CN102851325A - 一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法，玉米芯为原料，利用纤维素酶对玉米芯进行酶法糖化，对糖化过程中影响酶解效率的主要因子进行了研究，并进一步探究了利用酶解液进行乙醇发酵的可行性。

Description

一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法。
背景技术
乙醇是来自可再生资源的最有发展前景的液态燃料，具有清洁、安全和支持汽油充分燃烧的特点。目前国内燃料乙醇的生产主要以玉米、小麦等粮食淀粉为原料，而中国地少人多的现状限制了基于粮食为原料的乙醇大规模生产。我国拥有丰富且廉价的植物纤维资源，尤其是农林废弃物，采用生物技术将纤维原料降解成可发酵的葡萄糖，进一步发酵生产乙醇，对开发新能源和环境保护等方面具有重要意义。利用纤维素酶将天然纤维素降解成葡萄糖的过程中，必须依靠纤维素酶3种组分的协同作用完成，即纤维素大分子首先在内切型-β-葡聚糖酶(Cx酶)和外切型-β-葡聚糖酶(C1酶)的作用下降解成纤维二糖，再进一步在纤维二糖酶(也称β-葡萄糖苷酶)作用下生成葡萄糖。目前广泛使用的里氏木霉纤维素酶制剂中，内切型及外切型-β-葡聚糖酶活力较高，但由于纤维二糖酶的活力很低，在纤维素酶解过程中易造成纤维二糖的累积，从而对内切型及外切型-β-葡聚糖酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。
玉米芯是一类量大而集中的农业纤维废弃物，利用这种纤维废料代替粮食发酵生产乙醇具有重要的经济效益和社会效益。本专利以玉米芯为原料，利用纤维素酶对玉米芯进行酶法糖化，对糖化过程中影响酶解效率的主要因子进行了研究，并进一步探究了利用酶解液进行乙醇发酵的可行性。
发明内容
本发明提供了一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法。
1.      一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法，其特征在于，酶解液的乙醇发酵过程：分批补料酶解得到的酶解液，添加酵母膏至3 g/L，(NH4)2HPO4至0.25 g/L，将50 mL液量装入100 mL三角瓶中，灭菌后接入0.5 mL培养24 h的酿酒酵母细胞浓缩液(离心后收集的细胞沉淀悬浮于无菌水中)，于38℃厌氧发酵30 h，定时取样检测。
2.      步骤1所述的分批补料酶解的过程：在2 L自制酶解反应器中进行，初始底物质量浓度为100 g/L，加入一定量的纤维素酶和纤维二糖酶，Tween-80添加量为1％(v/v)，pH值4.8、50℃条件下水解。在酶解开始后12和24 h分两次补料，使底物最终质量浓度达到200 g/L，补料的同时添加相应的纤维素酶和纤维二糖酶，酶解时问控制为60 h。
3.      步骤2所述的批式酶解的过程：在2 L自制酶解反应器中进行，底物质量浓度为100 g/L，加入一定量的酶制剂，在pH值4.8、50℃条件下水解。
4.      步骤3所述的纤维素酶的最佳用量为25 FPIU。
5.      步骤3所述的批式酶解的最佳时间为54 h。
6.      步骤3所述的补加纤维二糖酶起到协同作用。
7.      步骤3所述的非离子型表面活性剂Tween-80的最佳用量为1.5%。
8.      步骤2所述的分批补料酶解工艺大大缩短了反应时间，提高了生产效率。
9.      步骤1所述的分批补料酶解液的乙醇发酵18 h后的乙醇浓度达到45.8 g/L。
本发明的有益效果在于：本发明以玉米芯为原料，利用纤维素酶对玉米芯进行酶法糖化，对糖化过程中影响酶解效率的主要因子进行了研究，并进一步探究了利用酶解液进行乙醇发酵的可行性。
附图说明
图1纤维素酶作用下的酶解时间进程。
图2补加纤维二糖酶后的协同酶解。
图3分批补料协同酶解时间进程。
图4酶解液的乙醇发酵。
具体实施方式
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
本专利所用的菌株为酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) CICC 1027，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1
本实施案例说明不同纤维素酶用量对批式酶解的影响，有效降低纤维素酶的成本是纤维素酶法糖化工艺中的关键环节之一。本实施案例研究了不同纤维素酶用量对玉米芯酶解效率的影响，结果见表l。
由表1可以看出，不同的纤维素酶用量对酶解效率有较大影响，当纤维素酶用量从10 FPIU增加到25 FPIU 时，酶解得率从48.7％ 提高到74.3％ ，进一步提高纤维素酶用量，酶解得率的上升幅度趋于平缓。从尽可能降低纤维素酶成本的经济角度考虑，纤维素酶的适宜用量为25 FPIU。
表1 纤维素酶用量对酶解效率的影响
纤维素酶用量/FPIU 还原糖（g/L） 酶解得率/%
10 35.4 48.7
15 43.2 61.2
20 50.4 68.9
25 56.3 74.3
30 56.6 74.5
实施例2
本实施案例说明不同玉米芯批式酶解的时间对批式酶解的影响，结果如图1所示。
从图1可以看出，随着酶解反应的进行，还原糖质量浓度迅速增加，54 h还原糖质量浓度达到49.6 g/L(其中葡萄糖为26.7 g/L)，酶解得率为68.6％，继续延长酶解时间，酶解得率没有明显的提高。另外发现酶解液中纤维二糖的含量随反应的进行而逐渐累积，54 h达到11.8 g/L，这是由于里氏木霉纤维素酶系中纤维二糖酶活力不足，导致产生的纤维二糖不能进一步被降解为葡萄糖而累积，从而对纤维素酶系中内切型及外切型-β-葡聚糖酶的催化作用形成强烈的反馈抑制。
实施例3
本实施案例说明补加纤维二糖酶的协同酶解的作用，为减弱纤维二糖累积而引起的反馈抑制，提高酶解得率，在酶解体系中补加纤维二糖酶。结果图2所示。
由图2所示，100 g/L的底物质量浓度下酶用量为25 FPIU和6.5 CBIU时的协同酶解时问进程。可以看出，补加纤维二糖酶后整个酶解过程中纤维二糖含量均维持在较低水平，没有明显的累积。酶解体系中补加适量的纤维二糖酶，生成的纤维二糖可以被迅速水解成葡萄糖，大大减弱了对纤维素酶系中内切型及外切型-β-葡聚糖酶的反馈抑制，从而提高了葡萄糖质量浓度和酶解得率。酶解54 h后，还原糖质量浓度达到62.4 g/L(其中葡萄糖为50.4 g/L)，酶解得率增加到84.3％。
实施例4
本实施案例说明非离子型表面活性剂Tween-80对批式酶解的影响，以蒸气***预处理后的云杉为底物进行酶解的过程中，加入Tween-80可以促进酶解，其促进机制可能是非离子型表面活性剂Tween-80能够吸附在底物中的木质素结构表面，从而减少了纤维素酶在木质素上的吸附，这样纤维素酶就可以充分作用于纤维素，进而提高酶解效率。试验中研究了协同酶解条件下(酶用量为25 FPIU和6.5 CBIU)Tween-80添加量对酶解效率的影响，水解54 h后结果见表2。
添加Tween-80可以有效促进酶解反应，当Tween-80添加量为1.5％(体积分数)时，还原糖质量浓度为68.2 g／L，酶解得率达92.4％ ，进一步提高Tween-80的添加量，还原糖质量浓度和酶解得率几乎不再变化。
表2 协同酶解条件下Tween-80添加量对酶解效率的影响
Tween-80添加量/% 还原糖（g/L） 酶解得率/%
0.5 60.3 84.2
1.0 62.3 86.3
1.5 68.2 92.4
2.0 69.1 92.7
实施例5
本实施案例说明分批补料酶解的效果，在纤维原料的酶法糖化工艺中，提高底物浓度有助于获得较高的糖浓度，但如果初始底物浓度太高，则料液过于黏稠，搅拌和传热阻力增大，不利于酶解反应进行，通过分批补料酶解工艺可以很好解决这一难题。结果如图3所示。
由图3可以看出，采用分批补料酶解工艺，分别在18和30 h时补料，使底物最终质量浓度增加到200 g/L，酶解66 h后还原糖质量浓度达到116.7 g/L，其中葡萄糖质量浓度为95.5 g/L，酶解得率达到80.3％，略低于批式酶解的水平；对于降解等量的底物而言，分批补料酶解工艺大大缩短了反应时间，提高了生产效率。
实施例6
本实施案例说明分批补料酶解液的乙醇发酵，利用一株酿酒酵母在38℃下对玉米芯酶解液进行乙醇发酵，实验结果见图4。
由图4可以看出，酿酒酵母可迅速发酵酶解液中葡萄糖生成乙醇，接种后18 h内葡萄糖被完全利用。发酵液中乙醇质量浓度达45.8 g/L，每克葡萄糖制得乙醇0.48 g，达到理论得率的94％(理论得率为0.51 g乙醇(以每克葡萄糖计))。

Claims (9)

1.一种利用酶法糖化玉米芯发酵生产乙醇的方法，其特征在于，酶解液的乙醇发酵过程：分批补料酶解得到的酶解液，添加酵母膏至3 g/L，(NH4)2HPO4至0.25 g/L，将50 mL液量装入100 mL三角瓶中，灭菌后接入0.5 mL培养24 h的酿酒酵母细胞浓缩液，于38℃厌氧发酵30 h，定时取样检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分批补料酶解的过程：在2 L自制酶解反应器中进行，初始底物质量浓度为100 g/L，加入一定量的纤维素酶和纤维二糖酶，Tween-80添加量为1％，pH值4.8、50℃条件下水解；在酶解开始后12和24 h分两次补料，使底物最终质量浓度达到200 g/L，补料的同时添加相应的纤维素酶和纤维二糖酶，酶解时问控制为60 h。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，批式酶解的过程：在2 L自制酶解反应器中进行，底物质量浓度为100 g/L，加入一定量的酶制剂，在pH值4.8、50℃条件下水解。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，纤维素酶的最佳用量为25 FPIU。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，批式酶解的最佳时间为54 h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，补加纤维二糖酶起到协同作用。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，非离子型表面活性剂Tween-80的最佳用量为1.5%。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，分批补料酶解工艺大大缩短了反应时间，提高了生产效率。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分批补料酶解液的乙醇发酵18 h后的乙醇浓度达到45.8 g/L。
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