CN105378078A - 用于治疗胃肠道间质瘤(gist)的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的特征在于编码嵌合免疫受体(CIRs)的核酸构建体，所述嵌合免疫受体(CIRs)可用于治疗患者中KIT+相关疾病。通常，CIRs包含与KIT+肿瘤细胞相互作用并破坏KIT+肿瘤细胞的胞外结构域(例如，KIT-配体(KL)或干细胞因子(SCF))、跨膜结构域，以及用于介导T细胞活化的胞质结构域(例如CD3ζ和/或CD28结构域)。本发明的特征还在于核酸构建体和/或表达CIRs的宿主细胞在治疗KIT+相关疾病，特别是胃肠道间质瘤(GIST)中的用途。

Description

用于治疗胃肠道间质瘤(GIST)的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求提交于2013年2月4日的美国临时申请No.61/760464的优先权的权益，该临时申请通过引用并入本文。
发明背景
胃肠道间质瘤(GIST)是最常见的G1间质赘生物。已经证明对患有弥散性GIST的患者在辅助设施中，甲磺酸伊马替尼显著延长无病生存期。不幸的是，大部分用伊马替尼治疗的患有转移性GIST的患者发展出抗性和随后发展出进展性疾病。对于发展出对酪氨酸激酶抑制剂(TKI)疗法如伊马替尼无反应的晚期GIST的患者，治疗选择是有限的。因此，在现有技术中，存在对用于治疗GIST，特别是抗传统疗法的形式的替代性疗法的需求。
发明总述
本发明特征在于编码嵌合免疫受体(CIR)蛋白的核酸构建体，所述嵌合免疫受体(CIR)蛋白包含：a)KIT-配体(KL)的胞外结构域，或其片段，或对抑制KIT二聚化特异的部分(例如，抗体或抗体片段)，b)跨膜结构域，以及c)胞质结构域，其中所述跨膜结构域包括CD3ζ链的结构域，或其片段，并且所述胞质结构域包括CD3ζ链的结构域，或其片段。本发明的特征还在于编码CIR蛋白的核酸构建体，所述CIR蛋白包含：a)KIT-配体的胞外结构域，或其片段，或对抑制KIT二聚化特异的部分(例如，抗体或抗体片段)，b)跨膜结构域，以及c)胞质结构域，其中所述跨膜结构域包括CD28的结构域，或其片段，并且所述胞质结构域包括CD3ζ链结构域和CD28的结构域，或其片段。
在某些实施方案中，胞外结构域进一步包括CD28的结构域，或其片段。在一个实施方案中，当表达于T细胞中时，CIR蛋白能够在酪氨酸-蛋白激酶KIT阳性(KIT+)肿瘤细胞的存在下激活所述T细胞。在另一个实施方案中，当表达于T细胞中时，CIR蛋白的胞外结构域能够与肿瘤细胞表面上的KIT相互作用。
本发明的特征还在于包括上述核酸构建体的载体以及包括所述核酸构建体和载体的宿主细胞。一方面，所述宿主细胞选自T细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞和单核细胞系的细胞。在某些方面，宿主细胞与受试者是自体同源的。在其它方面，宿主细胞与受试者不是自体同源的。
本发明特征在于破坏KIT+细胞的方法，所述方法包括给予包括上述核酸构建体的组合物。在一些实施方案中，所述方法包括使KIT+细胞与包含上述宿主细胞的组合物接触。本发明的特征还在于治疗患有KIT+相关疾病的受试者的方法，所述方法包括给予包含上述核酸构建体或宿主细胞的组合物。
本发明的某些方面包括给予第二剂用于治疗患有KIT+相关疾病的受试者或破坏KIT+细胞。在某些实施方案中，所述第二剂是酪氨酸-激酶抑制剂。在优选实施方案中，酪氨酸-激酶抑制剂是伊马替尼。
在本发明的所有实施方案中，KIT+相关疾病表征为存在KIT+肿瘤细胞。在一些实施方案中，KIT+相关疾病选自：胃肠道间质瘤、急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤以及神经外胚层源的软组织肉瘤。在优选的实施方案中，KIT+相关疾病为胃肠道间质瘤(GIST)。在其它实施方案中，GIST是抗甲磺酸伊马替尼的。
定义
“能够与KIT相互作用”是指识别并结合酪氨酸激酶KIT，但基本上不识别并结合样品(例如，人血液样品)中的其它分子的胞外结构域。
“治疗”是指减轻病况的状况或症状(例如，胃肠道间质瘤、急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤以及神经外胚层源的软组织肉瘤的症状)。“治疗KIT+相关疾病”(例如，胃肠道间质瘤、急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、骨髓发育不良综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、侵袭性***性肥大细胞增生症(ASM)、高嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、神经外胚层源的软组织肉瘤、肝细胞癌，以及所有源自KIT+干细胞的赘生物)是指对患有KIT+相关疾病的受试者给予治疗以改善受试者的病况。与等同的未治疗对照相比，此减轻或治疗的程度为疾病状态改善的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
“载体”是指DNA分子，其通常源自质粒或噬菌体，DNA片段可以***或克隆到所述载体中。重组载体会包含一个或多个唯一的限制位点，并且在限定的宿主或媒介生物体中可能能够自主复制以使克隆序列可复制。载体包含可操作性地连接至基因或编码区的启动子，以使在转染进受体细胞时，表达RNA或编码蛋白。
“宿主细胞”是指其中引入了一种或多种核酸构建体的细胞。宿主细胞可以分离自受试者和/或分离自外部供体。宿主细胞的实例包括但不限于T细胞(例如，分离自人外周血液单核细胞、骨髓，和/或胸腺)、造血干细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞和单核细胞系的细胞(例如，血液单核细胞和巨噬细胞)。
“嵌合免疫受体”或“CIR”是指融合蛋白，当表达于宿主细胞时，该融合蛋白包含特异性与靶蛋白结合的胞外结构域和调节宿主细胞活化的胞质结构域。
“KIT-配体”是指结合于酪氨酸-蛋白激酶KIT(KIT)、c-KIT受体，或CD117的细胞因子。结合于KIT的KIT-配体可导致KIT形成二聚体，该二聚体激活蛋白的固有酪氨酸激酶活性。KIT-配体在现有技术中还已知为青灰因子或干细胞因子(SCF)。“KIT-配体”包括具有至少对应人KIT-配体(SEQIDNO：1)1-273的残基的多肽，或例如与cKIT-配体的胞外结构域(例如，由SEQIDNOS：2，3编码(斜体核苷酸分别表示Ncol和BamHI限制性位点))的序列基本相同的序列的多肽。
SEQIDNO：1人KIT-配体氨基酸序列
(5’-gattccaggaattgatttccccatggcaaagaagacacaaacttg-3’SEQIDNO：2
5’-ctaagctctagccaattgaattggatccgtgtaggctggagtctcc-3’SEQIDNO：3)
“CD28胞质结构域”是指具有CD28的C-末端区域的多肽，例如具有SEQIDNO：4的127-234位氨基酸的氨基酸序列的多肽，所述CD28的C-末端区域当表达于T细胞中时位于细胞质中。术语“CD28胞质结构域”是指包括保持有调节T细胞活化的能力并且在多肽片段长度上与SEQIDNO：4的127-234位氨基酸基本相同的任意CD28片段。
SEQIDNO：4人CD28氨基酸序列
“CD3ζ”是指具有具有SEQIDNO：5的氨基酸序列的多肽的多肽。术语“CD3ζ”还包括保持有调节T细胞活化的能力并且在蛋白片段长度上与SEQIDNO：5基本相同的多肽片段。
SEQIDNO：5人CD3ζ氨基酸序列
“激活T细胞”是指诱导表达本发明的CIR的T细胞以自分泌方式释放作用于T细胞的白介素2(IL-2)。激活的T细胞还产生IL-2受体(CD25或IL-2R)的α亚基，激活可与IL-2结合的全功能受体，这继而激活T细胞的增殖途径。
术语“肿瘤细胞”是指表征为在组织中不适当的积聚的细胞群的组分。此不适当的积聚可以是发生于细胞群的一个或多个细胞中的遗传或表观遗传变异的结果。此遗传或表观遗传变异导致细胞群的细胞比周围正常组织生长更快、死亡更慢，或分化更慢。本文所用术语“肿瘤细胞”还包括支持恶性细胞生长或生存的细胞。此类支持细胞可包括成纤维细胞、血管或***内皮细胞、炎症细胞或有利于恶性细胞生长或生存的共扩充的非赘生物细胞。术语“肿瘤细胞”是指包括造血、上皮、内皮或实体组织源的癌症。术语“肿瘤细胞”还指包括癌症干细胞。
“KIT+肿瘤细胞”是指表达与肿瘤相关的KIT的细胞。
“KIT+相关疾病”是指表征为在各种细胞类型中增加的KIT表达或异常的KIT活性(例如KIT活化)的疾病，所述各种细胞类型包括但不限于：肥大细胞、造血组细胞、黑素细胞、生殖细胞、和/或胃肠道起搏细胞。KIT+相关疾病可由KIT+干细胞引起。KIT+相关疾病的实例包括但不限于：胃肠道间质瘤、急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、骨髓发育不良综合征(MDS)、骨髓增生性疾病(MPD)、侵袭性***性肥大细胞增生症(ASM)、高嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、神经外胚层源的软组织肉瘤、肝细胞癌，以及所有源自KIT+干细胞的赘生物。
“基本相同”是指当最优比对时，例如使用下述方法时，核苷酸或氨基酸序列与第二条核苷酸或氨基酸序列共享至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。以本领域技术中的各种方法来确定两个多肽或核苷酸序列之间的同一性百分比，例如使用公共可得的计算机软件如SmithWatermanAlignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)JMolBiol，147：195-7)；并入到GeneMatcherPlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，AdvancesinAppliedMathematics，482-489(1981))，蛋白序列和结构的SchwarzandDayhof(1979)Atlas，Dayhof，M.O.，Edpp353-358；BLAST程序(基本局部比对搜索工具；(Altschul，S.F.，W.Gish，等人(1990)JMolBiol，215：403-10)，BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N，BLAST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，ALlGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)软件。另外，本领域技术人员可以确定测量比对的适当参数，其包括在被比较的序列全长上实现最大比对所需的任意算法。通常，对于蛋白或核酸，比较的长度可以是任意长度，多至并包括全长(例如，5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)。保守替换通常包括以下基团内的替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸；及苯丙氨酸、酪氨酸。
“受试者”是指哺乳动物(例如，人或非人)。
本发明的其它特征和优势会由以下详细的说明书、附图及权利要求书而显而易见。
附图简述
图1A-1B为抗-KIT嵌合免疫受体的结构的描述。图1A显示了第一代和第二代CIR遗传构建体的示意图。图1B显示了第一代和第二代CIR的结构。抗-KITCIRs是自抗-CEA逆转录病毒载体构建体重新工程化的，其中KIT配体(KL)的胞外结构域被扩增并克隆以取代抗-CEA胞外结构域。
图2A-2B为显示人抗-KIT设计者T细胞的转导效率和表型的图。图2A显示了分离的PBMC和用表达KIT特异性CIRs的逆转录病毒激活和转导的原代人T细胞的图。阴影柱状图代表设计者T细胞，和开放曲线代表未被转导的细胞。图2B显示了第一代和第二代转导的设计者T细胞的表型的流式细胞术分析，所述分析证明中央型记忆表型(CD45RO+CD62LCCR7+)的T细胞占大多数。数据为三次或更多次重复的代表。
图3A-3G为显示人抗-KIT设计者T细胞在体外保持增殖能力的图。将第一代和第二代设计者T细胞与人KIT+GIST细胞系、图3A-3B和3E中的GIST882，以及图3C-3D和3F中的GIST48共培养。用CFSE对设计者T细胞和未转导的CTRLT细胞染色，并且通过对CD3+细胞设门测量CFSE稀释而评估增殖。为确认被KIT+GIST细胞系激活的设计者T细胞，用ELISA来测量IFNγ产量，并发现所述IFNγ产量在462-475pg/mL范围内，而未修饰的T细胞(CTRL)的IFNγ产量可忽略(G)。数据为三次或更多次重复的代表。
图4A-4E为显示人抗-KIT设计者T细胞有效裂解KIT+肿瘤细胞的能力的图。图4A显示了来自评价肿瘤细胞裂解之后的酶释放的LDH测定的结果，所述肿瘤细胞裂解在来自第一代和第二代设计者T细胞与辐射GIST882细胞的共培养的上清液上进行。最大释放由最高实验值来定义。图4B-4C显示了用以确认设计者T细胞的细胞毒性能力的，与未标记T细胞一起培养的并用CFSE标记的经辐射的GIST-88s或GIST48细胞的图。通过对剩余的活细胞设门来测量CFSE荧光的降低，从而定量肿瘤细胞死亡。图4D-4E显示了通过关于未修饰T细胞(CTRL)的MFI数据标准化MFI数据而定量的第一代和第二代设计者T细胞的杀伤百分比的结果。数据为至少三次重复的代表。
图5A-5E为在体内测试人抗-KIT设计者T细胞的结果。图5A显示了来自皮下异种移植模型的单个代表性实验的中值结果，其中在用人抗-KIT设计者T细胞处理之前，将GIST882细胞皮下注射入免疫缺陷小鼠，和图5B显示了来自3次实验的合并数据的结果。图5C显示了由水平条表示的灌注后第5天、第10天、第15天的中值肿瘤尺寸的线图，单个肿瘤测量由单个数据点表示。图5D显示检测肿瘤浸润CD3+T细胞(箭头)的免疫组织化学印迹(上排10x并且下排40x)。图5E显示用于评估小鼠中肿瘤坏死(星号)的程度的常规组织学印迹，所述小鼠用第一代和第二代设计者T细胞处理，两者有或没有增补IL2(左列10x并且右列40x)。
发明详述
大体上，本发明特征在于编码嵌合免疫受体(CIR)蛋白的核酸构建体，所述嵌合免疫受体(CIR)蛋白包括KIT-配体(KL)或干细胞因子(SCF)。当表达于细胞(例如，受试者T细胞)中时，这些核酸构建体可用于治疗与增长的KIT表达或异常的KIT活性相关的疾病。此类疾病的实例包括胃肠道间质瘤(GIST)，特别是抗伊马替尼和其它常规疗法的那些。某些实施方案包括工程CIR，所述工程CIR包括KIT的自然配体(例如，KIT-配体(KL))或干细胞因子(SCF)。例如，KIT-配体(KL)或干细胞因子(SCF)可与T细胞(第一代，第一代)受体的CD3ζ链组分或CD3ζ+CD28协同刺激分子(第二代，第二代)融合。第二代T细胞表达靶向KIT+肿瘤并同时整合CD28协同刺激信号的构建体。在下面列举的实施例中，此第一代和第二代T细胞在体外生产并在体内测试，以证明其破坏KIT+肿瘤的效力。
胞外结构域
本发明的CIR特征在于能够特异结合酪氨酸蛋白激酶KIT(KIT)并能够将本发明的CIR指引至表达KIT+的肿瘤细胞的胞外结构域。因此，本发明的CIR的胞外结构域可包括，例如全长干细胞因子(SCF)或KIT-配体(KL)，或其片段。或者，所述胞外结构域可包括特异性抑制KIT二聚化、抑制酪氨酸激酶活性、和/或KIT磷酸化的任意结合部分、抗KIT的抗体片段(例如，抗cKIT抗体，例如可从Abcam，Biolegend，GenwayBiotech等商售可得的那些)。
所述胞外结构域可任选地包括可用于纯化表达的CIR的另外蛋白标签，例如人源c-myc标签(EQKLISEEDL)，在N-末端的，Z结构域、HA标签、FLAG标签，和/或GST标签。优选地选择蛋白标签以使所述标签不妨碍KL与KIT相互作用。所述胞外结构域也可任选地包括可用于成像的另外的蛋白标签，例如荧光蛋白。包含这些蛋白可促进构建体的未来的研究并创建更有效的构建体。
跨膜结构域
本发明的CIR特征在于跨膜结构域，例如源自CD28或CD3ζ的那些。包含ζ链的跨膜区域或CD28的跨膜或部分胞外结构域提供了分子间二硫键的能力。预测包含这些跨膜结构域的CIRs通过位于ζ的跨膜的半胱氨酸残基或通过位于CD28的部分胞外结构域的近端半胱氨酸残基(CD28的第123位)形成二硫化物连接的二聚体，模拟天然ζ及CD28的二聚体构型。
胞质结构域
本发明的CIR还特征在于当结合于KIT+肿瘤细胞时调节宿主T细胞活化以激活T细胞基细胞毒反应攻击KIT+肿瘤细胞的胞质结构域。在某些实施例中，用于本发明的本发明CIRs的胞质结构域包括CD3ζ、CD28，或其片段。本发明特征还在于源自多个胞外结构域的多肽的融合，所述胞外结构域当结合于KIT+肿瘤细胞时用于增强T细胞的活化(例如，包括CD3ζ和CD28二者的活性片段的胞质结构域或仅包括CD3ζ的胞质结构域)。
核酸构建体
本发明的核酸构建体可用于在宿主细胞(例如分离自受试者的T细胞)中表达CIR构建体。CIR构建体可包含于单个核酸构建体或多个核酸构建体中。编码CIR的核酸序列可变为与用于产生CIR的表达载体或宿主细胞更兼容的密码子。密码子可被取代以消除限制位点或包括沉默限制位点，这可有助于表达载体中核酸的克隆并加工所选宿主细胞中的核酸。为了促进宿主细胞的转染，核酸构建体可包含于病毒载体中(例如，逆转录病毒载体或腺病毒载体)或被设计为通过电穿孔或化学方法(例如，利用脂质转染试剂)被转染进宿主细胞中。
宿主细胞
本发明的宿主细胞可自包含T细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞及单核细胞系(例如，血液单核细胞或巨噬细胞)的细胞的任何哺乳动物源(例如，人外周血单核细胞、骨髓、和/或胸腺，并分离自，例如，受试者自身细胞或另一个供体源)衍生。用本发明的核酸构建体(例如，编码CIR的核酸构建体)转染或感染宿主细胞。在给予至患者前，宿主细胞可在细胞培养中扩增。在一个实施方案中，将修饰的宿主细胞给予至患者，所述宿主细胞原先分离自所述患者。在另一个实施方案中，将修饰的宿主细胞给予至来自另一源的患者，所述宿主细胞分离自所述另一源。
病况与病症
组织学研究确认本发明的CIR定位于KIT+肿瘤并在静脉输注后介导肿瘤坏死。在一些实施方案中，必须单次或多次输注以实现所移植生长的肿瘤的完全消退。在特定实施方案中，添加IL15和IL21以促进效应子表型可提供增强本发明的CIR效力的潜能。在特定实施方案中，体内模型中肿瘤生长的显著延迟支持用于治疗GIST的本发明CIR的潜在效用。在另一实施方案中，本发明的CIR也可用于治疗KIT+相关疾病。KIT+相关疾病的实例包括但不限于：急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤、骨髓增生性疾病(MPD)、侵袭性***性肥大细胞增生症(ASM)、高嗜酸性粒细胞增多综合征(HES)、隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、神经外胚层源的软组织肉瘤、和/或表征为KIT过表达和/或过度活化的其它疾病。
添加剂和组合治疗
本发明的CIR可用于GIST治疗和其它KIT+相关疾病的治疗，所述治疗可单独使用或与其它疗法组合使用，其包括酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)和其它免疫调节剂和/或疗法。伊马替尼已经被报道诱导调节T细胞凋亡，并且其效力通过并存的免疫治疗而增强。添加伊马替尼至抗-KIT设计者T细胞注入物中可通过肿瘤微环境中的有利的免疫调节来增强效力，允许所述CIR介导增强的肿瘤细胞裂解。可与本发明的CIR一起使用的其它TKIs包括但不限于：厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、索拉非尼、尼罗替尼、博舒替尼、来那替尼和瓦他拉尼。本发明的CIRs还可与免疫调节剂如抗-PD1和抗-CTLA4抗体共同施用。在本发明的任一治疗方法中，本发明的CIRs也可与在Dudley等人，JClinOncol，26：5233-5239，2008中描述的骨髓抑制(myeloablative)预处理共同施用。
实施例
构建可被用于重编人T细胞以识别并杀死KIT+GIST肿瘤的抗-KITCIR。KIT、SCF的天然配体提供抗肿瘤特异性。鼠类和人T细胞被以高水平效力转导，并且体外研究确认应答于KIT+GIST细胞，抗-KIT设计者T细胞增殖并分泌IFNγ。设计者T细胞还能够裂解两种KIT+细胞系。利用异种移植模型，证明第一代和第二代抗-KIT设计者T细胞的全身输注导致肿瘤生长速率的显著降低。总之，对抗-KIT设计者T细胞的研究支持其进一步发展为用于KIT+赘生物的潜在新治疗。
材料与方法
逆转录病毒载体构建
从之前描述于Emtage等人，ClinCancerRes14：8112-8122，2008中的抗-CEA逆转录病毒载体表达构建体来重新工程化第一代和第二代抗-KITCIR。利用掺入NcoI(SEQIDNO：2中的斜体核苷酸)和BamHI(SEQIDNO：3中的斜体核苷酸)限制性位点的引物，从ATTC克隆010560371PCR扩增跨越N-末端起始密码子至跨膜起始的cKIT配体的胞外结构域(GenebankBC069733.1，cDNA克隆MGC：97379)，并将其克隆进框中以取代抗-CEA胞外结构域。
编码cKIT配体的胞外结构域的核酸：
(5′-gattccaggaattgatttccccatggcaaagaagacacaaacttg-3′SEQIDNO：2
5′-ctaagctctagccaattgaattggatccgtgtaggctggagtctcc-3′SEQIDNO：3)
设计者T细胞产生
人外周血单核细胞(PBMC)获自随机供体的全血滤液(罗德岛血液中心，Providence，RI)。用无菌PBS(Cellgro，Manassas，VA)洗涤血液过滤器，并根据制造商说明，通过利用Histopaque(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的密度梯度分离来分离PBMC。PBMC以2x106细胞/ml的密度接种，并且在抗-CD3包覆(OKT3，eBioscience，SanDiego，CA)的750ml瓶上，在带有2μg/mL抗-CD28(CD28.2，eBioscience)和300U/mL人IL-2的AIMV培养基(Invitrogen，GrandIsland，NY)中激活，所述AIMV培养基补充有5％加热灭火的无菌人血清(ValleyBiomedical，Winchester，VA)。利用LipoD283(SignaGenLabories，Rockville，MD)，用50μg第一代或第二代cKIT配体CIR逆转录病毒质粒转染293T-HEKphoenix双向性细胞(Orbigen，AlleleBiotechnology，SanDiego，CA)。收获病毒上清液用于转导已达到80％汇合的NIH-3T3PG13逆转录病毒包装细胞(ATTC：CRL-10686)。PG13细胞在37℃下培养，当细胞达到80％汇合时，收获上清液并通过0.45μm过滤器(Corning，CorningNY)过滤。培养24-48小时后，将PBMC接种于6孔板的重组人纤维连接蛋白(retronectin)包覆(20μg/mL，TakaraBio，Otsu，Shiga，日本)的孔中，并用描述于Emtage等人，ClinCancerRes14：8112-8122，2008中的抗-KITCIR载体转导以创建设计者T细胞。用包含抗-KITCIR载体(第一代)或添加有CD28部分的抗-KITCIR载体(第二代)的上清液转导细胞。将转导的T细胞维持在添加有5％热灭活的无菌人血清和100IU/mlIL-2的AIMV培养基中。通过用与别藻蓝素-XL缀合(Chromaprobe，MarylandHts，MO)的Reprokine抗-SCFmAb(Fx2)染色的流式细胞术分析来评估KIT特异性CIR在设计者T细胞上的表达。还用抗人CD3(Sk7)、CD4(RPA-T4)、CD8(SK1)、CD62L、CD45RO、CD197(CCR7、150503)、以及CD25(M-A251)的抗体对细胞染色，所述抗体与FITC、PE、PerCP、别藻蓝素、别藻蓝素-Cy7或Pe-Cy7(BDBiosciences，FranklinLakesNJ)缀合。对于FoxP3细胞间染色，按照生产商的方案(BD)将样品固定、透化，并用与PE缀合的FoxP3对其染色。
细胞增殖测定
进行基于流式细胞术的***测定以分析响应于被KIT+人GIST细胞系刺激的第一代和第二代设计者T细胞的增殖。将设计者T细胞用1μM羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)标记，并按与KIT+GIST882和GIST48细胞4∶1的比例在96孔圆底板中添加，每孔添加1x105个dTc。缺乏KIT表面表达的GIST48b被用作阴性对照。在5000拉德下辐射肿瘤细胞。孵育共培养5天，在此时间点分离上清液并通过流式细胞术分析细胞。针对IFN-γ水平通过流式细胞小球阵列(BDBiosciences)分析上清液。细胞因子产生结果还通过用于确认的IFN-γELISA测定(Biolegend)来定量。
细胞毒性试验
第一代和第二代设计者T细胞与KIT+GIST882或GIST48细胞一起培养以在根据生产商的方案进行的LDH测定(Roche，Indianapolic.IN)中评估其细胞毒性能力。在5000G下辐射肿瘤细胞50分钟。评估以不同的效应子-靶比例添加的第一代设计者T细胞、第二代设计者T细胞和未转导的人T细胞的细胞毒性能力。通过肿瘤细胞死亡的流式细胞术分析进一步确认来自LDH测定的细胞毒性结果。如前述辐射GIST细胞并用CFSE标记，而设计者T细胞未被染色。用流式细胞术分析CFSE+细胞的损失，并用以下公式计算细胞毒性：第一代或第二代设计者T细胞的平均荧光指数(MFI)除以未转导的T细胞的MFI。用Annexin-V(BDBiosciences)染色肿瘤细胞。
体内肿瘤研究
六周大雄性免疫缺陷小鼠(NU/J)购自JacksonLaboratories(BarHabor，MX)，并且遵照罗杰威廉斯医疗中心学会性动物保护和利用委员会(theRogerWilliamsMedicalCenterInstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的指南进行实验。在37℃下将GIST细胞系维持在具有1％的I-谷氨酰胺(Invitrogen)的IMDM中，所述IMDM补充有15％FBS和1％盘尼西林/链霉素/安福霉素(Cellgro)。双侧地给予皮下侧面注射在200μl无菌PBS中的3x107个KIT+GIST882细胞。通过尾静脉注射设计者T细胞或未转导的人T细胞(200μlPBS中1x107个)。对于具有IL-2的实验组，根据生产商的方案用IL-2填充Alzet7-日微渗透压泵并将其皮下移植。设定泵以10000IU/h(500pg/h)的速率释放。用游标卡尺二维测量肿瘤，并且从T细胞注射的时间直至研究终结，每日获取测量。针对每只小鼠使用左右侧肿瘤的平均值，并且将测量结果关于初始肿瘤大小标准化。处死后，将肿瘤切除并送至马萨诸塞大学，伍斯特医学中心实验病理学服务中心用于组织切片和染色。将切片染色用于常规H&E和抗CD3免疫组化。在罗杰威廉斯医疗中心的病理科分析载片并在10x和40x放大倍数下拍照。
统计值
利用用于Windows的GraphPadPrismV5.00(GraphPadSoftware，SanDiego，CA)计算统计值。利用双尾学生t检验确定增殖和细胞毒性测定的统计显著性，p≤0.05的值被归为统计上显著的。呈现肿瘤尺寸中间值，并且逻辑回归被用于比较组之间的生长曲线斜率和高度。利用FlowJo软件(Treestar，Ashland，OR)进行带有***峰的计算的细胞增殖分析。
实施例1：抗-KIT嵌合免疫受体的工程化和设计者T细胞的产生
此研究的目在于构建并测试由人外周血T细胞表达的KIT-特异性CIR的功能用于临床前研究。抗-KITCIR构建体基于预先存在的描述于Emtage等人，ClinCancerRes14：8112-8122，2008中的抗-CEA形式。用KL的胞外结构域取代抗-CEAsFv片段。预备第一代和第二代构建体(图1A)。第二代构建体包含CD28以提供共刺激。KL组分表达于CIR的胞外表面以使得能够与靶肿瘤细胞表面上的KIT相互作用(图1B)。在转导活化的淋巴细胞之前，通过直接DNA测序来确认所述构建体。
活化和转导之后，用抗-KL抗体通过流式细胞术来确认CIR表达。活化小鼠脾细胞的逆转录病毒转导(其被用作初步评估)导致第一代和第二代CIR表达率为27％(范围，16-41)。在对方案优化之后，活化的人PBMC的转导(图2A)产生对于第一代和第二代人设计者T细胞分别50％(范围，33-74)和42％(范围，24-62)的平均转导率，而两种CIR形式无显著差异(p＝0.67)。在用抗-CD3、抗-CD28及IL2刺激PMBC后，＞70％的细胞为CD3+并且中央型记忆表型(CD45RO+CD62L+CCR7+)占优势(图2B)。少于30％的细胞具有幼稚(CD45RO-CD62L+)或效应子记忆(CD45RO+CD62L+CCR7-)表型，并且少于10％的来自两代的转导的T细胞具有调节性T细胞表型(CD25+FoxP3+)，组之间无差异。对于第一代dTc，33.4％的T细胞为CD4+CD8-，并且52.7％为CD8+CD4-，而第二代dTc的相应值为35.5％和52.6％。转导或暴露于KIT+肿瘤之后，CD4∶CD8的比例不变。对于所有的后续实验，批量使用设计者T细胞，没有通过CD4或CD8表达而分级，与当前的临床实践保持一致。
实施例2：在KIT+肿瘤细胞存在下抗-KIT设计者T细胞的增殖
为了测试表达抗-KITCIR的人T细胞的增殖能力，我们在两种人KIT+GIST细胞系(GIST882和GIST48)的存在下培养dTc。在GIST882和GIST48的存在下，当与未转导T细胞(CTRL)比较时，表达第一代或第二代抗-KITCIR的dTc增殖至更大程度，如通过CFSE稀释所确定(图3A)。当与GIST882一起培养时，39％的第一代和47％的第二代dTc***(相比于CTRLp＜0.001)，两种CIR形式之间无显著差异(p＝0.23，图3B)。同样，在抗伊马替尼的GIST48细胞的存在下，培养3天后33-38％的dTc***，这显著高于CTRL细胞(相比于CTRLp≤0.03)，两种CIR形式之间无显著差异(p＝0.56，图3C)。通过当如所示在KIT-GIST48B细胞的存在下培养dTc时产生的最小增殖来确认KIT+肿瘤细胞对dTc增殖的需求，并且在KIT+肿瘤的存在下CIR-活化的T细胞未增殖。IFNγ产量确认了通过KIT+肿瘤的dTc活化，并发现IFNγ产量在462-475pg/ml的范围内，而通过CIR-T细胞的产量可忽略不计(p＜0.001，图3D)。抗-KITdTc与KIT-对照肿瘤细胞的共培养没有导致显著的IFNγ产量。
实施例3：通过抗-KIT设计者T细胞裂解KIT+肿瘤细胞
有效的过继细胞免疫治疗的特征是产品以特定方式裂解肿瘤细胞的能力。为此，进行体外测定以确定表达抗-KITCIR的设计者T细胞是否能够破坏GIST细胞。通过LDH释放证明第二代设计者T细胞有效裂解KIT+肿瘤并且比第一代形式更有效(图4A)。为了确认这些发现，将CFSE-标记的受辐射的肿瘤细胞与未标记的设计者T细胞混合。通过定量来自剩余的活细胞的CFSE荧光的降低来测量肿瘤细胞减少。当与CTRL细胞相比时，第一代和第二代设计者T细胞介导CFSE荧光水平和由此活的肿瘤细胞数目的显著降低(图4B-4C)。已经证明抗-KIT设计者T细胞在体外响应KIT+肿瘤被刺激***并裂解KIT+靶，接下来测量体内功效。
实施例4：体内评估抗-KIT设计者T细胞
为了确定抗-KIT设计者T细胞运输、浸润和限制所移植生长的肿瘤的生长的能力，使用了皮下异种移植模型。将人KIT+GIST细胞皮下注入免疫缺陷小鼠中，7日后，用尾静脉注入第一代、第二代或未修饰的抗-KIT设计者T细胞处理所述免疫缺陷小鼠。肿瘤测量以二维(mm2)进行并且表示为相对于处理初日的肿瘤大小的中值百分比变化。对于一些组，IL2治疗与设计者T细胞一起给予。没有IL2的第一代设计者T细胞(p＝0.05)和具有IL2的第二代设计者T细胞(p＜0.001)介导肿瘤生长的显著减少(图5A)。当合并所有数据时，在没有IL2治疗的情况下，第一代和第二代设计者T细胞对肿瘤生长有显著影响。有IL2支持，第一代设计者T细胞具有显著效果(p＝0.05)而第二代设计者T细胞(p＝0.13)展现出有利趋势(图5B，第一代dTc可能比第二代dTc更加依赖IL2，因为通过构建体的CD28部分的协同刺激信号的存在可降低第二代dTc对细胞因子如IL2的依赖)。数据进一步被表示为每个单独样品的肿瘤生长以展示数值的范围(图5C)。处死后，我们获取肿瘤并确认在用第一代和第二代dTc处理的动物中过继转移的dTc以及坏死的存在(图5D和5E)。
其它实施方案
在不背离本发明范围和精神的情况下，本发明的所述方法以及组合物的各种修改和变化对本领域技术人员会是显而易见的。尽管本发明已经与特定所需实施方案关联描述，应当理解要求保护的发明不应过度限于这些特定实施方案。的确，对于医学、免疫学、药理学、内分泌学领域或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在本发明范围之内。
本说明书中提及的所有出版物通过引用并入本发明，与如同各个单独出版物通过引用特定地和单独地并入的程度相同。

Claims (23)

1.一种编码嵌合免疫受体(CIR)蛋白的核酸构建体，所述嵌合免疫受体(CIR)蛋白包含
a.KIT-配体(KL)的胞外结构域，或其片段
b.跨膜结构域，和
c.胞质结构域，
其中所述跨膜结构域包含CD3ζ链结构域，或其片段，并且所述胞质结构域包含CD3ζ链结构域或其片段。
2.编码CIR蛋白的核酸构建体，所述CIR蛋白包含
a.KIT-配体的胞外结构域，或其片段
b.跨膜结构域，以及
c.胞质结构域，
其中所述跨膜结构域包含CD28结构域，或其片段，并且所述胞质结构域包含CD3ζ链结构域和CD28结构域，或其片段。
3.如权利要求2的核酸构建体，其中所述胞外结构域进一步包含CD28结构域，或其片段。
4.如权利要求1-3任一项的核酸构建体，其中当表达于T细胞中时，所述CIR蛋白能够在酪氨酸-蛋白激酶KIT+(KIT+)肿瘤细胞的存在下激活所述T细胞。
5.如权利要求1-4任一项的核酸构建体，其中当表达于T细胞中时，所述CIR蛋白的所述胞外结构域能够与肿瘤细胞表面上的KIT相互作用。
6.包含前述权利要求任一项的核酸构建体的载体。
7.包含权利要求1-5任一项的核酸构建体或权利要求6的载体的宿主细胞。
8.如权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自T细胞、造血干细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞和单核细胞系的细胞。
9.破坏KIT+细胞的方法，所述方法包括给予包含权利要求1-5的核酸构建体或权利要求6的载体的组合物。
10.破坏KIT+细胞的方法，所述方法包括使所述KIT+细胞与包含权利要求7或8的宿主细胞的组合物接触。
11.如权利要求9或10的方法，其进一步包含给予第二剂至所述KIT+细胞。
12.如权利要求11的方法，其中所述第二剂是酪氨酸-激酶抑制剂。
13.治疗患有KIT+相关疾病的受试者的方法，所述方法包括给予包含权利要求1-6的核酸构建体的组合物。
14.治疗患有KIT+相关疾病的受试者的方法，所述方法包括给予包含权利要求7或8的宿主细胞的组合物。
15.如权利要求13或14的方法，其中所述KIT+相关疾病表征为存在KIT+肿瘤细胞。
16.如权利要求15的方法，其中所述KIT+相关疾病选自胃肠道间质瘤、急性骨髓性白血病、小细胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤、成神经细胞瘤以及神经外胚层源的软组织肉瘤。
17.如权利要求16的方法，其中所述KIT+相关疾病是胃肠道间质瘤(GIST)。
18.如权利要求17的方法，其中所述GIST是抗甲磺酸伊马替尼的。
19.如权利要求13-18任一项的方法，其中所述宿主细胞与所述受试者是自体同源的。
20.如权利要求13-18任一项的方法，其中所述宿主细胞与所述受试者不是自体同源的。
21.如权利要求13-20任一项的方法，进一步包括给予第二剂。
22.如权利要求21的方法，其中所述第二剂是酪氨酸-激酶抑制剂。
23.如权利要求22的方法，其中所述酪氨酸-激酶抑制剂是伊马替尼。
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