CN105372115B - 一种双水相体系及其富集痕量塔格糖的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种双水相体系及其富集痕量塔格糖的应用，包括N‑丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体、柠檬酸铵盐和水。按质量百分比计，双水相体系中N‑丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体为40％～50％，柠檬酸铵盐为14％～18％，其余为水，三者的质量百分比之和为100％。该方法对塔格糖的萃取率可达97.8％。具有线性范围宽，检出限低，相对标准偏差较小，对样品的测定回收率高的特点，操作简单，萃取率高，适用于酸乳中塔格糖的定量分析。

Description

一种双水相体系及其富集痕量塔格糖的应用

技术领域

本发明属于食品科学和分析化学的技术领域，具体涉及一种双水相体系及其富集痕量塔格糖的应用。

背景技术

D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊功能的甜味剂,甜度与蔗糖相似,并具有低能量、改善肠道菌群、降低血糖、抗龋齿等功能，还能用作预防和治疗心脑血管疾病与代谢性疾病等慢性病的保健品和药品(成分)。D-塔格糖是D-半乳糖的酮糖异构体,自然界中极少存在,因此,D-塔格糖的大量生产通常通过生物转化或者化学转化法获得。这两种方法生产D-塔格糖的直接原料均是D-半乳糖,最终反应产物是D-塔格糖和D-半乳糖的混合物,所以D-塔格糖高效分离富集方法建立对于D-塔格搪的批量生产将具有重要意义。

鉴于塔格糖在食品和医药方面的重要功效，近年来，对塔格糖的开发利用越来越受到国家重视。然而我国在该领域的探索才刚刚起步，技术还不成熟，在分析仪器、提取方法、数据处理等方面还存在很多问题，面临着样品中塔格糖的提取率低，萃取出的产品杂质含量高，现有分析方法灵敏度不够，样品基质对塔格糖提取存在干扰，大型仪器价格昂贵，难以普及等困难。因此，建立高效、灵敏的塔格糖提取方法对于人类的生产生活是至关重要的。

酸乳中含有嗜热链球菌，在发酵过程中能够产生β-半乳糖苷酶，这种酶可以降解乳糖、半乳糖、果糖、葡萄糖等单糖，但对D-塔格糖无影响，因此能使塔格糖与其他单糖有效分离，大大减少萃取产物中的杂质，提高萃取率。

离子液体双水相作为近几年来出现的一种新型绿色分离体系，因其具有分相时间短、粘度低、萃取过程不易乳化且离子液体可以回收利用等优点而收到越来越多的关注。其中，离子液体具有不挥发、毒性小、不易燃易爆、不易氧化，以及较高的热稳定性等特征被认为是传统萃取工艺中挥发性有机溶剂的理想绿色替代品。此外，离子液体双水相两相的主要成分都是水，使得其具有生物活性分子所需要的温度和环境，在萃取分离生物物质上具有广阔的应用前景。但是到目前为止，关于离子液体双水相体系作为萃取体系分离富集生物物质的数据资料还十分缺乏，同时，关于吡啶类离子液体双水相体系用于塔格糖分离的研究还未见报道，因而对该类体系的研究探讨具有理论和现实意义。

发明内容

针对现有的塔格糖提取方法中存在的稳定性差，分离产物杂质含量大，成本高，普及困难等缺点，本发明的目的在于提供一种双水相体系及其富集痕量塔格糖的应用，可以提高塔格糖提取的纯度，缩短制备周期，同时具有操作简便，不使用大型仪器，减少使用传统有机挥发性溶剂以避免带来二次污染的特点。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种双水相体系，包括N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体、柠檬酸铵盐和水。

具体的，按质量百分比计，双水相体系中N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体为40％～50％，柠檬酸铵盐为14％～18％，其余为水，三者的质量百分比之和为100％。

优选的，按质量百分比计，双水相体系中N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体为40％，柠檬酸铵盐为18％，其余为水，三者的质量百分比之和为100％。

所述的双水相体系用于富集痕量塔格糖的应用。

所述的双水相体系用于富集酸乳中痕量塔格糖的应用。

具体的富集过程包括：

步骤一：将待富集塔格糖的酸乳配制成浓度为0.04g/mL的水溶液得到待富集溶液；

步骤二：按质量比为5:1，将所述双水相萃取体系与待富集溶液混合进行萃取，萃取温度25℃～35℃，萃取pH值为5.2，萃取后静置分相即得。

优选的，具体的富集过程包括：

步骤一：将待富集塔格糖的酸乳配制成浓度为0.04g/mL的水溶液得到待富集溶液；

步骤二：按质量比为5:1，将所述双水相萃取体系与待富集溶液混合进行萃取，萃取温度30℃，萃取pH值为5.2，萃取后静置分相即得。

本发明的优点如下：

(1)本发明的方法集合了离子液体与双水相的优点，克服了聚合物双水相体系的易乳化、分相时间长等缺点，为痕量超痕量塔格糖的分离富集提供了一种可行的新途径；该方法用于萃取酸乳中的塔格糖，萃取过程中酸乳中嗜热链球菌产生的β-半乳糖苷酶能有效降解萃取产物中的果糖等单糖，将杂糖与塔格糖彻底分离，使萃取物纯度更高。

(2)经试验该方法对酸乳中塔格糖萃取率能够达到97.8％，具有线性范围宽，检出限低，纯度高，相对标准偏差较小，对样品的测定回收率高的特点。适用于酸乳中痕量塔格糖的分离提取。

附图说明

图1是[Bpy]BF₄离子液体浓度对萃取率的影响关系图；

图2是C₆H₅O₇(NH₄)₃盐浓度对萃取率的影响关系图；

图3是温度对萃取率的影响关系图；

以下结合附图和具体实施方式对本发明进一步解释说明。

具体实施方式

本发明的双水相体系富集痕量塔格糖包括：将N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体、柠檬酸铵盐与水混合均匀，得到双水相萃取体系，其中，N-丁基吡啶四氟硼酸盐和柠檬酸铵的质量分数分别为40％～50％和14％～18％；按质量比为8/3将塔格糖标准溶液加入所述双水相萃取体系，然后在25℃～35℃温度和pH值为5.2的条件下，在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h。

本发明所指痕量是塔格糖的质量分数在0.001％～0.01％范围内。N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体购于上海成捷化学有限公司，其纯度为0.99。

本发明通过一系列的实验，采用以N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体([Bpy]BF₄)与柠檬酸铵盐(C₆H₅O₇(NH₄)₃)形成的双水相体系作为萃取溶剂，萃取酸乳中痕量塔格糖。为了实现高萃取率，本发明设计了一系列实验以得到较优的工艺参数：

样品预处理：称量10g酸乳于烧杯中，加水溶解后，转入250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释到刻度，摇匀，配制成塔格糖标准溶液。本发明中该塔格糖标准溶液将同时用于酸乳中塔格糖、三聚氰胺、维生素B12和L-组氨酸的检测。奶粉、冲剂型咖啡、止咳糖浆的塔格糖标液配置方法与酸乳相同。

1、分别取4.0gN-丁基吡啶四氟硼酸盐，1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐，N,N-二甲基-N-乙基-2-叠氮乙基二氰胺铵，N-乙基吡啶硝酸盐，1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯盐，与1.6gC₆H₅O₇(NH₄)₃和4.4g蒸馏水充分混匀，再分别加入2g塔格糖标准溶液，于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，待分相清晰后，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如表1所示。

表1

从表1中可以看出，不同的离子液体萃取体系对塔格糖的萃取率不同，其中N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体和柠檬酸铵盐的分相最明显，对塔格糖的萃取率最高，可达96.7％，而1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐，N,N-二甲基-N-乙基-2-叠氮乙基二氰胺铵与柠檬酸铵盐形成的双水相分相效果不好，萃取率低，柠檬酸铵盐在N-乙基吡啶硝酸盐和1，3-二甲基咪唑磷酸二甲酯盐中溶解度小，因此萃取率低。由此可见，使用N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体对塔格糖萃取效果更好。

2、分别取1.6g柠檬酸铵、醋酸钠、酒石酸钠、硫酸铵、氯化钡与4.0g[Bpy]BF₄离子液体和4.4g蒸馏水充分混匀，再分别加入2g塔格糖标准溶液，于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，待分相清晰后，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如表2所示。

表2

从表2中可以看出，盐的种类对塔格糖的萃取有很大的影响，无机盐硫酸铵、氯化钡与[Bpy]BF₄离子液分相不好，因此萃取效果不好，而醋酸钠和酒石酸钠与[Bpy]BF₄体系对塔格糖的萃取率低，不能满足对塔格糖提取的要求，而柠檬酸铵盐与[Bpy]BF₄离子液体分分相效果最佳。因此，本体系使用柠檬酸铵盐可使萃取率达到最高。

3、取4.0gN-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体，1.6g的C₆H₅O₇(NH₄)₃和4.4g蒸馏水充分混匀，再分别加入2g塔格糖标准溶液。于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，待分相清晰后，分别测定水相中塔格糖、三聚氰胺、维生素B12和L-组氨酸的含量。由萃取前后水相中不同目标物的含量计算其萃取率。结果如表3所示。

表3

从表3中可以看出，该离子液体双水相体系对塔格糖的萃取效果最好，而对三聚氰胺等其他物质的萃取率较低，因此该体系更适用于分离富集塔格糖。

4、分别取1.0g、2.0g、3.0g、4.0g、5.0g、6.0g的[Bpy]BF₄离子液体，1.6g的C₆H₅O₇(NH₄)₃盐和水，使体系的总质量为10g，充分混匀后加入2g塔格糖标准溶液。于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如图1所示。

图1中横坐标表示[Bpy]BF₄离子液体在加入待测溶液之前的萃取体系中的浓度，纵坐标表示萃取率。当离子液体浓度过低时，双水相区域小，离子液体的析相能力弱，塔格糖的萃取率低，随着离子液体浓度增加，盐逐渐析出，双水相分相明显，萃取率高，因此塔格糖的萃取率随着离子液体的浓度的增加而增大，当[Bpy]BF₄离子液体质量分数超过50％时，塔格糖的萃取率有下降的趋势。这是因为离子液体浓度过高，导致盐的析相能力减弱，从而萃取率降低。从图中可以看出，[Bpy]BF₄离子液体的加入量为4.0-5.0g时萃取率最高，即[Bpy]BF₄在萃取体系(加入塔格糖待测溶液之前)中的最优浓度为40％～50％。

5、分别取0.6g、1.0g、1.4g、1.8g、2.2g、2.6g、3.0g的C₆H₅O₇(NH₄)₃盐，4.0的[Bpy]BF₄离子液体与水充分混匀，使体柠檬酸铵盐系的总质量为10g。再分别加入2g塔格糖标准溶液，于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如图2所示。

图2中横坐标表示C₆H₅O₇(NH₄)₃在加入待测溶液之前的萃取体系中浓度，纵坐标表示萃取率。随着体系中C₆H₅O₇(NH₄)₃浓度的增加，塔格糖的萃取率呈先增大后略有减小的趋势。离子液体双水相体系中，C₆H₅O₇(NH₄)₃的加入量在1.4～1.8g时，塔格糖的萃取率随C₆H₅O₇(NH₄)₃加入量的增加而增加，此时萃取率最大可以达到96.7％。当C₆H₅O₇(NH₄)₃的加入量超过1.8g时，离子液体析相能力差，塔格糖的萃取率略有下降。可见，C₆H₅O₇(NH₄)₃的加入量为1.4～1.8g时萃取率最高，即C₆H₅O₇(NH₄)₃在萃取体系(加入塔格糖待测溶液之前)中的最优浓度为14％～18％。

6、取4.0g[Bpy]BF₄离子液体，1.6g的C₆H₅O₇(NH₄)₃和4.4g蒸馏水充分混匀，再加入2g塔格糖标准溶液，分别于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如图3所示。

图3中，横坐标表示温度，纵坐标表示萃取率，塔格糖的萃取率随温度的升高先升高后降低。对于[Bpy]BF₄/C₆H₅O₇(NH₄)₃双水相萃取体系，在15℃～30℃范围内，随着温度的升高，酸乳中嗜热链球菌产生的β-半乳糖苷酶活性越高，对杂糖的降解效果越好，塔格糖的萃取率就越高；30℃以后，随着温度的升高，β-半乳糖苷酶活性下降，塔格糖的萃取率迅速下降；当温度超过50℃，β-半乳糖苷酶失去活性，萃取趋于平衡。在30℃时，萃取率约为97.8％。因此，离子液体双水相萃取塔格糖在25～35℃进行可达到良好的效果。

7、取4.0g[Bpy]BF₄离子液体、1.6gC₆H₅O₇(NH₄)₃和4.4g蒸馏水充分混匀，再分别加入2g用酸乳、奶粉、冲剂型咖啡、止咳糖浆配制成的塔格糖标准溶液，于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h。测定水相中剩余塔格糖的浓度，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算塔格糖的萃取率。结果如表4所示。

表4不同来源塔格糖的萃取率表

从表4可以看出，加到酸乳中的塔格糖萃取率最高，其他三种物质中的塔格糖萃取率低，这是由于酸乳中的嗜热链球菌产生的β-半乳糖苷酶降解了其他单糖，使塔格糖与杂糖的分离效果好，提高了萃取率，而其他物质不能产生β-半乳糖苷酶，塔格糖与多种单糖混合在一起，不易分离，萃取率低。同时，酸乳提供了弱酸性环境，更有助于目标物塔格糖的萃取。所以，该离子液体双水相体系对酸乳中的塔格糖提取效果最好。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1：

取4.0g的[Bpy]BF₄离子液体，与1.4gC₆H₅O₇(NH₄)₃与4.6g蒸馏水充分混匀，加入2g塔格糖标准溶液，于25℃和pH5.2下在恒温振荡器中震荡30min，分相后静置萃取24h，待分相清晰后，测定水相中剩余塔格糖的浓度，由萃取前后水相中塔格糖的含量计算出塔格糖的萃取率为96.7％。

实施例2：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例将离子液体换为1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸盐，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为84.3％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果一般。

实施例3：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例将有机盐换为酒石酸钠，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为88.4％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果一般。

实施例4：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例将萃取目标物换为2g三聚氰胺，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出三聚氰胺的萃取率为80.7％。表明此发明对三聚氰胺的萃取效果一般。

实施例5：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例所用[Bpy]BF₄离子液体为6.0g，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为85.4％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果一般。

实施例6：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例所用[Bpy]BF₄离子液体为1.0g，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为60.9％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果很差。

实施例7：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例中C₆H₅O₇(NH₄)₃盐的用量为0.6g，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为9.8％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果很差。

实施例8：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例中C₆H₅O₇(NH₄)₃盐的用量为3.0g，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为91.3％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果一般。

实施例9：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例将萃取温度改为15℃，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为83.4％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果一般。

实施例10：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例将萃取温度改为55℃，其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出塔格糖的萃取率为75.9％。表明此发明对酸乳中塔格糖的萃取效果较差。

实施例11：

本实施例中的制备方法与实施例1相同，区别仅在于制备过程中的条件不同，本实施例塔格糖的来源为奶粉，即加入2g用奶粉制备的塔格糖标准溶液。其余条件不变。

对分相后的体系进行塔格糖浓度的测定，可得出奶粉中塔格糖的萃取率为80.5％。表明此发明对奶粉中塔格糖的萃取效果一般。

Claims (1)

1.一种双水相体系富集酸乳中痕量塔格糖的应用，其特征在于，所述的双水相体系由N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体、柠檬酸铵盐和水组成；

按质量百分比计，双水相体系中N-丁基吡啶四氟硼酸盐离子液体为40％～50％，柠檬酸铵盐为14％～18％，其余为水，三者的质量百分比之和为100％；

富集过程包括：

步骤一：将待富集塔格糖的酸乳配制成浓度为0.04g/mL的水溶液得到待富集溶液；

步骤二：按质量比为5:1，将所述双水相萃取体系与待富集溶液混合进行萃取，萃取温度25℃～35℃，萃取pH值为5.2，萃取后静置分相即得。