有C-末端糖基化位点的部分纯化的胰高血糖素的MALDI-TOFMS，所述工程化菌株产生M3、M5、GlcNAcMan3GlcNAc2和GalGlcNAcMan3GlcNAc2糖肽。
图12.糖基化的抗原。最初来自肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)连接有四个连续的C-末端糖基化位点并在GLY0l中表达的用抗六组氨酸抗体(左)和对末端α-甘露糖特异的伴刀豆球蛋白A凝集素(右)检测的部分纯化的(A)3473和(B)1275蛋白质的蛋白质印迹。
具体实施方式
定义
提供术语的以下定义和方法以更好地描述本公开以及指导本领域普通技术人员实践本公开。
本文提及的所有出版物、专利和其它参考文献据此通过引用整体并入。
EC编号由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB))(在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/获得)创建。本文引用的EC编号来源于KEGG配体数据库，其由京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)维护并部分由东京大学赞助。除非另外指明，EC编号为如2013年3月的数据库所提供的。
本文引用的登录号来源于由美国的国立卫生研究所维护的NCBI数据库(国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))。除非另外指明，登录号为如2013年3月的数据库所提供的。
本发明的方法和技术通常根据本领域熟知的常规方法以及如本说明书通篇引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献所述进行，除非另外指明。参见，例如,Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)；Ausubel等,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates(1992,以及至2002年的增刊)；Harlow和Lane,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990)；Taylor和Drickamer,IntroductiontoGlycobiology,OxfordUniv.Press(2003)；WorthingtonEnzymeManual,WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,N.J.；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolI,CRCPress(1976)；HandbookofBiochemistry:SectionAProteins,VolII,CRCPress(1976)；EssentialsofGlycobiology,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。虽然类似于或等同于本文所述的那些方法和材料可用于实践或测试本公开，但以下描述了合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是说明性的而非意图进行限制。本公开的其它特征从以下详述和权利要求中显而易见。
在临时申请中的术语“权利要求”与实施方式或优选实施方式同义。
如本文所用，“包含(comprising)”意指“包括(including)”，单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数的指代物，除非上下文清楚地指出。例如，提及“包含细胞”包括一个或多个此类细胞。术语“或者”是指陈述的可选元件的单个元件或两种或更多种元件的组合，除非上下文清楚地指出。
关于糖蛋白的术语“类似于人的”是指这样的蛋白质，其具有连接到蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮(N-连接的)的附接的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基，该蛋白质类似于或甚至等同于人中产生的那些。
“N-聚糖”或“N-连接的聚糖”是指N-连接的寡糖结构。N-聚糖可连接到蛋白质或合成的糖蛋白中间体，这可在体外或体内进一步操作。在糖蛋白中发现的主要糖为葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，N-乙酰基-神经氨酸(NeuAc或NANA)。也可以发现己糖(Hex)。N-聚糖在包含加入至“三甘露糖核心”的***糖(例如，GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分枝(“触角”或“臂”)数目上是不同。术语“三甘露糖核心”也被称为“M3、”“M3GN2，”“三甘露糖核心、”“戊多糖核心”或“寡甘露糖核心”反映Man3GlcNAc2寡糖结构，其中Manαl,3臂和Manαl,6臂从二-GlcNAc结构(GlcNAc2):β1,4GlcNAc-β1,4GlcNAc延伸。根据N-聚糖的分枝组分对其分类(例如，高甘露糖、复合的或混合的)。
“高甘露糖”型N-聚糖包含二-GlcNAc寡糖结构上的四个或更多个甘露糖残基。“M4”反映Man4GlcNAc2。“M5”反映Man5GlcNAc2。
“混合”型N-聚糖在三甘露糖核心的αl,3甘露糖(Manαl,3)臂的末端具有至少一个GlcNAc残基以及在三甘露糖核心的αl,6甘露糖(Manαl,3)臂上具有零个或多个甘露糖。不同的N-聚糖也被称为“糖型”。混合聚糖的一个实例为“GNM3GN2”，其为GlcNAcMan3GlcNAc2。
“复合”型N-聚糖通常具有连接到三甘露糖核心的Manαl,3臂的至少一个GlcNAc残基以及连接到三甘露糖核心的Manαl,6臂的至少一个GlcNAc。复合的N-聚糖也可以具有半乳糖或任选被唾液酸或衍生物修饰的N-乙酰半乳糖胺残基(例如，“Neu”是指神经氨酸以及“Ac”是指乙酰基)。复合生物N-聚糖也可以具有链内取代，这包括“平分”GlcNAc和核心岩藻糖。复合的N-聚糖也可以在三甘露糖核心上具有多个触角，经常被称为“多触角聚糖”或也被称为“多分枝聚糖，”其可为三触角、四触角或五触角聚糖。
术语“G0”是指GlcNAc2Man3GlcNAc2。术语“G0(1)”是指GlcNAc3Man3GlcNAc2，术语“G0(2)”是指GlcNAc4Man3GlcNAc2以及术语“G0(3)”是指GlcNAc5Man3GlcNAc2。术语“Gl”是指GalGlcNAc2Man3GlcNAc2，“G2”是指Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2，“G3”是指Gal3GlcNAc3-5Man3GlcNAc2，“G4”是指Gal4GlcNAc4-5Man3GlcNAc2，“G5”是指Gal5GlcNAc5Man3GlcNAc2。术语“S1”是指NANAGal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2，“S2”是指NANA2Gal2-5GlcNAc2-5Man3GlcNAc2。“S3”是指NANA3Gal3-5GlcNAc3-5Man3GlcNAc2，“S4”是指NANA4Gal4-5GlcNAc4-5Man3GlcNAc2，“S5”是指NANA5Gal5GlcNAc5Man3GlcNAc2。
如本文所用，术语“主要地(predominantly)”或诸如“主要的(thepredominant)”或“其为主要的”的变体应理解为意指在已经去除糖蛋白(例如，用PNGase处理并释放聚糖)并通过质谱例如MALDI-TOFMS分析之后所测量的占总N-聚糖的最高摩尔百分比(％)的聚糖物质。换句话说，短语“主要地”被定义为以比任何其它单独实体大的摩尔百分比存在的单独实体，如特定糖型。例如，如果组合物由40摩尔％的物质A、35摩尔％的物质B以及25摩尔％的物质C组成，组合物主要包含物质A。在提及聚糖时，术语“富含的、”“均一的、”“匀质的”以及“基本上由……组成”也与“主要的”同义。
在阳性模式中通过MALDI-TOF-MS测量的N-聚糖的摩尔％是指相对于总N-聚糖的摩尔％，糖转移的摩尔％。某些阳离子加合物如K+和Na+通常与通过各自加合物的分子质量增加N-聚糖的质量而洗脱的峰相关。
除非另外指明，作为针对本文所述的在通用格式“SEQIDNO:”下的所有序列的实例，“包含SEQIDNO:1的核酸”是指这样的核酸，其至少一部分具有(i)SEQIDNO:1的序列，或(ii)与SEQIDNO:1互补的序列。两个之间的选择由上下文来规定。例如，如果核酸被用作探针，两个之间的选择由与期望靶标互补的探针的需求来规定。
“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合物)或糖蛋白为基本上与在其天然宿主细胞中天然伴随天然多核苷酸的其它细胞组分(例如，核糖体、聚合酶及其天然结合的基因组序列)分离的核酸或多核苷酸或糖蛋白。术语涵盖这样的核酸、多核苷酸，其(1)已经从其天然存在的环境中去除，(2)在自然界中发现的“分离的多核苷酸”不与所有或部分多核苷酸结合，(3)可操作地连接到多核苷酸，在自然界中不连接到多核苷酸或(4)在自然界中不存在。在提及重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或通过异源***生物合成的多核苷酸类似物时，也可使用术语“分离的”或“基本上纯的”。
然而，“分离的”不一定需要如此描述的核酸、多核苷酸或糖蛋白本身已经从其天然环境中物理去除。例如，如果异源序列置于邻近内源核酸序列，使得该内源核酸序列的表达发生改变，则在生物体的基因组中的内源性核酸序列被认为是“分离的”。在该上下文中，异源序列为这样的序列，其天然上不邻近于内源核酸序列，无论异源序列本身是否为内源的(源于相同宿主细胞或其后代)或外源的(源于不同宿主细胞或其后代)。例如，启动子序列可替代(例如，通过同源重组)宿主细胞的基因组中基因的天然启动子，使得该基因具有改变的表达模式。该基因现应变为“分离的”，因为其从天然位于其侧面的序列的至少一些中分离出来。
如果核酸含有不会天然发生于基因组中相应核酸的任何修饰，核酸也被认为是“分离的”。例如，如果内源编码序列含有例如通过人为干涉人工引入的***、缺失或点突变，内源编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”也包括在异源位点整合入宿主细胞染色体的核酸以及以附加体存在的核酸构建体。此外，“分离的核酸”可基本上不含其它细胞材料或基本上不含培养基(当通过重组技术产生时)或基本上不含化学前体或其它化学品(当化学合成时)。
如本文所用，术语治疗性蛋白质的“治疗有效量”是指足以治愈、减轻或部分阻止给定疾病和/或其并发症的临床表现的量。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效量”。各个目的的有效量应取决于疾病或损害的严重度以及对象的体重和一般状态。应理解适当剂量的确定可以通过构建有价值的基质并测试基质中的不同点使用常规实验来实现，其全部在受过训练的医师或兽医的普通技术人员的水平内。
本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”及其它变体是指出于与病况如疾病或病症战斗的目的管理和照顾患者或对象。术语意图包括对于给定病况的全部范围的治疗，从患者遭受的病况，如施用所讨论的活性化合物以减轻症状或其并发症，至延迟疾病、病症或病患的进展；至治愈或消除疾病、病症或病况和/或以防止病况，因为预防被理解为出于与疾病、病况或病症战斗的目的管理和照顾患者，以及包括施用所讨论的活性化合物以防止症状或并发症的发作。待治疗的患者优选为哺乳动物，特别是人，但其它动物的治疗也在本发明范围内，其它动物如犬、猫、牛、马、绵羊、山羊或猪。
例如，对于患有由于严重的低血糖症(低血糖)而产生的胰岛素昏迷或胰岛素反应的患者，本发明的胰高血糖素肽的治疗有效量对于成人为lmg(l单位)。对于体重低于441b(20kg)的儿童，其为0.5mg。在以下情况下给予胰高血糖素，如果(1)患者为无意识的，(2)患者不能吃糖或加糖产品，(3)患者患有癫痫发作或(4)重复施用糖或加糖产品，如定期的软饮料或果汁而未改善患者的病况。在其它情况下，剂量范围可为0.25单位至2单位，该剂量可肌内或静脉内施用。1毫克纯的胰高血糖素大约等价于1单位。给药方案可变化但可从约每天一次至每个事件的需要。实际的方案应取决于许多因素，包括施用于患者的胰高血糖素的类型(胰高血糖素或糖基化的胰高血糖素)以及个体患者的反应。较高剂量范围通常不用于低血糖症应用，但可以用于其它治疗应用。实现并建立对患者而言为适当剂量的手段为本领域熟知的并通常实践的。
如本文所用，术语“药学上可接受的”被给予其通常含义。药学上可接受的组合物通常与制剂的其它材料相容并且通常不会对对象有害。
本发明的任何组合物可以以治疗有效剂量施用于对象。对于疫苗，本文使用的“治疗有效”或“有效”量或剂量意指有必要诱导对象内的免疫力或耐受性和/或使对象能够更有效地抵抗疾病(例如，对抗外源病原体、癌症、自身免疫病等)的量。当施用于对象时，有效量应取决于正治疗的特定病况和期望结果。治疗有效剂量可以由本领域普通技术人员例如，采用诸如以下进一步描述的那些因素或仅使用常规实验来确定。
在一些实施方式中，治疗有效量可最初由细胞培养试验确定。例如可用于诱导树突细胞反应的本发明的组合物的有效量可使用关于刺激指数的体外测定来评估。刺激指数可用于确定本发明的特定组合物对于特定对象的有效量，并且可向上或向下调节剂量以在对象中实现期望水平。治疗有效量也可由动物模型来确定。基于施用的组合物的相对生物利用度和效能，可调节施加剂量。基于以上所述的方法和其它方法调节剂量以实现最大功效在本领域普通技术人员的能力范围内。可仅使用常规实验来调节这些剂量。
在将本发明的组合物施用于对象时，可以选择给药量、给药方案、施用途径等以便影响这些组合物的已知活性。基于实验模型的结果，任选地与本发明的组合物的测定结果组合，可以估计剂量。可以适当地调节剂量以实现期望的局部或全身组分水平，这取决于施用模式。可以以每天施用一次或若干次给定剂量。在特定对象的反应在此类剂量下是不足的情况下，可以采用对象耐受性所允许程度的甚至较高剂量(或通过不同的、更局部的递送途径的有效较高剂量)。在一些情况下也考虑了每天多剂量以在对象内或对象的活性位点内实现组合物的适当的全身水平。
至对象的组合物的剂量可以为使得组合物的治疗有效量在对象内达到组合物的活性位点，即体内的树突细胞和/或其它抗原递呈细胞。在一些情况下可以在对象内给定最大量的剂量同时避免或最小化任何潜在的有害副作用。实际上施用的组合物的剂量取决于诸如以下的因素：在活性位点期望的最终浓度、施用于对象的方法、组合物的功效、对象内组合物的寿命、施用时间、同时治疗的效果(例如，作为在混合物中)等。递送的剂量也可以取决于与对象相关的病况并且在一些情况下可在对象间变化。例如，对象的年龄、性别、体重、尺寸、环境、身体状况或当前的健康状态也可以影响所需的剂量和/或活性位点处组合物的浓度。可以在不同个体之间或甚至不同天数的相同个体内出现给药的变化。可以优选的是使用最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。优选地，剂型为使其不会实质上有害地影响对象。在某些实施方式中，组合物可以施用于对象作为预防措施。在一些实施方式中，本发明组合物可以基于人口统计学或流行病学研究施用于对象或施用于特定领域或职业的对象。
本发明的组合物的施用可以通过任何医学上可接受的方法实现，所述医学上可接受的方法允许组合物到达其靶标，即体内的树突细胞和/或其它抗原递呈细胞。选择的特定模式当然应取决于诸如先前所述的那些因素，例如特定组合物、正治疗的对象状态的严重度、治疗功效所需的剂量等。如本文所用，治疗的“医学上可接受的”模式为这样的模式，其能够在对象内产生有效水平的组合物而不引起临床上不可接受的不良作用。
可以使用任何医学上可接受的方法以将组合物施用于对象。施用可以为局部的(即，至特定区域、生理***、组织、器官细胞类型)或全身的，这取决于待治疗的病况。例如，组合物可以经肺施用、经鼻施用、经皮施用、通过肠胃外注射或植入、经由手术施用或任何其它施用方法施用，其中本发明的组合物实现接近靶标。可与本发明使用的肠胃外形态的实例包括静脉内、皮肤内、皮下、腔内、肌内、腹膜内、硬膜上或鞘内。植入形态的实例包括任何可植入或可注射的药物递送***。
在本发明的某些实施方式中，可以设计本发明的组合物的施用以便在某个时段内，例如数小时、数天、数周、数月或数年内产生组合物的连续暴露。这可以例如通过重复施用本发明的组合物，通过以上所述的方法之一或通过持续或控制释放递送***来实现，在所述持续或控制释放递送***中，经长时间递送组合物而无需重复施用。可以例如，通过口服剂型、快速浓注、透皮贴剂或皮下移植物使用此类递送***施用组合物。在一些情况下，维持组合物的基本上恒定的浓度可以为优选的。
也可以按常规计划施用组合物，但替代地，可以以出现的症状施用组合物。本文使用的“常规计划”是指预定的指定时段。常规计划可以涵盖长度相同或不同的时段，只要计划为预定的。例如，常规计划可以涉及每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每两周、每月、每两月或于其间的任何设定数目的天数或周数、每两月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等施用组合物。替代地，预定的常规计划可涉及第一周每天施用组合物，随后每月施用组合物保持若干月，然后之后每三个月施用组合物。常规计划应覆盖任何特定的组合只要其提前确定适当的计划涉及在某一天的施用。
在一些情况下，将组合物施用于预期过敏事件的对象中以便防止过敏事件。过敏事件可以为但不必限于哮喘攻击、季节性过敏性鼻炎(例如，花粉热，花粉、豚草过敏症)或全年性过敏性鼻炎(例如，过敏原的过敏症，如本文所述的那些)。在一些情况下，在过敏事件之前基本上施用组合物。如本文所用，“基本上在前的”意指在过敏事件之前至少六个月、至少五个月、至少四个月、至少三个月、至少两个月、至少一个月、至少三个月、至少两周、至少一周、至少5天或至少2天。
类似地，组合物可以在过敏事件之前立即施用(例如，过敏事件的48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、4小时内、3小时内、2小时内、1小时内、30分钟内或10分钟内)，基本上与过敏事件同时施用(例如，在对象与过敏原接触或经历过敏症症状期间)或在过敏事件之后施用。为了使对象对特定过敏原脱敏，含有该抗原或过敏原的缀合物可以在一段时间内以非常小的剂量施用，这与传统的脱敏疗法一致。
适合用于本发明的其它递送***包括时间释放、延迟释放、持续释放或控制释放递送***。此类***可以避免在许多情况中重复施用组合物，从而为对象增加便利。许多类型的释放递送***为可用的并且被本领域普通技术人员已知的。它们包括例如，基于聚合物的***，如聚乳酸和/或聚乙醇酸、聚酐、聚已酸内酯和/或这些的组合；为基于脂质的非聚合物***，包括甾醇，如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪，如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放***；基于脂质体的***；基于磷脂的***；硅橡胶***；基于肽的***；蜡涂层；使用常规的粘合剂和赋形剂的压制片剂；或部分融合的移植物。制剂可以呈例如，微球体、水凝胶、聚合物储层、胆固醇基质或聚合***。在一些实施方式中，***可以例如，通过控制含有组合物的制剂的扩散或磨蚀/降解速率来允许发生持续或控制释放组合物。另外，基于泵的硬件递送***可以用于递送本发明的一个或多个实施方式。
长期释放装置的使用在本发明的一些实施方式中可为特别合适的。本文使用的“长期释放”意指构建并准备含有组合物的装置以在至少30或45天，优选至少60或90天，或在一些情况下甚至更长递送治疗有效水平的组合物。长期释放移植物对本领域普通技术人员为熟知的，并且包括以上所述的一些释放***。
糖基化工程
使用本文提供的新型表达***和方法，本发明的不同方面通过原核生物宿主细胞的糖工程学提供高甘露糖、混合和复合聚糖的产生。本发明的一个方面涉及重组原核生物宿主，其包括生物合成途径以表达具有结构上同源的类似于人聚糖的N-连接的糖蛋白。本发明的应用包括治疗性蛋白质的改善的生物化学和药代动力学稳定性。另外的实施方式提供用于产生能够诱发对象的保护性免疫的碳水化合物缀合的疫苗的方法和组合物。本发明的目标为产生安全且更有效的糖蛋白和疫苗的迅速的、基于微生物的制造方法。
原核生物中的高甘露糖型聚糖产生
由三甘露糖基核心构建，本发明提供了重组表达甘露糖转移酶以产生图1中显示的高甘露糖型聚糖的方法。在一个实施方式中，本发明提供培养重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种α-1,2-甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.131)，其催化原核生物宿主细胞中两个GDP-甘露糖残基转移至三甘露糖寡糖组合物。实施例3描述α-1,2-甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.131)的表达。优选的α-1,2-甘露糖转移酶酶活性由融合至GST(溶解度增强子)的酿酒酵母algll编码。表I列出了多种溶解度增强子。
因此，本发明提供了产生高甘露糖型寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种α-1,2-甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.131)，其催化GDP-甘露糖残基转移至末端甘露糖残基，所述培养步骤在有效产生具有至少4个末端甘露糖残基的寡糖组合物的条件下进行。在某些实施方式中，寡糖组合物在三甘露糖核心上包含至少2个另外的甘露糖残基。在优选实施方式中，疫苗候选物在原核生物宿主细胞中重组表达，在那它们为N-连接到M5糖型。图1中显示的主要糖型的预期结构为Manαl-2Manαl-2Manαl-3(Manα1-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
在本发明的原核生物宿主细胞中，在糖蛋白的糖基化之前，糖基化酶作用于脂质连接的聚糖。在真核生物中，α-1,2-甘露糖转移酶作用于连接到内质网膜的细胞溶质侧的多萜醇焦磷酸酯的三甘露糖核心聚糖。然后，Man5GlcNAc2-多萜醇焦磷酸酯通过内源翻转酶翻转入内质网，所述翻转酶对Man5GlcNAc2-多萜醇焦磷酸酯为高度特异的以确保翻转之前寡糖完成装配(Sanyal&Menon，PNAS2009)。在原核生物中，已经显示Man3GlcNAc2脂质可被翻转(Valderrama-Rincon等，"AnengineeredeukaryoticproteinglycosylationpathwayinEscherichiacoli,"Nat.Chem.Biol.AOP(2012))并且对于三甘露糖核心以外的寡糖的翻转、危害装配不存在已知的特异性。因此，本发明的目标为在原核生物***中产生包括Man7-9GlcNAc2、Man6GlcNAc、Man5GlcNAc2和Man4GlcNAc2的高甘露糖型寡糖组合物，其将甘露糖残基转移至M3寡糖底物以及此外催化寡糖至周质的翻转活性。在优选实施方式中，宿主细胞产生50摩尔％或更多的高甘露糖型聚糖。
原核生物中的GnT表达
在某些方面，提供产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性(EC2.4.1.101；EC2.4.1.143；EC2.4.1.145)，其催化UDP-GlcNAc残基转移至所述末端甘露糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端GlcNAc残基的寡糖组合物的条件下进行。在真核生物中，N-乙酰葡萄糖胺基转移酶作用于共价连接到糖基化蛋白质的天冬酰胺残基的寡糖。在原核生物中，寡糖独立于危害混合和复合寡糖产生的蛋白质糖基化过程而产生。
为产生混合糖型，UDP-GlcNAc残基被转移至三甘露糖基核心寡糖结构(受体底物)的Manαl,3臂。在示例性实施方案中，本发明提供了在表达Algl3、Algl4、Algl和Alg2的宿主细胞中用编码融合至MBP(溶解度增强子)的烟草GnTI的基因转化原核生物宿主细胞。产生如图2A中显示的混合糖型GlcNAcMan3GlcNAc2。显示的糖型的预期结构为β1-2-GlcNAcManαl-3(Manαl-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
为产生复合糖型，UDP-GlcNAc残基被转移至三甘露糖基核心寡糖结构(受体底物)的Manαl,3和Manαl,6臂。在该实施方式中，在表达Algl3、Algl4、Algl、Alg2和GnTI的宿主细胞中，用编码融合至MBP的人GnTII的基因转化原核生物宿主细胞。产生如图3中显示的复合GlcNAc2Man3GlcNAc2(GO)糖型并且预期结构为β1-2-GlcNAcManα1-3(β1-2-GlcNAcManα1-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
在本发明的其它方面，产生多触角聚糖。例如，在表达Algl3、Algl4、Algl、Alg2和GnTI的宿主细胞中编码融合至MBP的牛科动物GnTIV的基因转化原核生物宿主细胞。图4A显示使用本发明的方法产生的GlcNAc2Man3GlcNAc2混合糖型，其中两个UDP-GlcNAc残基被转移至三甘露糖基核心的Manαl,3臂。显示的糖型的预期结构为β1-2-GlcNAc(β1-2-GlcNAc)Manα1-3(Manαl-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
在替代实施方式中，也可例如，通过实施例7中所述的寡糖的酶促合成来离体形成聚糖。例如，图5描述了包含GlcNAc3Man3GlcNAc2糖型的复合的、多触角聚糖的MS，所述糖型通过表达GnTI、GnTII、GnTIV(离体)、Algl3、Algl4、Algl和Alg2产生，导致两个UDP-GlcNAc残基转移至Manαl,3臂以及一个UDP-GlcNAc残基转移至三甘露糖基核心寡糖结构的Manαl,6臂。显示的糖型预期结构为(β1-2-GlcNAcManαl-3)β1-2-GlcNAc(β1-2-GlcNAcManα1-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
可在原核生物***中表达另外的GnT活性，如GnTV(EC2.4.1.155)和GnTVI(2.4.1.201)。因此，使用本发明的方法，在三甘露糖核心上存在高达5个分枝的多触角聚糖是可能的。多分枝聚糖使得例如红细胞生成素的唾液酸化作用增强、血清半衰期和效能增加(Elliot，NatureBiotech2003；Misaizu，Blood1995)。
糖基转移酶溶解度增强子
虽然不同的GnT可在宿主细胞中表达，但在优选实施方式中，GnT融合至，例如，MBP并表达为融合蛋白以将末端UDP-GlcNAc残基转移至三甘露糖基核心，实际上增强糖基转移酶的溶解度。表1提供了这样的列表，其提供了一类膜靶向结构域和溶解度增强子。
表1.溶解度增强子
使用融合文库，在本发明的原核生物***中产生诸如GlcNAc(1-5)Man3GlcNAc2的聚糖。在本发明的某些方面，MBP-融合的糖基转移酶在原核生物宿主中表达。也可表达其它膜靶向结构域和溶解度增强子，如MstX。筛选将UDP-GlcNAc残基加入至受体寡糖底物的此类N-乙酰葡糖胺转移酶-MBP或N-乙酰葡糖胺转移酶-MstX融合物。在优选实施方式中，以下融合物：烟草GnTI-MBP、智人GnTII-MBP、欧洲牛GnTIV-MBP使UDP-GlcNAc转移至三甘露糖基核心。因此，可制备GnT融合物的文库以在原核生物宿主细胞中产生混合的、复合的和多触角聚糖。使用本发明的方法可制备不同的GnT融合构建体。此类融合构建体在本发明的范围内并且可筛选较好活性或增强的溶解度。
原核生物中的半乳糖转移酶表达
在本发明的其它方面，提供了产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养宿主细胞以表达一种或多种半乳糖转移酶酶活性(EC2.4.1.38,EC2.7.8.18)，其催化UDP-半乳糖残基转移至所述末端GlcNAc残基，所述培养步骤在有效产生具有末端半乳糖残基的寡糖组合物的条件下进行。图6描述了在大肠杆菌中产生的混合糖型GalGlcNAcMan3GlcNAc2的MS。实施例5描述了大肠杆菌中幽门螺杆菌β-l,4GalT的表达，其将UDP-半乳糖残基转移至GlcNAcMan3GlcNAc2受体寡糖。
为了在原核生物中产生混合的半乳糖化糖型，将UDP-半乳糖残基转移至复合糖型的三甘露糖基核心的β-l,2GlcNAcManαl,3以及三甘露糖基核心的β-l,2GlcNAcManαl,3和β-l,2GlcNAcManαl,6臂。在此类实施方式中，在表达Algl3、Algl4、Algl、Alg2、GnTI和GnTII的宿主细胞中用编码幽门螺杆菌GalT的基因转化原核生物宿主细胞。实施例8提供了产生复合Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的方法。图7显示了m/z1662.2处的峰，其与复合半乳糖化聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量相关。可产生另外的半乳糖化糖型，其包括：Gal(1-4)GlcNAc2Man3GlcNAc2。混合末端半乳糖聚糖的预期结构为β1-4Galβ1-2-GlcNAcManαl-3(Manαl-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc，以及复合末端半乳糖聚糖为β1-4Galβ1-2-GlcNAcManα1-3(β1-4Galβ1-2-GlcNAcManα1-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
可表达来自不同其它生物体的半乳糖转移酶，所述生物体包括但不限于幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseriameningitides)、淋病奈瑟球菌(Neisseriagonorrhoeae)、杜氏利什曼原虫(Leishmaniadonovani)、智人(Homosapiens(GALT))、欧洲牛(BosTaurus)、黑腹果蝇(Drosophiamelanogaster)褐家鼠(Rattusnorvegicus)(GalTI))、小家鼠(Musmusculus)、灰仓鼠(Cricetulusgriseus)、家马(Equuscaballus)、尤金袋鼠(Macropuseugenii)(4β-GalT)、斑马鱼(Daniorerio)(GalTI)和野猪(Susscrofa)、绵羊(Ovisaries)。
在一些实施方式中，将不同的半乳糖转移酶酶活性融合至诸如MBP或mstX的溶解度增强子，并筛选加入UDP-半乳糖的受体寡糖底物。不像GnT，人和牛科动物GalT-mstX融合物似乎未将UDP-半乳糖转移至末端GlcNAc寡糖底物。
在更优选的实施方式中，氧化的细菌菌株被用于幽门螺杆菌β-l,4-GalT的表达。
在示例性实施方式中，在原核生物宿主中表达以下酶：Algl3、Algl4、Algl、Alg2、烟草(Nicotianatabaccum)GnTI、人GnTII、牛科动物GnTIV、幽门螺杆菌β-l,4GalT。在氧化的细菌宿主中表达GnT和GalT。
原核生物中的唾液酸转移酶表达
完全复合的寡糖结构以末端唾液酸(例如NANA残基)结尾。原核生物中唾液酸转移酶的表达已经成为重要的目标。迄今为止，虽然若干组已经承担用于糖蛋白产生的唾液酸转移的任务许多年，但不存在产生唾液酸转移以在原核生物中产生类人聚糖的报告。
因此，本发明提供了产生寡糖组合物的方法，其通过培养重组原核生物宿主以表达一种或多种唾液酸转移酶酶活性(EC2.4.99.4和EC2.4.99.1)，所述唾液酸转移酶酶活性催化CMP-NANA残基转移至所述末端半乳糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端唾液酸残基的寡糖组合物的条件下进行。使用本发明的方法体内或离体表达各种唾液酸转移酶。在一个实施方式中，在宿主细胞或在培养基中表达α-2,3唾液酸转移酶(EC2.4.99.4)。在进一步实施方式中，在宿主细胞或在培养基中表达α-2,6唾液酸转移酶(EC2.4.99.1)。
在优选实施方式中，在原核生物宿主中表达以下酶：Algl3、Algl4、Algl、Alg2、烟草GnTI、牛科动物GnTIV、幽门螺杆菌β-l,4-GalT和美人鱼发光杆菌(P.damselae)ST6。方法允许体内和离体反应的组合，所述反应显示CMP-NANA适当转移至恰当的寡糖底物。如图8中显示，产生混合的唾液酸化糖型，其中显示的糖型的预期结构为2,6NANAβ1-4Galβ1-2-GlcNAcManαl-3(Manαl-6)-Manβ1-4-GlcNAcβ1-4-GlcNAc。
糖核苷酸前体
在其它实施方式中，提供培养增加糖核苷酸前体的宿主细胞的方法。例如，在***中表达催化GDP-甘露糖合成的酶。将磷酸甘露糖变位酶酶活性(ManB)(EC5.4.2.8)和甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶酶活性(ManC)(EC2.7.7.13)引入本发明的宿主细胞。图9A(左)显示当ManC/B过表达时，三甘露糖基核心的产生增加。
在另外实施方式中，在细胞质中生成足够的糖基供体库。UDP-GlcNAc(GnTI和GnTII的底物)天然存在于大肠杆菌细胞质中，但可工程化宿主细胞用于增加UDP-GlcNAc合成。在此类实施方式中，通过表达催化UDP-GlcNAc合成的谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶酶活性GlmS(EC2.6.1.16)、GlmU(EC2.7.7.23&EC2.3.1.157)、GlmM(EC5.4.2.10)提供培养增加UDP-GlcNAc的宿主细胞的方法。图9A(右)显示当GlmS过表达时，GlcNAcMan3GlcNAc2增加。加入具有ManC/B的甘油导致聚糖产量增加，如图9B中显示。丙酮酸酯似乎也增加聚糖产量，如图9C中显示。
ManC/B的过表达对产生的聚糖的同质性具有显著影响，如图10所证明的。M3糖型(D)、M5糖型(E)和GNM3GN2(F)产生这样的聚糖，其为主要的并且似乎已经去除了可能由于反应的不完全核苷酸糖转移而产生的峰。因此，宿主细胞能够产生和控制所产生的精确糖型。
在酵母中，Bobrowicz等显示在毕赤酵母中完全表达UDP-半乳糖转运蛋白、UDP-半乳糖4-差向异构酶和β1,4GalT增加末端半乳糖化聚糖Pichia的产生(Bobrowicz等，EngineeringofanartificialglycosylationpathwayblockedincoreoligosaccharideassemblyintheyeastPichiapastoris:productionofcomplexhumanizedglycoproteinswithterminalgalactose.Glycobiology2004Sep；14(9):757-66.)。UDP-半乳糖还天然存在于大肠杆菌的细胞质中，然而，研究已经显示UDP-半乳糖的利用度可通过UDP-Gal合成基因的过表达而增加，其包括尿苷酸激酶(pyrH)、Glc-l-P尿苷酰转移酶(galU)、Gal-l-P尿苷酰转移酶(galT)、半乳糖激酶(galK)和UDP-半乳糖差向异构酶(galE)(Chung,S等，GalactosylationandsialylationofterminalglycanresiduesofhumanimmunoglobulinGusingbacterialglycosyltransferaseswithinsituregenerationofsugar-nucleotides.EnzymeandMicrobialTechnology,2005.39(1):p.60-66.)。因此，在优选实施方式中，使用基于酵母的重组，将选自大肠杆菌K12的galETK、galU和pyrH的一种或多种基因进行克隆，随后在宿主菌株中表达以确保半乳糖转移至受体寡糖组合物的糖基供体底物的足够的UDP-Gal混合物。
已经在酵母和昆虫细胞中显示出CMP-NANA水平的调节。Hamilton等显示使用CMP-唾液酸转运蛋白、UDP-GlcNAc2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖激酶、CMP-唾液酸合酶、N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶和唾液酸转移酶在毕赤酵母中增加细胞CMP-NANA混合物用于成功的唾液酸转移(Hamilton,S.R等，Productionofcomplexhumanglycoproteinsinyeast.Science,301,1244(2003))。Lawrence等显示胞苷一磷酸唾液酸合酶(CMP-SA)和唾液酸磷酸合酶(SAS)基因与N-乙酰甘露糖胺的共表达为昆虫细胞补给增加的CMP-SA底物产生(Lawrence等，CloningandexpressionofhumansialicacidpathwaygenestogenerateCMP-sialicacidsininsectcells.GlycoconjJ.2001Mar；18(3):205-13)。仅选定的很少的宿主细胞如大肠杆菌Kl具有内源的CMP-NANA机制，然而，许多原核生物没有产生CMP-NANA的机制，至少预期增加CMP-NANA水平对于原核生物中适当的唾液酸化作用是必需的。
真核生物蛋白质，尤其是膜蛋白在大肠杆菌和其它细菌中的成功表达是非平凡任务(Baneyx等，"RecombinantProteinFoldingandMisfoldinginEscherichiacoli,"NatBiotechnol22:1399-1408((2004))。因此，必需考虑许多问题以便实现正确折叠的和正确定位的蛋白质的(例如，***内膜)的高表达产量。所有这些因素共同地表明当在大肠杆菌细胞中表达时真核生物蛋白质是否为功能性的。
另外的糖工程学
缺乏某些酶活性的宿主细胞为优选的，此类宿主细胞不表达某些酶或某些酶为减弱的，该酶与糖生物合成竞争(例如，甘露糖转移酶)。在优选实施方式中，方法提供培养GDP-D-甘露糖脱水酶酶活性(EC4.2.1.47)减弱的宿主细胞，如在Valderrama-Rincon等中显示。构建没有编码GDP-甘露糖脱水酶(GMD)的gmd基因的大肠杆菌菌株，这实际上应增加Algl和Alg2底物的利用度，GDP-甘露糖被GMD转化成GDP-4-酮-6-脱氧甘露糖作为GDP-L-岩藻糖的合成中的第一步骤(Ruffing,A.&Chen,R.R.Metabolicengineeringofmicrobesforoligosaccharideandpolysaccharidesynthesis.MicrobCellFact5,25(2006)。宿主细胞的另外的工程化可能需要敲除某些竞争途径。
密码子最优化
在本发明的另外实施方式中，真核生物糖基转移酶为密码子优化的以克服大肠杆菌(和其它细菌)与高等生物体(如酵母和哺乳动物细胞)之间与密码子使用偏好性相关的局限性。密码子使用偏好性是指编码蛋白质的DNA序列(基因)的密码子在生物体之间出现的频率的差异。密码子为一系列的三个核苷酸(三联体)，其编码多肽链中的特定氨基酸残基。密码子最优化可通过以下来实现：做出特定的核苷酸颠换变化，即嘌呤至嘧啶或嘧啶至嘌呤的核苷酸变化，或核苷酸转换变化，即嘌呤至嘌呤或嘧啶至嘧啶的核苷酸变化。在一些情况下，密码子优化的多肽变体保留与未进行密码子优化的多肽相同的生物学功能。对于大肠杆菌中的表达，一种或多种密码子可如，例如Grosjean等,Gene18:199-209(1982)中所述进行优化。如本文所用，“*”表明终止密码子。
本文所述的alg、N-乙酰葡糖胺转移酶、半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶、ManB/C、glmS、寡糖基转移酶的核酸分子、多肽分子和同系物、变体和衍生物也包括多核苷酸和多肽变体，其可为天然存在的或使用已知的基因工程技术体外产生，包括化学合成。在一些实施方式中，多核苷酸序列与SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27或29具有至少75％、77％、80％、85％、90％或95％的同一性。在其它实施方式中，多肽变体与SEQIDNO:2、4、6、8,10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、31、32或33具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、77％、80％、85％、90％或95％的同源性。
本发明还涵盖在严格条件下与上述核酸分子杂交的核酸分子。如上定义，以及如本领域熟知的，严格杂交为在特定条件设置下低于特定DNA杂交的热解链温度(Tm)约25℃下进行，其中Tm为50％的靶序列与完全配对的探针杂交的温度。严格洗涤可在特定条件设置下低于特定DNA杂交的Tm约5℃的温度下进行。
本发明的多核苷酸或核酸分子是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸。这些包括分子(例如，线性、环状、cDNA、染色体的、基因组的或合成的、双链的、单链的、三链的、四链体、部分双链的、支链的、发卡状、环形或呈挂锁构型)和RNA分子(例如，tRNA、rRNA、mRNA、基因组的或合成的)和所述的DNA或RNA分子的类似物以及含有非天然的核苷酸类似物、非天然的核苷间键或两者的DNA或RNA的类似物。本发明的分离的核酸分子包括在核酸源自的生物体的染色体DNA中不含天然侧翼序列(即，位于核酸分子的5'和3'端的序列)的核酸分子。在不同实施方式中，分离的核酸分子可含有小于约10kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、0.1kb、50bp、25bp或10bp的核酸分子源自的微生物的天然侧翼核苷酸染色体DNA序列。
将异源的核酸分子以相对于启动子和任何其它5'调节性分子的适当有义(5'→3')方向***表达***或载体，并校正阅读框。核酸构建体的制备可使用本领域熟知的标准克隆方法进行，如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsLaboratoryPress,ColdSpringsHarbor,NewYork(1989)所述。Cohen和Boyer的美国专利第4,237,224号也描述了使用限制性酶切割以及用DNA连接酶连接产生重组质粒形式的表达***。
合适的表达载体包括含有来源于与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的那些载体。例如，如果将大肠杆菌用作宿主细胞，可以使用诸如pUC19、pUC18或pBR322的质粒。其它合适的表达载体描述于MolecularCloning:aLaboratoryManual:3rdedition,SambrookandRussell,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress。例如在制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白质分析中操作核酸的许多已知的技术和方案详细描述于CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编辑，(1992)。
不同的基因信号和加工事件控制许多水平的基因表达(例如，DNA转录和信使RNA(“mRNA”)翻译)以及随后在核糖体表面展示的融合蛋白的量。DNA的转录取决于启动子的存在，所述启动子为指引RNA聚合酶的结合，从而促进mRNA合成的DNA序列。启动子在其“强度”(即，促进转录的能力)中存在变化。出于表达克隆化基因的目的，需要使用强启动子以获得高水平的转录，以及因此获得高水平的表达和表面展示。因此，取决于利用的宿主***，也可以将许多合适的启动子中的任一个掺入携带有偶联至终止序列的编码目标蛋白的脱氧核糖核酸分子的表达载体。例如，当使用大肠杆菌、其噬菌体或质粒时，启动子如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体λ以及其它的PR和PL启动子，包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp等可以用于指引邻近DNA片段的高水平转录。另外，重组DNA或其它合成DNA技术产生的杂合trp-lacUV5(tac)启动子或其它大肠杆菌启动子可以用于提供***基因的转录。
原核生物中mRNA的翻译取决于适当的原核生物信号的存在，所述信号不同于真核生物的那些。原核生物中mRNA的有效翻译需要mRNA上被称为Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖体结合位点。该序列为位于起始密码子之前的mRNA的短核苷酸序列，所述起始密码子通常为AUG，其编码蛋白质的氨基末端的甲硫氨酸。SD序列与16SrRNA(核糖体RNA)的3'-端互补，并可能通过与rRNA成对来促进mRNA与核糖体结合以使得核糖体的正确定位。对于使基因表达最大化的综述，参见RobertsandLauer,MethodsinEnzymology,68:473(1979)。
宿主细胞
根据本发明，宿主细胞为原核生物。此类细胞充当表达重组蛋白用于产生目标重组治疗性蛋白的宿主。示例性的宿主细胞包括大肠杆菌和其它肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、埃希氏菌属(Escherichiasp.)、弯曲杆菌属(Campylobactersp.)、沃廉菌属(Wolinellasp.)、脱硫弧菌属(Desulfovibriosp.)、弧菌属(Vibriosp.)、假单胞菌属(Pseudomonassp.)、芽孢杆菌属(Bacillussp.)、李斯特菌属(Listeriasp.)、葡萄球菌属(Staphylococcussp.)、链球菌属(Streptococcussp.)、消化链球菌属(Peptostreptococcussp.)、巨球菌属(Megasphaerasp.)、梳状菌属(Pectinatussp.)、月形单胞菌属(Selenomonassp.)、嗜发酵菌属(Zymophilussp.)、放线菌属(Actinomycessp.)、节细菌属(Arthrobactersp.)、弗兰克菌属(Frankiasp.)、小单孢菌属(Micromonosporasp.)、诺卡尔菌属(Nocardiasp.)、丙酸菌属(Propionibacteriumsp.)、链霉菌属(Streptomycessp.)、乳杆菌属(Lactobacillussp.)、乳球菌属(Lactococcussp.)、明串珠菌属(Leuconostocsp.)、片球菌属(Pediococcussp.)、醋酸杆菌属(Acetobacteriumsp.)、真细菌属(Eubacteriumsp.)、太阳杆菌属(Heliobacteriumsp.)、螺旋阳光菌属(Heliospirillumsp.)、鼠孢菌属(Sporomusasp.)、螺原体属(Spiroplasmasp.)、脲原体属(Ureaplasmasp.)、丹毒丝菌属(Erysipelothrixsp.)、棒杆菌属(Corynebacteriumsp.)、肠球菌属(Enterococcussp.)、梭菌属(Clostridiumsp.)、支原体属(Mycoplasmasp.)、分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)、放线菌属(Actinobacteriasp.)、沙门菌属(Salmonellasp.)、志贺菌属(Shigellasp.)、莫拉菌属(Moraxellasp.)、螺杆菌属(Helicobactersp)、狭长平胞属(Stenotrophomonassp.)、微球菌属(Micrococcussp.)、奈瑟球菌属(Neisseriasp.)、蛭弧菌属(Bdellovibriosp.)、嗜血杆菌属(Hemophilussp.)、克雷伯菌属(Klebsiellasp.)、奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、沙雷菌属(Serratiasp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobactersp.)、变形杆菌属(Proteussp.)、沙雷菌属(Serratiasp.)、耶尔森菌属(Yersiniasp.)、不动杆菌属(Acinetobactersp.)、放线杆菌属(Actinobacillussp.)、博德特菌属(Bordetellasp.)、布鲁杆菌属(Brucellasp.)、噬二氧化碳细胞菌属(Capnocytophagasp.)、心杆菌属(Cardiobacteriumsp.)、艾肯菌属(Eikenellasp.)、弗朗西丝菌属(Francisellasp.)、嗜血菌属(Haemophilussp.)、金氏杆菌属(Kingellasp.)、巴斯德菌属(Pasteurellasp.)、黄杆菌属(Flavobacteriumsp.)、黄单胞菌属(Xanthomonassp.)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderiasp.)、气单胞菌属(Aeromonassp.)、邻单胞菌属(Plesiomonassp.)、军团菌属(Legionellasp.)和α-蛋白菌，如沃尔巴克体属(Wolbachiasp.)、蓝细菌、螺旋体、绿色硫细菌和绿色非硫细菌、革兰氏阴性球菌、革兰氏阴性杆菌，其为需要复杂营养的、肠杆菌科葡萄糖发酵的革兰氏阴性杆菌、革兰氏阴性杆菌-非葡萄糖发酵、革兰氏阴性杆菌-葡萄糖发酵氧化酶阳性。
在本发明的一个实施方案中，使用大肠杆菌宿主菌株C41(DE3)，因为先前已经对该菌株的一般膜蛋白过表达进行了优化(Miroux等，"Over-productionofProteinsinEscherichiacoli:MutantHostsThatAllowSynthesisofSomeMembraneProteinsandGlobularProteinsatHighLevels,"JMolBiol260:289-298(1996)。宿主菌株的进一步优化包括缺失编码DnaJ蛋白质的基因(例如，ΔdnaJ细胞)。该缺失的原因为：已知dnaJ的失活增加过表达的膜蛋白的积聚以及抑制通常与膜蛋白过表达相关的严重的细胞毒性(Skretas等，"GeneticAnalysisofGProtein-coupledReceptorExpressioninEscherichiacoli:InhibitoryRoleofDnaJontheMembraneIntegrationoftheHumanCentralCannabinoidReceptor,"BiotechnolBioeng(2008))。申请人已经观察到以下Algl和Alg2的表达。此外，竞争性糖生物合成反应的缺失对于确保最优水平的N-聚糖生物合成是必需的。例如，缺失大肠杆菌O16抗原生物合成途径中的基因(Feldman等，"TheActivityofaPutativePolyisoprenol-linkedSugarTranslocase(Wzx)InvolvedinEscherichiacoliOAntigenAssemblyisIndependentoftheChemicalStructureoftheORepeat,"JBiolChem274:35129-35138(1999))应确保细菌萜醇-GlcNAc-PP底物对于期望的哺乳动物哺乳动物N-聚糖反应是可获得的。为消除不想要的副反应，以下为从大肠杆菌宿主菌株中缺失的代表性基因：wbbL、glcT、glf、gafT、wzx、wzy、waaL。然而，其它菌株包括MC4100、BL21、ORIGAMITM、
用表达载体转化/转染宿主细胞的方法为本领域熟知的并且取决于所选择的宿主***，如Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringsLaboratoryPress,ColdSpringsHarbor,NewYork(1989)中所述。对于真核生物细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-Dextran)、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其它病毒，例如牛痘或杆状病毒(针对昆虫细胞)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化法、电穿孔和使用噬菌体的转染。
本发明的原核生物宿主细胞的主要优势包括：(i)细菌的基因操作周围具有的海量数据；(ii)对于自2003年以来由FDA批准的蛋白质疗法中～30％的蛋白质产生所使用细菌确定的记录是在大肠杆菌细菌中产生的；以及(iii)细菌产生蛋白质药物的许多公司内具有现存的基础设施。
与不同的真核生物蛋白质表达***相比，使用本发明的方法和组合物的过程提供可扩展的、成本效益好的、优化的重组糖蛋白表达，不含人病原体，不含免疫原性的N-和O-连接的糖基化反应，能够迅速克隆和快速的生长率，快速的倍增时间(～20分钟)，高生长(高OD)，高滴度和蛋白质产量(在50％的可溶性蛋白总量(TSP)范围内)，容易从周质或上清液中进行产物纯化，基因上易处理的、充分研究的、与广泛收集相容的表达最优方法(例如，启动子工程、mRNA稳定方法、分子伴侣共表达、蛋白酶耗尽等)。
不像酵母和所有其它真核生物，原核生物(例如大肠杆菌)作为糖蛋白表达的宿主的另一主要优势为不存在天然的糖基化***。因此，预期加入(或随后去除)糖基化相关的基因对于糖工程化的大肠杆菌细胞的活力具有很少的至没有承受力。此外，在这些细胞中基本上消除通过内源的糖基化反应使非人聚糖附着于靶蛋白的潜能。
因此，在不同实施方式中，公开了不同寡糖组合物(例如，高甘露糖、混合、复合)的糖蛋白表达和产生的替代方案，其中原核生物宿主细胞被用于产生相同且产生N-连接的糖蛋白，其为避免与真核生物细胞培养相关的显著障碍提供有吸引力的解决方案。将细菌用作产生结构上均匀的类似于人的N-聚糖同时大幅降低与蛋白质药物开发和制备相关的成本和时间的生产媒介物为本发明的目标。
原核生物中寡糖至靶蛋白的位点特异性转移
如在Valderrama-Rincon等中所述，为开始“人源化”细菌糖基化机制，在大肠杆菌中经由包括脂质连接的生物合成的重组途径生成Man3GlcNAc2寡糖结构。具体地说，几种真核生物糖基转移酶中的一种在大肠杆菌中功能表达并将所得脂质连接的寡糖经由寡糖基转移酶转移至蛋白质。
原核生物宿主细胞中的聚糖装配为脂质连接到十一异戊二烯基磷酸(Und-P)，不像真核生物，它们在多萜醇磷酸(Dol-P)上进行装配。在空肠弯曲杆菌中，N-连接的糖基化通过将核苷酸激活糖依序加入至脂质载体来进行，从而导致分枝的七庚糖的形成。然后，通过PglK(以前为WlaB)和OTasePglB将该聚糖翻转跨越内膜，接着催化聚糖转移至天冬酰胺侧链。Bac为2,4-二乙酰胺基-2,4,6-三脱氧葡萄糖；GalNAc为N-乙酰半乳糖胺；HexNAc为N-乙酰己糖胺；Glc为葡萄糖。参见Szymanski等,"ProteinGlycosylationinBacterialMucosalPathogens,"NatRevMicrobiol3:225-37(2005)。PglK翻转酶负责将脂质连接的空肠弯曲杆菌七庚糖易位跨越内膜。偶然地，PglK对脂质连接的寡糖中间体的聚糖结构表现出松弛的特异性(Alaimo等,"TwoDistinctButInterchangeableMechanismsforFlippingofLipid-linkedOligosaccharides,"EmboJ25:967-76(2006)以及Wacker等,"SubstrateSpecificityofBacterialOligosaccharyltransferaseSuggestsaCommonTransferMechanismfortheBacterialandEukaryoticSystems,"ProcNatlAcadSciUSA103:7088-93(2006)。
在优选实施方式中，本发明的宿主细胞表达翻转酶酶活性(GenbankANAP009048.1)，其将十一葵烯醇-连接的寡糖易位跨越内膜。此类酶活性可以为内源的或异源的或在表达中被工程化修饰的。在另外的实施方式中，原核生物宿主细胞包含翻转酶活性，其包括pglK和rftl。
在原核生物中产生类似于人的寡糖结构需要将不同的寡糖转移至多肽链的N-X-S/T位点。这需要负责将寡糖转移至靶蛋白的被称为寡糖基转移酶(OST)的整合膜蛋白或蛋白复合物的功能性表达。不同的原核生物和真核生物OST能够将脂质连接的寡糖转移至靶蛋白。本发明公开了显示将高甘露糖、混合和复合聚糖转移至蛋白质的原核生物***。因此，原核生物蛋白质表达***包含至少一种OST活性以产生糖基化的靶蛋白。在此类实施方式中，宿主细胞表达除了糖基转移酶之外的寡糖基转移酶酶活性(EC2.4.1.119)。可表达不同的OST(表2)并且该OST可以为内源的或异源的或在表达中被工程化修饰的。在进一步实施方式中，原核生物宿主细胞包含至少一种寡糖基转移酶活性，如来自空肠弯曲杆菌(Aebi等)或红嘴鸥弯曲杆菌(Valderrama-Rincon等)的PglB。转移至蛋白质的寡糖与蛋白质为N-连接的。
表2.寡糖基转移酶列表。
寡糖组合物
最近，已经引入几种真核生物表达宿主作为制备N-糖蛋白的哺乳动物细胞培养的替代方案。这些包括基因工程酵母毕赤酵母(Hamilton,S.R.等，Humanizationofyeasttoproducecomplexterminallysialylatedglycoproteins.Science,2006.313(5792):p.1441-3)、作为重组杆状病毒的宿主的培养的昆虫细胞(Aumiller,J.J.,J.R.Hollister和D.L.Jarvis,AtransgenicinsectcelllineengineeredtoproduceCMP-sialicacidandsialylatedglycoproteins.Glycobiology,2003.13(6):p.497-507)以及植物细胞(Aviezer,D.等,Aplant-derivedrecombinanthumanglucocerebrosidaseenzyme—apreclinicalandphaseIinvestigation.PLoSOne,2009.4(3):p.e4792)。不幸地是，当使用任何真核生物宿主细胞(包括哺乳动物、植物、昆虫和酵母细胞)时，非人糖型来源于天然的糖基化途径。已经显示哺乳动物宿主细胞将不受控水平的甘露糖-6-磷酸和岩藻糖添加至聚糖并经常缺乏末端唾液酸(VanPatten,S.M.等,EffectofmannosechainlengthontargetingofglucocerebrosidaseforenzymereplacementtherapyofGaucherdisease.Glycobiology,2007.17(5):p.467-78.)。植物细胞添加免疫原性的β-1,2木糖和核心α-1,3岩藻糖(Bardor,M.等,Immunoreactivityinmammalsoftwotypicalplantglyco-epitopes,corealpha(l,3)-fucoseandcorexylose.Glycobiology,2003.13(6):p.427-34)，后者也发现于昆虫细胞中(Bencurova,M.等,SpecificityofIgGandIgEantibodiesagainstplantandinsectglycoproteinglycansdeterminedwithartificialglycoformsofhumantransferrin.Glycobiology,2004.14(5):p.457-66)。O-连接的糖基化在酵母中也为重要的过程(Gentzsch,M.和W.Tanner,ThePMTgenefamily:proteinO-glycosylationinSaccharomycescerevisiaeisvital.EmboJ,1996.15(21):p.5752-9)并且不期望的O-聚糖可共价连接到靶标糖蛋白。
通过原核生物糖基化机制连接的寡糖链在结构上不同于通过高等真核生物和人糖基化途径连接的寡糖链(Weerapana等，"Asparagine-linkedProteinGlycosylation:FromEukaryotictoProkaryoticSystems,"Glycobiology16:91R-101R(2006)。在原核生物中并且由本发明的方法产生的寡糖组合物也不同于真核生物***，如酵母、昆虫、哺乳动物以及甚至人细胞。
与真核生物宿主细胞表达***(例如，CHO、NSO、lemna、Sf9)相比，几种特征区别由本发明的方法产生的寡糖组合物。例如，本发明的寡糖组合物没有岩藻糖。抗体中岩藻糖的不存在已与ADCC和CDC活性增加相关(ShinkawaT等,TheabsenceoffucosebutnotthepresenceofgalactoseorbisectingN-acetylglucosamineofhumanIgGlcomplex-typeoligosaccharidesshowsthecriticalroleofenhancingantibody-dependentcellularcytotoxicity.JBioChem,278,3466-73,2003)。此外，原核生物固有地没有O-连接的聚糖，其与免疫原性相关。本发明的寡糖组合物不表达在许多真核生物表达***中存在的令人憎恶的聚糖，如高甘露糖或甘露糖磷酸。另外，糖工程化的大肠杆菌提供(i)控制糖基化(包括在N-或C-末端)的特异性位点和化学计量，(ii)糖型的选择(iii)能够工程化新型糖型，因为糖基化在大肠杆菌中不是重要的过程，以及(iv)没有竞争性糖基化途径，包括O-糖基化和甘露糖6-磷酸，这改善人宿主内产物均一性并可以帮助避免错位(mislocalization)至其它受体，如甘露糖6-磷酸受体(Hayette,M.P.等PresenceofhumanantibodiesreactingwithCandidaalbicansO-linkedoligomannosidesrevealedbyusinganenzyme-linkedimmunosorbentassayandneoglycolipids.JClinMicrobiol30,411-417(1992).Podzorski,R.P.,Gray,G.R.&Nelson,R.D.DifferenteffectsofnativeCandidaalbicansmannanandmannan-derivedoligosaccharidesonantigen-stimulatedlymphoproliferationinvitro.JImmunol144,707-716(1990))。
本发明的寡糖组合物可为均一的并且也为富集的以便促进抗炎性质，例如，在静脉内Ig(IVIG)的Fc上富含α2,6唾液酸(Anthony等,Identificationofareceptorrequiredfortheanti-inflammatoryactivityofIVIG.NatlAcadSciUSA2008Dec16；105(50):19571-8)。另外的研究已经表明在所有人中存在Neu5Gc-特异性抗体，有时是高水平的(Ghaderi等,ImplicationsofthepresenceofN-glycolylneuraminicacidinrecombinanttherapeuticglycoproteins.NatBiotechnol,2010Aug；28(8):863-7)。因此，富含治疗性蛋白质，例如具有特异性唾液酸残基的抗体(例如，与Neu5Ac、Neu5Gc相对的NeuNAc)可以降低不良反应，如免疫原性或减少蛋白质疗法的无效性。
如本文所体现的，原核生物***可以以相对高的产量产生匀质的聚糖。在优选实施方式中，寡糖组合物基本上由至少50mole％、60mole％、70mole％、80mole％、90mole％、95mole％、99mole％的单一糖型组成。在进一步实施方式中，寡糖组合物基本上由至少50mole％、60mole％、70mole％、80mole％、90mole％、95mole％、99mole％的两种期望糖型组成。在进一步实施方式中，寡糖组合物基本上由至少50mole％、60mole％、70mole％、80mole％、90mole％、95mole％、99mole％的三种期望糖型组成。
在某些实施方式中，产生的寡糖组合物为GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2。某些乙二醇工程化的宿主细胞产生寡糖组合物，其主要为GlcNAcMan3GlcNAc2或GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其它实施方式中，产生的寡糖组合物为Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2。某些乙二醇工程化的宿主细胞产生寡糖组合物，其主要为GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其它实施方式中，产生的寡糖组合物为NANA1-5Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2。某些乙二醇工程化的宿主细胞产生寡糖组合物，其主要为NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2或NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在其它实施方式中，产生的寡糖组合物为Man2GlcNAc2、Man4GlcNAc、Man3GlcNAc2、HexMan3GlcNAc2、HexMan5GlcNAcMan6GlcNAc和Man5GlcNAc2。某些乙二醇工程化的宿主细胞产生主要为Man5GlcNAc2的寡糖组合物。
因此，本发明提供大量新型寡糖组合物和N-连接的糖蛋白的立体特异性生物合成。在某些实施方式中，使用代谢途径和蛋白质工程技术在大肠杆菌中重构真核生物N-糖基化途径产生结构上均匀的类人聚糖的N-糖蛋白。这确保了每个糖工程化细胞系对应于独特的碳水化合物特征。
可通过用3H-GlcNAc和3H-甘露糖或用荧光凝集素(例如，AlexaFluor-ConA)代谢标记细胞来分析聚糖。也可用PNGase释放聚糖并在MALDI/TOF-MS下检测该聚糖。
可用MS估计聚糖的定量或通过HPLC更精确地进行。NMR可测定聚糖结构的糖苷键。
靶标糖蛋白
为产生不同的目标糖蛋白，将编码靶蛋白的基因引入宿主细胞。
“靶蛋白”、“目标蛋白”或“治疗性蛋白质”包括但不限于细胞因子如干扰素，G-CSF，凝血因子如因子VIII、因子IX和人蛋白质C，可溶的IgE受体α-链，IgG，IgG片段，IgM，白细胞介素，尿激酶，糜酶和尿胰蛋白酶抑制剂，IGF-结合蛋白，表皮生长因子，生长激素释放因子，膜联蛋白V融合蛋白，血管抑素，血管内皮生长因子-2，骨髓祖细胞抑制因子-1，骨保护素，α-1抗胰蛋白酶，DNaseII，α-甲胎蛋白，AAT，rhTBP-1(akaTNF结合蛋白1)，TACI-Ig(跨膜激活剂和钙调节剂以及亲环素配体相互作用分子)，FSH(促卵泡激素)，GM-CSF，胰高血糖素，胰高血糖素肽，GLP-1w/和w/oFC(胰高血糖素样蛋白1)IL-I受体激动剂，sTNFr(aka可溶性TNF受体Fc融合物)，CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4-Ig)，受体，激素如人生长激素，红细胞生成素，肽，订书肽，人疫苗，动物疫苗，血清白蛋白和诸如ATIII、重组人凝血酶(rhThrombin)、葡糖脑苷酯酶和天冬酰胺酶的酶。
已经批准的来自大肠杆菌的疗法也为靶蛋白。它们包括激素(人胰岛素和胰岛素类似物、降钙素、甲状旁腺素、人生长激素、胰高血糖素、生长激素和胰岛素生长因子1)、干扰素(αl、α2a、α2b和γlb)、白细胞介素2和11、产生针对血管内皮生长因子-α的轻链和重链、肿瘤坏死因子α、霍乱毒素B亚基蛋白、B型利钠肽，粒细胞集落刺激因子和组织型纤溶酶原激活物。
靶蛋白也包括含有蛋白质和至少一种肽的糖蛋白缀合物，所述肽含有融合至蛋白的D-X1-N-X2-T基序，其中D为天冬氨酸，X1和X2为除脯氨酸之外的任何氨基酸，N为天冬酰胺并且T为苏氨酸。
在优选实施方式中，至少30mol％、50mol％、70mol％、90mol％、95mol％并且优选100mol％的聚糖通过OST转移至靶蛋白。
培养条件
在其它实施方式中，方法提供在氧化条件下培养宿主细胞。优选地，使用氧化细菌菌株。培养条件可以导致糖蛋白和聚糖的产量和滴度增加。此类工艺条件和参数包括调节pH、温度、渗透度、培养持续时间、培养基、营养物、溶解氧、氮的浓度、核苷酸糖以及甚至碳源的水平或利用度，例如，甘油(图9B)可影响产生***。根据利用的产物和特定宿主细胞，培养条件可发生变化。***的生产率也可能受培养条件的影响。另外的代谢工程对于最大生产率以及限制生长抑制代谢物可为必需的。
寡糖的酶合成
在本发明的替代方面，使用受体聚糖、纯化的酶/裂解物并添加如实施例7所述的核苷酸糖在无细胞的提取物中合成聚糖。
在某些实施方式中，本发明提供包含重组原核生物、UDP-GlcNAc和GnT(EC2.4.1.101；EC2.4.1.143；EC2.4.1.145)的细胞培养物，其中所述GnT催化UDP-GlcNAc残基转移至所述末端甘露糖残基，在有效产生具有末端GlcNAc残基的寡糖组合物的条件下进行培养。
在进一步实施方式中，本发明提供包含重组原核生物、UDP-半乳糖和GalT(EC2.4.1.38)的细胞培养物，其中所述GalT催化UDP-半乳糖残基转移至所述末端GlcNAc残基，在有效产生具有末端半乳糖残基的寡糖组合物的条件下进行培养。
在优选实施方式中，本发明提供包含重组原核生物、CMP-NANA和唾液酸转移酶(EC2.4.99.4和EC2.4.99.1)的细胞培养物，其中所述唾液酸转移酶催化CMP-NANA残基转移至所述末端半乳糖残基，在有效产生具有末端唾液酸残基的寡糖组合物的条件下进行培养。
无糖基化的相对于糖基化的IgG
本发明的另一方面涉及包含Fv部分和Fc部分的糖基化的抗体，所述Fv部分识别并结合于天然抗原，所述Fc部分在保守的天冬酰胺残基处为糖基化的。替代实施方式包括双抗体、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、Fab和scFab。
本发明的糖基化的抗体可呈单克隆或多克隆抗体的形式。
单个免疫球蛋白分子由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。轻链由一个恒定结构域(CL)和一个可变结构域(VL)组成，而重链由三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)和一个可变结构域(VH)组成。总之，VH和VL结构域构成被称为Fv的分子的抗原结合部分。Fc部分在保守的Asn297残基处为糖基化的。在该位置连接N-聚糖产生“开放”构型，其对效应物相互作用是必要的。
可使用重组DNA方法制备单克隆抗体，如Cabilly等的美国专利第4,816,567号以及Anderson等，"ProductionTechnologiesforMonoclonalAntibodiesandtheirFragments,"CurrOpinBiotechnol.15:456-62(2004)所述。诸如通过RT-PCR使用特异性扩增编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物诸如从成熟的B-细胞或杂交瘤细胞中分离编码单克隆抗体的多核苷酸，并使用常规程序测定其序列。然后，将分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆至合适的表达载体，接着将其转染至本发明的宿主细胞并生成单克隆抗体。在一个实施方式中，重组DNA技术用于修饰具有N-末端输出信号肽(例如，PelB信号肽)的重链和轻链以将重链和轻链多肽指引至细菌周质。另外，重链和轻链可由双顺反子构建体(例如，被翻译以产生两条多肽的单个mRNA)或替代地，由两个顺反子***(例如，针对重链和轻链中的每条产生两个单独的mRNA)表达。为在细菌周质中实现全长IgG的高水平表达和有效装配，可操作双顺反子和两个顺反子构建体以实现有利的表达比率。例如，可使用刚好***表达载体的双顺反子和两个顺反子构建体上游的一系列翻译起始区(TIR)来升高或降低翻译水平(Simmons等，"TranslationalLevelisaCriticalFactorfortheSecretionofHeterologousProteinsinEscherichiacoli,"NatBiotechnol14:629-34(1996))。当将产生该抗体的质粒引入也包含表达糖基化酶的质粒-或基因组-编码的基因的细菌宿主时，所得抗体在周质被糖基化。也可如所述从噬菌体展示文库中分离期望物种的重组单克隆抗体或其片段(McCafferty等，"PhageAntibodies:FilamentousPhageDisplayingAntibodyVariableDomains,"Nature348:552-554(1990)；Clackson等,"MakingAntibodyFragmentsusingPhageDisplayLibraries,"Nature352:624-628(1991)；以及Marks等，"By-PassingImmunization.HumanAntibodiesfromV-GeneLibrariesDisplayedonPhage,"J.Mol.Biol.222:581-597(1991))。
编码单克隆抗体的多核苷酸可以使用重组DNA技术以多种不同方式进一步修饰以生成替代性抗体。在一个实施方式中，例如，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可替代人抗体的那些区域以生成嵌合抗体。替代地，小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可替代非免疫球蛋白多肽以生成融合抗体。在其它实施方式中，截短或去除恒定区以生成单克隆抗体的期望的抗体片段。此外，可变区的定向位点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的特异性和亲和力。
在一些实施方式中，本发明的抗体为人源化抗体。人源化抗体为这样的抗体，其在可变区内含有来自非人(例如鼠)抗体的最小序列。当施用于人对象时，此类抗体在治疗上被用于降低抗原性和人抗-小鼠抗体应答。在实践中，人源化抗体通常为具有最小至没有非人序列的人抗体。人抗体为由人产生的抗体或具有相应于人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。
人源化抗体可使用本领域已知的各种技术来产生。通过用具有期望的特异性、亲和力和能力的非人抗体(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等)的互补性决定区(CDR)替代人抗体的互补性决定区(CDR)可将抗体人源化(Jones等,"ReplacingtheComplementarity-DeterminingRegionsinaHumanAntibodyWithThoseFromaMouse,"Nature321:522-525(1986)；Riechmann等,"ReshapingHumanAntibodyforTherapy,"Nature332:323-327(1988)；Verhoeyen等,"ReshapingHumanAntibody:GraftinganAntilysozymeActivity,"Science239:1534-1536(1988))。可通过替换Fv框架区和/或在替换的非人残基内的另外的残基进一步修饰人源化抗体以改善和优化抗体特异性、亲和力和/或能力。
双特异性抗体也适合用于本发明的方法中。双特异性抗体为能够特异性识别并结合至少两个不同表位的抗体。双特异性抗体可为完整的抗体或抗体片段。制备双特异性抗体的技术在本领域是常见的(Traunecker等,"BispecificSingleChainMolecules(Janusins)TargetCytotoxicLymphocytesonHIVInfectedCells,"EMBOJ.10:3655-3659(1991)andGruberetal,"EfficientTumorCellLysisMediatedbyaBispecificSingleChainAntibodyExpressedinEscherichiacoli,"J.Immunol.152:5368-74(1994))。
原核生物中糖基化的胰高血糖素肽产生
简单的体外糖缀合物技术已经显示出改善胰高血糖素肽，然而此类治疗性肽仍存在缺点，因为它们很小并且通常为单体，具有通常小于几小时的短的半衰期并且聚乙二醇化极少与小肽有效地作用。当前方法仍具有显著受抑的活性。
本发明涉及具有期望聚糖的新型糖基化的肽。糖基化的胰高血糖素肽的优势包括改善溶解度、改善凝胶和纤丝形成的物理稳定性、增加半衰期以及改善活性和药代动力学性质。其它优势包括能够进行单一或同时发生体内过程以产生蛋白质和聚糖，从而避免多个步骤。在一些实施方式中，由于在中性pH或略微碱性pH下延长血浆清除半衰期和延长吸收期以及改善水性溶解度，新型糖基化的胰高血糖素肽在体内具有延长的暴露。在其它实施方式中，本发明对于水溶液中凝胶和纤丝的形成具有改善的稳定性。在优选实施方式中，主要的N-聚糖为不引发哺乳动物的免疫原性的N-聚糖。
对于产生的任何特定的糖蛋白，N-糖基化位点占有率可在真核生物***(例如，CHO和酵母)中发生变化。可调节生长条件以控制位点占有率。
通常，胰高血糖素肽不具有糖基化。在某些实施方式中，将糖基化位点设计在肽上。在示例性实施方案中，本发明的胰高血糖素肽具有一个糖基化位点。在某些实施方式中，方法提供添加多个聚糖/肽以赋予较好活性。在进一步实施方式中，将宿主细胞工程化以产生胰高血糖素肽，其具有特定N-聚糖作为主要物质。示例性的糖基化模式显示于图11中。
因此，本发明的方法提供包含一种或多种糖型的糖蛋白和糖肽。优选地，糖型包括M4、M5、GO、G0(1)、G0(2)、G0(3)、Gl、G2、G3、G4、G5、S1、S2、S3、S4、S5，其赋予改善的溶解度或稳定性性质以及增加受体结合活性。与糖基化的肽(如胰高血糖素)相比，期望本发明增加肽的半衰期。已经通过本发明的方法产生另外的肽，如hGH、ASNase和ILl-Ra。产生的其它肽在本发明的范围内。在优选实施方式中，至少50mol％的胰高血糖素肽为糖基化的。疫苗制备
增强候选抗原的免疫原性的普遍方法应降低在疫苗开发早期投资的时间和成本并且可应用于任何目标疾病。一种记录的增强免疫原性的策略为甘露糖基化，即将甘露糖-末端聚糖缀合于蛋白质。与经由胞饮作用摄取抗原相比，在抗原呈递细胞(APC)上通过受体介导的胞吞作用而内化的特定受体(包括CD206和CD209)的甘露糖靶标抗原导致抗原呈递增加高达200倍(Engering,A等,Themannosereceptorfunctionsasahighcapacityandbroadspecificityantigenreceptorinhumandendriticcells.EurJImmunol,1997.27(9):p.2417-25.Lam,J.S等,AModelVaccineExploitingFungalMannosylationtoIncreaseAntigenImmunogenicity.TheJournalofImmunology,2005.175(11):p.7496-7503.)。抗原的甘露糖基化赋予几种优势，包括：(i)增加APC的抗原摄取，(ii)将MHCII类介导的抗原呈递增强高达10,000倍，(iii)促进T细胞增殖和成熟，以及(iv)改善体液免疫反应，包括血清的杀菌活性(Arigita,C等,LiposomalMeningococcalBVaccination:RoleofDendriticCellTargetingintheDevelopmentofaProtectiveImmuneResponse.InfectionandImmunity,2003.71(9):p.5210-5218.)。未将大肠杆菌用作疫苗产生的平台主要是因为其并非天然编码N-糖基化的途径并且因此不适合制备糖蛋白。
在某些实施方式中，本发明通过大肠杆菌的糖工程化菌株来提供甘露糖化的疫苗抗原的方法和组合物。在小鼠模型中评估甘露糖基化对免疫原性的作用。在细菌中能够产生疫苗候选物提供了许多优势。大肠杆菌为表达ExPEC(肠外致病性)和其它细菌蛋白的极好的平台，提供容易的重组DNA操作，可用于生成大的组合文库，允许快速和低成本菌株形成以及产量迅速上升和消除真核生物表达***遇到的病毒污染的风险(Aguilar-Yanez,J.等,AninfluenzaA/HIN1/2009hemagglutininvaccineproducedinEscherichiacoli.PLoSOne,2010.5(7):p.el1694.Choi,B.-K.等,UseofcombinatorialgeneticlibrariestohumanizeN-linkedglycosylationintheyeastPichiapastoris.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2003.100(9):p.5022-5027.)。在大肠杆菌中产生甘露糖化候选抗原应允许体内合成期望的糖蛋白而无需进一步化学或酶修饰。因此，本发明方法提供了针对疫苗开发的新的范式以增加大肠杆菌产生的疫苗候选物的功效。
预期本发明的糖工程化大肠杆菌产生具有增强的免疫原性的甘露糖化蛋白。大肠杆菌中甘露糖化抗原的合成代表疫苗开发的显著进步，允许廉价、迅速地产生具有增强的免疫原性性质的候选蛋白。在过去，已经将几种策略用于甘露糖基化抗原，包括体外化学缀合甘露聚糖或甘露糖-末端聚糖，在毕赤酵母中体内表达蛋白质用于酵母高甘露糖寡糖的糖基化，或将抗原体外包封至甘露糖化脂质体(Lam,J.S.等,Arigita,C等,Apostolopoulos,V.等,Oxidative/reductiveconjugationofmannantoantigenselectsforTlorT2immuneresponses.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1995.92(22):p.10128-10132.Sheng,K.等,Deliveryofantigenusinganovelmannosylateddendrimerpotentiatesimmunogenicityinvitroandinvivo.EurJImmunol,2008.38(2):p.424-36.)。然而，迄今为止，在细菌中将甘露糖-末端聚糖直接体内缀合于蛋白质从未实现。大肠杆菌表达平台应在普遍的蛋白质产生和聚糖表达的异位宿主方面提供超过现存技术的多个优势。
选择尿路致病性大肠杆菌(UPEC)抗原，cl275用于初步表达和糖基化。cl275蛋白质靶向糖工程化大肠杆菌的周质，用GlycTag(图3a)修饰，并与OSTPglB和装配空肠弯曲杆菌七庚糖聚糖所必需的糖基转移酶共表达。在纯化后，基于蛋白质印迹上出现的较慢的迁移条带以及这些产物与已知识别该寡糖的GalNAc特异性凝集素大豆凝集素(SBA)的反应性(图12)，糖基化的cl275为明显的(Young,N.M.等,StructureoftheN-linkedglycanpresentonmultipleglycoproteinsintheGram-negativebacterium,Campylobacterjejuni.JBiolChem,2002.277(45):p.42530-9.)。有趣地，cl275的糖基化不一定依赖于GlycTag的存在。序列分析揭示在该蛋白质中存在天然的DSNAT基序，这满足了PglB的公开的受***点需求。cl275的成功糖基化支持了假设：候选疫苗抗原可在大肠杆菌周质中成功表达和糖基化。
常规疫苗仅诱导体液免疫反应。DNA疫苗具有很大的希望，因为它们诱发体液和细胞介导的免疫，而没有与活病毒疫苗相关的相同危险。与减毒活病毒疫苗相比，DNA疫苗可以被递送至相同或不同的组织或细胞，而活病毒必须结合特异性受体。以天然形式产生的抗原改善了抗原至宿主免疫***的呈递。不像减毒活疫苗，DNA疫苗不易传染并且不能回复至毒力。
用各种寡糖，如Man3GlcNAc2修饰候选抗原。这可导致生成用于疫苗制剂的具有真核生物甘露糖-末端聚糖修饰的抗原。很多靶标抗原选自ExPEC疫苗候选物的公开评估，已知所述ExPEC疫苗候选物赋予小鼠模型保护。然而，应指出本发明为高度模块化的，因此可广泛应用于增强多种蛋白质和肽候选物的疫苗开发。
药物制剂
通过将具有期望程度的纯度的糖蛋白与任选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences第16版，Osol,A.编辑(1980))混合来将糖蛋白的治疗性制剂制备成冻干制剂或水溶液形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的并且包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(包括抗坏血酸和甲硫氨酸)；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其它碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖、或糊精)；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
聚糖为PEG聚合物的方便的锚，因为在存在诸如碘酸钠的弱氧化剂时，某些糖，如甘露糖或半乳糖可容易地转化成反应性醛(Soares,A.L.等,EffectsofpolyethyleneglycolattachmentonphysicochemicalandbiologicalstabilityofE.coliL-asparaginase.IntJPharm,2002.237(1-2):p.163-70)。然后，可将用肼基团官能化的PEG聚合物用于产生糖聚乙二醇化的生物缀合物。这允许合成位点特异性、高度受控的、均匀的和活性蛋白缀合物。由于聚乙二醇化经常为非特异性过程，聚乙二醇化经常产生异质性和活性丧失的问题。位点特异性聚乙二醇化方法涉及：(i)突变赖氨酸以使PEG靶向特定赖氨酸(Narimatsu,S.等,Lysine-deficientlymphotoxin-alphamutantforsite-specificPEGylation.Cytokine,2011.56(2):p.489-93.Youn,Y.S.和K.C.Lee,Site-specificPEGylationforhigh-yieldpreparationofLys(21)-aminePEGylatedgrowthhormone-releasingfactor(GRF)(1-29)usingaGRF(l-29)derivativeFMOC-protectedatTyr(l)andLys(12).BioconjugChem,2007.18(2):p.500-6)或靶向N-末端的胺基(Lee,H.等,N-terminalsite-specificmono-PEGylationofepidermalgrowthfactor.PharmRes,2003.20(5):p.818-25.Yamamoto,Y.等,Site-specificPEGylationofalysine-deficientTNF-alphawithfullbioactivity.NatBiotechnol,2003.21(5):p.546-52)或(ii)添加未配对的半胱氨酸残基以使靶向游离的硫醇基(Shaunak,S.等,Site-specificPEGylationofnativedisulfidebondsintherapeuticproteins.NatChemBiol,2006.2(6):p.312-3.Doherty,D.H.等,Site-specificPEGylationofengineeredcysteineanaloguesofrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor.BioconjugChem,2005.16(5):p.1291-8.Manjula,B.N.等,Site-specificPEGylationofhemoglobinatCys-93(beta):correlationbetweenthecolligativepropertiesofthePEGylatedproteinandthelengthoftheconjugatedPEGchain.BioconjugChem,2003.14(2):p.464-72)。这些方法具有一些主要缺点。首先，带正电荷的赖氨酸对于蛋白质结构/功能经常为重要的(Yoshioka,Y.等,Optimalsite-specificPEGylationofmutantTNF-alphaimprovesitsantitumorpotency.BiochemBiophysResComrnun,2004.315(4):p.808-14)。其次，添加半胱氨酸残基产生可溶性表达和二硫键形成的严重问题，并且可能甚至需要移至哺乳动物表达宿主(Constantinou,A.等,Site-specificpolysialylationofanantitumorsingle-chainFvfragment.BioconjugChem,2009.20(5):p.924-31)。第三，位点特异性聚乙二醇化严重限制连接的PEG分子的数目。糖聚乙二醇化涉及PEG至聚糖的缀合，所述聚糖已经连接到蛋白质内的特定残基。优势为：(i)过程为位点特异的，(ii)可远离活性位点将糖基化位点工程化，以及(iii)产物可为高度活化的并且为相对均匀的。
本文的制剂也可以含有正治疗的特定适应症所需的多于一种活性化合物，优选具有不会不利地互相影响互补活性的那些活性化合物。例如，制剂可以还包括另一抗体或化学治疗剂。此类分子以对预期目的有效的量合适地组合存在。
活性成分也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、包埋在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或包埋在粗乳剂中。此类技术公开于Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980)。
将用于体内施用的制剂必须是无菌的。这易于通过经由无菌过滤膜过滤来实现。可以制备缓释制备剂。缓释制备剂的合适实例包括包含糖蛋白的固体疏水性聚合物的半透过性基质，这些基质为成形制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙基酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸使分子释放能够超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质较短的时间段。当封装的抗体在身体中保持较长时间时，它们可由于37℃下暴露于水分而变性或聚集，从而导致生物活性丧失和可能的免疫原性改变。可根据所涉及的机制设计合理的策略以用于稳定。例如，如果发现聚集机制是通过硫基-二硫化物交换形成分子间S--S键，可通过修饰巯基残基、从酸性溶液冻干、控制含水量、使用适当添加剂以及开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
可以冻干药物组合物。冻干的抗体制剂描述于美国专利第6,267,958号。稳定的水性抗体制剂描述于美国专利第6,171,586B1号。
在某些方面，本发明的方法和组合物可用于非治疗目的，如分析、诊断、试剂和试剂盒。
试剂盒
本发明进一步提供了含有寡糖物质的制造制品和试剂盒。制造制品包括具有标签的容器。合适的容器包括例如，瓶、小瓶和试管。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳包含本文所述的寡糖制备剂的组合物。在其它实施方式中，试剂盒包括糖蛋白。容器上的标签表明组合物可用于治疗或预防特定疾病或病症，并且也可以表明体内用法说明，如上文描述的那些。本发明的试剂盒包括以上所述的容器以及包含缓冲液的第二容器。其还可以包括在商业和使用者看来可取的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和具有使用说明书的包装插页。
最终，原核生物(例如，大肠杆菌)中不同糖型的合成促进连接到蛋白质、掺入聚糖阵列、以及用作底物以产生其它类似于人的、N-连接的聚糖、诊断、试剂盒或试剂。
以上公开内容基本上描述了本发明。更具体的描述提供于下述实施例中。描述的实施例仅出于示例性说明目的而不旨在限制本发明的范围。也涵盖等价物的形式变化和替换作为情况提示(circumstancessuggest)或渲染的权宜之计(renderexpedient)。虽然本文已经使用了特定术语，但此类术语旨在描述意义而非出于限制目的。
实施例
实施例1-质粒构建
Vaderrama-Rincon等最近公开了在大肠杆菌的细胞质膜中于Und-PP上生物合成和装配Man3GlcNAc2的生物合成途径。该途径包括具有野生型核苷酸序列或密码子优化的序列的Algl3Algl4Algl和Alg2活性，该途径赋予原核生物宿主细胞真核生物糖基转移酶活性。该途径用于将GlcNAc和甘露糖单元添加至十一葵烯醇-连接的载体底物，从而产生三甘露糖基核心寡糖结构。大肠杆菌具有整合膜蛋白WecA，其介导来自UDP-GlcNAc的GlcNAc-1-磷酸转移至十一异戊二烯基磷酸(Und-P)以形成Und-PP-GlcNAc(Rick,P.D.&Silver,R.P.inEscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology,(ed.F.C.a.o.Neidhardt)104-122(AmericanSocietyforMicrobiology,Washingtion,D.C.；1996)。因此，天然产生的Und-PP-GlcNAc以期望的Man3GlcNAc2聚糖的候选前体存在。对于第二GlcNAc残基的添加，表达酿酒酵母β1,4-GlcNAc转移酶，其由两个亚基Algl3和Algl4组成。在酵母中，Algl4为整合膜蛋白，其起到膜锚的作用以将可溶性Algl3募集至ER的细胞溶质表面，在那发生Dol-PP-GlcNAc2的催化作用(Bickel,T.等,Bopsynthesisoflipid-linkedoligosaccharidesinSaccharomycescerevisiae:Algl3pandAlgl4pformacomplexrequiredfortheformationofGlcNAc(2)-PP-dolichol.JBiolChem280,34500-34506(2005))。当在大肠杆菌中共表达时，观察到Algl4定位于膜部分，而Algl3存在于细胞质和膜部分，这与酵母的情况一致。对于后续步骤，表达了酿酒酵母β1,4-甘露糖转移酶Algl和双功能甘露糖转移酶Alg2，所述酿酒酵母β1,4-甘露糖转移酶Algl将第一个甘露糖连接到聚糖，所述双功能甘露糖转移酶Alg2催化αl,3-和αl,6-甘露糖残基添加至聚糖(O'Reilly,M.K.等,InvitroevidenceforthedualfunctionofAlg2andAlgl1:essentialmannosyltransferasesinN-linkedglycoproteinbiosynthesis.Biochemistry45,9593-9603(2006))。在大肠杆菌中表达之后，Algl和Alg2定位于细胞膜。为测定正确定位的Alg酶是否能够在Und-PP上产生Man3GlcNAc2，构建了允许同时表达Algl3、Alg14、Algl和Alg2的质粒pYCG(Valderrama-Rincon等)。
构建了质粒pMW07(Valderrama-Rincon等)。用Ahdl将质粒pMQ70(Shanks等,2006AEM.72(7)5027-5036.)线性化，该Ahdl为Eaml1051的同裂酶。由pBAD33扩增pl5aori和cat基因并将其用于与线性化载体pMQ70共转化酵母。酵母中的同源重组导致替换colElori和bla基因，从而生成载体pMW07(Valderrama-Rincon等)。表3列出了不同菌株的构建体和基因型。
实施例2–分析方案
提取和纯化N-连接的寡糖的方法如Gao等(Gao等,"Non-radioactiveanalysisoflipidlinkedoligosaccharidecompositionbyfluorophore-assistedcarbohydrateelectrophoresis,"MethodEnzymol415:3-20)所述进行。通过MALDI-TOF质谱法使用二羟基苯甲酸(DHB)作为基质来分析纯化的寡糖(ABSciexTOF/TOF5800)。
聚糖图形为标准的CFG(ConsortiumforFunctionalGenomics)黑色和白色符号，其在GlycoWorkbench2.0中生成。
实施例3-在大肠杆菌中产生类似于人的N-连接的Man5GlcNAc2高甘露糖寡糖
在人和其它真核生物中，Man5GlcNAc2糖型为聚糖合成中的关键中间体。在真核生物中，该关键糖型在内质网膜的细胞溶质侧合成。酶Alg11催化两个αl,2-甘露糖残基添加至Man3GlcNAc2聚糖核心的α1,3甘露糖。将来自酿酒酵母的编码Alg11的基因作为与编码谷胱甘肽S-转移酶的基因(gst)的融合物克隆至质粒pMW07-YCG-PglB.CO，其用于产生Man3GlcNAc2三甘露糖基核心(Valderrama-Rincon等)。将所得质粒通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmdv.kan(Gly02)。使Gly02在100mLLuria-Bertani(LB)肉汤中生长，一旦培养物达到3.0的光密度时，通过添加0.2％(v/v)***糖来诱导。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的Man5GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1257.6Na+)(图1A)。在一些样品中，出现了次峰，其与Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.5Na+)。在其它实例中，出现了包括与以下一致的聚糖的次峰：Man2GlcNAc2、Man4GlcNAc、Man3GlcNAc2、HexMan3GlcNAc2、HexMan5GlcNAcMan6GlcNAc。为确认预期的α1,2甘露糖残基添加至Man3GlcNAc2聚糖核心，根据制造商的方案用α1,2甘露糖苷酶(Prozyme)处理纯化的聚糖。在与酶温育后，标记聚糖并通过质谱法和在Gao等的方法中的FACE凝胶对其进行分析。在未处理的样品中，观察到与Man5GlcNAc2糖型一致的主峰(未显示)。在处理的样品中，观察到与Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z933.4Na+)(图1B)。这确认了两个αl,2-甘露糖残基预期添加至Man3GlcNAc2聚糖核心。因此，类似于人的Man5GlcNAc2糖型可通过在大肠杆菌中表达Alg11而产生。Man5GlcNAc2糖型的分离受到其它手段的挑战，因为在真核生物中，Man5GlcNAc2糖型为不稳定的寡糖。由于难于表达足够量的活性酶，所以该***中Man5GlcNAc2的合成也具有挑战性。探索连同单独的Alg11一起的不同融合伴侣，并检查导致缺少有效的产物形成的多数Alg11部分。融合至Alg11的gst和mstX在该***中产生Man5GlcNAc2糖型。
实施例4-在大肠杆菌中产生混合N-连接的GlcNAcMan3GlcNAc2寡糖
在人和其它真核生物中，GlcNAcMan3GlcNAc2糖型糖型为聚糖合成中的关键中间体。该糖型通常仅存在于连接到真核生物高尔基体中蛋白质的N-连接的聚糖。在这里，聚糖在大肠杆菌的脂质载体上进行装配。为了达到这点，合成烟草N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I(GnTI)的截短形式(残基30-446)的基因。通过PCR扩增GnTI基因并将其作为与编码缺少天然信号序列的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的基因(malE)的融合物亚克隆至质粒pMQ70。将所得的pMQ70-MBP-NtGnTI连同第二个质粒pMW07-YCG-PglB.CO一起通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(Gly03)和Origami2gmd::kan(Gly03.1)用于产生Man3GlcNAc2三甘露糖基核心(Valderrama-Rincon等)并在100mLLuria-Bertani(LB)肉汤中生长。一旦培养物达到3.0的光密度，通过添加0.2％(v/v)***糖来诱导糖基转移酶表达。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1136.5Na+)(图2A)。次峰与Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.4Na+)。为确认预期的GlcNAc添加至Man3GlcNAc2聚糖核心，根据制造商的方案用β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶(NewEnglandBiolabs)处理纯化的聚糖。在与酶温育后，标记聚糖并通过质谱法和在Gao等的方法中的FACE凝胶对其进行分析。在未处理的样品中，观察到与GlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致的主峰(未显示)。在处理的样品中，主峰与Man3GlcNAc2糖型一致(图2B)。这确认了β-GlcNAc预期添加至Man3GlcNAc2聚糖核心。因此，类似于人的GlcNAcMan3GlcNAc2糖型可通过在大肠杆菌中表达GnTI而产生。GlcNAcMan3GlcNAc2糖型的分离受到其它手段的挑战，因为在真核生物中，GlcNAcMan3GlcNAc2糖型为不稳定的寡糖。使用该***也遇到障碍，其中首次在大肠杆菌中尝试表达单独的人GnTI，或融合至mstX的人GnTI，未有效产生期望的GlcNAcMan3GlcNAc2糖型(图未显示)。此外，当未融合至MBP时，烟草GnTI未能产生期望的产物(图未显示)。
实施例5-大肠杆菌中N-连接的GlcNAc2Man3GlcNAc2复合寡糖的产生
在人和其它真核生物中，GlcNAc2Man3GlcNAc2复合糖型(“G0”)为聚糖合成中的关键中间体，因为其是聚糖充分修饰的“核心”。该糖型通常仅存在于连接到真核生物高尔基体中蛋白质的N-连接的聚糖。在这里，聚糖在大肠杆菌的脂质载体上进行装配。为了达到这点，合成编码人N-乙酰葡萄糖胺基转移酶II(GnTII)的截短形式(残基30-447)的基因。通过PCR扩增GnTII基因并将其作为与缺少天然信号序列的MBP的融合物亚克隆至质粒pMQ70。将所得的pMQ70-MBP-hGnTII连同第二个质粒pMW07-YCG-MBP-NtGnTI一起通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(gly06)、Origami2gmd::kan(Gly06.1)、DR473gmd::kan(Gly06.2)和ShuffleΔwaaLgmd::kan(Gly06.3)用于产生GlcNAcMan3GlcNAc2底物寡糖。用0.2％(v/v)***糖来诱导糖基转移酶表达并在接种至1LLuria-Bertani(LB)肉汤后立即添加。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1339.8Na+)(图3)。次峰与Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.5Na+)。在光谱中也观察到与GlcNAcMan3GlcNAc2(m/z1136.6Na+)一致的第二个次峰。在糖工程化的大肠杆菌中表达GnTII证明是具有挑战性的，其中来自三种生物体的GnTII通过单独的表达来检查或通过当融合至mstX或MBP时的表达来检查。另外，在氧化和非氧化细菌菌株中检查GnTII表达。在检查的六个GnTII部分和四个细菌菌株中，在具有MBP-融合的、人GnTII的四个细菌菌株中观察到一个细菌菌株有效产生GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖(图未显示)。
实施例6-大肠杆菌中分枝的N-连接的GlcNAc2Man3GlcNAc2混合寡糖的产生
多触角、N-连接的聚糖的合成为人和其它真核生物中常见的特征。三触角寡糖的产生通过N-乙酰葡萄糖胺基转移酶IV(GnTIV)将GlcNAc残基添加至GlcNAc2Man3GlcNAc2来实现。GnTIV也可作用于GlcNAcMan3GlcNAc2，从而产生双触角、混合寡糖，其为GlcNAc2Man3GlcNAc2复合聚糖的结构异构体。合成编码牛科动物GnTIV的截短形式(残基93-535)的细菌密码子优化的基因。通过PCR扩增GnTIV基因并将其作为与缺少天然信号序列的MBP的融合物亚克隆至质粒pMQ70。将所得的pMQ70-MBP-hGnTIV连同第二个质粒pMW07-YCG-MBP-NtGnTI一起通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(gly05)和Origami2gmd::kan(Gly05.1)用于产生GlcNAcMan3GlcNAc2底物寡糖。用0.2％(v/v)***糖来诱导糖基转移酶表达并在接种至1LLuria-Bertani(LB)肉汤后立即添加。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1339.7Na+)(图4A)。在一些样品中，次峰与Man3GlcNAc2糖型(m/z933.5Na+)一致。为确认预期的GlcNAc添加至GlcNAcMan3GlcNAc2聚糖，根据制造商的方案用β-Ν-乙酰氨基葡糖苷酶(NewEnglandBiolabs)处理纯化的聚糖。在与酶温育之后，标记聚糖并通过质谱法分析。在未处理的样品中，观察到与GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(未显示)。在处理的样品中，主峰与Man3GlcNAc2糖型一致(图4B)。这确认了β-GlcNAc预期添加至GlcNAcMan3GlcNAc2聚糖核心。在糖工程化的大肠杆菌中表达GnTIV证明是具有挑战性的，其中在氧化和非氧化细菌菌株中检查GnTII表达。仅在氧化细菌菌株中观察到GlcNAc2Man3GlcNAc2聚糖的有效产生(图未显示)。
实施例7-大肠杆菌中多触角N-连接的GlcNAc3Man3GlcNAc2混合寡糖的产生
三触角、N-连接的聚糖的合成为存在于人和其它真核生物中的特征。一种此类三触角寡糖的产生通过N-乙酰葡萄糖胺基转移酶IV(GnTIV)将UDP-GlcNAc残基添加至GlcNAc2Man3GlcNAc2来实现。合成了编码牛科动物GnTIV的密码子优化的基因。通过PCR扩增GnTIV基因并亚克隆越过质粒pMQ70-MBP-hGnTII中人GnTII基因的3'-末端。将所得的构建体连同第二个质粒pMW07-YCG-MBP-NtGnTI一起通过电穿孔转化至大肠杆菌细胞(Origami2gmd::kan)用于产生GlcNAcMan3GlcNAc2底物寡糖以产生菌株GLY06.1。用0.2％(v/v)***糖诱导糖基转移酶表达，在接种至1LLuria-Bertani(LB)肉汤后立即添加。提取和纯化N-连接的寡糖的方法如Gao等所述进行。通过MALDI-TOF质谱法使用DHB作为基质(ABSciexTOF/TOF5800)分析纯化的寡糖。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与底物GlcNAc2Man3GlcNAc2和GlcNAc3Man3GlcNAc2产物糖型一致的m/z值分别为1339.9(Na+)和1543.1(Na+)的两个主峰(图5B)。
为生成底物寡糖G0(1)，在30℃下将1LGLY06的高浓度培养物用0.2％v/v***糖诱导20小时。通过遵照Gao等所述的方法来分离G0寡糖。在25℃下通过用0.2％v/v***糖诱导16小时的单独的100mL培养物来表达糖基转移酶。将该培养物通过离心沉淀，重悬在2mlGnTIV活性缓冲液(50mMtris,10mMMnCl2,pH7.5)中并超声处理。通过离心澄清裂解物并将20uL加入至干燥的三甘露糖基核心底物(～5μg)。将过量的核苷酸糖(20μg)加入至反应物，随后在30℃下温育。在24小时时段内的不同时间点通过MALDI-TOF质谱法监测反应。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GlcNAc3Man3GlcNAc2糖型一致的峰(m/z1542.9Na+)(图5A)。
实施例7-大肠杆菌中混合N-连接的GalGlcNAc2Man3GlcNAc2混合寡糖的产生
在人和其它真核生物中，GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖型为聚糖合成中的中间体。该糖型在健康成人中稍微非典型的，但已经在患有***癌的个体中观察到(Kyselova等,"Alterationsintheserumglycomeduetometastaticprostatecancer,"J.ProteomeRes.(2007))。在这里，将聚糖装配至大肠杆菌中的脂质载体。合成了编码幽门螺杆菌P-l,4-半乳糖转移酶(GalT)的基因，通过PCR扩增并亚克隆至质粒pMQ70。将所得的pMQ70-HpGalT连同第二个质粒pMW07-YCG-MBP-NtGnTI一起通过电穿孔转化至MC4100ΔwaaLgmd::kan(Gly04)和Origami2gmd::kan(Gly04.1)用于产生GlcNAcMan3GlcNAc2底物寡糖。用0.2％(v/v)***糖诱导糖基转移酶表达，在接种至1LLuria-Bertani(LB)肉汤后立即添加。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GalGlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1298.7Na+)(图6)。在一些样品中，次峰与Man3GlcNAc2糖型一致(m/z933.5Na+)(图未显示)。在糖工程化的大肠杆菌中表达GalT证明是具有挑战性的，其中来自牛科动物和人的未融合的以及融合至MBP和mstX以及来自脑膜炎球菌的GalT未在大肠杆菌中产生期望的寡糖(未显示)。此外，在氧化和非氧化的细菌菌株中检查到幽门螺杆菌GalT的表达，但仅在氧化的细菌菌株中观察到有效的半乳糖基化。
实施例8-在大肠杆菌中产生N-连接的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2复合寡糖
在人和其它真核生物中，Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型为聚糖合成中的关键中间体。该糖型通常仅存在于连接到真核生物中蛋白质的N-连接的聚糖。
在一个样品中，使用Gly06产生的G0寡糖以及如实施例7所述的方法离体产生聚糖。通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1664.1Na+)(图7A)。
对于末端半乳糖化的聚糖的体内合成，合成了编码幽门螺杆菌β-l,4-半乳糖转移酶(GalT)的基因，通过PCR扩增并将其亚克隆至质粒pMQ132。将所得的pMQ132-HpGalT连同第二个质粒pMW07-YCG-MBP-NtGnTI和第三个质粒pMQ70-MBP-hGnTII一起通过电穿孔转化至Origami2gmd::kan(Gly04.2)用于产生GlcNAc2Man3GlcNAc2底物寡糖。用0.2％(v/v)***糖诱导糖基转移酶表达，在接种至1L的Luria-Bertani(LB)肉汤后立即添加。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型一致的主峰(m/z1664.1Na+)(图7A)。在Gly04.2中合成的聚糖分析揭示与G2糖型一致的峰(m/z1662.2Na+)，与Gl糖型一致的峰(m/z1500.0Na+)以及与G0糖型一致的峰(m/z1337.9Na+)。当在大肠杆菌中产生Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型时，遇到了实施例7中所述的相同挑战，这是因为相同的酶用于产生两种产物。
实施例8-在大肠杆菌中产生N-连接的NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2混合寡糖
为生成底物寡糖GalGlcNAcMan3GlcNAc2，在30℃下将1LGLY04的高浓度培养物用0.2％v/v***糖诱导20小时。通过遵照Gao等所述的方法来分离底物寡糖。在25℃下通过用0.2％v/v***糖诱导16小时的单独的100mL培养物来表达ST6。将该培养物通过离心沉淀，重悬在2mlST6活性缓冲液(50mMtris,10mMMnCl2,pH7.5)中并超声处理。通过离心澄清裂解物并将20uL加入至干燥的三甘露糖基核心底物(～5μg)。将过量的核苷酸糖(20μg)加入至反应物，随后在30℃下温育。在24小时时段内的不同时间点通过MALDI-TOF质谱法监测反应。
通过质谱法分析纯化的寡糖揭示与期望的NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致的峰(m/z1565.7Na+)(图8)。
实施例9-在大肠杆菌中优化N-连接的聚糖产生
在糖工程化的大肠杆菌中存在增加产生N-连接的聚糖的量的许多方法，其包括：(i)增加糖蛋白产生(ii)以及促进糖分析(glycoanalytical)工具的产生，如聚糖阵列。因此，开始进行改善三甘露糖基核心聚糖、Man5GlcNAc2聚糖的产量以及将GlcNAc残基添加至三甘露糖基核心。理解到大肠杆菌中的核苷酸糖混合物可能为有限的，核苷酸糖生物合成途径中的酶被靶向在糖工程化的大肠杆菌中过表达。具体地，研究了磷酸甘露糖变位酶(ManB)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶(ManC)和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶(GlmS)，其中ManB和ManC涉及GDP-甘露糖的形成，GlmS涉及UDP-GlcNAc的形成。
将来自大肠杆菌的编码ManB和ManC的基因双顺反子(ManC/ManB)克隆至质粒pMQ70并连同pMW07-YCG-PglB.CO一起通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(Gly0l.2)用于产生Man3GlcNAc2三甘露糖基核心(Valderrama-Rincon等)。将来自大肠杆菌的编码GlmS的基因克隆至质粒pTrc99Y(Valderrama-Rincon等)并连同pMW07-YCG-MBP-NtGnTI一起通过电穿孔转化至大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(Gly01.3)。将含有pMW07-YCG-PglB.CO的大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmd::kan(Gly01)和含有pMW07-YCG-MBP-NtGnTI的大肠杆菌MC4100ΔwaaLgmdv.kan(Gly01.1)用作对照。使Gly0l和Gly01.2在100mLLuria-Bertani(LB)肉汤中生长并在光密度(O.D.)为3时用0.2％(v/v)***糖诱导表达。使Gly01.1和Gly01.3在100mLLB肉汤中生长并在O.D.为3时用0.2％(v/v)***糖和1mMIPTG(仅Gly0l.3)诱导表达。提取和纯化N-连接的寡糖的方法如Gao等所述进行。使用Gao等所述的方法通过荧光团辅助的碳水化合物电泳(FACE)来分析纯化的寡糖。
关于Gly0l.2，当与Gly0l相比时观察到三甘露糖基核心的产生大幅增加(图9A左图)。然而，定量产量的差异存在困难，因为Gly0l三甘露糖基核心条带实质上是不可检测的。类似地，关于Gly0l.3，当与Gly0l.1相比时观察到聚糖产量大幅增加(图9A右图)。另外，当与Gly0l.l相比时，观察到GlcNAcMan3GlcNAc2大幅增加，这是靶向该酶用于过表达的目标。由于在核苷酸糖生物合成中涉及了许多酶，所以在测定糖工程化的大肠杆菌中哪个酶靶向过表达进行了细心考虑，其中许多酶可能对聚糖产量具有很小的影响。
甘油提供了葡萄糖的碳源替代物以便不经由启动子抑制而影响质粒的基因表达，因为cAMP水平在具有过量甘油的大肠杆菌中保持高的。甘油的使用似乎增加聚糖产量，如图9B所显示。丙酮酸酯在克雷布斯循环(Krebscycle)中使GDP再循环至GTP起着重要作用。GTP为GDP-甘露糖焦磷酸化酶的底物，所述GDP-甘露糖焦磷酸化酶对于GDP-甘露糖形成是必需的。预期加入丙酮酸酯图9C也增加聚糖产量。
与无ManC/B过表达的宿主细胞相比，通过具有ManC/B过表达的宿主细胞的质谱法分析纯化的寡糖揭示次峰的实质消除。GLY01.4产生与期望的M3糖型一致的单个主峰(m/z933.5Na+)(图10D)。GLY02.1产生与期望的M5糖型一致的单个主峰(m/z1257.7Na+)(图10E)。GLY01.5产生与期望的混合GlcNAcMan3GlcNAc2糖型一致的单个主峰(m/z1136.9Na+)(图10F)。
实施例10-大肠杆菌中糖基化的胰高血糖素产生
胰高血糖素构建体由C-末端具有N-连接的糖基化位点(DQNAT)随后六个组氨酸标签的胰高血糖素组成。胰高血糖素被表达为在载体pTrc99Y中三个连续的C-末端TEV蛋白酶位点之后的MBPC-末端的融合物。也将编码ManC和ManB的基因克隆至该载体越过编码胰高血糖素区域3'端。将所得质粒连同相应的糖基转移酶质粒一起通过电穿孔转化至大肠杆菌细胞(Origami2ΔwaaL,gmd::kan)细胞。使每种菌株的100mL培养物生长至600nm处～2.0的光密度并在30℃用0.2％v/v***糖诱导16小时，随后用0.1mMIPTG诱导8小时。通过离心收获细胞，重悬在裂解缓冲液(50mMPO4缓冲液,300mMNaCl,pH8.0)中，超声处理并离心以去除碎片。将澄清的细胞裂解物上样至预平衡的Ni-NTA吸附柱(Qiagen)并用含有30mM咪唑的缓冲液洗涤。用200μL300mM咪唑洗脱融合蛋白。随后，在30℃将洗脱的蛋白质用1μgTEV蛋白酶(SigmaAldrich)温育。在24小时时段的不同时间点处通过质谱法分析样品。
连接有C-末端糖基化位点的部分纯化的胰高血糖素的MALDI-TOFMS分析如下：来自菌株(图11A)GLY01.6的与预期的Man3GlcNAc2糖肽一致(m/z6283)，来自菌株(图11B)GLY02.2的与预期的GlcNAcMan5GlcNAc2糖肽一致(m/z6611)，来自菌株(图11C)GLY01.7的与预期的GlcNAcMan3GlcNAc2糖肽一致(m/z6488),以及来自菌株(图11D)GLY04.3的与预期的GalGlcNAcMan3GlcNAc2糖肽一致(m/z6649)。星号表明在所有样品中不依赖于糖基转移酶存在的背景信号。
实施例11-大肠杆菌中甘露糖化疫苗产生
克隆和表达具有候选抗原的基因。在准备糖基化研究中候选抗原的成功表达需要该蛋白质编码受体天冬酰胺并在周质中表达。使用含有四个反复的对于细菌OSTPglB最优化的N-糖基化序列子的GlycTag。使用来自大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)的信号肽，所述麦芽糖结合蛋白经由Sec途径输出并在输出用于糖基化的异位蛋白质中表现良好(Fisher,A.C.等,ProductionofSecretoryandExtracellularN-LinkedGlycoproteinsinEscherichiacoli.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2011.77(3):p.871-881.)。由异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)-可诱导的TRC启动子表达蛋白质以提供糖基化研究中使用的适当表达水平(Fisher等)。
大肠杆菌疫苗抗原的甘露糖基化。将来自致病性ExPEC大肠杆菌的编码候选疫苗抗原cl275和3473的基因(Moriel等,PNAS2010)以融合物克隆至成熟MBP的C-末端并在其C-末端用四个连续的糖基化序列子(4xGlycTag)和六组氨酸标签进行修饰。利用来自DsbA的信号肽以将蛋白质靶向周质。将所得质粒通过电穿孔与大肠杆菌细胞(MC4100ΔwaaLΔgmd::kan)中pMW07-YCG-PglB进行配对。在接种至10L培养物之后，使每种菌株生长至600nm处大约3.0的光密度并用添加0.2％(v/v)***糖和1mMIPTG进行诱导。通过ConA亲和色谱，随后通过镍亲和色谱如先前所述(Valerrama-Rincon等)分离糖蛋白。使用抗六组氨酸抗体和ConA凝集素分析部分纯化的样品的蛋白质印迹(图12)。
用天冬酰胺-连接的甘露糖-末端聚糖修饰抗原。在成功连接到空肠弯曲杆菌七庚糖之后，将甘露糖末端聚糖连接到候选抗原。少甘露糖寡糖结构以正常的人N-聚糖存在，并且当前用于人类治疗学中(VanPatten,S.M.等,EffectofmannosechainlengthontargetingofglucocerebrosidaseforenzymereplacementtherapyofGaucherdisease.Glycobiology,2007.17(5):p.467-478.)，这表明聚糖自身在人中是耐受的。质粒(pYCG-PglB)表达OSTPglB和来自酿酒酵母的四个糖基转移酶：Algl3、Algl4、Algl和Alg2(Valderrama等)。这些蛋白质协调Man3GlcNAc2聚糖及其衍生物的合成和缀合，这形成人复合N-聚糖的基础。
通过与空肠弯曲杆菌七庚糖糖基化验证的候选抗原在糖基化宿主菌株MC4100ΔwaaLgmd::kan中与pYCG-PglB单独地共表达。在诱导糖基化途径酶和抗原之后，将细胞裂解并用结合α-连接的甘露糖残基的ConA凝集素分离靶蛋白。因为工程化的聚糖用α-甘露糖残基终止，所以用ConA纯化支持回收用完全期望的聚糖修饰的蛋白质。镍亲和色谱用于进一步纯化甘露糖化抗原并且一部分蛋白质经历PNGaseF处理以切掉聚糖。通过SDS-PAGE随后用ConA和αHis抗体的免疫印迹的分析证实回收期望的甘露糖化蛋白质。为确认连接的聚糖为Man3GlcNAc2，使PNGaseF-释放的聚糖经历质谱，如(Valderrama-Rincon等)所述。预期该过程产生均匀的、细菌来源的甘露糖化的靶标抗原。甘露糖化的抗原通过用凝集素ConA的蛋白质印迹检测，并通过质谱法确认聚糖身份。
评价甘露糖化抗原的免疫原性。纯化甘露糖化的和糖基化的疫苗抗原并评估靶标抗原的免疫原性性质。使用小鼠模型，检查甘露糖化的ExPEC抗原的体液和细胞-介导的免疫应答的标志物。
甘露糖化抗原的纯化。使用在ConA柱上的凝集素-亲和色谱随后通过镍纯化来纯化甘露糖化的抗原。糖基化的抗原通过镍亲和色谱进行类似纯化。比较制备剂以确保银染色的类似纯度并对每个样品测定内毒素水平。回收合适量的类似纯度的甘露糖化蛋白质和糖基化蛋白质以进行免疫原性研究。
通过人骨髓(mDC)测试甘露糖化抗原的结合。将甘露糖化或糖基化的抗原与mDC温育以评估与甘露糖受体的结合(Wieser,A.等,AMultiepitopeSubunitVaccineConveysProtectionagainstExtraintestinalPathogenicEscherichiacoliinMice.InfectionandImmunity,2010.78(8):p.3432-3442.)。在洗涤之后，固定细胞并使用流式细胞术用αHis-FITC抗体检测表面结合的抗原。与游离的甘露糖或甘露聚糖的竞争证实甘露糖受体在甘露糖化抗原的特异性结合中的作用(Wieser等)。在小鼠模型中评估免疫原性之前，该步骤起到初步证实甘露糖化抗原的作用。
测量甘露糖化抗原的免疫原性。与糖基化的对照相比，评价在皮下施用甘露糖化抗原之后小鼠的免疫应答。该步骤为将Man3GlcNAc2聚糖用作疫苗候选物的抗原性的增强子的重要验。将六只CD1小鼠的群组(CharlesRiverLaboratories)在第1、21和35天用例如，20g抗原进行皮下免疫。使用相同的免疫时间线，CD1小鼠在先前已经被用作ExPEC疫苗研究的败血症模型(Moriel,D.G.等)并且因此，这些实验为未来的攻击研究做好准备。在最终免疫之后两周收集血清并将ELISA用于定量体液应答，包括IgG和IgM的滴度(Park,S.-U.等,ImmunizationwithaDNAvaccinecocktailinducesaThlresponseandprotectsmiceagainstMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosischallenge.Vaccine,2008.26(34):p.4329-4337.)。与具有GlycTag和6x-His标签的无关的对照蛋白质相比，评价抗原特异性应答。将CD8+T细胞测定用于定量细胞应答(Sivick,K.E.和H.L.T.Mobley,WagingWaragainstUropathogenicEscherichiacoli:WinningBacktheUrinaryTract.InfectionandImmunity,2010.78(2):p.568-585.)，因为体液和细胞介导的免疫可能在与ExPEC感染的战斗中起重要作用(Thumbikat,P等,Antigen-SpecificResponsesAccelerateBacterialClearanceintheBladder.TheJournalofImmunology,2006.176(5):p.3080-3086.Nallamsetty,S.和D.Waugh,Solubility-enhancingproteinsMBPandNusAplayapassiveroleinthefoldingoftheirfusionpartners.ProteinExprPurif,2006.45(1):p.175-82.)。
将模型抗原构建为与正常的大肠杆菌周质驻留的MBP的融合蛋白。N-末端MBP融合物可促进适当折叠并从细胞质输出，这继而可改善糖基化(Nallamsetty等)。测试替代信号肽序列可解决不适当的定位。将空肠弯曲杆菌七庚糖连接到用末端GlycTag修饰的蛋白质在所有情况下可靠地实现，其中足够的靶蛋白适当地定位于周质并用作与Man3GlcNAc2聚糖成功糖基化的预测性指示物。然而，糖基化也可以通过以下来改善：调节GlycTag的位置或利用不同的甘露糖-末端聚糖，如来自大肠杆菌O9的聚甘露糖LPS，其在细菌N-糖基化反应中已经预先缀合于蛋白质(Wacker,M.等,Substratespecificityofbacterialoligosaccharyltransferasesuggestsacommontransfermechanismforthebacterialandeukaryoticsystems.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2006.103(18):p.7088-7093.)。
使用小鼠模型评估甘露糖基化对结合于mDC的抗原以及免疫原性的作用。抗原内化的动力学影响我们使mDC结合和表面结合的抗原可视化的能力并且如果需要，使用胞内体运输的抑制剂或评估透性化细胞中内化的抗原。将定量细胞介导的和抗原特异性体液免疫反应用于测定疫苗抗原候选物的甘露糖基化是否对这些指示物的免疫原性具有影响。用替代性甘露糖聚糖，如来自大肠杆菌O9的聚甘露糖LPS评价不同糖基化的抗原。替代地，可用另外的糖基化位点修饰抗原以促进多个聚糖的连接。
表3.菌株和质粒列表。
尽管在本文中详细示出和描述优选的实施方案，但对相关领域技术人员来说，显然在未违背本发明的精神下可进行各种修改、添加、替代等，并因而将其认定为在如所附权利要求中所限定的本发明的范围内。
非正式序列表
优化的SEQIDNO:1alg13密码子
ATGGGTATCATCGAAGAAAAAGCTCTGTTCGTTACCTGCGGTGCTACCGTTCCGTTCCCGAAACTGGTTTCTTGCGTTCTGTCTGACGAATTCTGCCAGGAACTGATCCAGTACGGTTTCGTTCGTCTGATCATCCAGTTCGGTCGTAACTACTCTTCTGAATTCGAACACCTGGTTCAGGAACGTGGTGGTCAGCGTGAATCTCAGAAAATCCCGATCGACCAGTTCGGTTGCGGTGACACCGCTCGTCAGTACGTTCTGATGAACGGTAAACTGAAAGTTATCGGTTTCGACTTCTCTACCAAAATGCAGTCTATCATCCGTGACTACTCTGACCTGGTTATCTCTCACGCTGGTACCGGTTCTATCCTGGACTCTCTGCGTCTGAACAAACCGCTGATCGTTTGCGTTAACGACTCTCTGATGGACAACCACCAGCAGCAGATCGCTGACAAATTCGTTGAACTGGGTTACGTTTGGTCTTGCGCTCCGACCGAAACCGGTCTGATCGCTGGTCTGCGTGCTTCTCAGACCGAAAAACTGAAACCGTTCCCGGTTTCTCACAACCCGTCTTTCGAACGTCTGCTGGTTGAAACCATCTACTCTTAA
SEQIDNO:2alg13
MGIIEEKALFVTCGATVPFPKLVSCVLSDEFCQELIQYGFVRLIIQFGRNYSSEFEHLVQERGGQRESQKIPIDQFGCGDTARQYVLMNGKLKVIGFDFSTKMQSIIRDYSDLVISHAGTGSILDSLRLNKPLIVCVNDSLMDNHQQQIADKFVELGYVWSCAPTETGLIAGLRASQTEKLKPFPVSHNPSFERLLVETIYS*
优化的SEQIDNO:3algl4密码子
ATGAAAACCGCTTACCTGGCTTCTCTGGTTCTGATCGTTTCTACCGCTTACGTTATCCGTCTGATCGCTATCCTGCCGTTCTTCCACACCCAGGCTGGTACCGAAAAAGACACCAAAGACGGTGTTAACCTGCTGAAAATCCGTAAATCTTCTAAAAAACCGCTGAAAATCTTCGTTTTCCTGGGTTCTGGTGGTCACACCGGTGAAATGATCCGTCTGCTGGAAAACTACCAGGACCTGCTGCTGGGTAAATCTATCGTTTACCTGGGTTACTCTGACGAAGCTTCTCGTCAGCGTTTCGCTCACTTCATCAAAAAATTCGGTCACTGCAAAGTTAAATACTACGATTCATGAAAGCTCGTGAAGTTAAAGCTACCCTGCTGCAGTCTGTTAAAACCATCATCGGTACCCTGGTTCAGTCTTTCGTTCACGTTGTTCGTATCCGTTTCGCTATGTGCGGTTCTCCGCACCTGTTCCTGCTGAACGGTCCGGGTACCTGCTGCATCATCTCTTTCTGGCTGAAAATCATGGAACTGCTGCTGCCGCTGCTGGGTTCTTCTCACATCGTTTACGTTGAATCTCTGGCTCGTATCAACACCCCGTCTCTGACCGGTAAAATCCTGTACTGGGTTGTTGACGAATTCATCGTTCAGTGGCAGGAACTGCGTGACAACTACCTGCCGCGTTCTAAATGGTTCGGTATCCTGGTTTAA.
SEQIDNO:4alg14
MKTAYLASLVLIVSTAYVIRLIAILPFFHTQAGTEKDTKDGVNLLKIRSSKKPLKIFVFLGSGGHTGEMIRLLENYQDLLLGKSIVYLGYSDEASRQRFAHFIKKFGHCKVKYYEFMKAREVKATLLQSVKTIIGTLVQSFVHVVRIRFAMCGSPHLFLLNGPGTCCIISFWLKIMELLLPLLGSSHIVYVESLARINTPSLTGKILYWVVDEFIVQWQELRDNYLPRSKWFGILV*
优化的SEQIDNO:5algl密码子
ATGTTCCTGGAAATCCCGCGTTGGCTGCTGGCTCTGATCATCCTGTACCTGTCTATCCCGCTGGTTGTTTACTACGTTATCCCGTACCTGTTCTACGGTAACAAATCTACCAAAAAACGTATCATCATCTTCGTTCTGGGTGACGTTGGTCACTCTCCGCGTATCTGCTACCACGCTATCTCTTTCTCTAAACTGGGTTGGCAGGTTGAACTGTGCGGTTACGTTGAAGACACCCTGCCGAAAATCATCTCTTCTGACCCGAACATCACCGTTCACCACATGTCTAACCTGAAACGTAAAGGTGGTGGTACCTCTGTTATCTTCATGGTTAAAAAAGTTCTGTTCCAGGTTCTGTCTATCTTCAAACTGCTGTGGGAACTGCGTGGTTCTGACTACATCCTGGTTCAGAACCCGCCGTCTATCCCGATCCTGCCGATCGCTGTTCTGTACAAACTGACCGGTTGCAAACTGATCATCGACTGGCACAACCTGGCTTACTCTATCCTGCAGCTGAAATTCAAAGGTAACTTCTACCACCCGCTGGTTCTGATCTCTTACATGGTTGAAATGATCTTCTCTAAATTCGCTGACTACAACCTGACCGTTACCGAAGCTATGCGTAAATACCTGATCCAGTCTTTCCACCTGAACCCGAAACGTTGCGCTGTTCTGTACGACCGTCCGGCTTCTCAGTTCCAGCCGCTGGCTGGTGACATCTCTCGTCAGAAAGCTCTGACCACCAAAGCTTTCATCAAAAACTACATCCGTGACGACTTCGACACCGAAAAAGGTGACAAAATCATCGTTACCTCTACCTCTTTCACCCCGGACGAAGACATCGGTATCCTGCTGGGTGCTCTGAAAATCTACGAAAACTCTTACGTTAAATTCGACTCTTCTCTGCCGAAAATCCTGTGCTTCATCACCGGTAAAGGTCCGCTGAAAGAAAAATACATGAAACAGGTTGAAGAATACGACTGGAAACGTTGCCAGATCGAATTCGTTTGGCTGTCTGCTGAAGACTACCCGAAACTGCTGCAGCTGTGCGACTACGGTGTTTCTCTGCACACCTCTTCTTCTGGTCTGGACCTGCCGATGAAAATCCTGGACATGTTCGGTTCTGGTCTGCCGGTTATCGCTATGAACTACCCGGTTCTGGACGAACTGGTTCAGCACAACGTTAACGGTCTGAAATTCGTTGACCGTCGTGAACTGCACGAATCTCTGATCTTCGCTATGAAAGACGCTGACCTGTACCAGAAACTGAAAAAAAACGTTACCCAGGAAGCTGAAAACCGTTGGCAGTCTAACTGGGAACGTACCATGCGTGACCTGAAACTGATCCACTAA.
SEQIDNO:6algl
MFLEIPRWLLALIILYLSIPLVVYYVIPYLFYGNKSTKKRIIIFVLGDVGHSPRICYHAISFSKLGWQVELCGYVEDTLPKIISSDPNITVHHMSNLKRGGGTSVIFMVKVLFQVLSIFKLLWELRGSDYILVQNPPSIPILPIAVLYKLTGCKLIIDWHNLAYSILQLKFKGNFYHPLVLISYMVEMIFSKFADYNLTVTEAMRYLIQSFHLNPKRCAVLYDRPASQFQPLAGDISRQKALTTKAFIKYIRDDFDTEKGDKIIVTSTSFTPDEDIGILLGALKIYENSYVKFDSSLPKILCFITGKGPLKEKYMKQVEEYDWKRCQIEFVWLSAEDYPKLLQLCDYGVSLHTSSSGLDLPMKILDMFGSGLPVIAMNYPVLDELVQHNVNGLKFVDRRELHESLIFAMKDADLYQKLKKNVTQEAENRWQSNWERTMRDLKLIH*
优化的SEQIDNO:7alg2密码子
ATGATCGAAAAAGACAAACGTACCATCGCTTTCATCCACCCGGACCTGGGTATCGGTGGTGCTGAACGTCTGGTTGTTGACGCTGCTCTGGGTCTGCAGCAGCAGGGTCACTCTGTTATCATCTACACCTCTCACTGCGACAAATCTCACTGCTTCGAAGAAGTTAAAAACGGTCAGCTGAAAGTTGAAGTTTACGGTGACTTCCTGCCGACCAACTTCCTGGGTCGTTTCTTCATCGTTTTCGCTACCATCCGTCAGCTGTACCTGGTTATCCAGCTGATCCTGCAGAAAAAAGTTAACGCTTACCAGCTGATCATCATCGACCAGCTGTCTACCTGCATCCCGCTGCTGCACATCTTCTCTTCTGCTACCCTGATGTTCTACTGCCACTTCCCGGACCAGCTGCTGGCTCAGCGTGCTGGTCTGCTGAAAAAAATCTACCGTCTGCCGTTCGACCTGATCGAACAGTTCTCTGTTTCTGCTGCTGACACCGTTGTTGTTAACTCTAACTTCACCAAAAACACCTTCCACCAGACCTTCAAATACCTGTCTAACGACCCGGACGTTATCTACCCGTGCGTTGACCTGTCTACCATCGAAATCGAAGACATCGACAAAAAATTCTTCAAAACCGTTTTCAACGAAGGTGACCGTTTCTACCTGTCTATCAACCGTTTCGAAAAAAAAAAAGACGTTGCTCTGGCTATCAAAGCTTTCGCTCTGTCTGAAGACCAGATCAACGACAACGTTAAACTGGTTATCTGCGGTGGTTACGACGAACGTGTTGCTGAAAACGTTGAATACCTGAAAGAACTGCAGTCTCTGGCTGACGAATACGAACTGTCTCACACCACCATCTACTACCAGGAAATCAAACGTGTTTCTGACCTGGAATCTTTCAAAACCAACAACTCTAAAATCATCTTCCTGACCTCTATCTCTTCTTCTCTGAAAGAACTGCTGCTGGAACGTACCGAAATGCTGCTGTACACCCCGGCTTACGAACACTTCGGTATCGTTCCGCTGGAAGCTATGAAACTGGGTAAACCGGTTCTGGCTGTTAACAACGGTGGTCCGCTGGAAACCATCAAATCTTACGTTGCTGGTGAAAACGAATCTTCTGCTACCGGTTGGCTGAAACCGGCTGTTCCGATCCAGTGGGCTACCGCTATCGACGAATCTCGTAAAATCCTGCAGAACGGTTCTGTTAACTTCGAACGTAACGGTCCGCTGCGTGTTAAAAAATACTTCTCTCGTGAAGCTATGACCCAGTCTTTCGAAGAAAACGTTGAAAAAGTTATCTGGAAAGAAAAAAAATACTACCCGTGGGAAATCTTCGGTATCTCTTTCTCTAACTTCATCCTGCACATGGCTTTCATCAAAATCCTGCCGAACAACCCGTGGCCGTTCCTGTTCATGGCTACCTTCATGGTTCTGTACTTCAAAAACTACCTGTGGGGTATCTACTGGGCTTTCGTTTTCGCTCTGTCTTACCCGTACGAAGAAATCTAA
SEQIDNO:8alg2
MIEKDKRTIAFIHPDLGIGGAERLVVDAALGLQQQGHSVIIYTSHCDKSHCFEEVKNGQLKVEVYGDFLPTNFLGRFFIVFATIRQLYLVIQLILQKVNAYQLIIIDQLSTCIPLLHIFSSATLMFYCHFPDQLLAQRAGLLKKIYRLPFDLIEQFSVSAADTVVVNSNFTKTFHQTFKYLSNDPDVIYPCVDLSTIEIEDIDKFFKTVFNEGDRFYLSINRFEKKKDVALAIKAFALSEDQINDNVKLVICGGYDERVAENVEYLKELQSLADEYELSHTTIYYQEIKRVSDLESFKTNNSKIIFLTSISSSLKELLLERTEMLLYTPAYEHFGIVPLEAMKLGKPVLAVNNGGPLETIKSYVAGENESSATGWLKPAVPIQWATAIDESRKILQNGSVNFERNGPLRVKYFSREAMTQSFEENVEKVIWKEKKYYPWEIFGISFSNFILHMAFIKILPNNPWPFLFMATFMVLYFKYLWGIYWAFVFALSYPYEEI*
SEQIDNO:9alg11
ATGGGCAGTGCTTGGACAAACTACAATTTTGAAGAGGTTAAGTCTCATTTTGGGTTCAAAAAATATGTTGTATCATCTTTAGTACTAGTGTA
TGGACTAATTAAGGTTCTCACGTGGATCTTCCGTCAATGGGTGTATTCCAGCTTGAATCCGTTCTCCAAAAAATCTTCATTACTGAACAGAGCAGTTGCCTCCTGTGGTGAGAAGAATGTGAAAGTTTTTGGTTTTTTTCATCCGTATTGTAATGCTGGTGGTGGTGGGGAAAAAGTGCTCTGGAAAGCTGTAGATATCACTTTGAGAAAAGATGCTAAGAACGTTATTGTCATTTATTCAGGGGATTTTGTGAATGGAGAGAATGTTACTCCGGAGAATATTCTAAATAATGTGAAAGCGAAGTTCGATTACGACTTGGATTCGGATAGAATATTTTTCATTTCATTGAAGCTAAGATACTTGGTGGATTCTTCAACATGGAAGCATTTCACGTTGATTGGACAAGCAATTGGATCAATGATTCTCGCATTTGAATCCATTATTCAGTGTCCACCTGATATATGGATTGATACAATGGGGTACCCTTTCAGCTATCCTATTATTGCTAGGTTTTTGAGGAGAATTCCTATCGTCACATATACGCATTATCCGATAATGTCAAAAGACATGTTAAATAAGCTGTTCAAAATGCCCAAGAAGGGTATCAAAGTTTACGGTAAAATATTATACTGGAAAGTTTTTATGTTAATTTATCAATCCATTGGTTCTAAAATTGATATTGTAATCACAAACTCAACATGGACAAATAACCACATAAAGCAAATTTGGCAATCCAATACGTGTAAAATTATATATCCTCCATGCTCTACTGAGAAATTAGTAGATTGGAAGCAAAAGTTTGGTACTGCAAAGGGTGAGAGATTAAATCAAGCAATTGTGTTGGCACAATTTCGTCCTGAGAAACGTCATAAGTTAATCATTGAGTCCTTTGCAACTTTCTTGAAAAATTTACCGGATTCTGTATCGCCAATTAAATTGATAATGGCGGGGTCCACTAGATCCAAGCAAGATGAAAATTATGTTAAAAGTTTACAAGACTGGTCAGAAAATGTATTAAAAATTCCTAAACATTTGATATCATTCGAAAAAAATCTGCCCTTCGATAAGATTGAAATATTACTAAACAAATCTACTTTCGGTGTTAATGCCATGTGGAATGAGCACTTTGGAATTGCAGTTGTAGAGTATATGGCTTCCGGTTTGATCCCCATAGTTCATGCCTCGGCGGGCCCATTGTTAGATATAGTTACTCCATGGGATGCCAACGGGAATATCGGAAAAGCTCCACCACAATGGGAGTTACAAAAGAAATATTTTGCAAAACTCGAAGATGATGGTGAAACTACTGGATTTTTCTTTAAAGAGCCGAGTGATCCTGATTATAACACAACCAAAGATCCTCTGAGATACCCTAATTTGTCCGACCTTTTCTTACAAATTACGAAACTGGACTATGACTGCCTAAGGGTGATGGGCGCAAGAAACCAGCAGTATTCATTGTATAAATTCTCTGATTTGAAGTTTGATAAAGATTGGGAAAACTTTGTACTGAATCCTATTTGTAAATTATTAGAAGAGGAGGAAAGGGGCTGA
SEQIDNO:10Alg11蛋白质
MGSAWTNYNFEEVKSHFGFKYVVSSLVLVYGLIKVLTWIFRQWVYSSLNPFSKSSLLNRAVASCGEKNVKVFGFFHPYCNAGGGGEKVLWKAVDITLRKDAKNVIVIYSGDFVNGENVTPENILNNVKAKFDYDLDSDRIFFISLKLRYLVDSSTWKHFTLIGQAIGSMILAFESIIQCPPDIWIDTMGYPFSYPIIARFLRRIPIVTYTHYPIMSKDMLNKLFKMPKGIKVYGKILYWKVFMLIYQSIGSKIDIVITNSTWTNNHIKQIWQSNTCKIIYPPCSTEKLVDWKQKFGTAKGERLNQAIVLAQFRPEKRHKLIIESFATFLKLPDSVSPIKLIMAGSTRSKQDENYVKSLQDWSENVLKIPKHLISFEKNLPFDKIEILLNKSTFGVNAMWNEHFGIAVVEYMASGLIPIVHASAGPLLDIVTPWDANGNIGKAPPQWELQKYFAKLEDDGETTGFFFKEPSDPDYNTTKDPLRYPNLSDLFLQITKLDYDCLRVMGARNQQYSLYKFSDLKFDKDWENFVLNPICKLLEEEERG*
SEQIDNO:11malE(MBP)
AAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCGTATCACCAAGTAA
SEQIDNO:12MalE蛋白质(MBP)
KIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTRITK*
SEQIDNO:13mstX
ATGTTTTGTACATTTTTTGAAAAACATCACCGGAAGTGGGACATACTGTTAGAAAAAAGCACGGGTGTGATGGAAGCTATGAAAGTGACGAGTGAGGAAAAGGAACAGCTGAGCACAGCAATCGACCGAATGAATGAAGGACTGGACGCGTTTATCCAGCTGTATAATGAATCGGAAATTGATGAACCGCTTATTCAGCTTGATGATGATACAGCCGAGTTAATGAAGCAGGCCCGAGATATGTACGGCCAGGAAAAGCTAAATGAGAAATTAAATACAATTATTAAACAGATTTTATCCATCTCAGTATCTGAAGAAGGAGAAAAAGAA
SEQIDNO:14MstX蛋白质
MFCTFFEKHHRKWDILLEKSTGVMEAMKVTSEEKEQLSTAIDRMNEGLDAFIQLYNESEIDEPLIQLDDDTAELMKQARDMYGQEKLNEKLNTIIKQILSISVSEEGEKE*
SEQIDNO:15GnTI(EC2.4.1.101)
GCGACACAGTCAGAATATGCAGATCGCCTTGCTGCTGCAATTGAAGCAGAAAATCATTGTACAAGCCAGACCAGATTGCTTATTGACCAGATTAGCCTGCAGCAAGGAAGAATAGTTGCTCTTGAAGAACAAATGAAGCGTCAGGACCAGGAGTGCCGACAATTAAGGGCTCTTGTTCAGGATCTTGAAAGTAAGGGCATAAAAAAGTTGATCGGAAATGTACAGATGCCAGTGGCTGCTGTAGTTGTTATGGCTTGCAATCGGGCTGATTACCTGGAAAAGACTATTAAATCCATCTTAAAATACCAAATATCTGTTGCGTCAAAATATCCTCTTTTCATATCCCAGGATGGATCACATCCTGATGTCAGGAAGCTTGCTTTGAGCTATGATCAGCTGACGTATATGCAGCACTTGGATTTTGAACCTGTGCATACTGAAAGACCAGGGGAGCTGATTGCATACTACAAAATTGCACGTCATTACAAGTGGGCATTGGATCAGCTGTTTTACAAGCATAATTTTAGCCGTGTTATCATACTAGAAGATGATATGGAAATTGCCCCTGATTTTTTTGACTTTTTTGAGGCTGGAGCTACTCTTCTTGACAGAGACAAGTCGATTATGGCTATTTCTTCTTGGAATGACAATGGACAAATGCAGTTTGTCCAAGATCCTTATGCTCTTTACCGCTCAGATTTTTTTCCCGGTCTTGGATGGATGCTTTCAAAATCTACTTGGGACGAATTATCTCCAAAGTGGCCAAAGGCTTACTGGGACGACTGGCTAAGACTCAAAGAGAATCACAGAGGTCGACAATTTATTCGCCCAGAAGTTTGCAGAACATATAATTTTGGTGAGCATGGTTCTAGTTTGGGGCAGTTTTTCAAGCAGTATCTTGAGCCAATTAAACTAAATGATGTCCAGGTTGATTGGAAGTCAATGGACCTTAGTTACCTTTTGGAGGACAATTACGTGAAACACTTTGGTGACTTGGTTAAAAAGGCTAAGCCCATCCATGGAGCTGATGCTGTCTTGAAAGCATTTAACATAGATGGTGATGTGCGTATTCAGTACAGAGATCAACTAGACTTTGAAAATATCGCACGGCAATTTGGCATTTTTGAAGAATGGAAGGATGGTGTACCACGTGCAGCATATAAAGGAATAGTAGTTTTCCGGTACCAAACGTCCAGACGTGTATTCCTTGTTGGCCATGATTCGCTTCAACAACTCGGAATTGAAGATACTTAA
SEQIDNO:16GnTI蛋白质
ATQSEYADRLAAAIEAENHCTSQTRLLIDQISLQQGRIVALEEQMKRQDQECRQLRALVQDLESKGIKKLIGNVQMPVAAVVVMACNRADYLEKTIKSILKYQISVASKYPLFISQDGSHPDVRKLALSYDQLTYMQHLDFEPVHTERPGELIAYYKIARHYKWALDQLFYKHNFSRVIILEDDMEIAPDFFDFFEAGATLLDRDKSIMAISSWNDNGQMQFVQDPYALYRSDFFPGLGWMLSKSTWDELSPKWPKAYWDDWLRLKENHRGRQFIRPEVCRTYNFGEHGSSLGQFFKQYLEPIKLNDVQVDWKSMDLSYLLEDNYVKHFGDLVKKAKPIHGADAVLKAFNIDGDVRIQYRDQLDFENIARQFGIFEEWKDGVPRAAYKGIVVFRYQTSRRVFLVGHDSLQQLGIEDT*
SEQIDNO:17GnTII(EC2.4.1.143)
ATGCGCTTTCGTATCTATAAACGTAAAGTGCTGATCCTGACACTGGTTGTTGCCGCTTGTGGTTTTGTTCTGTGGAGCAGTAATGGTCGTCAGCGTAAAAATGAAGCCCTGGCACCTCCTCTGCTGGATGCTGAACCGGCACGTGGTGCTGGCGGTCGTGGTGGTGATCATCCGTCTGTTGCCGTTGGTATTCGTCGTGTGAGCAATGTTTCGGCTGCCTCTCTGGTCCCGGCTGTTCCTCAACCTGAAGCTGATAACCTGACCCTGCGCTATCGCTCTCTGGTGTATCAACTGAACTTCGATCAAACTCTGCGTAACGTGGATAAAGCAGGCACATGGGCTCCTCGTGAACTGGTACTGGTAGTCCAGGTCCATAATCGTCCGGAATATCTGCGTCTGCTGCTGGATTCTCTGCGCAAAGCTCAAGGCATCGATAATGTCCTGGTCATCTTCTCTCATGATTTCTGGAGCACGGAGATTAACCAGCTGATTGCCGGCGTGAATTTTTGTCCTGTGCTGCAGGTGTTTTTTCCGTTTTCTATCCAACTGTATCCGAACGAATTTCCGGGTTCTGATCCTCGTGATTGTCCTCGTGATCTGCCTAAAAATGCCGCTCTGAAACTGGGCTGTATTAATGCCGAGTATCCTGATTCTTTTGGCCACTATCGTGAGGCGAAATTTTCTCAGACCAAACATCATTGGTGGTGGAAACTGCATTTCGTGTGGGAACGTGTGAAAATCCTGCGCGACTATGCTGGCCTGATTCTGTTTCTGGAAGAAGATCACTATCTGGCTCCGGACTTTTATCATGTGTTCAAAAAAATGTGGAAACTGAAACAGCAGGAATGTCCAGAATGTGATGTGCTGTCACTGGGCACCTATAGTGCTTCTCGCTCCTTCTATGGTATGGCCGACAAAGTGGACGTTAAAACATGGAAATCCACCGAGCACAACATGGGTCTGGCACTGACTCGTAATGCCTATCAAAAACTGATTGAGTGTACCGACACCTTTTGTACGTATGATGACTATAACTGGGACTGGACCCTGCAATATCTGACCGTGAGCTGTCTGCCAAAATTTTGGAAAGTTCTGGTGCCTCAGATTCCTCGTATCTTTCATGCTGGCGACTGTGGTATGCACCATAAAAAAACTTGCCGTCCGTCAACACAATCTGCTCAGATCGAGTCGCTGCTGAATAATAACAAACAGTATATGTTCCCGGAGACTCTGACAATTTCTGAAAAATTCACCGTGGTCGCCATTTCTCCGCCTCGTAAAAATGGAGGTTGGGGCGATATCCGTGACCATGAACTGTGTAAAAGCTATCGTCGTCTGCAGTGA
SEQIDNO:18GnTII(EC2.4.1.143)
MRFRIYKRVLILTLVVAACGFVLWSSNGRQRNEALAPPLLDAEPARGAGGRGGDHPSVAVGIRRVSNVSAASLVPAVPQPEADNLTLPvYPvSLVYQLNFDQTLRNVDKAGTWAPRELVLVVQVHNRPEYLRLLLDSLRKAQGIDNVLVIFSHDFWSTEINQLIAGVNFCPVLQVFFPFSIQLYPNEFPGSDPRDCPRDLPKNAALKLGCINAEYPDSFGHYREAKFSQTKHHWWWKLHFVWERVKILRDYAGLILFLEEDHYLAPDFYHVFKKMWKLKQQECPECDVLSLGTYSASRSFYGMADKVDVKTWKSTEHNMGLALTRNAYQKLIECTDTFCTYDDYNWDWTLQYLTVSCLPKFWKVLVPQIPRIFHAGDCGMHHKTCRPSTQSAQIESLLNNKQYMFPETLTISEKFTVVAISPPRNGGWGDIRDHELCKSYRLQ*
SEQIDNO:19GnTIV(EC2.4.1.145)
TTGAAAGAACTGACGTCCAAAAAGAGCTTGCAAGTCCCGTCCATCTACTATCACTTGCCGCACTTGCTGCAAAACGAGGGCTCTTTGCAACCGGCAGTTCAGATCGGCAATGGTCGCACCGGCGTGAGCATTGTTATGGGTATCCCGACCGTGAAACGTGAAGTGAAAAGCTATCTGATTGAAACGCTGCATAGCCTGATCGATAACCTGTACCCGGAAGAAAAACTGGACTGCGTGATTGTCGTTTTCATTGGTGAAACCGACACGGATTATGTGAATGGCGTTGTTGCCAATCTGGAAAAAGAGTTCAGCAAAGAGATCAGCAGCGGCCTGGTTGAGATCATTTCTCCGCCGGAGAGCTATTACCCGGATCTGACGAACCTGAAAGAAACCTTCGGTGATAGCAAAGAGCGTGTCCGTTGGCGCACTAAGCAGAACCTGGACTATTGTTTTCTGATGATGTACGCGCAAGAAAAGGGTACGTATTACATCCAACTGGAGGACGACATTATTGTGAAGCAAAACTACTTCAACACCATTAAGAACTTCGCGCTGCAGCTGAGCAGCGAAGAGTGGATGATTCTGGAGTTCAGCCAGCTGGGCTTCATTGGCAAGATGTTTCAGGCACCGGACTTGACCCTGATCGTGGAGTTTATCTTTATGTTCTACAAAGAGAAACCGATCGATTGGCTGCTGGATCATATCCTGTGGGTCAAGGTCTGCAATCCGGAAAAAGATGCCAAGCATTGTGACCGCCAGAAAGCGAATCTGCGTATTCGTTTTCGTCCTAGCCTGTTCCAACACGTGGGTCTGCACAGCTCTCTGACCGGTAAGATCCAAAAGCTGACCGACAAAGATTACATGAAACCGCTGCTGCTGAAGATCCATGTCAACCCGCCAGCAGAGGTGAGCACCTCGCTGAAAGTCTACCAGGGTCACACTCTGGAGAAAACCTATATGGGCGAGGACTTCTTTTGGGCGATTACGCCTGTTGCGGGTGACTATATCTTGTTTAAGTTTGACAAGCCGGTTAATGTAGAGAGCTACTTGTTTCATAGCGGTAACCAGGATCACCCAGGTGACATTCTGCTGAACACCACCGTTGAAGTGTTGCCGCTGAAAAGCGAAGGTCTGGATATTTCGAAAGAAACGAAGGATAAGCGTCTGGAGGATGGTTACTTCCGTATCGGCAAGTTCGAGAATGGCGTGGCTGAAGGTATGGTCGACCCGAGCCTGAACCCGATTTCCGCATTTCGCCTGTCCGTCATCCAGAATAGCGCGGTTTGGGCTATCCTGAATGAGATTCACATCAAAAAGGTTACGAATTAA
SEQIDNO:20GnTIV(EC2.4.1.145)
ILKELTSKSLQVPSIYYHLPHLLQNEGSLQPAVQIGNGRTGVSIVMGIPTVKREVKSYLIETLHSLIDNLYPEEKLDCVIVVFIGETDTDYVNGVVANLEKEFSKEISSGLVEIISPPESYYPDLTNLKETFGDSKERVRWRTKQNLDYCFLMMYAQEKGTYYIQLEDDIIVKQNYFNTIKFALQLSSEEWMILEFSQLGFIGKMFQAPDLTLIVEFIFMFYKEKPIDWLLDHILWVKVCNPEKDAKHCDRQKANRIRFRPSLFQHVGLHSSLTGKIQKLTDKDYMKPLLLKIHVNPPAEVSTSLKVYQGHTLEKTYMGEDFFWAITPVAGDYILFKFDKPVNVESYLFHSGNQDHPGDILLNTTVEVLPLKSEGLDISKETKDKRLEDGYFRIGKFENGVAEGMVDPSLNPISAFRLSVIQNSAVWAILNEIHIKVTN*
SEQIDNO:21GalT(EC2.4.1.38)
ATGCGTGTCTTTATTATCAGTCTGAACCAGAAAGTGTGTGACAAATTCGGCCTGGTGTTTCGTGATACCACAACCCTGCTGAATAACATCAATGCCACCCGCCACAAAGCACAGATTTTTGACGCCGTCTATAGCAAAACGTTCGAAGGTGGGCTGCATCCACTGGTGAAAAAACATCTGCACCCGTATTTCATTACCCAGAACATCAAAGACATGGGCATTACCACCAACCTGATTAGCGGTGTATCCAAATTCTATTATGCTCTGAAATATCACGCCAAATTCATGAGCCTGGGCGAACTGGGCTGTTATGCCAGCCATTATAGCCTGTGGGAGAAATGTATTGAGCTGAACGAGGCCATTTGTATCCTGGAAGATGACATTACGCTGAAAGAAGATTTCAAAGAGGGCCTGGATTTCCTGGAAAAACACATTCAGGAGCTGGGCTATGTTCGTCTGATGCATCTGCTGTATGATGCCTCCGTTAAAAGCGAACCTCTGTCCCATAAAAACCACGAGATTCAAGAGCGTGTCGGGATCATTAAAGCTTATAGTCACGGTGTTGGCACTCAGGGATATGTGATTACTCCGAAAATTGCCAAAGTGTTCAAAAAATGCTCCCGTAAATGGGTTGTTCCGGTGGATACGATCATGGATGCCACGTTTATTCATGGGGTGAAAAACCTGGTACTGCAACCGTTTGTGATTGCCGATGATGAGCAAATTTCCACGATTGTCCGTAAAGAGGAGCCGTATTCCCCTAAAATTGCCCTGATGCGCGAACTGCACTTCAAATATCTGAAATATTGGCAGTTTGTGTGA
SEQIDNO:22GalT(EC2.4.1.38)
MRVFIISLNQKVCDKFGLVFRDTTTLLNNINATRHKAQIFDAVYSKTFEGGLHPLVKKHLHPYFITQNIKDMGITTNLISGVSKFYYALKYHAKFMSLGELGCYASHYSLWEKCIELNEAICILEDDITLKEDFKEGLDFLEKHIQELGYVRLMHLLYDASVKSEPLSHKNHEIQERVGIIKAYSHGVGTQGYVITPKIAKVFKKCSRKWVVPVDTIMDATFIHGVKLVLQPFVIADDEQISTIVRKEEPYSPKIALMRELHFKYLKYWQFV*
SEQIDNO:23manB(EC5.4.2.8)
ATGAAAAAATTAACCTGCTTTAAAGCCTATGATATTCGCGGGAAATTAGGCGAAGAACTGAATGAAGATATCGCCTGGCGCATTGGTCGCGCCTATGGCGAATTTCTCAAACCGAAAACCATTGTGTTAGGCGGTGATGTCCGCCTCACCAGCGAAACCTTAAAACTGGCGCTGGCGAAAGGTTTACAGGATGCGGGCGTTGACGTGCTGGATATTGGTATGTCCGGCACCGAAGAGATCTATTTCGCCACGTTCCATCTCGGCGTGGATGGCGGCATTGAAGTTACCGCCAGCCATAATCCGATGGATTATAACGGCATGAAGCTGGTTCGCGAGGGGGCTCGCCCGATCAGCGGAGATACCGGACTGCGCGACGTCCAGCGTCTGGCTGAAGCCAACGACTTTCCTCCCGTCGATGAAACCAAACGCGGTCGCTATCAGCAATCAACCTGCGTGACGCTTACGTTGATCACCTGTTCGGTTATATCAATGTCAAAAACCTCACGCCGCTCAAGCTGGTGATCAACTCCGGGAACGGCGCAGCGGGTCCGGTGGTGGACGCCATTGAAGCCCGCTTTAAAGCCCTCGGCGCGCCCGTGGAATTAATCAAAGTGCACAACACGCCGGACGGCAATTTCCCCAACGGTATTCCTAACCCACTACTGCCGGAATGCCGCGACGACACCCGCAATGCGGTCATCAAACACGGCGCGGATATGGGCATTGCTTTTGATGGCGATTTTGACCGCTGTTTCCTGTTTGACGAAAAAGGGCAGTTTATTGAGGGCTACTACATTGTCGGCCTGTTGGCAGAAGCATTCCTCGAAAAAAATCCCGGCGCGAAGATCATCCACGATCCACGTCTCTCCTGGAACACCGTTGATGTGGTGACTGCCGCAGGTGGCACGCCGGTAATGTCGAAAACCGGACACGCCTTTATTAAAGAACGTATGCGCAAGGAAGACGCCATCTATGGTGGCGAAATGAGCGCCCACCATTACTTCCGTGATTTCGCTTACTGCGACAGCGGCATGATCCCGTGGCTGCTGGTCGCCGAACTGGTGTGCCTGAAAGATAAAACGCTGGGCGAACTGGTACGCGACCGGATGGCGGCGTTTCCGGCAAGCGGTGAGATCAACAGCAAACTGGCGCAACCCGTTGAGGCGATTAACCGCGTGGAACAGCATTTTAGCCGTGAGGCGCTGGCGGTGGATCGCACCGATGGCATCAGCATGACCTTTGCCGACTGGCGCTTTAACCTGCGCACCTCCAATACCGAACCGGTGGTGCGCCTGAATGTGGAATCGCGCGGTGATGTGCCGCTGATGGAAGCGCGAACGCGAACTCTGCTGACGTTGCTGAACGAGTAA
SEQIDNO:24manB(EC5.4.2.8)
MKKLTCFKAYDIRGKLGEELNEDIAWRIGRAYGEFLKPKTIVLGGDVRLTSETLKLALAKGLQDAGVDVLDIGMSGTEEIYFATFHLGVDGGIEVTASHNPMDYNGMKLVREGARPISGDTGLRDVQRLAEANDFPPVDETKRGRYQQINLRDAYVDHLFGYINVKLTPLKLVINSGNGAAGPVVDAIEARFKALGAPVELIKVHNTPDGNFPNGIPNPLLPECRDDTRNAVIKHGADMGIAFDGDFDRCFLFDEKGQFIEGYYIVGLLAEAFLEKPGAKIIHDPRLSWNTVDVVTAAGGTPVMSKTGHAFIKERMRKEDAIYGGEMSAHHYFRDFAYCDSGMIPWLLVAELVCLKDKTLGELVRDRMAAFPASGEINSKLAQPVEAINRVEQHFSREALAVDRTDGISMTFADWRFNLRTSNTEPVVRLNVESRGDVPLMEARTRTLLTLLNE*
SEQIDNO:25manC(EC2.7.7.13)
ATGGCGCAGTCGAAACTCTATCCAGTTGTGATGGCAGGTGGCTCCGGTAGCCGCTTATGGCCGCTTTCCCGCGTACTTTATCCCAAGCAGTTTTTATGCCTGAAAGGCGATCTCACCATGCTGCAAACCACCATCTGCCGCCTGAACGGCGTGGAGTGCGAAAGCCCGGTGGTGATTTGCAATGAGCAGCACCGCTTTATTGTCGCGGAACAGCTGCGTCAACTGAACAAACTTACCGAGAACATTATTCTCGAACCGGCAGGGCGAAACACGGCACCTGCCATTGCGCTGGCGGCGCTGGCGGCAAAACGTCATAGCCCGGAGAGCGACCCGTTAATGCTGGTATTGGCGGCGGATCATGTGATTGCCGATGAAGACGCGTTCCGTGCCGCCGTGCGTAATGCCATGCCATATGCCGAAGCGGGCAAGCTGGTGACCTTCGGCATTGTGCCGGATCTACCAGAAACCGGTTATGGCTATATTCGTCGCGGTGAAGTGTCTGCGGGTGAGCAGGATATGGTGGCCTTTGAAGTGGCGCAGTTTGTCGAAAAACCGAATCTGGAAACCGCTCAGGCCTATGTGGCAAGCGGCGAATATTACTGGAACAGCGGTATGTTCCTGTTCCGCGCCGGACGCTATCTCGAAGAACTGAAAAAATATCGCCCGGATATCCTCGATGCCTGTGAAAAAGCGATGAGCGCCGTCGATCCGGATCTCAATTTTATTCGCGTGGATGAAGAAGCGTTTCTCGCCTGCCCGGAAGAGTCGGTGGATTACGCGGTCATGGAACGTACGGCAGATGCTGTTGTGGTGCCGATGGATGCGGGCTGGAGCGATGTTGGCTCCTGGTCTTCATTATGGGAGATCAGCGCCCACACCGCCGAGGGCAACGTTTGCCACGGCGATGTGATTAATCACAAAACTGAAAACAGCTATGTGTATGCTGAATCTGGCCTGGTCACCACCGTCGGGGTGAAAGATCTGGTAGTGGTGCAGACCAAGATGCGGTGCTGATTGCCGACCGTAACGCGGTACAGGATGTGAAAAAAGTGGTCGAGCAGATCAAAGCCGATGGTCGCCATGAGCATCGGGTGCATCGCGAAGTGTATCGTCCGTGGGGCAAATATGACTCTATCGACGCGGGCGACCGCTACCAGGTGAAACGCATCACCGTGAAACCGGGCGAGGGCTTGTCGGTACAGATGCACCATCACCGCGCGGAACACTGGGTGGTTGTCGCGGGAACGGCAAAAGTCACCATTGATGGTGATATCAAACTGCTTGGTGAAAACGAGTCCATTTATATTCCGCTGGGGGCGACGCATTGCCTGGAAAACCCGGGGAAAATTCCGCTCGATTTAATTGAAGTGCGCTCCGGCTCTTATCTCGAAGAGGATGATGTGGTGCGTTTCGCGGATCGCTACGGACGGGTGTAA
SEQIDNO:26manC(EC2.7.7.13)
MAQSKLYPVVMAGGSGSRLWPLSRVLYPKQFLCLKGDLTMLQTTICRLNGVECESPVVICNEQHRFIVAEQLRQLNKLTENIILEPAGRNTAPAIALAALAAKRHSPESDPLMLVLAADHVIADEDAFRAAVRNAMPYAEAGKLVTFGIVPDLPETGYGYIRRGEVSAGEQDMVAFEVAQFVEKPNLETAQAYVASGEYYWNSGMFLFRAGRYLEELKYRPDILDACEKAMSAVDPDLNFIRVDEEAFLACPEESVDYAVMERTADAVVVPMDAGWSDVGSWSSLWEISAHTAEGNVCHGDVINHKTENSYVYAESGLVTTVGVKDLVVVQTKDAVLIADRNAVQDVKVVEQIKADGRHEHRVHREVYRPWGKYDSIDAGDRYQVKRITVKPGEGLSVQMHHHRAEHWVVVAGTAKVTIDGDIKLLGENESIYIPLGATHCLENPGKIPLDLIEVRSGSYLEEDDVVRFADRYGRV*
SEQIDNO:27glmS(EC2.6.1.16)
ATGTGTGGAATTGTTGGCGCGATCGCGCAACGTGATGTAGCAGAAATCCTTCTTGAAGGTTTACGTCGTCTGGAATACCGCGGATATGACTCTGCCGGTCTGGCCGTTGTTGATGCAGAAGGTCATATGACCCGCCTGCGTCGCCTCGGTAAAGTCCAGATGCTGGCACAGGCAGCGGAAGAACATCCTCTGCATGGCGGCACTGGTATTGCTCACACTCGCTGGGCGACCCACGGTGAACCTTCAGAAGTGAATGCGCATCCGCATGTTTCTGAACACATTGTGGTGGTGCATAACGGCATCATCGAAAACCATGAACCGCTGCGTGAAGAGCTAAAAGCGCGTGGCTATACCTTCGTTTCTGAAACCGACACCGAAGTGATTGCCCATCTGGTGAACTGGGAGCTGAAACAAGGCGGGACTCTGCGTGAGGCCGTTCTGCGTGCTATCCCGCAGCTGCGTGGTGCGTACGGTACAGTGATCATGGACTCCCGTCACCCGGATACCCTGCTGGCGGCACGTTCTGGTAGTCCGCTGGTGATTGGCCTGGGGATGGGCGAAAACTTTATCGCTTCTGACCAGCTGGCGCTGTTGCCGGTGACCCGTCGCTTTATCTTCCTTGAAGAGGGCGATATTGCGGAAATCACTCGCCGTTCGGTAAACATCTTCGATAAAACTGGCGCGGAAGTAAAACGTCAGGATATCGAATCCAATCTGCAATATGACGCGGGCGATAAAGGCATTTACCGTCACTACATGCAGAAAGAGATCTACGAACAGCCGAACGCGATCAAAAACACCCTTACCGGACGCATCAGCCACGGTCAGGTTGATTTAAGCGAGCTGGGACCGAACGCCGACGAACTGCTGTCGAAGGTTGAGCATATTCAGATCCTCGCCTGTGGTACTTCTTATAACTCCGGTATGGTTTCCCGCTACTGGTTTGAATCGCTAGCAGGTATTCCGTGCGACGTCGAAATCGCCTCTGAATTCCGCTATCGCAAATCTGCCGTGCGTCGTAACAGCCTGATGATCACCTTGTCACAGTCTGGCGAAACCGCGGATACCCTGGCTGGCCTGCGTCTGTCGAAAGAGCTGGGTTACCTTGGTTCACTGGCAATCTGTAACGTTCCGGGTTCTTCTCTGGTGCGCGAATCCGATCTGGCGCTAATGACCAACGCGGGTACAGAAATCGGCGTGGCATCCACTAAAGCATTCACCACTCAGTTAACTGTGCTGTTGATGCTGGTGGCGAAGCTGTCTCGCCTGAAAGGTCTGGATGCCTCCATTGAACATGACATCGTGCATGGTCTGCAGGCGCTGCCGAGCCGTATTGAGCAGATGCTGTCTCAGGACAAACGCATTGAAGCGCTGGCAGAAGATTTCTCTGACAAACATCACGCGCTGTTCCTGGGCCGTGGCGATCAGTACCCAATCGCGCTGGAAGGCGCATTGAAGTTGAAAGAGATCTCTTACATTCACGCTGAAGCCTACGCTGCTGGCGAACTGAAACACGGTCCGCTGGCGCTAATTGATGCCGATATGCCGGTTATTGTTGTTGCACCGAACAACGAATTGCTGGAAAAACTGAAATCCAACATTGAAGAAGTTCGCGCGCGTGGCGGTCAGTTGTATGTCTTCGCCGATCAGGATGCGGGTTTTGTAAGTAGCGATAACATGCACATCATCGAGATGCCGCATGTGGAAGAGGTGATTGCACCGATCTTCTACACCGTTCCGCTGCAGCTGCTGGCTTACCATGTCGCGCTGATCAAAGGCACCGACGTTGACCAGCCGCGTAACCTGGCAAAATCGGTTACGGTTGAGTAA
SEQIDNO:28glmS(EC2.6.1.16)
MCGIVGAIAQRDVAEILLEGLRRLEYRGYDSAGLAVVDAEGHMTRLRRLGKVQMLAQAAEEHPLHGGTGIAHTRWATHGEPSEVNAHPHVSEHIVVVHNGIIENHEPLREELKARGYTFVSETDTEVIAHLVNWELKQGGTLREAVLRAIPQLRGAYGTVIMDSRHPDTLLAARSGSPLVIGLGMGENFIASDQLALLPVTRRFIFLEEGDIAEITRRSVNIFDKTGAEVKRQDIESNLQYDAGDKGIYRHYMQKEIYEQPNAIKNTLTGRISHGQVDLSELGPNADELLSKVEHIQILACGTSYNSGMVSRYWFESLAGIPCDVEIASEFRYRKSAVRRNSLMITLSQSGETADTLAGLRLSKELGYLGSLAICNVPGSSLVRESDLALMTNAGTEIGVASTKAFTTQLTVLLMLVAKLSRLKGLDASIEHDIVHGLQALPSRIEQMLSQDKRIEALAEDFSDKHHALFLGRGDQYPIALEGALKLKEISYIHAEAYAAGELKHGPLALIDADMPVIVVAPNELLEKLKSNIEEVRARGGQLYVFADQDAGFVSSDNMHIIEMPHVEEVIAPIFYTVPLQLLAYHVALIKGTDVDQPRNLAKSVTVE*
SEQIDNO:29(EC2.4.99.1)ST6
ATGAAAAAAATCCTGACCGTGCTGTCCATCTTTATCCTGTCTGC
CTGTAATAGCGACAATACCAGCCTGAAAGAGACTGTTAGCAGCAATTCAGCGGATGTTGTGGAAACCGAAACTTATCAACTGACGCCGATCGATGCTCCTTCTTCGTTCCTGAGCCATTCTTGGGAACAGACCTGTGGTACACCAATTCTGAACGAGTCCGACAAACAGGCCATTTCCTTCGATTTTGTTGCCCCGGAACTGAAACAAGACGAGAAATATTGCTTCACCTTCAAAGGCATTACCGGTGATCATCGTTATATCACGAACACCACTCTGACTGTCGTAGCACCGACACTGGAAGTGTATATCGACCATGCCAGCCTGCCTAGTCTGCAGCAACTGATCCATATTATCCAGGCGAAAGACGAATATCCGAGCAACCAGCGTTTTGTGAGCTGGAAACGTGTTACTGTGGATGCCGACAACGCCAATAAACTGAACATTCACACCTATCCTCTGAAAGGCAATAACACCAGCCCTGAGATGGTAGCGGCGATTGATGAGTATGCCCAGAGCAAAAACCGTCTGAACATTGAGTTCTATACCAATACGGCCCACGTGTTTAATAACCTGCCGCCAATCATTCAACCTCTGTATAACAACGAGAAAGTGAAAATCAGCCACATTTCGCTGTATGATGATGGCAGTAGCGAGTATGTTAGCCTGTATCAGTGGAAAGACACCCCGAATAAAATCGAGACTCTGGAGGGTGAAGTTTCTCTGCTGGCCAACTATCTGGCCGGTACAAGTCCTGATGCTCCGAAAGGGATGGGTAACCGCTATAATTGGCACAAACTGTATGACACCGACTATTATTTTCTGCGCGAGGATTATCTGGACGTGGAAGCCAATCTGCATGATCTGCGCGATTATCTGGGTTCTAGCGCCAAACAAATGCCGTGGGATGAATTTGCTAAACTGTCCGATTCTCAGCAAACCCTGTTCCTGGACATCGTTGGCTTTGATAAAGAGCAGCTGCAACAGCAGTATAGCCAGTCACCGCTGCCGAACTTCATTTTTACTGGCACCACCACATGGGCAGGGGGTGAGACAAAAGAGTATTATGCTCAACAACAGGTGAACGTCATCAACAATGCCATTAACGAAACCTCCCCATATTATCTGGGTAAAGACTATGACCTGTTCTTTAAAGGCCATCCGGCTGGAGGAGTGATTAATGATATTATCCTGGGCTCCTTTCCTGACATGATTAACATTCCGGCGAAAATCTCATTTGAGGTGCTGATGATGACTGATATGCTGCCGGATACCGTTGCTGGAATTGCCTCTTCCCTGTATTTCACCATTCCTGCCGACAAAGTGAACTTCATCGTGTTCACCAGCAGTGATACCATTACAGACCGTGAAGAAGCGCTGAAATCTCCTCTGGTTCAGGTGATGCTGACACTGGGTATCGTGAAAGAAAAAGACGTCCTGTTTTGGGCCGACCATAAAGTGAATAGCATGGAGGTGGCCATCGACGAAGCGTGTACTCGTATTATCGCCAAACGTCAGCCTACCGCTTCAGATCTGCGTCTGGTTATCGCCATTATCAAAACGATCACCGATCTGGAGCGTATTGGAGATGTTGCCGAAAGCATTGCCAAAGTTGCCCTGGAGAGCTTTTCTAACAAACAGTATAATCTGCTGGTCAGCCTGGAATCTCTGGGTCAACACACCGTTCGTATGCTGCATGAAGTGCTGGATGCTTTTGCCCGTATGGATGTGAAAGCAGCCATTGAAGTCTATCAGGAGGATGACCGTATCGATCAGGAATATGAGAGCATTGTCCGTCAACTGATGGCCCATATGATGGAAGATCCGTCTAGCATTCCGAATGTGATGAAAGTGATGTGGGCAGCTCGTAGTATTGAACGTGTGGGTGACCGCTGCCAGAACATTTGTGAGTATTCATCTATTTCGTAAAAGGCAAAGATGTTCGCCACACCAAACCGGATGACTTCGGTACTATGCTGGACTGA
SEQIDNO:30(EC2.4.99.1)ST6
MKKILTVLSIFILSACNSDNTSLKETVSSNSADVVETETYQLTPIDAP
SSFLSHSWEQTCGTPILNESDKQAISFDFVAPELKQDEKYCFTFKGITGDHRYI
TNTTLTVVAPTLEVYIDHASLPSLQQLIHIIQAKDEYPSNQRFVSWKRVTVDADNANKLNIHTYPLKGNNTSPEMVAAIDEYAQSKNRLNIEFYTNTAHVFNNLPPIIQPLYNNEKVKISHISLYDDGSSEYVSLYQWKDTPNKIETLEGEVSLLANYLAGTSPDAPKGMGNRYNWHKLYDTDYYFLPvEDYLDVEANLHDLRDYLGSSAKQMPWDEFAKLSDSQQTLFLDIVGFDKEQLQQQYSQSPLPNFIFTGTTTWAGGETKEYYAQQQVNVINNAINETSPYYLGKDYDLFFKGHPAGGVINDIILGSFPDMINIPAKISFEVLMMTDMLPDTVAGIASSLYFTIPADKVNFIVFTSSDTITDREEALKSPLVQVMLTLGIVKEKDVLFWADHKVNSMEVAIDEACTRIIAKRQPTASDLRLVIAIIKTITDLERIGDVAESIAKVALESFSNKQYNLLVSLESLGQHTVRMLHEVLDAFARMDVKAAIEVYQEDDRIDQEYESIVRQLMAHMMEDPSSIPNVMKVMWAARSIERVGDRCQNICEYIIYFVKGKDVRHTKPDDFGTMLD*
SEQIDNO:31MBP-GnTI融合物
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCGTATCACCAAGGCGACACAGTCAGAATATGCAGATCGCCTTGCTGCTGCAATTGAAGCAGAAAATCATTGTACAAGCCAGACCAGATTGCTTATTGACCAGATTAGCCTGCAGCAAGGAAGAATAGTTGCTCTTGAAGAACAAATGAAGCGTCAGGACCAGGAGTGCCGACAATTAAGGGCTCTTGTTCAGGATCTTGAAAGTAAGGGCATAAAAAAGTTGATCGGAAATGTACAGATGCCAGTGGCTGCTGTAGTTGTTATGGCTTGCAATCGGGCTGATTACCTGGAAAAGACTATTAAATCCATCTTAAAATACCAAATATCTGTTGCGTCAAAATATCCTCTTTTCATATCCCAGGATGGATCACATCCTGATGTCAGGAAGCTTGCTTTGAGCTATGATCAGCTGACGTATATGCAGCACTTGGATTTTGAACCTGTGCATACTGAAAGACCAGGGGAGCTGATTGCATACTACAAAATTGCACGTCATTACAAGTGGGCATTGGATCAGCTGTTTTACAAGCATAATTTTAGCCGTGTTATCATACTAGAAGATGATATGGAAATTGCCCCTGATTTTTTTGACTTTTTTGAGGCTGGAGCTACTCTTCTTGACAGAGACAAGTCGATTATGGCTATTTCTTCTTGGAATGACAATGGACAAATGCAGTTTGTCCAAGATCCTTATGCTCTTTACCGCTCAGATTTTTTTCCCGGTCTTGGATGGATGCTTTCAAAATCTACTTGGGACGAATTATCTCCAAAGTGGCCAAAGGCTTACTGGGACGACTGGCTAAGACTCAAAGAGAATCACAGAGGTCGACAATTTATTCGCCCAGAAGTTTGCAGAACATATAATTTTGGTGAGCATGGTTCTAGTTTGGGGCAGTTTTTCAAGCAGTATCTTGAGCCAATTAAACTAAATGATGTCCAGGTTGATTGGAAGTCAATGGACCTTAGTTACCTTTTGGAGGACAATTACGTGAAACACTTTGGTGACTTGGTTAAAAAGGCTAAGCCCATCCATGGAGCTGATGCTGTCTTGAAAGCATTTAACATAGATGGTGATGTGCGTATTCAGTACAGAGATCAACTAGACTTTGAAAATATCGCACGGCAATTTGGCATTTTTGAAGAATGGAAGGATGGTGTACCACGTGCAGCATATAAAGGAATAGTAGTTTTCCGGTACCAAACGTCCAGACGTGTATTCCTTGTTGGCCATGATTCGCTTCAACAACTCGGAATTGAAGATACTTAA
SEQIDNO:32MBP-GnTII融合物
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCGTATCACCAAGCGTCAGCGTAAAAATGAAGCCCTGGCACCTCCTCTGCTGGATGCTGAACCGGCACGTGGTGCTGGCGGTCGTGGTGGTGATCATCCGTCTGTTGCCGTTGGTATTCGTCGTGTGAGCAATGTTTCGGCTGCCTCTCTGGTCCCGGCTGTTCCTCAACCTGAAGCTGATAACCTGACCCTGCGCTATCGCTCTCTGGTGTATCAACTGAACTTCGATCAAACTCTGCGTAACGTGGATAAAGCAGGCACATGGGCTCCTCGTGAACTGGTACTGGTAGTCCAGGTCCATAATCGTCCGGAATATCTGCGTCTGCTGCTGGATTCTCTGCGCAAAGCTCAAGGCATCGATAATGTCCTGGTCATCTTCTCTCATGATTTCTGGAGCACGGAGATTAACCAGCTGATTGCCGGCGTGAATTTTTGTCCTGTGCTGCAGGTGTTTTTTCCGTTTTCTATCCAACTGTATCCGAACGAATTTCCGGGTTCTGATCCTCGTGATTGTCCTCGTGATCTGCCTAAAAATGCCGCTCTGAAACTGGGCTGTATTAATGCCGAGTATCCTGATTCTTTTGGCCACTATCGTGAGGCGAAATTTTCTCAGACCAAACATCATTGGTGGTGGAAACTGCATTTCGTGTGGGAACGTGTGAAAATCCTGCGCGACTATGCTGGCCTGATTCTGTTTCTGGAAGAAGATCACTATCTGGCTCCGGACTTTTATCATGTGTTCAAAAAAATGTGGAAACTGAAACAGCAGGAATGTCCAGAATGTGATGTGCTGTCACTGGGCACCTATAGTGCTTCTCGCTCCTTCTATGGTATGGCCGACAAAGTGGACGTTAAAACATGGAAATCCACCGAGCACAACATGGGTCTGGCACTGACTCGTAATGCCTATCAAAAACTGATTGAGTGTACCGACACCTTTTGTACGTATGATGACTATAACTGGGACTGGACCCTGCAATATCTGACCGTGAGCTGTCTGCCAAAATTTTGGAAAGTTCTGGTGCCTCAGATTCCTCGTATCTTTCATGCTGGCGACTGTGGTATGCACCATAAAAAAACTTGCCGTCCGTCAACACAATCTGCTCAGATCGAGTCGCTGCTGAATAATAACAAACAGTATATGTTCCCGGAGACTCTGACAATTTCTGAAAAATTCACCGTGGTCGCCATTTCTCCGCCTCGTAAAAATGGAGGTTGGGGCGATATCCGTGACCATGAACTGTGTAAAAGCTATCGTCGTCTGCAGTGA
SEQIDNO:33MBP-GnTIV融合物
ATGAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCGAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCGTATCACCAAGATTTTGAAAGAACTGACGTCCAAAAAGAGCTTGCAAGTCCCGTCCATCTACTATCACTTGCCGCACTTGCTGCAAAACGAGGGCTCTTTGCAACCGGCAGTTCAGATCGGCAATGGTCGCACCGGCGTGAGCATTGTTATGGGTATCCCGACCGTGAAACGTGAAGTGAAAAGCTATCTGATTGAAACGCTGCATAGCCTGATCGATAACCTGTACCCGGAAGAAAAACTGGACTGCGTGATTGTCGTTTTCATTGGTGAAACCGACACGGATTATGTGAATGGCGTTGTTGCCAATCTGGAAAAAGAGTTCAGCAAAGAGATCAGCAGCGGCCTGGTTGAGATCATTTCTCCGCCGGAGAGCTATTACCCGGATCTGACGAACCTGAAAGAAACCTTCGGTGATAGCAAAGAGCGTGTCCGTTGGCGCACTAAGCAGAACCTGGACTATTGTTTTCTGATGATGTACGCGCAAGAAAAGGGTACGTATTACATCCAACTGGAGGACGACATTATTGTGAAGCAAAACTACTTCAACACCATTAAGAACTTCGCGCTGCAGCTGAGCAGCGAAGAGTGGATGATTCTGGAGTTCAGCCAGCTGGGCTTCATTGGCAAGATGTTTCAGGCACCGGACTTGACCCTGATCGTGGAGTTTATCTTTATGTTCTACAAAGAGAAACCGATCGATTGGCTGCTGGATCATATCCTGTGGGTCAAGGTCTGCAATCCGGAAAAAGATGCCAAGCATTGTGACCGCCAGAAAGCGAATCTGCGTATTCGTTTTCGTCCTAGCCTGTTCCAACACGTGGGTCTGCACAGCTCTCTGACCGGTAAGATCCAAAAGCTGACCGACAAAGATTACATGAAACCGCTGCTGCTGAAGATCCATGTCAACCCGCCAGCAGAGGTGAGCACCTCGCTGAAAGTCTACCAGGGTCACACTCTGGAGAAAACCTATATGGGCGAGGACTTCTTTTGGGCGATTACGCCTGTTGCGGGTGACTATATCTTGTTTAAGTTTGACAAGCCGGTTAATGTAGAGAGCTACTTGTTTCATAGCGGTAACCAGGATCACCCAGGTGACATTCTGCTGAACACCACCGTTGAAGTGTTGCCGCTGAAAAGCGAAGGTCTGGATATTTCGAAAGAAACGAAGGATAAGCGTCTGGAGGATGGTTACTTCCGTATCGGCAAGTTCGAGAATGGCGTGGCTGAAGGTATGGTCGACCCGAGCCTGAACCCGATTTCCGCATTTCGCCTGTCCGTCATCCAGAATAGCGCGGTTTGGGCTATCCTGAATGAGATTCACATCAAAAAGGTTACGAATTAA
SEQIDNO:34GST-algl1融合物
ATGAAATTGTTCTACAAACCGGGTGCCTGCTCTCTCGCTTCCCATATCACCCTGCGTGAGAGCGGAAAGGATTTTACCCTCGTCAGTGTGGATTTAATGAAAAAACGTCTCGAAAACGGTGACGATTACTTTGCCGTTAACCCTAAGGGGCAGGTGCCTGCATTGCTGCTGGATGACGGTACTTTGCTGACGGAAGGCGTAGCGATTATGCAGTATCTTGCCGACAGCGTCCCCGACCGCCAGTTGCTGGCACCGGTAAACAGTATTTCCCGCTATAAAACCATCGAATGGCTGAATTACATCGCCACCGAGCTGCATAAAGGTTTCACACCTCTGTTTCGCCCTGATACACCGGAAGAGTACAAACCGACAGTTCGCGCGCAGCTGGAGAAGAAGCTGCAATATGTGAACGAGGCACTGAAGGATGAGCACTGGATCTGCGGGCAAAGATTTACAATTGCTGATGCCTATCTGTTTACGGTTCTGCGCTGGGCATACGCGGTGAAACTGAATCTGGAAGGGTTAGAGCACATTGCAGCATTTATGCAACGTATGGCTGAACGTCCGGAAGTACAAGACGCGCTGTCAGCGGAAGGCTTAAAGGGCAGTGCTTGGACAAACTACAATTTTGAAGAGGTTAAGTCTCATTTTGGGTTCAAAAAATATGTTGTATCATCTTTAGTACTAGTGTATGGACTAATTAAGGTTCTCACGTGGATCTTCCGTCAATGGGTGTATTCCAGCTTGAATCCGTTCTCCAAAAAATCTTCATTACTGAACAGAGCAGTTGCCTCCTGTGGTGAGAAGAATGTGAAAGTTTTTGGTTTTTTTCATCCGTATTGTAATGCTGGTGGTGGTGGGGAAAAAGTGCTCTGGAAAGCTGTAGATATCACTTTGAGAAAAGATGCTAAGAACGTTATTGTCATTTATTCAGGGGATTTTGTGAATGGAGAGAATGTTACTCCGGAGAATATTCTAAATAATGTGAAAGCGAAGTTCGATTACGACTTGGATTCGGATAGAATATTTTTCATTTCATTGAAGCTAAGATACTTGGTGGATTCTTCAACATGGAAGCATTTCACGTTGATTGGACAAGCAATTGGATCAATGATTCTCGCATTTGAATCCATTATTCAGTGTCCACCTGATATATGGATTGATACAATGGGGTACCCTTTCAGCTATCCTATTATTGCTAGGTTTTTGAGGAGAATTCCTATCGTCACATATACGCATTATCCGATAATGTCAAAAGACATGTTAAATAAGCTGTTCAAAATGCCCAAGAAGGGTATCAAAGTTTACGGTAAAATATTATACTGGAAAGTTTTTATGTTAATTTATCAATCCATTGGTTCTAAAATTGATATTGTAATCACAAACTCAACATGGACAAATAACCACATAAAGCAAATTTGGCAATCCAATACGTGTAAAATTATATATCCTCCATGCTCTACTGAGAAATTAGTAGATTGGAAGCAAAAGTTTGGTACTGCAAAGGGTGAGAGATTAAATCAAGCAATTGTGTTGGCACAATTTCGTCCTGAGAAACGTCATAAGTTAATCATTGAGTCCTTTGCAACTTTCTTGAAAAATTTACCGGATTCTGTATCGCCAATTAAATTGATAATGGCGGGGTCCACTAGATCCAAGCAAGATGAAAATTATGTTAAAAGTTTACAAGACTGGTCAGAAAATGTATTAAAAATTCCTAAACATTTGATATCATTCGAAAAAAATCTGCCCTTCGATAAGATTGAAATATTACTAAACAAATCTACTTTCGGTGTTAATGCCATGTGGAATGAGCACTTTGGAATTGCAGTTGTAGAGTATATGGCTTCCGGTTTGATCCCCATAGTTCATGCCTCGGCGGGCCCATTGTTAGATATAGTTACTCCATGGGATGCCAACGGGAATATCGGAAAAGCTCCACCACAATGGGAGTTACAAAAGAAATATTTTGCAAAACTCGAAGATGATGGTGAAACTACTGGATTTTTCTTTAAAGAGCCGAGTGATCCTGATTATAACACAACCAAAGATCCTCTGAGATACCCTAATTTGTCCGACCTTTTCTTACAAATTACGAAACTGGACTATGACTGCCTAAGGGTGATGGGCGCAAGAAACCAGCAGTATTCATTGTATAAATTCTCTGATTTGAAGTTTGATAAAGATTGGGAAAACTTTGTACTGAATCCTATTTGTAAATTATTAGAAGAGGAGGAAAGGGGCTGA。

Claims (70)

1.一种产生寡糖组合物的方法，所述方法包括：
培养产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性(EC2.4.1.101；EC2.4.1.143；EC2.4.1.145；EC2.4.1.155；EC2.4.1.201)，所述N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性催化UDP-GlcNAc残基转移至所述末端甘露糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端GlcNAc残基的寡糖组合物的条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤还包括用以表达一种或多种半乳糖转移酶酶活性(EC2.4.1.38)的所述宿主细胞，所述半乳糖转移酶酶活性催化UDP-半乳糖残基转移至所述末端GlcNAc残基，所述培养步骤在有效产生具有末端半乳糖残基的寡糖组合物的条件下进行。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述培养步骤还包括用以表达一种或多种唾液酸转移酶酶活性(EC2.4.99.4和EC2.4.99.1)的所述宿主细胞，所述唾液酸转移酶酶活性催化CMP-NANA残基转移至所述末端半乳糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端唾液酸残基的寡糖组合物的条件下进行。
4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达一种或多种真核生物UDP-GlcNAc转移酶酶活性(EC2.4.1.141或EC2.4.1.145)以及一种或多种真核生物甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.142、EC2.4.1.132)的所述宿主细胞，其中所述酶赋予所述宿主细胞真核生物糖基转移酶活性。
5.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤还包括用以表达一种或多种所述酶的融合物的所述宿主细胞，其中所述融合物包含选自以下溶解度增强子中的至少一种：DsbA、GlpE、GST、MBP、MstX、NusA和TrxA。
6.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤处于氧化条件下。
7.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达下述酶活性中的一种或多种的所述宿主细胞：磷酸甘露糖变位酶酶活性(ManB)(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶酶活性(ManC)(EC2.7.7.13)和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶酶活性(GlmS)(EC2.6.1.16)，其中ManB和ManC催化GDP-甘露糖合成，并且其中GlmS催化UDP-GlcNAc合成。
8.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括GDP-D-甘露糖脱水酶酶活性(EC4.2.1.47)减弱的所述宿主细胞。
9.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达翻转酶酶活性的所述宿主细胞。
10.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达寡糖基转移酶酶活性(EC2.4.1.119)的宿主细胞。
11.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述方法还包括向所述宿主细胞引入编码目标蛋白的基因，由此所述宿主细胞产生糖基化的蛋白质。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述寡糖组合物被N-连接到所述蛋白质。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达所述糖基化的蛋白质作为抗体的所述重组原核生物宿主细胞，所述抗体包含以下中的至少一种：
Fv部分，所述Fv部分结合于天然抗原；Fc部分，所述Fc部分在保守的天冬酰胺残基处为糖基化的；双抗体；scFv；scFv-Fc；scFv-CH；Fab和scFab。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述糖基化的蛋白质包括：细胞因子，例如干扰素；G-CSF；凝血因子，例如因子VIII、因子IX和人蛋白质C；可溶的IgE受体α-链；IgG；IgG片段；IgM；白细胞介素；尿激酶；糜酶和尿胰蛋白酶抑制剂；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；膜联蛋白V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子-2；骨髓祖细胞抑制因子-1；骨保护素；α-1抗胰蛋白酶；DNaseII；α-甲胎蛋白；AAT；rhTBP-1(akaTNF结合蛋白1)；TACI-Ig(跨膜激活剂和钙调节剂以及亲环素配体相互作用分子)；FSH(促卵泡激素)；GM-CSF；胰高血糖素；胰高血糖素肽；GLP-1w/和w/oFC(胰高血糖素样蛋白1)IL-I受体激动剂；sTNFr(aka可溶性TNF受体Fc融合物)；CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4-Ig)；受体；激素，例如人生长激素；红细胞生成素；肽；订书肽；人疫苗；动物疫苗；血清白蛋白和酶，该酶例如为ATIII、重组人凝血酶、葡糖脑苷酯酶和天冬酰胺酶。
15.如权利要求1、2或3所述的方法，其中所述培养步骤包括将表达至少一种N-乙酰葡糖胺转移酶、半乳糖转移酶或唾液酸转移酶的所述宿主细胞可操作地融合至MBP。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达所述半乳糖转移酶酶活性的氧化宿主细胞。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述寡糖组合物包含GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述寡糖组合物主要为GlcNAcMan3GlcNAc2或GlcNAc2Man3GlcNAc2。
19.如权利要求2所述的方法，其中所述寡糖组合物包含Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2。
20.如权利要求2所述的方法，其中所述寡糖组合物主要为GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
21.如权利要求3所述的方法，其中所述寡糖组合物包含NANA1-5Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2。
22.如权利要求3所述的方法，其中所述寡糖组合物主要为NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2或NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
23.如权利要求1、2或3所述的方法，其中在存在甘油或丙酮酸酯的情况下，培养所述宿主细胞。
24.一种产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞，所述重组原核生物宿主细胞包含：一种或多种N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性(EC2.4.1.101；EC2.4.1.143；EC2.4.1.145；EC2.4.1.155；EC2.4.1.201)，所述N-乙酰葡糖胺转移酶酶活性催化UDP-GlcNAc残基转移至所述末端甘露糖残基，其中所述宿主细胞产生具有末端GlcNAc残基的寡糖组合物。
25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含一种或多种半乳糖转移酶酶活性(EC2.4.1.38)，所述半乳糖转移酶酶活性催化UDP-半乳糖残基转移至所述末端GlcNAc残基，其中所述宿主细胞产生具有末端半乳糖残基的寡糖组合物。
26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含一种或多种唾液酸转移酶酶活性SialylT(EC2.4.99.4和SialylT(EC2.4.99.1)，所述唾液酸转移酶酶活性SialylT催化CMP-NANA残基转移至所述末端半乳糖残基，其中所述宿主细胞产生具有末端唾液酸残基的寡糖组合物。
27.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一种或多种真核生物UDP-GlcNAc转移酶酶活性(EC2.4.1.141或EC2.4.1.145)和一种或多种真核生物甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.142,EC2.4.1.132)，其中所述酶赋予所述宿主细胞真核生物糖基转移酶活性。
28.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含一种或多种所述酶的融合物，其中所述融合物包含以下中的至少一种：DsbA、GlpE、GST、MBP、MstX、NusA和TrxA。
29.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为氧化宿主。
30.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含下述酶中的一种或多种：磷酸甘露糖变位酶酶活性(ManB)(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶酶活性(ManC)(EC2.7.7.13)和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶酶活性(GlmS)(EC2.6.1.16)，其中ManB和ManC催化GDP-甘露糖合成并且其中GlmS催化UDP-GlcNAc的合成。
31.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含减弱GDP-D-甘露糖脱水酶酶活性(EC4.2.1.47)。
32.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含翻转酶酶活性。
33.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含寡糖基转移酶酶活性(EC2.4.1.119)。
34.如权利要求24、25或26所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码目标蛋白的基因，由此所述宿主细胞产生糖基化的蛋白质。
35.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生被N-连接到所述蛋白质的寡糖组合物。
36.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞将所述糖基化的蛋白质表达为包含下述的至少一种的抗体：Fv部分，所述Fv部分结合于天然抗原；Fc部分，所述Fc部分在保守的天冬酰胺残基处为糖基化的；双抗体；scFv；scFv-Fc；scFv-CH；Fab和scFab。
37.如权利要求34所述的宿主细胞，其中所述糖基化的蛋白质包括：细胞因子，例如干扰素；G-CSF；凝血因子，例如因子VIII、因子IX和人蛋白质C；可溶的IgE受体α-链；IgG；IgG片段；IgM；白细胞介素；尿激酶；糜酶和尿胰蛋白酶抑制剂；IGF-结合蛋白；表皮生长因子；生长激素释放因子；膜联蛋白V融合蛋白；血管抑素；血管内皮生长因子-2；骨髓祖细胞抑制因子-1；骨保护素；α-1抗胰蛋白酶；DNaseII；α-甲胎蛋白；AAT；rhTBP-1(akaTNF结合蛋白1)；TACI-Ig(跨膜激活剂和钙调节剂以及亲环素配体相互作用分子)；FSH(促卵泡激素)；GM-CSF；胰高血糖素；胰高血糖素肽；GLP-1w/和w/oFC(胰高血糖素样蛋白1)IL-I受体激动剂；sTNFr(aka可溶性TNF受体Fc融合物)；CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞相关的抗原4-Ig)；受体；激素例如人生长激素；红细胞生成素；肽；订书肽；人疫苗；动物疫苗；血清白蛋白和酶，该酶例如为ATIII、重组人凝血酶、葡糖脑苷酯酶和天冬酰胺酶。
38.如权利要求24所述的宿主细胞，其中将表达至少一种甘露糖转移酶、N-乙酰葡糖胺转移酶、半乳糖转移酶或唾液酸转移酶的所述宿主细胞可操作地融合至MBP。
39.如权利要求24所述的宿主细胞，其中氧化宿主细胞被用于表达所述半乳糖转移酶酶活性。
40.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生包含GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2的寡糖组合物。
41.如权利要求40所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物主要为GlcNAcMan3GlcNAc2或GlcNAc2Man3GlcNAc2。
42.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生包含Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2和Man3GlcNAc2的寡糖组合物。
43.如权利要求42所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物主要为GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
44.如权利要求26所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物包含NANA1-5Gal1-5GlcNAc1-5Man3GlcNAc2。
45.如权利要求44所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物主要为NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2或NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
46.一种产生高甘露糖型寡糖组合物的方法，所述方法包括：培养产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞以表达一种或多种α-1,2-甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.-)，所述α-1,2-甘露糖转移酶酶活性催化GDP-甘露糖残基转移至所述末端甘露糖残基，所述培养步骤在有效产生具有末端甘露糖残基的寡糖组合物的条件下进行。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达一种或多种真核生物UDP-GlcNAc转移酶酶活性(EC2.4.1.141或EC2.4.1.145)以及一种或多种真核生物甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.142、EC2.4.1.132)的所述宿主细胞，其中所述酶赋予所述宿主细胞真核生物糖基转移酶活性。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤还包括表达一种或多种所述酶的融合物的所述宿主细胞，其中所述融合物包含选自以下溶解度增强子中的至少一种：DsbA、GlpE、GST、MBP、MstX、NusA和TrxA。
49.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括下述酶活性中的一种或多种的所述宿主细胞：磷酸甘露糖变位酶酶活性(ManB)(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶酶活性(ManC)(EC2.7.7.13)和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶酶活性(GlmS)(EC2.6.1.16)，其中ManB和ManC催化GDP-甘露糖合成并且其中GlmS催化UDP-GlcNAc合成。
50.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括GDP-D-甘露糖脱水酶酶活性(EC4.2.1.47)减弱的所述宿主细胞。
51.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达翻转酶酶活性的所述宿主细胞。
52.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达寡糖基转移酶酶活性(EC2.4.1.119)的所述宿主细胞。
53.如权利要求46所述的方法，其中所述方法还包括向所述宿主细胞引入编码目标蛋白的基因，由此所述宿主细胞产生糖基化的蛋白质。
54.如权利要求46所述的方法，其中所述寡糖组合物被N-连接到所述蛋白质。
55.如权利要求46所述的方法，其中表达至少一种甘露糖转移酶的所述宿主细胞可操作地融合至MBP。
56.如权利要求46所述的方法，其中所述培养步骤包括用以表达作为疫苗的所述糖基化的蛋白质的所述重组原核生物宿主细胞。
57.如权利要求46所述的方法，其中所述寡糖组合物选自Man2GlcNAc2、Man4GlcNAc、Man3GlcNAc2、HexMan3GlcNAc2、HexMan5GlcNAcMan6GlcNAc和Man5GlcNAc2。
58.如权利要求46所述的方法，其中所述寡糖组合物主要为Man5GlcNAc2。
59.一种产生高甘露糖型寡糖组合物的重组原核生物宿主细胞，其包含：a)一种或多种真核生物UDP-GlcNAc转移酶酶活性(EC2.4.1.141或EC2.4.1.145)，b)一种或多种真核生物甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.142、EC2.4.1.132)，以及c)一种或多种α-1,2-甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.-)，其催化GDP-甘露糖残基转移至所述三甘露糖寡糖组合物。
60.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一种或多种真核生物UDP-GlcNAc转移酶酶活性(EC2.4.1.141或EC2.4.1.145)以及一种或多种真核生物甘露糖转移酶酶活性(EC2.4.1.142、EC2.4.1.132)，其中所述酶赋予所述宿主细胞真核生物糖基转移酶活性。
61.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含一种或多种所述酶的融合物，其中所述融合物包含下述中的至少一种：DsbA、GlpE、GST、MBP、MstX、NusA和TrxA。
62.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含下述酶活性中的的一种或多种：磷酸甘露糖变位酶酶活性(ManB)(EC5.4.2.8)、甘露糖-1-磷酸鸟苷酸转移酶酶活性(ManC)(EC2.7.7.13)和谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶酶活性(GlmS)(EC2.6.1.16)，其中ManB和ManC催化GDP-甘露糖合成并且其中GlmS催化UDP-GlcNAc合成。
63.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含GDP-D-甘露糖脱水酶酶活性(EC4.2.1.47)的减弱。
64.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含翻转酶酶活性。
65.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含寡糖基转移酶酶活性(EC2.4.1.119)。
66.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含编码目标蛋白的基因，由此所述宿主细胞产生糖基化的蛋白质。
67.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生被N-连接到所述所述蛋白质的寡糖组合物。
68.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞表达作为疫苗的所述糖基化的蛋白质。
69.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物选自由Man2GlcNAc2、Man4GlcNAc、Man3GlcNAc2、HexMan3GlcNAc2、HexMan5GlcNAcMan6GlcNAc和Man5GlcNAc2构成的组。
70.如权利要求59所述的宿主细胞，其中所述寡糖组合物主要为Man5GlcNAc2。
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