CN105378088A - 对玉米中的特定基因座的精确基因靶向 - Google Patents

Abstract

本发明要求保护经由使用锌指核酸酶将外源DNA稳定整合入玉米基因组中的特定基因座E32中的方法。要求保护通过本发明的方法转化的玉米植物和植物部分。本发明可用于在玉米中创建期望的性状，诸如除草剂抗性、除草剂耐受性、昆虫抗性、昆虫耐受性、疾病抗性、疾病耐受性、应激耐受性、和应激抗性。由于天然农艺学表型不被破坏，E32基因座代表一种用于***外来基因的卓越位点。

Description

对玉米中的特定基因座的精确基因靶向

对相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月13日提交的美国临时专利申请No.61/736856和2013年5月07日提交的美国临时专利申请No.61/820231的优先权。前述每篇的全部内容在此通过提及完整收入本文。

发明领域

本公开内容涉及经由使用锌指核酸酶将外来多核苷酸靶向稳定整合入玉米基因组的一个特定基因座中。

提及电子提交的序列表

序列表的正式拷贝以ASCII格式序列表经由EFS-Web电子提交，并且与说明书同时提交，其中文件命名为“74381_ST25.txt”，在2013年11月26日创建，并且具有23.7千字节的大小。此ASCII格式文件中含有的序列表是说明书的一部分，并且通过提及完整收入本文。

发明背景

玉米事件DAS-59132的基因组基因座记载于美国专利8,273,535，METHODSFORDETECTIONOFCORNEVENTDAS-59132。转基因表达盒作为全长T链***物整合入Hi-II玉米种质的B73玉米基因组衍生区的染色体8(D.D.Songstad,W.L.Petersen,C.L.Armstrong,AmericanJournalofBotany,Vol.79,pp.761-764,1992)中。另外，转基因基因座周围的基因组DNA相对于天然B73序列缺乏任何大的缺失，并且除了单一小重复元件外一般缺乏重复元件。广泛的田间研究揭示了事件的存在没有不利影响携带该事件的植物的正常生长和发育。此外，含有该事件的玉米系保留在农艺学性能上与未转化同种系(isolines)可比的农艺学和育种特征。因此，整合有玉米事件DAS-59132的基因组基因座代表一种在玉米中用于靶向整合其它转基因构建体的卓越内源基因组基因座，并且在下文中称为E32或事件32基因座。

植物的靶向性基因组修饰一直是应用和基础研究两者的长期存在且难以捉摸的目的。正在开发通过位点特异性核酸酶靶向并切割基因组DNA的方法和组合物以达到此目的。位点特异性核酸酶包括但不限于(锌指核酸酶(ZFN)，大范围核酸酶(Meganuclease)，TALENS和具有工程化crRNA/tracrRNA的CRISPR/Cas，参见Burgess；等；NatureReviewsGenetics14,80-81(February2013))。例如，可以使用ZFN对基因组基因座的位点特异性切割来诱导靶向诱变，诱导细胞DNA序列的靶向缺失，并且促进外源供体DNA多核苷酸在预先确定的基因组基因座内的靶向重组。参见例如美国专利公开文本No.20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；和20060188987，及国际专利公开文本No.WO2007/014275，其公开内容通过提及完整收录用于所有目的。美国专利公开文本No.20080182332描述了非规范锌指核酸酶(ZFN)用于靶向修饰植物基因组的用途，并且美国专利公开文本No.20090205083描述了ZFN介导的靶向修饰植物EPSP基因组基因座。另外，Moehle等.(2007)Proc.Natl.Acad.Sci.USA104(9):3055-3060描述了使用设计的ZFN以在规定的基因组基因座处实现靶向基因添加。目前的靶向方法通常牵涉用含有至少一种转基因的供体DNA多核苷酸和设计为结合并切割特定基因组基因座的位点特异性核酸酶共转化植物组织。这引起供体DNA多核苷酸稳定***切割的基因组基因座内，导致在指定基因组基因座处的靶向性基因添加。

发明概述

目前要求保护的发明是一种用于将一种或多种功能性外源核酸序列整合入具有E32基因座的玉米细胞基因组中的方法。该方法包括使用一种或多种包含锌指结合域的锌指核酸酶在E32基因座中进行双链切割，所述锌指结合域结合选自表1B中显示的组的靶位点。这导致包含一种或多种外源序列的功能性多核苷酸在E32基因座内整合入玉米细胞基因组中。任选地，该方法包括表达由一种或多种外源序列编码并控制的基因产物。

附图简述

图1描绘了设计为结合E32基因座的ZFN的关系。在酵母测定法中鉴定出6个ZFN(E32ZFN1-6)，并且将4种ZFN进一步用于在植物中进行评估。

图2是pDAB105906的质粒图。

图3是pDAB111809的质粒图。

图4是pDAB100655的质粒图，并且代表一种典型的供体构建体，其中可以用其它期望的编码序列(包括但不限于PAT)替换AAD-1区。

图5是E32基因座的ZFN基因座破坏图，其中箭头标示破坏的基因组基因座。

图6是pDAB108688(对照载体)的质粒图。

图7是pDAB108690(靶向载体)的质粒图。

图8显示了用于ZFN破坏qPCR的引物和探针位置。

图9是ZFN破坏测定图(上面括号标示非破坏的事件，而下面括号显示破坏的事件)。

图10是pDAB104179的质粒图。

图11显示了用于ZFN破坏qPCR的引物和探针位置。

图12是ZFN破坏测定图(上面括号标示非破坏的事件阴性，而下面括号显示破坏的事件)。

图13显示了用于内外(in/out)PCR的引物位置。

图14是一种Southern分析策略，其显示了用于探针生成的酶切割位点和引物的位置。

图15是pDAB107855的质粒图。

发明详述

用于转化玉米事件DAS-59132的全长DNA分子(PHI17662A)，基因组侧翼序列的3’端、和PHI17662A/3’玉米基因组接合(junction)记载于美国专利8,273,535的公开内容。E32基因座以SEQIDNO:1描述，并且指玉米事件DAS-59132的基因组侧翼区，其用于鉴定用于设计锌指蛋白结合域以***外源基因的基因组靶序列。这些靶位点包括但不限于表1B中描述的那些。在鉴定E32基因座为对于***外源基因高度期望的位置(其为本发明的一个实施方案)后，鉴定和使用E32基因座内的其它靶位点完全在熟练技术人员范围内。

SEQIDNO:1以下述序列提供；

agttgggaaggcaaaacgaatataagtgcattcggattactgtttagtcgagtcatatttaaggaattcattgtaaatgttctaacctaacctaagtattaggcagctatggctgatatggatctgattggacttgatttatccatgataagtttaagagcaactcaaagaggttaggtatatatggttttgtaaaggtaaatttagttaatattagaaaaaaaaagtgtatccaataggctctataaacaactcttcaaatttagtggctttctatccatccacctttgctctctatttttggatagcctgatttactctctattcagtccgtaggtttaatgagtctgttggattagcctacactttttctgtaaaatctattttagatagtagctaaatcagtaaatttggctagtatttttagctattctcttggagtttgctataagaccagaacatgtaaattggaagtttgtggacccggacgagaatgcatgacaaatccagagtattgatgatggaattcacctattttacccgactcttccattgtgtccatttctcatcatccccgggcgctttctgcatccggtacagctgacatgacacgttcacgcgttacatggctgatggctcacaagtcacccccacatgtctagtgttcgcccaggcagatcgtcctcggcctgcgctgccgtgctcttgccgccgcttgcttgggccctgctggcgcccgctgccgatcacacggcctacgcggtgcaggcagcgccaccgaacccgcagtcttgttgtgccgataggtggcagtggcagtggcactggcacggcacgcgatcgatcgctccgctcatctgctgacagtggatagagcagcgttggccgttggggccggatctccgtgaagcggtcgtccctgctgtactgtgccgctatggcgtgtcgctttcgccatgttttcttttcttttttttttctttttctttttgctagggcggtttctcgttcgctggtaacagggaccacttcggttgatccgttgaatttactgaaagagatgggaatggtcgctgtgcccgggacattgaatgagatgttgtgtaagtgaatatggctttagccttttgcgagtggggcggcaatgcacggcatgaactataatttccggtcaaacttttgtgtggaaatggatgctaaacgaacacaaaccgggtttaaaccagaggccgacacggcacacacggcgacattcaccgccggcttcctccgtcgccactcggcacaaggctcatcagtcgccgatgcccgatgcgatcaacggaagcggatggcccgcttctttagaattggcacaggaacactggccactgcccttgatgtgcaattatgcctgcgaaagcctaggcaacacacgcgaataaacgagcgaatgacacggaaagctgatgtggtatgaattatacaacattatgggccaaaatattattctatccaccattgtgtagccacagcatcggtatttgagttgtgcgaggacaaatccctcgtgaggtcaaaaacagcaaataataaacccatctcctgaagacaccaaaaaaaaggagcagctcctcgtgtcaatgaacaagcgtcacaagaaaagggagcacgtaaataacctcttcaattgcttcagcatgaaaagaacgggaagaaatgcaagtctacagaggaaagtgcagctgtttcggctgccatggcaagttcctacatgggcgaggaaaagctgaactggattccagtcttcgcgctgtcatgctcagcttgctttaggatgcggcaatagttcacctggatgaaaaagatacaagttagtcttgaagcagtcgagtggacatccaaagtatcaaaatcgaaagcttgtaaatggggaaggaaatatacctctacccggaaaagtttggtaggcaaaataatcccaacgccagcagagctccggaacgtttgccgaaattcagaagccgaaaagttcttgtactcaccctccgacagtttcgcaaggtttccagcagtaaggaatgcgtggccatggattccagcgtctctgaatatcttgaggggcagatcaaaagaaaggtcagcgaaggcagacacggccagatcacctcccaagtaatcccttccagggtcagccgagccactctccgagttattaaggacatgcctccgcgcctctgttgggccaactccccttaatctgaaacccagcagagatgacggtccgcccaagctgcacactggagaagaattacctccaagataaaacctctctggcactgatgaagtcgaattcatgaatccccctgcaagcggtaaaatgacacccgctcctacaccaacgttgagagcagcactataaaatcccaaaggcacagcaccacgtacatcgaactcctgagagcaaacccaacggcaatatttttgtaatagtgatggtcagaactgagaagatcagataaaattatacactgatgcaattatttcatagtttcgcccatgaactgtaagggctagacaaagcaaaaagtaagacatgaagggcaagagaataacctgccggaaatatctcaatcctttgctattccatagaccaccaacttgagaagttgactgaaacgcatatcctttcgttggcctaagatgtgaatccctcttatcaatcttgtatgtgtacttcaatgcagaaagaaggttatgccctaactgcctccttatggcctttgatgagacacgtgatggatcagttaaggtacgccacgcaaggttgtatgacaagtcatggttccttgttgacagcaaaccaaatgaaaggccaagtaggcgctccttgtatgatgaaaacttcagccaatcttgtgatgacaaagatgcccgagccatcaatggtgttggtattgatttaaacctcggtaggcagactccaacaccaacctctgttgtttggtcccaaccaaaggatcctgatgcatcccagatgtcaccatagccaaacaagttcttcaacttaagtgacccttccagcgaccaagatcttgcctacaagagtggcaagcacagtca

本公开内容进一步涉及使用ZFN和基因供体构建体靶向整合入玉米E32基因座中的方法和组合物。除非另有指示，本文中公开的方法的实施以及组合物的制备和使用采用在本领域技术内的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域中的常规技术。在文献中完整解释了这些技术。参见例如Sambrook等.MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989和第3版,2001；Ausubel等.,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,JohnWiley&Sons,NewYork,1987和定期更新；呈系列的METHODSINENZYMOLOGY,AcademicPress,SanDiego；Wolfe,CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION,第3版,AcademicPress,SanDiego,1998；METHODSINENZYMOLOGY,Vol.304,"Chromatin"(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,SanDiego,1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY,Vol.119,"ChromatinProtocols"(P.B.Becker,ed.)HumanaPress,Totowa,1999。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于其中的一种或多种氨基酸是相应天然存在氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的氨基酸聚合物。

“结合”指大分子间(例如蛋白质与核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。并非结合相互作用的所有组分需要是序列特异性的(例如与DNA主链中的磷酸酯残基接触)，只要相互作用整体上是序列特异性的。此类相互作用一般以10^-6M或更低的解离常数为特征。“亲和力”指结合强度：升高的结合亲和力与较低的结合常数(Kd)相关联。

“结合蛋白”指能够非共价结合另一个分子的蛋白质。例如，结合蛋白可以结合DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况中，它可以结合自身(以形成同二聚体、同三聚体等)和/或它可以结合一种或多种不同蛋白质的一个或多个分子。结合蛋白可以具有超过一类结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合域)指经由一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质，或较大蛋白质内的域，所述锌指是结合域内的氨基酸序列的区域，其结构是经由锌离子配位而稳定化的。术语锌指DNA结合蛋白经常缩写为锌指蛋白或ZFP。

可以“工程化改造”锌指结合域以结合预先确定的核苷酸序列。用于工程化改造锌指蛋白的方法的非限制性例子是设计和选择。设计的锌指蛋白指不天然存在的蛋白质，其设计/组成主要源自合理标准。用于设计的合理标准包括应用替代规则和用于处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息的计算机化算法。参见例如美国专利No.6,140,081；6,453,242；6,534,261及6,794,136；还可见WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536和WO03/016496。

“切割”指DNA分子的共价主链的断裂。可以通过多种方法启动切割，所述方法包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者是可能的，并且双链切割可以由于两个不同的单链切割事件而发生。DNA切割可以导致平末端或交错末端的生成。在某些实施方案中，使用融合多肽进行靶向双链DNA切割。“切割域”包含拥有DNA切割的催化活性的一种或多种多肽序列。切割域可以是包含于单一多肽链中的或者切割活性可以源自两个(或更多个)多肽的联合。

“靶位点”或“靶序列”指限定核酸中会与结合分子结合的区域的核酸序列，只要存在足够的结合条件。

“外源”分子指在正常情况下不存在于细胞中，但是可以通过一种或多种遗传、生物化学或其它方法导入细胞中的分子。“在细胞中正常存在”是就细胞的特定发育阶段和环境条件而言确定的。如此，例如通过热休克诱导的分子是就未经热休克细胞而言的外源分子。例如，外源分子可以包含任何多肽或其片段，功能障碍的内源分子的功能型式或正常发挥功能的内源分子的功能障碍型式的编码序列。另外，外源分子可以包含来自另一个物种的编码序列。

核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线性，分支或环状的；并且可以是任何长度的。核酸包括那些能够形成双链体的，及三链体形成核酸。参见例如美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化的DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基化酶、乙酰化酶、脱乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和螺旋酶。

“外源核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物两者，例如转录产物(多核苷酸诸如RNA)和翻译产物(多肽)及基因表达的产物和基因产物。

“融合”分子指其中两个或更多个亚基分子例如共价连接的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一类融合分子的例子包括但不限于融合蛋白(例如ZFPDNA结合域和切割域之间的融合物)和融合核酸(例如编码上文描述的融合蛋白的核酸)。第二类融合分子的例子包括但不限于三链体形成核酸和多肽之间的融合物，和小沟结合剂和核酸之间的融合物。

细胞中融合蛋白的表达可以源自融合蛋白对细胞的投递或者通过将编码融合蛋白的多核苷酸投递到细胞进行，其中多核苷酸被转录，并且转录物被翻译，以生成融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接也可以牵涉细胞中蛋白质的表达。在本公开内容中别处呈现了用于对细胞的多核苷酸和多肽投递的方法。

出于本公开内容的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区(参见下文)，及调节基因产物生成的所有DNA区，无论此类调节序列在编码和/或转录序列附近与否。因而，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列，诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。

“基因表达”指将基因中含有的信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、干扰RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译生成的蛋白质。基因产物还包括通过诸如帽化、多聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA，和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化、和糖基化修饰的蛋白质。

公开的方法和组合物包括融合蛋白，其包含切割域和DNA结合域(ZFP)，其中DNA结合域通过结合E32基因座中的序列将切割域的活性引导至序列附近，并且因此诱导E32基因座中的双链断裂。如本公开内容中别处列出的，可以工程化改造锌指域以结合实际上任何期望的序列。因而，可以工程化改造一种或多种DNA结合域以结合E32基因座中的一种或多种序列。在细胞中表达包含DNA结合域和切割域的融合蛋白实现靶位点处或附近的切割。

例如，可以依照美国专利6,453,242中公开的方法实现E32基因座中被锌指域结合的靶位点的选择，该专利还公开了用于设计ZFP以结合选定序列的方法。本领域技术人员会清楚的是，也可以使用核苷酸序列的简单视觉检查来选择靶位点。因而，可以在本文中描述的方法中使用用于靶位点选择的任何手段。

对于ZFPDNA结合域，靶位点一般由多个相邻的靶亚位点构成。靶亚位点指被单个锌指结合的序列，通常是核苷酸三联体或核苷酸四联体，其可以与相邻的四联体重叠一个核苷酸。参见例如WO02/077227。与锌指蛋白产生最多接触的链称作靶链“主要识别链”或“主要接触链”，一些锌指蛋白结合靶链中的三碱基三联体和非靶链上的第四个碱基。靶位点一般具有至少9个核苷酸的长度，并且因而被包含至少3个锌指的锌指结合域结合。然而，例如4指结合域对12个核苷酸的靶位点、5指结合域对15个核苷酸的靶位点或6指结合域对18个核苷酸的靶位点的结合也是有可能的。如会显而易见的，较大结合域(例如7、8、9指和更多)对较长靶位点的结合与本发明也是一致的。

靶位点不必要是多个三核苷酸。在发生交叉链相互作用的情况中(参见例如美国专利6,453,242和WO02/077227)，多指结合域的一个或多个锌指个体可以结合重叠的四联体亚位点。因此，三指蛋白质可以结合10个核苷酸的序列，其中第10个核苷酸是被末端指结合的四联体的部分，四指蛋白质可以结合13个核苷酸的序列，其中第13个核苷酸是被末端指结合的四联体的部分，等等。

多指结合域中锌指个体间的氨基酸接头序列的长度和性质也影响对靶序列的结合。例如，多指结合域中相邻锌指间所谓的“非规范接头”、“长接头”或“有结构的接头”的存在可以容许那些指结合不直接相邻的亚位点。此类接头的非限制性例子记载于例如美国专利No.6,479,626和WO01/53480。因而，锌指结合域的靶位点中的一个或多个亚位点彼此可以相隔1、2、3、4、5或更多个核苷酸。为了提供仅一个例子，4指结合域可以结合13个核苷酸的靶位点，其在序列上包含两个连续的3核苷酸亚位点、1个居间核苷酸、和2个连续的三联体亚位点。

靶位点间的距离指介于2个靶位点间的核苷酸或核苷酸对的数目，如从彼此最近的序列的边缘测量的。在切割依赖于两个锌指域/切割半域融合分子对分开的靶位点的结合的某些实施方案中，两个靶位点可以在相反的DNA链上。在其它实施方案中，两个靶位点都在同一DNA链上。

对于靶向整合入E32基因座中，工程化改造一个或多个ZFP以结合预先确定的切割位点处或附近的靶位点，并且在细胞中表达包含工程化DNA结合域和切割域的融合蛋白。在融合蛋白的锌指蛋白部分结合靶位点时，DNA在靶位点附近被切割域切割，优选经由双链断裂进行。

事件32基因座中双链断裂的存在经由同源重组或经由非同源性指导的修复机制促进外源序列的整合。如此，包含要***事件32基因座中的外源序列的多核苷酸会包含一个或多个与E32的同源性区以促进同源重组。

在本文中描述的融合分子外，选定基因组序列的靶向替换也牵涉供体序列的导入。可以在融合蛋白表达之前、同时、或之后将供体序列导入细胞中。供体多核苷酸含有与E32足够的同源性以支持它和与它携带同源性的E32基因组序列之间的同源重组。供体和基因组序列之间约25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000个核苷酸或更多的序列同源性，或10和2,000个核苷酸或更多之间的任何整数值会支持同源重组。在某些实施方案中，同源性臂的长度小于1,000个碱基对。在其它实施方案中，同源性臂的长度小于750个碱基对。

供体序列的长度范围可以是10至50,000个碱基对或其间的任何整数值或更长的核苷酸。会容易显而易见的是，供体序列通常与其替换的基因组序列不相同。另外，供体序列可以包含含有与替换区不同源的序列的载体分子。一般地，供体序列的同源区会与期望重组的基因组序列具有至少50％序列同一性。在某些实施方案中，60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、或99.9％序列同一性是存在的。1％和100％之间任何数值的序列同一性可以是存在的，这取决于供体多核苷酸的长度。

供体分子可以含有与细胞染色质具有同源性的几个不连续的区域。例如，对于靶向***通常不存在于感兴趣区域中的序列，所述序列可以存在于供体核酸分子中，并且侧翼有与感兴趣区域中的基因序列有同源性的区域。

也可以将供体分子***E32基因座中以充当供以后使用的储备库。例如，可以在E32基因座中***含有感兴趣突变的供体分子。接着，可以引入对感兴趣基因特异性的ZFN，其会切割内源基因座和E32基因座中含有感兴趣突变的供体分子两者。然后，基因组中的所得双链断裂可以变为自E32基因座释放的供体分子的整合位点。这样，在感兴趣的任何区域处供体序列的靶向整合效率可以是大大增加的，因为方法不依赖于编码ZFN的核酸和那些供体序列两者的同时摄取。

也可以将供体分子***E32基因座中以充当后续***的靶位点。例如，可以将由含有别的ZFN设计的识别位点的DNA序列构成的供体分子***基因座中。随后，可以生成别的ZFN设计，并在细胞中表达，从而初始供体分子被切割，并且通过修复或同源重组修饰。这样，可以在E32基因座处发生供体分子的反复整合。

可以将任何外源序列导入E32基因座中，如本文中描述的。例示性的外源序列包括但不限于任何多肽编码序列(例如cDNA)、启动子、增强子和其它调节序列(例如干扰RNA序列、shRNA表达盒、表位标签、标志物基因、切割酶识别位点和各种类型的表达构建体)。此类序列可以使用标准分子生物学技术(克隆、合成等)容易获得和/或是商品化的。

为了表达ZFN，通常将编码融合蛋白的序列亚克隆入含有启动子以指导转录的表达载体中。合适的细菌和真菌启动子是本领域中公知的，并且记载于例如Sambrook等.,MolecularCloning,ALaboratoryManual(2nded.1989；3.sup.rded.,2001)；Kriegler,GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual(1990)；及CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等.,见上文。用于表达ZFN的细菌表达***在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌物种(Bacillussp.)、和沙门氏菌属(Salmonella)中可得到(Palva等.,Gene22:229-235(1983))。用于此类表达***的试剂盒是商品化的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达***是本领域技术人员公知的，并且也是商品化的。

就融合蛋白的意图用途，例如在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达而言选择用于将遗传材料转运到细胞中的特定表达载体(参见下文描述的表达载体)。标准的细菌和动物表达载体是本领域中已知的，并且详细记载于例如美国专利公开文本20050064474A1和国际专利公开文本WO05/084190、WO05/014791和WO03/080809。

可以使用标准转染方法来生成细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，其表达大量的蛋白质，然后可以使用标准技术(参见例如Colley等.,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989)；GuidetoProteinPurification,inMethodsinEnzymology,vol.182(Deutscher,ed.,1990))纯化所述蛋白质。依照标准技术(参加例如Morrison,J.Bact.132:349-351(1977)；Clark-Curtiss&Curtiss,MethodsinEnzymology101:347-362(Wu等.,eds.,1983)实施真核和原核细胞的转化。

可以使用任何公知的用于将外来核苷酸序列导入此类宿主细胞中的规程。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、超声方法(例如声孔处理(sonoporation))、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体(附加体和整合型两者)，和任何其它公知的用于将克隆基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传材料导入宿主细胞中的方法(参见例如Sambrook等.,见上文)。仅必需的是，使用的特定遗传工程化规程能够将至少一种基因成功导入能够表达选择蛋白质的宿主细胞中。

如上文记录的，可以通过多种常规技术将DNA构建体导入期望植物物种的基因组中。关于此类技术的综述，参见例如Weissbach&WeissbachMethodsforPlantMolecularBiology(1988,AcademicPress,N.Y.)SectionVIII,pp.421-463；andGrierson&Corey,PlantMolecularBiology(1988,2dEd.),Blackie,London,Ch.7-9。

可以使用诸如电穿孔和显著注射植物细胞原生质体等技术将DNA构建体直接导入植物细胞的基因组DNA中，或者可以生物射弹法，诸如DNA颗粒轰击(参见例如Klein等.(1987)Nature327:70-73)将DNA构建体直接导入植物组织中。或者，可以经由纳米颗粒转化(参见例如美国专利公开文本No.20090104700，其通过提及完整并入本文)将DNA构建体导入植物细胞中。或者，可以将DNA构建体与合适的T-DNA边界/侧翼区组合，并且导入常规的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)宿主载体中。根癌土壤杆菌介导的转化技术(包括二元载体的解武装(disarming)和使用)是科学文献中充分描述的。参见例如Horsch等.(1984)Science233:496-498,及Fraley等.(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803。

另外，可以使用非土壤杆菌细菌或病毒诸如根瘤菌(Rhizobiumsp.)NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboiummeliloti)、百脉根根瘤菌(Mesorhizobiumloti)、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒实现基因转移。参见例如Chung等.(2006)TrendsPlantSci.11(1):1-4。

根癌土壤杆菌宿主的毒力功能会在使用二元TDNA载体(Bevan(1984)Nuc.AcidRes.12:8711-8721)或共培养规程(Horsch等.(1985)Science227:1229-1231)通过细菌感染细胞时指导含有构建体和相邻标志物的T链***植物细胞DNA中。一般地，使用土壤杆菌转化***工程化改造双子叶植物(Bevan等.(1982)Ann.Rev.Genet.16:357-384；Rogers等.(1986)MethodsEnzymol.118:627-641)。也可以使用土壤杆菌转化***将DNA转化及转移到单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616；Hernalsteen等.(1984)EMBOJ.3:3039-3041；Hooykass-VanSlogteren等.(1984)Nature311:763-764；Grimsley等.(1987)Nature325:1677-179；Boulton等.(1989)PlantMol.Biol.12:31-40；及Gould等.(1991)PlantPhysiol.95:426-434。

备选基因转移和转化方法包括但不限于经由钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸DNA摄取的原生质体转化(参见Paszkowski等.(1984)EMBOJ.3:2717-2722,Potrykus等.(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Fromm等.(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828；及Shimamoto(1989)Nature338:274-276)和植物组织的电穿孔(D’Halluin等.(1992)PlantCell4:1495-1505)。用于植物细胞转化的其它方法包括显微注射、碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等.(1990)PlantCellReporter9:415-418)、和微粒轰击(参见Klein等.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85:4305-4309；及Gordon-Kamm等.(1990)PlantCell2:603-618)。

可以使用公开的方法和组合物将外源序列***预先确定的位置诸如E32基因座中。这是有用的，因为对玉米基因组导入的转基因的表达关键依赖于其整合位点。因而，可以通过靶向重组***编码除草剂耐受性、昆虫抗性、营养物、抗生素或治疗性分子的基因。

可以培养通过任何上述转化技术生成的转化植物细胞以再生拥有转化基因型和如此期望表型的全植物。此类再生技术依赖于在组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，通常取决于已经与期望的核苷酸序列一起导入的生物杀灭剂和/或除草剂标志物。自培养的原生质体的植物再生记载于Evans,等.,"ProtoplastsIsolationandCulture"inHandbookofPlantCellCulture,pp.124-176,MacmillianPublishingCompany,NewYork,1983；及Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRCPress,BocaRaton,1985。也可以自植物愈伤组织、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得再生。此类再生技术一般记载于Klee等.(1987)Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467-486。

本领域技术人员会认可在外源序列在转基因植物中稳定整合并且确认为可操作后，可以通过有性杂交将其导入其它植物中。根据要杂交的物种，可以使用多种标准育种技术之任一种。

可以通过对工程化植物材料选择或筛选由转化DNA上存在的标志物基因编码的性状鉴定和分离转化的玉米细胞、愈伤组织、组织或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂的培养基上培养工程化植物材料实施选择，所述转化基因构建体对所述抗生素或除草剂赋予抗性。此外，也可以通过筛选可以在重组核酸构建体上存在的任何可视标志物基因(例如beta-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase)、萤光素酶、B或C1基因)的活性鉴定转化细胞。此类选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。

也可以使用物理和生物化学方法来鉴定含有***基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)Southern分析或PCR扩增以检测和测定重组DNA***物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或逆转录酶-PCR扩增以检测和检查基因构建体的RNA转录物；3)酶促测定法以检测酶或核酶活性，其中此类基因产物由基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫测定法(ELISA)，其中基因构建体产物是蛋白质。也可以使用其它技术，诸如原位杂交、酶染色、和免疫染色来检测特定植物器官和组织中重组构建体的存在或表达。用于进行所有这些测定法的方法是本领域技术人员公知的。

可以通过例如自感兴趣组织分离的RNA(例如mRNA)的Northern印迹观察使用本文中公开的方法的基因操作的效果。通常，若mRNA是存在的或者mRNA的量已经增加，则可以假设在表达相应的转基因。可以使用测量基因和/或编码多肽活性的其它方法。根据使用的底物和检测反应产物或副产物的增加或减少的方法，可以使用不同类型的酶促测定法。另外，可以以免疫化学法(即ELISA、RIA、EIA和本领域技术人员公知的其它基于抗体的测定法，诸如通过电泳检测测定法(用染色或Western印迹))测量表达的多肽水平。作为一个非限制性例子，使用ELISA测定法检测AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶(aryloxyalkanoatedioxygenase)；参见WO2005/107437)和PAT(膦丝菌素-N-乙酰基-转移酶(PAT),EC2.3.1.183)蛋白记载于美国专利公开文本No.20090093366，其通过提及完整收入本文。可以在植物的一些组织中或在一些发育阶段选择性表达转基因，或者可以在基本上所有植物组织中，基本上沿着其整个生存周期表达转基因。然而，任何组合表达模式也是可适用的。

本公开内容还涵盖上文描述的转基因植物的种子，其中种子具有转基因或基因构建体。本公开内容进一步涵盖上文描述的转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有转基因或基因构建体。

通过通常用于将融合蛋白导入至最终接触要处理的植物细胞的任何路径来施用有效量。以任何合适的方式(优选与可接受载体一起)施用ZFP。施用此类调控剂的合适方法是可用的且本领域技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种路径来施用特定的组合物，特定的路径经常可以提供比另一种路径更直接且更有效的反应。

实施例

实施例1：设计为结合用于玉米事件DAS-59132的基因组基因座的锌指蛋白的生成

按照Urnov等.(2005)Nature435:646-651中描述的方法设计针对DNA序列的锌指蛋白，所述DNA序列包含用于玉米事件DAS-59132的基因组基因座(参见，图1)。例示性的靶序列和识别螺旋显示于表1A(识别螺旋区设计)和表1B(靶位点)。在表1B中，靶位点中由ZFP识别螺旋接触的核苷酸以大写字母标示；非接触核苷酸以小写字母标示。

表1A

用于玉米事件DAS-59132结合性锌指设计的基因组基因座。

表1B

锌指蛋白的靶序列。

锌指编号	SEQ ID NO:	靶序列
			25686	2	caCAACAAGACtGCGGGTtcggtggcgc
25687	3	gaTAGGTGGCAGTGGCAgtggcactggc
			25688	4	taTCGGCACAACAAGACtgcgggttcgg
25689	5	tgGCAGTGGCAGTGGCActggcacggca
			25692	6	caGCAGATGAGcGGAGCGatcgatcgcg
25693	7	caGTGGATAGAGCAGCGttggccgttgg
			25710	8	agGAAGCCGGCGGTGAAtgtcgccgtgt
25711	9	cgTCGCCAcTCGGCACAAggctcatcag
			25712	10	atCGGGCATCGGCGACTgatgagccttg
25713	11	gaTCAACGGAAGCGGATGGCccgcttct
			25716	12	tgATCGCAtCGGGCATCGgcgactgatg
25717	13	cgGAAGCGGATGGCCCGcttctttagaa

将E32锌指蛋白设计掺入编码具有至少一个具有CCHC结构的指的蛋白质的载体中。参见美国专利公开文本No.2008/0182332。特别地，每个蛋白质中的最后一个指具有用于识别螺旋的CCHC主链。经由4个氨基酸的ZC接头和源自玉蜀黍(Zeamays)的opaque-2核定位信号将非规范锌指编码序列与IIS类限制酶FokI的核酸酶域(Wah等.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10564-10569的序列的氨基酸384-579)融合以形成玉米事件DAS-59132锌指核酸酶(ZFN)。使用先前显示为鉴定活性核酸酶的基于芽殖酵母的***对最佳的锌指验证切割活性。参见例如美国专利公开文本No.20090111119；Doyon等.(2008)NatBiotechnol.26:702–708；Geurts等.(2009)Science325:433。选择多个功能域的锌指以在体内使用。在经过设计、生成和测试以结合推定的玉米事件DAS-59132基因组多核苷酸靶位点的众多ZFN中，6对ZFN鉴定为具有高水平的体内活性，并且选择用于进一步的实验。参见表1A。将最佳结合E32基因座的选定ZFN对进一步用于在瞬时玉米转化测定法中测试。

图1显示了关于6个ZFN对的ZFN多核苷酸结合/靶位点的E32基因座的基因组构造。头3个ZFN对(E32ZFN1、E32ZFN2、和E32ZFN3)在玉米事件DAS-59132转基因***物上游结合，后3个ZFN对(E32ZFN4、E32ZFN5、和E32ZFN6)在玉米事件DAS-59132转基因***物下游结合。4个ZFN表征为能够在植物原位(inplanta)有效结合和切割玉米事件DAS-59132基因组多核苷酸靶位点。

实施例2：锌指核酸酶构建体和AAD-1基因供体构建体

使用本领域中通常实施的技术设计并构建含有6个例示性锌指核酸酶的ZFN表达构建体的质粒载体。将每个锌指编码序列与编码位于锌指核酸酶上游的opaque-2核定位信号的序列(Maddaloni等.(1989)Nuc.AcidsRes.17(18):7532)融合。

将opaque-2核定位信号和锌指核酸酶融合序列与互补的opaque-2核定位信号和锌指核酸酶融合序列配对。因而，每个构建体由单一可读框组成，所述可读框由以来自Thoseaasigna病毒的2A序列(Mattion等.(1996)J.Virol.70:8124-8127)分开的2个opaque-2核定位信号和锌指核酸酶融合序列构成。ZFN编码序列的表达由高度表达的组成性玉蜀黍泛素1启动子(Christensen等.(1992)PlantMol.Biol.18(4):675-89)驱动，并且侧翼有玉蜀黍Per53’多聚A非翻译区(美国专利6,699,984)。经由限制酶消化和经由DNA测序确认所得的6种质粒构建体。图2和3提供了完成的质粒构建体的图示。质粒构建体pDAB105906(图2)中表达的ZFN含有“Fok-Mono”，其是一种野生型FokI内切核酸酶。质粒构建体pDAB111809(图3)中表达的ZFN含有“Fok1-ELD”，其是一种经修饰的FokI内切核酸酶。经修饰的Fok1内切核酸酶含有变化，如记载于DoyonY.,VoT.,MendelM.,GreenbergS.,WangJ.,XiaD.,MillerJ.,UrnovF.,GregoryP.,andHolmesM.(2010)Enhancingzinc-finger-nucleaseactivitywithimprovedobligateheterodimericarchitecture.NatureMethods,8(1)；74-79的。

设计供体构建体以整合入E32基因座的经ZFN切割的基因组DNA中。图4显示了供体构建体pDAB100655，其由单一基因表达盒组成。此单一基因表达盒由玉蜀黍泛素1启动子(ZmUbi1启动子)、AAD-1编码序列(美国专利No.7,838,733)和玉蜀黍Per53’非翻译区(ZmPer53’UTR)构成。构建体含有AAD-1基因表达盒下游包含的一对重复玉米事件DAS-59132ZFN6结合序列。在基于pUC的高拷贝数质粒中装配各种基因元件。

实施例3：瞬时转化玉米Hi-II培养物以测定ZFN效率

ZFN基因的转化

如记载于美国专利7,179,902的那样生成玉米Hi-II胚胎发生培养物，并且用于评估和测试不同ZFN的效率。将由pDAB105901、pDAB105902、pDAB105903、pDAB105904、pDAB105905和pDAB105906组成的质粒DNA瞬时转化到玉米愈伤组织细胞中以比较不同ZFN与标准测试ZFN(即pDAB7430)(其针对玉米基因组内的肌醇多磷酸盐2-激酶基因基因座设计，如记载于美国专利申请No.2011/0119786的)的切割频率。

自Hi-II培养物，将来自先前冷冻保存的细胞系的12mL压紧细胞体积(PCV)及28mL条件化培养基传代培养到500mLErlenmeyer瓶中的80mLGN6液体培养基(N6培养基(Chu等.,(1975)SciSin.18:659–668),2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,pH6.0)中，并于28℃以125rpm置于摇动器上。使用相同细胞系将此步骤重复两次，使得在3个烧瓶间分配总共36mLPCV。在24小时后，将内容物倒入无菌PETRI^TM皿中，并且除去GN6液体培养基。将略微湿润的愈伤组织转移到含有滤纸的GN6S/M固体培养基(N6培养基(Chu等.,(1975)SciSin.18:659-668),2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,45.5g/L山梨醇,45.5g/L甘露醇,100mg/L肌肉肌醇,2.5g/LGelrite^TM,pH6.0)上的2.5cm直径圆圈。将板于28℃在黑暗中温育4小时。

通过称出21mg到无菌硅化1.7mL微量离心管(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)制备微粒金(0.6微米,BioRad,Hercules,CA,)以进行DNA沉淀，并添加350μL冰冷的100％乙醇，并且涡旋振荡1分钟。通过使用MINISPIN^TM离心机(Eppendorf,Hauppauge,NY)以10,000rpm离心15秒沉淀金。在除去上清液后，添加350μL冰冷的无菌水，用移液管上下混合，并以10,000rpm离心15秒。将清洗步骤再重复一次，之后在350μL冰冷无菌水中悬浮金。然后，于-20℃贮存清洗过的金，直至需要。

对于每次DNA沉淀，将50μL水中的3mg金等分取样到硅化的1.7mL微量离心管(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中。将质粒DNA(质粒pDAB105901,pDAB105902,pDAB105903,pDAB105904,pDAB105905或pDAB105906中的2.5μgE32ZFN和质粒pDAB7430中的2.5μgIPK1ZFN)在0.6mL微量离心管(FisherScientific,Nazareth,PA)中预先混合，并且添加到金悬浮液，温和上下移液5-10次以彻底混合。然后，添加20微升(20μL)冷0.1M亚精胺，并且通过上下移液5-10次温和混合。将50微升(50μL)冰冷的2.5M氯化钙缓慢添加，并且通过上下移液5-10次温和混合。然后，给管加盖，并且容许于室温温育10分钟。在以10,000rpm离心15秒后，小心除去上清液，并且添加60μL冰冷的100％乙醇。通过温和上下移液5-10次重悬金DNA混合物。

对于微粒轰击，将经灭菌的大载体(macrocarrier)(BioRad,Hercules,CA)安装到不锈钢固定器(holder)(BioRad,Hercules,CA)中，并且高压灭菌。将9微升(9μL)金/DNA悬浮液在大载体中心均匀分散，确保上下移液，从而保持悬浮液在等分试样间充分混合。然后，将大载体放到140x25mm玻璃PETRI^TM皿中8网孔DRIERITE^TM(W.AHammondDrieriteCo.,Xenia,OH)床上的一片无菌125mmWhatman#4滤纸(GEHealthcare,Buckinghamshire,UK)上。容许金/DNA彻底干燥约5-10分钟。通过在异丙醇中浸泡几秒灭菌破裂片(rupturediscs)(1,100psi,BioRad,Hercules,CA)，然后加载到微粒轰击装置(PDS-1000,BioRad,Hercules,CA)的保持帽(retainingcap)中。将经高压灭菌的终止屏(stoppingscreen)(BioRad,Hercules,CA)和加载的大载体放入发射装置中，旋上盖，并且放入轰击室中，刚好在喷嘴下。将含有靶物的PETRI^TM皿揭开，并且在喷嘴下6cm在轰击室中放置。抽成真空(-0.9巴)，并且将装置点火。对轰击的每种靶物重复上文描述的步骤。将靶物在相同的轰击介质上在黑暗中于28℃的温度温育24小时。将经轰击的细胞转移至回收GN6固体回收培养基(N6培养基(Chu等.,(1975)SciSin.18:659–668),2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,2.5g/LGelrite,pH6.0)，并于28℃在黑暗中再温育48小时。轰击后72小时，将细胞收获到2mLEPPENDORFMICROFUGESAFELOCKTUBES^TM中，并在VIRTISMODEL#50LVIRTUALXL-70LYOPHILIZER^TM(SPScientific,GardinerNY)中冻干48小时。

对瞬时转化玉米的下一代测序(NGS)分析

分析瞬时转化的玉米愈伤组织以测定锌指核酸酶蛋白的切割效率。

样品制备

将用ZFN构建体和2种对照载体pDAB100664和pDAB100665瞬时转化的玉米愈伤组织在2mLEPPENDORF^TM管中收集，并冻干48小时。使用QIAGENPLANTDNAEXTRACTIONKIT^TM(Valencia,CA)依照制造商的用法说明自冻干组织提取基因组DNA(gDNA)。在200μL水中重悬分离的gDNA，并且使用分光光度计(Invitrogen,Carlsbad,CA)测定浓度。通过在0.8％琼脂糖E-凝胶(Invitrogen)上运行样品评估DNA的完整性。将gDNA样品标准化(25ng/μL)以进行PCR扩增，从而生成扩增子，会经由ILLUMINA^TM测序(SanDiego,CA)分析所述扩增子。

用于扩增跨越每个测试的ZFN切割位点和对照样品的基因组区的PCR引物购自IntegratedDNATechnologies(Coralville,IA)。使用23.5μL反应中0.2μM合适引物、ACCUPRIMEPFXSUPERMIX^TM(1.1X,Invitrogen)和100ng模板基因组DNA通过温度梯度PCR鉴定用于引物的最佳扩增条件。循环参数是于95℃初始变性(5分钟)，接着是变性(95℃,15sec)、退火(55-72℃,30sec)、延伸(68℃,1min)的35个循环和最终延伸(72℃,7min)。在3.5％TAE琼脂糖凝胶上分析扩增产物。在鉴定最佳退火温度后，实施制备性PCR反应以确认每组PCR引物，并且生成ILLUMINA^TM测序扩增子。

对于制备性PCR，使用上文描述的条件对每个模板实施8个小规模PCR反应，并将所得的PCR产物合并在一起，并且使用QIAGENMINELUTEGELEXTRACTION/PURIFICATIONKIT^TM按照制造商的推荐在3.5％琼脂糖凝胶上用凝胶纯化。通过NANODROP^TM测定凝胶纯化的扩增子的浓度，并通过合并约100ng来自ZFN靶向物和相应野生型对照的PCR扩增子制备ILLUMINA^TM测序样品。下文表2中显示了用于PCR扩增子生成的引物。

表2

用于扩增ZFN结合位点的寡核苷酸。

ILLUMINA ^TM 测序和分析

设计ZFN以识别、结合和修饰转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座内的特定DNA序列。测定6个ZFN切割基因组基因座的效率以确定哪个ZFN最有效切割。在CofactorGenomics(St.Louis,MO)实施ILLUMINA^TM测序，并且使用序列分析脚本分析序列。过滤出低质量序列，并且依照独特的DNA序列标识符剖析剩余的序列。然后，将独特的DNA序列标识符与参照序列比对，并且在***/缺失(indel)方面评分。为了测定切割活性的水平，在源自***/缺失的序列变体的存在方面对ZFN切割位点周围的区域评分。将研究中每个ZFN的切割活性以具有***/缺失的序列数目/1M高质量序列或以具有***/缺失的高质量序列的百分比计算。通过相对于针对IPP2-K基因的ZFN的活性标准化切割活性的ZFN水平测定切割效率的水平，如记载于美国专利公开文本No.2011/0119786的。

含有25716和25717锌指结合域的E32ZFN6以最高的效率切割转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座。此ZFN以对照IPPK2锌指核酸酶效率的3.8倍发挥功能。鉴于E32ZFN6的高水平切割活性，选择此ZFN以用于经由非同源末端连接将供体DNA片段整合入基因组基因座中。

表3

测试eZFN的切割效率。

E32 ZFN编号	％IPPK2 ZFN活性
		25686/25687	32
25688/25689	108
		25712/25713	69
25716/25717	380

实施例4：玉米原生质体中E32ZFN的瞬时表达以证明对E32基因座的NHEJ靶向

建立用于基因靶向的快速测试***以靶向玉米事件DAS-59132的内源基因组基因座以及优化玉米中的供体靶向参数。在玉米事件DAS-59132的基因组内生成双链断裂，并且通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性依赖性修复(HDR)来修复。

原生质体分离

按3.5天传代培养日程表维持玉米Hi-II胚胎发生悬浮培养物。将10mL无菌6％(w/v)纤维素酶溶液和10mL无菌0.6％(w/v)果胶酶酶溶液移液到50mL锥形管中。接着，将4mL压紧细胞体积(packcellvolume,PCV)的Hi-II悬浮细胞添加入含有消化溶液的50mL管中，并且用包裹。将管于室温置于平台式振荡器上约16-18小时。接着，将细胞和酶溶液缓慢过滤流过50mL锥形管中放置的100μM细胞滤网。然后，使用100μM细胞滤网通过将10mLW5培养基移液流过滤网漂洗细胞。将细胞和酶溶液缓慢过滤流过70μM细胞滤网。此过滤步骤继之以另一个过滤步骤，其中将细胞和酶溶液缓慢过滤流过50mL锥形管中放置的40μM细胞滤网。使用10mL移液管尖端，用10mLW5培养基漂洗40μM细胞滤网以给出终体积40mL，并且倒转管。将8mL蔗糖缓冲溶液(cushionsolution)非常缓慢添加至原生质体/酶溶液的底部。使用具有摇摆臂桶式转子的离心机，以1,500rpm将管旋转15分钟。使用5mL窄孔移液器尖端取出原生质体细胞。将以原生质体带观察到的这些细胞(7-8mL)非常缓慢地取出，并且放入无菌50mL锥形管中。接着，使用25mLW5培养基清洗管。将W5清洗培养基添加至原生质体，并且将管缓慢倒转，并且以1,500rpm离心10分钟。除去上清液，并在缓慢倒转管的同时添加10mLMMG溶液以重悬原生质体团粒。使用血球计测定原生质体的密度。4个PCV产生约3000万个原生质体。

原生质体转化

使用MMG溶液将原生质体细胞稀释至每mL160万个原生质体。通过缓慢倒转管温和重悬原生质体。接着，将300μL原生质体(约500k原生质体)添加至无菌2mL管，并且倒转管以均匀分布原生质体细胞。将TE缓冲液中40-80μg浓度的质粒DNA添加至原生质体。表4中描述了实验条件。将管缓慢摇动以悬浮DNA与原生质体，并且于室温将管温育5-10分钟。接着，将300μLPEG溶液添加至原生质体/DNA溶液。一旦添加了所有PEG溶液，通过温和倒转管将PEG溶液与原生质体溶液混合。将混合物于室温在定期倒转管的情况下温育15-20分钟。在温育后，将1mLW5溶液缓慢添加至管，并且温和倒转管。最终，以1,000rpm将溶液离心15分钟。小心地除去上清液，使得不扰乱细胞团粒。添加1毫升清洗/温育溶液。温和倒转管以重悬细胞团粒。用铝箔覆盖管以消除对光的任何暴露，并且在架上以其侧面放置以温育过夜。在转化后24小时收获细胞以进行分子分析。

表4

用于原生质体转化的处理组。

使用NGS对靶向的序列确认

使用实施例3中描述的下一代测序法测定玉米原生质体中的ZFN切割活性。在源自***/缺失的序列变体的存在方面对测序的PCR扩增片段评分。来自每种E32ZFN6处理的***/缺失的相对频率在扩增子中在约1.5％的DNA分子处切割转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座。

使用内-外PCR证明靶向

经由内-外PCR反应确认经由NHEJ将含有AAD-1基因的供体盒靶向入转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座中，进入Hi-II玉米转基因细胞悬浮液中。内-外PCR反应扩增含有AAD-1基因供体和转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座的接合处的片段。将所得的扩增子进行第二次PCR反应，其中引物设计为在第一扩增子内在内部结合。两个独立PCR反应的组合导致除去可能是假阳性的背景扩增。

原生质体转化实验的内-外PCR结果证明了转基因玉米事件DAS-59132的基因组基因座可以用5.3kbAAD-1基因质粒供体和E32-ZFN6锌指核酸酶以1:10μgDNA比率进行可重复性靶向。通过以两个方向***AAD-1基因供体盒证明经由NHEJ法的靶向。内-外PCR扩增子的序列显示了供体DNA的完美整合的3个例子。

实施例5：WHISKERS^TM介导的ZFN和供体的稳定转化以在玉米Hi-II培养物中经由NHEJ靶向整合

将转基因事件靶向至玉米事件DAS-59132的内源基因组基因座。如实施例1中描述的构建体包含供体序列(pDAB100655)和事件32ZFN6(E32ZFN6；pDAB105906)。

将玉米愈伤组织细胞(其由来自先前冷冻保存的Hi-II细胞系的12mL压紧细胞体积(packedcellvolume,PCV)组成)及28mL条件化培养基传代培养入500mLErlenmeyer瓶中的80mLGN6液体培养基(N6培养基(Chu等.,(1975)SciSin.18:659–668),2.0mg/Lof2,4-D,30g/L蔗糖,pH5.8)，并且于28℃以125rpm置于摇动器上。使用相同细胞系将此步骤重复两次，使得在3个烧瓶间分布总共36mLPCV。在24小时后，将GN6液体培养基除去，并用72mLGN6S/M渗透培养基(N6培养基,2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,45.5g/L山梨糖醇,45.5g/L甘露醇,100mg/L肌肉肌醇,pH6.0)替换。将烧瓶在黑暗中于28℃在中等搅动(125rpm)的情况下温育30-35分钟。在温育期期间，通过将8.1mLGN6S/M液体培养基添加至405mg无菌碳化硅WHISKERS^TM制备50mg/mL碳化硅WHISKERS^TM(AdvancedCompositeMaterials,LLC,Greer,SC)悬浮液。

在GN6S/M渗透培养基中温育后，将每个***内容物合并入250mL离心管中。在烧瓶中的所有细胞沉到底部后，将超过约14mLGN6S/M液体的内容物体积抽出，并且在无菌1L烧瓶中收集以供未来使用。将预先湿润的WHISKERS^TM悬浮液在涡旋上以最大速度混合60秒，然后添加至离心管。

在此实施例中，将159μgpDAB100655(供体序列)和11μgpDAB10506(ZFN)质粒DNA添加至每个瓶。一旦添加质粒DNA，将瓶立即置于改良的REDDEVIL5400^TM商业油漆混合器(RedDevilEquipmentCo.,Plymouth,MN)中，并且搅拌10秒。在搅拌后，将细胞、培养基、WHISKERS^TM和质粒DNA的混合物与125mL新鲜GN6液体培养基一起添加至1L烧瓶内容物以降低渗透剂(osmoticant)。容许细胞在设置于125rpm的摇动器上恢复2小时。使用与房式真空线连接的玻璃细胞收集器单元将约6mL分散悬浮液过滤到Whatman#4滤纸(5.5cm)上，使得每瓶获得60份滤物。将滤物放到GN6固体培养基(与GN6液体培养基相同，只是具有2.5g/L草铵膦(glufosinate))的60x20mm板上。

推定的靶向事件的鉴定和分离

DNA投递后1周，将滤纸转移到含有选择剂的GN6(1H)选择培养基(N6培养基,2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,100mg/L肌肉肌醇,2.5g/LGelrite,pH5.8)的60x20mm板。将这些选择板于28℃在黑暗中温育1周。在黑暗中选择1周后，通过将来自每板的1/2细胞刮到含有于37-38℃保持的3.0mLGN6琼脂糖培养基(N6培养基,2.0mg/L2,4-D,30g/L蔗糖,100mg/L肌肉肌醇,7g/L琼脂糖,pH5.8,于121℃高压灭菌10分钟)的管中将组织包埋到新鲜培养基上。

用抹刀破碎琼脂糖/组织混合物，然后将3mL琼脂糖/组织混合物均匀倒入含有GN6(1H)培养基的100x25mmPETRI^TM皿表面上。对每个板的两个半边都重复此过程。一旦包埋了所有组织，将板于28℃在黑暗条件下温育长达10周。从包埋板取出在这些选择条件下生长的推定转化隔离群，并且将其转移到60x20mm板中的新鲜选择培养基。若在约2周后持续生长是明显的，则事件视为对应用的除草剂(选择剂)有抗性，并且随后收获细胞的等分试样以进行基因型分析。在此实施例中，从6个处理瓶回收24个事件。将这些事件进一步进行分子分析以确认整合。

对E32基因座的NHEJ靶向的分子分析

使用几种不同分子工具分析如上文描述的自WHISKERS^TM介导的转化回收的24个事件。作为分析的结果，鉴定出含有E32基因组基因座内整合的AAD-1转基因拷贝的事件。确认24个各种事件含有AAD-1转基因拷贝，然后测定是否存在有通过***/缺失或通过***AAD-1盒对E32位点的破坏。对在AAD-1基因和破坏的ZFN位点的存在上呈阳性的事件进一步表征预期供体和靶接合片段的存在(通过内-外PCR)和预期的分子量片段，其对应于Southern印迹中指示E33基因组基因座内供体DNA区的靶向***的条带大小。这些测定法确认含有经由NHEJ机制在E32基因组基因座内整合的AAD-1转基因拷贝的事件。

DNA提取

使用QIAGENBIOSPRINT96^TMDNA分离试剂盒按照制造商的推荐自冻干的玉米愈伤组织提取DNA。使用预先限定的程序进行自动提取，并且在200μL1:1TE缓冲液/蒸馏水中洗脱DNA。在THERMOSCIENTIFICNANODROP8000^TM上量化2微升(2μL)每种样品，并使用QIAGENBIOROBOT3000^TM将样品标准化为100ng/μL。将标准化的DNA于4℃贮存，直至进一步分析。

拷贝数评估

通过使用480***(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)的实时PCR实施通过水解探针测定法(类似于测定法)的转基因拷贝数测定。使用探针设计软件2.0对AAD-1和内部参照基因转化酶(Invertase)设计测定法。对于扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表5)的10μL体积多重反应中以1倍终浓度制备480探针主混合物(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)。在荧光采集的情况下通过于60℃延伸40秒实施两步扩增反应。使用软件版1.5使用相对定量模块(relativequantmodule)实施实时PCR拷贝数数据分析，并且该分析基于ΔΔCt法。对此，每次运行中包括来自单一拷贝校准物的gDNA样品和已知的两拷贝检验。

表5

用于AAD-1和内部参照的水解探针测定法的引物/探针序列。

玉米事件DAS-59132基因组基因座破坏测定法

通过使用480***(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)的实时PCR实施玉米事件DAS-59132的基因组基因座破坏测定法。使用探针设计软件2.0设计测定法以监测E32ZFN6(25716/25717)结合和切割E32基因座和内部参照基因转化酶的基因组序列的特异性。对于扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表6)的10μL体积多重反应中以1倍终浓度制备480探针主混合物(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)。在荧光采集的情况下通过于55℃延伸30秒实施两步扩增反应。使用靶物与参照比率实施破坏测定法的分析(图5)。8个事件中的4个鉴定为含有整合入玉米事件DAS-59132的基因组基因座中的AAD-1转基因。将以下事件进行进一步分子分析以确认AAD-1转基因在玉米事件DAS-59132的基因组基因座内的整合，所述事件由事件100655/105906[1]-001、事件100655/105906[5]-013、事件100655/105906[5]-015、和事件100655/105906[3]-018组成。

事件32基因座特异性内-外qPCR

可以在两个取向之一发生经由NHEJ在E32的基因组基因座内***AAD-1供体DNA。用内-外PCR测定法确认AAD-1转基因的整合和***物的取向。内-外PCR测定法利用“外”引物，其设计为结合E32的基因组基因座；“内”引物设计为结合AAD-1供体序列。使用这些引物的扩增反应仅扩增在靶位点***的供体基因。所得的PCR扩增子代表在***物的5’或3’端的E32靶位点和供体DNA序列的接合片段。测定法中包括阳性和阴性对照。构建两种阳性对照质粒pDAB100664和pDAB100665以模拟以两个不同取向中的每个在E32的基因组基因座处的供体***。

对于内-外PCR，在PCR混合物中使用DNA嵌入染料以在具有荧光检测能力的热循环仪上以实时检测扩增。另外，将熔解温度(Tm)分析程序附接于常规PCR程序，从而可以对扩增产物分析其Tm概况(profile)。未知样品和阳性对照样品的Tm概况之间的任何相似性会指示未知样品与阳性对照具有相同的扩增产物。使用10ng模板基因组DNA、0.2μMdNTP、0.2μM正向和反向引物、4μM和0.15μLExTaqHS进行PCR反应。在两步中完成反应：第一步由于94℃(2分钟)的1个循环和于98℃(12秒)、66℃(30秒)和68℃(1.3分钟)的35个循环组成；第二步是覆盖60-95℃，接着是65℃(30秒)和72℃(10分钟)的Tm程序(表6)。对扩增子测序以确认AAD-1基因已经在E32的基因组基因座内整合。

使用ABI软件显现实时内-外PCR扩增子的结果。使用凝胶迁移测定法进一步确认这些结果，其中在1.2％TAE凝胶上运行扩增子。预期的扩增子大小是约1.8kb(对于pDAB100664中描绘的取向)和约2kb(对于pDAB100665中描绘的取向)。凝胶迁移测定法结果确认实时内-外PCR数据。

基因座破坏数据和内-外PCR提示了1个拷贝的AAD-1转基因已经在通过2,4-D上选择回收的一些玉米事件中经由NHEJ整合入E32基因座中。

表6

用于内-外PCR以检测NHEJ介导的靶向的引物。

Southern印迹分析

使用Southern印迹测定法进一步筛选上文鉴定为推定靶向的玉米愈伤组织事件以确认AAD-1转基因已经经由NHEJ整合入E32基因座中。Southern印迹分析实验产生证明玉米基因组内AAD-1转基因的整合和完整性的数据。

DNA提取

自从每个单个事件收获的愈伤组织提取基因组DNA。最初，将组织样品在2mL管中收集，并且冻干2天。用KLECOTISSUEPULVERIZER^TM和钨珠(Kleco,Visalia,CA)实施组织浸渍。在组织浸渍后，使用DNEASYPLANTMINIKIT^TM(Qiagen,Germantown,MD)依照制造商建议的方案分离基因组DNA。

使用QUANT-ITPICOGREENDNAASSAYKIT^TM(MolecularProbes,Invitrogen,Carlsbad,CA)量化基因组DNA(gDNA)。将量化的gDNA调整至4μg以进行Southern印迹分析。然后，将DNA样品使用NcoI限制酶(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)于37℃消化过夜，并使用QUICK-PRECIP^TM(EdgeBioSystem,Gaithersburg,MD)依照制造商建议的方案纯化。将DNA在1X染料中重悬，并在0.8％SEAKEMLEAGAROSE^TM(Lonza,Rockland,ME)凝胶上电泳5小时。将凝胶变性，中和，然后转移至尼龙带电膜(Millipore,Bedford,MA)过夜，并使用UVSTRATALINKER1800^TM(Stratagene,LaJolla,CA)将DNA与膜交联，并将印迹与20mLPERFECTHYBPLUS^TM(Sigma,St.Louis,MO)预先杂交。将226bp探针SEQIDNO:34(GTGCATTCGGATTACTGTTTAGTCGAGTCATATTTAAGGAATTCATTGTAAATGTTCTAACCTAACCTAAGTATTAGGCAGCTATGGCTGATATGGATCTGATTGGACTTGATTTATCCATGATAAGTTTAAGAGCAACTCAAAGAGGTTAGGTATATATGGTTTTGTAAAGGTAAATTTAGTTAATATTAGAAAAAAAAAGTGTATCCAATAGGCTCTATAAACA)使用PRIME-ITRMTRANDOM^TM(Stratagene,LaJolla,CA)依照制造商建议的方案标记，并使用PROBEQUANTG-50MICROCOLUMNS^TM(GEHealthcare,Buckinghamshire,UK)按照制造商建议的方案纯化。将约20x10⁶cpm经标记探针添加至印迹，并温育过夜。将印迹清洗两次，每次清洗15分钟，并在磷光图像屏(phosphorimagescreen)上放置24小时，并通过STORM860SCANNER^TM(MolecularDynamics)分析。

来自Southern印迹分析的结果显示了来自一些事件的DNA具有自供体DNA经由NHEJ对E32基因座的整合预期大小的NcoI条带(2.9和5.5kb)。

将经转化的玉米组织再生成能育玉米植物，其携带由通过供体DNA导入的AAD-1基因赋予的对2,4-二氯苯氧基乙酸除草剂的真育表型抗性。

实施例6：玉蜀黍栽培种Hi-II中经由同源性指导的修复靶向事件32

质粒载体

构建含有ZFN表达构建体的质粒载体，如实施例2中描述的。质粒构建体pDAB105906(图2)中表达的ZNF含有作为野生型FokI内切核酸酶的“Fok-Mono”。质粒构建体pDAB111809(图3)中表达的ZFN含有作为经修饰的FokI内切核酸酶的“Fok1-ELD”。经修饰的Fok1内切核酸酶含有变化，如记载于DoyonY.,VoT.,MendelM.,GreenbergS.,WangJ.,XiaD.,MillerJ.,UrnovF.,GregoryP.,和HolmesM.(2010)Enhancingzinc-finger-nucleaseactivitywithimprovedobligateheterodimericarchitecture.NatureMethods,8(1)；74-79的。

设计供体构建体pDAB107855(图15)并构建为整合入DAS-59132基因组基因座的经ZFN切割的基因组DNA中。此单一基因表达盒由OsAct1启动子、膦丝菌素乙酰基转移酶(PAT)编码序列::和ZmLip3’UTR构成。另外，将供体质粒设计为具有在靶PAT基因任一端的1kb序列(同源性臂)，其与DAS-59132基因组基因座中ZFN切割位点的任一端的序列同源。同源性臂充当同源重组装置用于将转基因***基因组ZFN切割位点中的底物。在基于pUC的高拷贝数质粒中装配各种基因元件。

植物转化

使用pDAB107855(供体序列)和pDAB105906(ZFN)质粒DNA完成WHISKERSTM转化，如实施例5中描述的。

分子分析以确认pat基因盒对Hi-II的E32基因座的靶向整合

DNA提取

如实施例5中描述的那样完成DNA提取。

靶向基因座破坏测定法

WHISKERS^TM介导的用DAS-59132-ZFN和供体质粒转化Hi-II愈伤组织细胞导致靶向性和随机的转基因***。为了区别随机***事件与靶向性事件群体，最初使用基因座破坏测定法(使用表7中的引物完成，如实施例5中描述的)筛选生成的所有854个事件。此测定法测定基因座内的ZFN结合位点是否保持完整或是否已经经由ZFN切割或供体***而被破坏。基因组基因座内的破坏的指示是ZFN已经切割内源DAS-59132靶基因座并且指示供体DNA分子的靶向***的最初证据。将引物设计为扩增含有ZFN识别位点的内源靶区域，并且建立样品以通过qPCR分析。完整区域的扩增(指示未靶向事件)导致以可检测qPCR信号测量的140个碱基对的扩增子。供体分子的成功靶向整合导致可检测qPCR信号的破坏，并且显示为与对照相比更低的总体信号。

表7

用于靶向性基因座破坏测定法的寡核苷酸引物和探针序列。

用破坏测定法筛选自精确转化生成的854个事件，并且基于靶物对参照信号的显著下降来评分为破坏的。结果指示测定的854个事件中的63个在靶定基因座处具有破坏的信号，指示在该位点处的靶向性基因***或***/缺失。

靶向性基因座内-外PCR测定法

使用内-外PCR如实施例5中描述的那样并且使用表8中的引物进一步确认***物的存在。使用标准凝胶迁移测定法进一步确认在实时***上鉴定的阳性样品。

表8

用于DAS-59132基因座内-外测定法的引物和探针序列。

经由Southern印迹和测序(下一代测序的标准)进一步确认破坏测定法和靶向性基因座内-外PCR测定法的结果。

在此实施例中，提交的总共854份样品中的63个事件显示E32基因座的破坏。在这些中，通过内-外PCR和Southern分析鉴定8个靶向性事件。

将经转化的玉米组织再生成能育玉米植物，其携带供体DNA的真育表型，即对草铵膦和L-膦丝菌素除草剂的抗性。

实施例7：土壤杆菌介导的质粒载体投递以进行玉蜀黍栽培种B104中的事件32基因座破坏

转化

使用超二元转化***(美国专利5,591,616)用二元构建体pDAB108688(对照载体，图6)和pDAB108690(靶向载体，图7)转化玉蜀黍栽培种B104。因此，使用土壤杆菌以将ZFN投递至E32基因组基因座。获得转基因玉米愈伤组织，并经由分子确认测定法分析以测定玉蜀黍栽培种B104的E32基因组基因座被破坏与否。测定法的结果确认可以使用土壤杆菌投递ZFN以切割并破坏E32基因组基因座。

二元载体

将二元构建体pDAB108690(靶向载体，图7)设计并构建以含有供体基因表达盒和ZFN基因表达盒。此供体基因表达盒由玉蜀黍泛素1基因启动子(ZmUbi1启动子)、AAD-1编码序列构成，并且以玉蜀黍脂肪酶3’非翻译区(ZmLip3’UTR)为末端。另外，将供体质粒设计为具有在AAD-1基因的任一端的1kb序列(同源性臂)，其与E32基因组基因座中的ZFN切割位点任一端的序列同源以促进通过HDR的供体***。ZFN基因表达盒由稻肌动蛋白1基因启动子(OsAct1启动子)、25716和25717ZFN编码序列和ZmPer53’UTR构成。另外，将第二种对照二元构建体pDAB108688(对照载体,图6)设计并构建以含有AAD-1基因相同的基因表达盒。另外，将供体质粒设计为具有靶aad-1基因的任一端的1kb序列(同源性臂)，其与E32基因组基因座中ZFN切割位点的任一端的序列同源。

玉蜀黍栽培种B104转化

将构建体转移入土壤杆菌中，并用于转化玉蜀黍栽培种B104。利用的转化规程记载于美国专利公开文本No.2013/0157369。在完成转化后，选择分离的玉米愈伤组织，并且自含有除草剂选择剂的培养基获得。表9显示了实验中的转化频率。经由分子分析来分析所得的事件以确认经由土壤杆菌介导的转化投递ZFN和供体后ZFN介导的玉蜀黍栽培种B104的E32基因座的切割。

表9

使用pDAB108688(对照载体)和pDAB108690(靶向载体)生成的转化事件的汇总。

自愈伤组织的基因组DNA分离以进行PCR

如实施例5中描述的那样分离基因组DNA。

拷贝数测定

通过使用480***(RocheAppliedScience)的实时PCR实施通过水解探针测定法(类似于测定法)的转基因检测。设计测定法以检测AAD-1和ZFN破坏，并且与内部参照测定法(转化酶)多重化处理(multiplex)以确保每个测定法中存在合适量的gDNA。对于扩增，在含有0.4μM每种引物和0.2μM每种探针(表10)的10μL体积多重反应中以1倍终浓度制备480探针主混合物(RocheAppliedScience,Indianapolis,IN)。通过于60℃延伸40秒(对于AAD1反应)或于60℃延伸30秒(对于ZFN破坏反应)且在荧光采集的情况下实施两步扩增反应。

使用Cp得分(荧光信号与背景阈值交叉的点，其使用拟合点算法(Light软件版1.5)和相对定量模块(基于ΔΔCt法))实施实时PCR数据的分析。

ZFN破坏qPCR测定法测定ZFN靶位点是否是完整的或者在实验期间已经被修饰(通过供体***或通过NHEJ)。此测定法使用RocheUPL探针及引物，其设计为在ZFN切割位点和探针杂交区外部退火(图8)。若事件在两个等位基因处被破坏，则与对照相比靶物对参照比率是降低的。非靶向对照和没有被破坏的事件的分析显示0.4至0.6范围中的靶物对参照比率；破坏的事件显示了0.2至0.35范围中的靶物对参照比率(图9)。

此数据证明了可以通过经由土壤杆菌介导的转化导入ZFN来切割E32基因座。

表10

用于qPCR的引物和探针。

实施例8：在玉蜀黍栽培种B104中经由同源性指导的修复的事件32基因座靶向

载体

用于表达ZFN的质粒载体记载于实施例2中。

供体构建体pDAB104179(图10,SEQIDNO:61)(其设计为整合入E32基因组基因座的经ZFN切割的基因组DNA中)是一种单一基因表达盒，其由OsAct1启动子、PAT编码序列和ZmLip3’UTR构成。另外，将供体质粒设计为具有在靶PAT基因的任一端的1kb序列(同源性臂)，其与E32基因组基因座中ZFN切割位点的任一端的序列相同以促进供体DNA区的整合。

使用颗粒轰击转化入B104中

将近交系玉蜀黍栽培种B104的穗自花传粉，并在未成熟的胚的长度是约1.8–2.2mm时收获。将脱壳的穗转运到实验室以进行灭菌。将#4不锈钢解剖刀柄(缺乏刀片)的末端放入每个穗的远端部分中。使用液体去污剂(ALCONOX,Inc.)用指甲刷洗擦穗，并且通过在20％商业漂白剂(Ultra商业漂白剂,6.15％次氯酸钠)中浸没20分钟表面灭菌，然后在层流净化罩内部用无菌去离子水漂洗3次。将未成熟的合子胚自每个穗在无菌条件下切出，并放入Eppendorf^TM管中，该管含有约2.0mL“LS-inf培养基”(LS盐,N6维生素,68.5g/L蔗糖,36g/LD-葡萄糖,700mg/LL-脯氨酸和1.5mg/L2,4-D)。将管的内容物导到“静置培养基(restingmedium)”(MS盐和维生素,30g/L蔗糖,700mg/LL-脯氨酸,15mg/L硝酸银,500mg/LMES,100mg/L酪蛋白水解物,100mg/L肌肉肌醇和3.3mg/L麦草畏(dicamba)，调节至pH5.8并用2.3g/LGelzan^TM固化)的板上，除去过量的液体，并将胚以小盾片面朝上取向。将板于28℃在以50μmoles/m²s的24小时连续光照的情况中放置3天。

轰击前4小时，在“渗透培养基”(具有45.5g/L山梨糖醇和45.5g/L甘露醇添加的静置培养基)的培养皿中心在2.5cm直径区内以小盾片面朝上安排30个胚。轰击前将胚在此培养基上以50μmoles/m²s于28℃温育4小时。

为了制备金微粒以进行轰击，将15mg0.6微米金(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)称重入硅化的微量离心管中，并且添加500μL冷乙醇(100％)。将管在超声水浴中超声处理15秒，容许于室温放置30分钟，然后以3,000rpm离心60秒。除去上清液，并添加1mL冷的无菌水。将管用指涡旋振荡，容许沉降3-5分钟，并且以3,000rpm离心60秒。除去上清液，并将水清洗再重复两次。在第二次水清洗后，将金在500μL冷水中重悬，超声处理15秒，并一次等分取样25μL到10个无菌硅化微量离心管中。于-20℃冷冻各个管，直至使用。

对于将DNA沉淀到制备的金微粒上，对于要轰击的每10个板融化1管的金。将管在超声水浴中超声处理15秒，用指涡旋振荡，然后在层流净化罩上轻敲以收集所有液滴到底部。为了获得20:1摩尔比率的供体与锌指构建体，将4.75μg供体DNA(pDAB104182)与0.25μg锌指(pDAB105941)预混合，然后添加至金，期间上下移液。添加50μL2.5M氯化钙(无水)，期间上下移液，并且添加20μL0.1M亚精胺(游离碱)，期间上下移液。将管放置于设置为2的的Turbomix^TM附件上，并容许于室温摇动10分钟。将管自摇动器取出，并容许沉降3-5分钟，之后以5,000rpm离心15秒。除去上清液，添加250μL冷乙醇(100％)，并将管用指涡旋振荡以消除团粒，并且确保一致的悬浮液。经DNA包被的微粒沉降3-5分钟，并且以5,000rpm将管再离心15秒。在120μL冷乙醇(100％)中重悬团粒，并用指涡旋振荡以确保分散。将大载体放入大载体固定器中，高压灭菌以实现无菌性，用10μL制备的溶液包被，并容许完全干燥，之后轰击。

使用PDS-1000^TM(Bio-Rad)按制造商的使用说明以900psi在28英寸真空下以距离终止屏6cm的距离处完成胚的轰击。将每个样品轰击一次，然后回到于28℃50μmoles/m²s24小时光照过夜。次日，在相同的温度和光照条件下将胚转移至新鲜的“静置培养基”达7天。随后，将胚转移至“sel-5Bi培养基”(具有5mg/L双丙氨磷(Bialaphos)添加的静置培养基)达7天，第二次转移到相同培养基达14天，然后转移至相同温度和光照条件下的“pre-regen培养基”(MS盐和维生素,30g/L蔗糖,700mg/LL-脯氨酸,15mg/L硝酸银,500mg/LMES,100mg/L酪氨酸水解物,100mg/L肌肉肌醇和3.3mg/L麦草畏,2.5mg/LABA,1mg/LBAP,0.5mg/LNAA和5mg/L双丙氨磷，调节至pH5.8并用2.3g/LGelzan固化)达7天。然后，于28℃在16/8光照/黑暗光周期下以90μmoles/m²s光照将组织转移至“regen培养基”(MS盐和维生素,30g/L蔗糖,100mg/L肌肉肌醇和5mg/L双丙氨磷，调节至pH5.8并用2.3g/LGelzan固化)达14天。在150-200μmoles/m²s光照下于28℃使用相同光周期将小植物转移至“植物强健(robusting)培养基”(MS盐和维生素,30g/L蔗糖,500mg/LMES和100mg/L肌肉肌醇，调节至pH5.8并用2.3g/LGelzan固化)。一旦植物生长到至少8cm，在湿冰上收集叶组织的2cm切片，并投递至4℃冷室以进行分析。然后，将小植物移植入土壤中，并且转移至温室中，并经由分子分析来分析。

分子分析双丙氨磷选择的事件

自愈伤组织的基因组DNA分离以进行qPCR

在96孔收集板(Qiagen)中收集组织样品，并冻干48小时。用Kleco^TM组织粉碎机(GarciaManufacturing,Visalia,CA)在具有1个不锈钢珠的Biosprint96RLT裂解缓冲液^TM中实施组织破坏。在组织浸渍后，使用Biosprint96Plantkit^TM(Qiagen)和Biosprint96extractionrobot^TM以高通量形式分离基因组DNA。然后，将基因组DNA稀释至2ng/μL。

拷贝数测定

如实施例7中描述的那样完成基因拷贝数和破坏测定法。非靶向对照和没有被靶向或破坏的事件的分析显示了0.4至0.6范围中的靶物对参照比率；破坏或靶向事件显示0.2至0.35范围中的靶物对参照比率(图12)。

表11

用于qPCR的引物和探针

基因座特异性内-外PCR

如实施例5中描述的那样完成基因座特异性内-外PCR。

表12

用于内-外PCR的引物序列。

5’端扩增子的预期扩增大小是1,874bp，而3’端扩增子的预期扩增大小是2,089bp。将PCR条带切出并测序。所得的序列数据确认扩增子含有预期的基因组E32基因座-供体染色体接合序列。

Southern印迹

通过Southern印迹分析来自显示阳性破坏的事件和内-外PCR的DNA以确认靶物处完整的供体***。将DNA用NcoI消化，并用同源性臂外部的侧翼基因组DNA探查(图14)。对内源非靶向基因座预测1,950bp处的条带，而对靶定基因座预测4,370bp条带。

对于Southern，在终体积125μL中用50个单位的NcoI(NewEnglandBioLabs)在1倍缓冲液3(NewEnglandBioLabs)中消化基因组DNA(1μg至5μg)。将样品于37℃温育过夜。用QuickPrecipitationSolution^TM(EdgeBiosystems)依照制造商建议的方案通过再沉淀浓缩消化的DNA。将回收的消化物在30μL1倍加载缓冲液中重悬，并于65℃温育30分钟。将重悬的样品加载到在1XTAE(0.8MTris-乙酸盐[pH8.0]/0.04mMEDTA)中制备的0.8％琼脂糖凝胶上，并在1XTAE缓冲液中电泳。将凝胶序贯进行变性(0.2MNaOH/0.6MNaCl)30分钟，和中和(0.5MTris-HCl[pH7.5]/1.5MNaCl)30分钟。通过将20XSSC溶液过夜被动芯吸通过凝胶到经处理的ImmobilonNY+^TM(Millipore)实施DNA片段的转移。转移后，将膜用2XSSC短暂清洗，与StrataLinker1800^TM(Stratagene)交联，并于80℃烘烤1小时。

使用400型杂交培养箱^TM(RobbinsScientific)在玻璃滚瓶中于65℃将印迹与预杂交溶液(PerfectHybplus^TM,Sigma)一起温育1小时。对于探针制备，用引物(表13)PCR扩增在供体同源性区外部的基因组序列，并使用QIAquick基因提取试剂盒^TM(Qiagen)自琼脂糖凝胶纯化。使用II随机引物标记试剂盒^TM(Stratagene)依照制造商建议的方案用3000Ci/mmolα32P-dCTP(Perkin/Elmer/BLU513H)标记片段。以每mL/杂交缓冲液约2x10⁶个计数于65℃将印迹与变性探针杂交过夜。杂交后，于65℃用0.1XSSC/0.1％SDS清洗印迹40分钟。使用磷光成像仪屏(MolecularDynamics)暴露印迹，并使用StormImagingSystem^TM(MolecularDynamics,Storm860^TM)成像。

表13

用于产生Southern探针的引物

名称	SEQ ID NO:	寡聚物序列
			MAS600	SEQ ID NO:72	TGTTTATAGAGCCTATTGGATACA
MAS603	SEQ ID NO:73	AGTGCATTCGGATTACTGTTTAGTC

通过破坏和内-外PCR筛选总共912个事件，并且基于Southern分析确认16个是靶向性的。E32基因组基因座内供体片段的靶向频率计算为1.8％。

虽然为了理解清楚的目的已经通过例示和实施例相当详细地提供了公开内容，本领域技术人员应当显而易见的是，可以在不偏离本公开内容的精神或范围的前提下实施各种变化和修改。因而，前述说明和实施例不应解释为限制性的。

Claims (20)

1.一种用于将一种或多种外源核酸序列整合入具有E32基因座的玉米细胞基因组中的方法，所述方法包括：使用位点特异性核酸酶在所述E32基因座中进行双链切割，对所述玉米细胞的基因组在所述E32基因座内将包含所述一种或多种外源序列的多核苷酸连接入所述切割中。

2.权利要求1的方法，其中所述位点特异性核酸酶包含选自表1A中显示的组的一个或多个锌指核酸酶。

3.权利要求1的方法，其进一步包括表达所述一种或多种外源序列的产物的步骤。

4.权利要求2的方法，其进一步包括表达所述一种或多种外源序列的产物的步骤。

5.权利要求1的方法，其中所述一种或多种外源核酸序列包含编码序列、调节序列、或DNA结合域的靶位点。

6.权利要求2的方法，其中所述一种或多种外源核酸序列包含编码序列、调节序列、或DNA结合域的靶位点。

7.权利要求3的方法，其中所述一种或多种外源核酸序列包含编码序列、调节序列、或DNA结合域的靶位点。

8.权利要求4的方法，其中所述一种或多种外源核酸序列包含编码序列、调节序列、或DNA结合域的靶位点。

9.权利要求5的方法，其中所述编码序列编码产物，该产物赋予：除草剂抗性；除草剂耐受性；昆虫抗性；昆虫耐受性；疾病抗性；疾病耐受性；应激耐受性；应激抗性；氧化应激的变化；增加的油产量；食物含量和组成的变化；物理外观的变化；雄性不育；干燥(drydown)；可竖立性(standability)；出产力(prolificacy)；淀粉量或质量的变化；油质量的变化；蛋白质量或质量的变化；氨基酸组成的变化或其组合。

10.权利要求6的方法，其中所述编码序列编码产物，该产物赋予：除草剂抗性；除草剂耐受性；昆虫抗性；昆虫耐受性；疾病抗性；疾病耐受性；应激耐受性；应激抗性；氧化应激的变化；增加的油产量；食物含量和组成的变化；物理外观的变化；雄性不育；干燥；可竖立性；出产力；淀粉量或质量的变化；油质量的变化；蛋白质量或质量的变化；氨基酸组成的变化或其组合。

11.权利要求7的方法，其中所述编码序列编码产物，该产物赋予：除草剂抗性；除草剂耐受性；昆虫抗性；昆虫耐受性；疾病抗性；疾病耐受性；应激耐受性；应激抗性；氧化应激的变化；增加的油产量；食物含量和组成的变化；物理外观的变化；雄性不育；干燥；可竖立性；出产力；淀粉量或质量的变化；油质量的变化；蛋白质量或质量的变化；氨基酸组成的变化或其组合。

12.权利要求8的方法，其中所述编码序列编码产物，该产物赋予：除草剂抗性；除草剂耐受性；昆虫抗性；昆虫耐受性；疾病抗性；疾病耐受性；应激耐受性；应激抗性；氧化应激的变化；增加的油产量；食物含量和组成的变化；物理外观的变化；雄性不育；干燥；可竖立性；出产力；淀粉量或质量的变化；油质量的变化；蛋白质量或质量的变化；氨基酸组成的变化或其组合。

13.权利要求3的方法，其中所述外源序列选自下组：PAT基因和AAD-1基因。

14.权利要求4的方法，其中所述外源序列选自下组：PAT基因和AAD-1基因。

15.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸进一步包含与所述E32基因座中的序列同源的核苷酸序列。

16.根据权利要求15的方法，其中同源核苷酸序列在所述外源序列侧翼。

17.权利要求1的方法，其中所述多核苷酸进一步包含启动子。

18.权利要求1的方法，其中将一种或多种整合的外源核酸序列传给后续世代中的后代。

19.一种玉米植物或玉米植物部分，其包含依照权利要求1的方法整合入所述E32基因座中的一种或多种外源序列。

20.一种玉米种子，其包含依照权利要求1的方法整合入所述E32基因座中的一种或多种外源序列。