CN105353138A - 提高免疫检测准确性和线性范围的方法及试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供提高免疫分析仪检测准确性的方法和提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法和试剂,其改进之处均在于生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相先于吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体加入到样本中并进行孵育,然后加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,再进行孵育。这种改进可将较高浓度的分析物校准品的发光量显著地或更好地区分开来,从而提高分析物化学发光免疫检测的线性范围,同时显著降低化学发光背景值,而且也能更加准确地测量临床血清或血浆等样品中分析物的浓度。本发明所述方法和试剂与化学发光免疫分析仪配套使用,可用于肿瘤标记物、传染病、激素类、肝病、急性贫血等的检测。
Description
技术领域
本发明涉及提高免疫分析仪检测准确性的方法和提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法及其所用试剂,所述方法和所述试剂均涉及生物素标记抗体,吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,亲和素类物质固定的固相,清洗液和促发液,属于免疫技术领域。
背景技术
铁蛋白(ferritin)是一种水溶性的铁结合蛋白,存在于各种组织和体液中。它是由24个蛋白亚基组成的球状蛋白复合体,也是细胞内主要的铁储存蛋白。当未结合铁原子时,它被称作去铁铁蛋白(apoferritin)。每个铁蛋白一般可储存2500~3000个铁原子,最多可达45000个铁原子。正常人血清中含有少量铁蛋白,但在妊娠期和急性贫血时,血清中的铁蛋白浓度常常会降低,而在急慢性肝脏损害和肝癌等疾病时,血清中的铁蛋白浓度常常会升高。血清中的铁蛋白含量变化可作为判断是否缺铁或铁负荷过量的指标。测量血清中的铁蛋白浓度特别适合于区分由于体内铁利用不充足导致铁储存偏低引发的缺铁性贫血。
在人体中,铁蛋白以不同的分子形式存在,每种分子形式被称为异铁蛋白(isoferritin),这是因为铁蛋白的亚基以H和L两种形式存在,不同铁蛋白中的H亚基和L亚基按不同的比例存在,但两个亚基的总数为24。酸性最强的异铁蛋白含有24个H亚基,而碱性最强的异铁蛋白含有24个L亚基。不同的异铁蛋白在不同的免疫检测中可能存在不同的反应。
糖类抗原CA19-9是胰腺癌、胃癌、结直肠癌和胆囊癌的相关标志物,大量研究证明CA19-9浓度与这些肿瘤大小有关,是至今报道的对胰腺癌敏感性最高的标志物。胰腺癌患者85%~95%为阳性,CA19-9测定有助于胰腺癌的鉴别诊断和病情监测。当CA19-9小于1000U/ml时,有一定的手术意义,肿瘤切除后CA19-9浓度会下降,如再上升,则可表示复发。对胰腺癌转移的诊断也有较高的阳性率,当血清CA19-9水平高于10000U/ml时,几乎均存在外周转移。胃癌、结直肠癌、胆囊癌、胆管癌、肝癌的阳性率也会很高,若同时检测CEA和AFP可进一步提高阳性检测率(对于胃癌,建议做CA72-4和CEA联合检测)。胃肠道和肝的多种良性和炎症病变,如胰腺炎、轻微的胆汁郁积和黄疸,CA19-9浓度也可增高,其浓度多低于120U/ml,必须加以鉴别。
因人铁蛋白和CA19-9均为大分子蛋白,在采用诸如放射免疫分析法、酶联免疫吸附测定法(ELISA)和免疫比浊法等之类的免疫分析法检测血清或血浆等样品中的铁蛋白浓度时,多采用双抗体夹心免疫分析法进行检测。
自从化学发光免疫分析法(chemiluminesentimmunoassay,CLIA)于上个世纪七八十年代问世以来,因其采用非放射性标记,且将抗原抗体免疫反应和化学发光信号相结合,因而具有优良的特异性和显著提高的灵敏度,在国内外已得到广泛应用。目前,在市场产品中主要利用的CLIA技术可分为三大类:(1)酶促化学发光免疫分析法,如中国专利申请CN101545910A就采用这种方法,化学发光底物经酶的降解作用而发光,根据酶类型不同,主要分为:a)辣根过氧化物酶(HRP)化学发光免疫分析法,其常用的化学发光底物可选自鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物;b)碱性磷酸酶(ALP)化学发光免疫分析法,其常用的化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物,常见的有AMPPD、CSPD、CDP和CDP-Star以及Lumigen公司的PPD、Lumi-Phos和Lumi-Plus等;(2)电化学发光免疫分析法,如Roche公司的Elecsys系列和Cobas系列电化学发光免疫分析***就是采用这种方法,在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上包括了电化学和化学发光两个过程,其常用的电子受体为三丙胺(TPA),其常用的电化学发光试剂为三联吡啶钌;(3)基于吖啶酯(acridiniumester)或吖啶磺酰胺(acridiniumsulfonylamide)的化学发光免疫分析法,其化学发光试剂为吖啶酯或吖啶磺酰胺,不需催化剂,只需改变溶液的pH等条件就能发光。
在上述三种CLIA技术中,酶促化学发光免疫分析法的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移,而且低端斜率容易呈非线性下移,因而灵敏度较低,此外酶的稳定性较差,活性容易丧失,常需加大酶的用量,成本相对较高。而电化学发光免疫分析法测量准确度较高,但其所涉及的电化学发光反应和发光信号检测是在专门配套的电化学发光免疫分析仪的流动池中完成的,其仪器成本和售后维护费用高,测量方式复杂,不适合大规模推广使用,而且在检测传染病类项目如乙肝五项、丙肝抗原和/或抗体、HIV抗体和/或抗原、梅毒抗原和/或抗体、人单纯疱疹病毒I型/II型抗原和/或抗体、人巨细胞病毒抗原和/或抗体、弓形虫抗原和/或抗体、风疹病毒抗原和/或抗体等时,由于流动池是重复利用的,即便每次检测时利用清洗液多次清洗流动池,在先检测的强阳性样品仍然有可能少量地残留在流动池中,这就会影响后续待测的阴性样品的检测结果,从而有可能导致假阳性结果出现。而在第三种方法中,吖啶酯或吖啶磺酰胺与抗原或抗体的偶联相对简单,偶联物发光稳定,发光量与吖啶酯或吖啶磺酰胺浓度呈线性关系,且发光为闪光型,发光快速集中且强度大,便于快速检测,此外,发光反应干扰因素少,背景值低,信噪比高,因而越来越受到免疫诊断试剂开发者的重视。
比如,德国西门子ADVIACentaur化学发光免疫分析仪检测铁蛋白时就是采用上述第三种方法进行检测:往样品中加入吖啶酯标记的羊抗铁蛋白多克隆抗体和表面上偶联着小鼠抗铁蛋白单克隆抗体的磁珠,进行清洗后,依次加入酸液和碱液,促发吖啶酯化学发光,根据发光量确定血清或血浆样品中的铁蛋白浓度。此外,雅培公司的ARCHITECT铁蛋白检测试剂盒也是利用铁蛋白抗体包被的磁珠和吖啶酯标记铁蛋白抗体检测血清或血浆样品中的铁蛋白浓度。但是它们都未整合生物素-亲和素***,其检测灵敏度仍待进一步提高。罗氏公司的Elecsys1010/2010电化学发光免疫分析仪检测铁蛋白(或CA19-9)时,先往血清或血浆样品中加入生物素标记抗铁蛋白(或CA19-9)单克隆抗体和三联吡啶钌标记抗铁蛋白(或CA19-9)单克隆抗体,然后加入链霉素亲和素包被的磁性微粒,给电极施加电压,检测电化学发光信号,虽然通过整合生物素-亲和素***进一步提高化学发光信号,但仍然存在电化学发光免疫分析法中所提及的缺陷。
此外,美国专利US6986913B2实施例35揭示先将血浆与生物素标记羊抗PTH多克隆抗体和吖啶酯标记羊抗PTH多克隆抗体孵育产生一种免疫复合物,然后加入链霉亲和素包被的磁珠,通过生物素和链霉亲和素的相互作用,让这种免疫复合物结合到磁珠上,然后利用清洗液进行清洗,经促发后,利用Liaison免疫分析仪检测化学发光信号。然而,利用这种先加入生物素标记抗体和吖啶酯标记抗体然后加入链霉亲和素包被的磁珠的方法检测铁蛋白或CA19-9也有其不足之处:首先,利用这种方法检测不同浓度铁蛋白或CA19-9校准品的发光量时,较高浓度的铁蛋白或CA19-9校准品产生的发光量很难有效地或更加有效地区分开来;其次,在测量临床血清或血浆等样品时,这种方法的测量误差比较大,准确性差;再者,这种方法的化学发光背景值偏高,会影响测量准确性。
发明内容
针对现有技术的不足之处,本发明发现在利用基于吖啶酯或吖啶磺酰胺的直接化学发光免疫分析法检测样本时,先将样本与生物素标记抗体(Biotin-Ab)和亲和素类物质固定的固相进行孵育,然后加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体(AE-Ab)再进行孵育,接着利用清洗液进行多次清洗以便除去未结合的Biotin-Ab和AE-Ab,加入促发液并检测发光值,可显著地增加检测不同浓度校准品时较高浓度校准品所产生的发光量相差幅度,并且显著地降低化学发光背景值,同时提高临床血清或血浆等样品的检测准确性。所述样本选自校准品、临床血清或血浆等样品。
本发明中的“生物素标记抗体”中的抗体包括至少一种特异性结合样本中分析物(记为A)的抗体,本发明中的“吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体”中的抗体包括至少一种特异性结合样本中分析物A的抗体,所述分析物A可选自铁蛋白;肿瘤相关抗原,如AFP、CEA、PSA、CA19-9、CA125、CA153、CA724等;激素类抗原如FSH、TSH、LH等;传染病类抗原,如HBsAg、HBcAg、HBeAg、HBxAg、HCV抗原等。对双抗体夹心免疫分析法而言,“生物素标记抗体”中的至少一种特异性结合分析物A的抗体和“吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体”中的至少一种特异性结合分析物A特异性结合分析物A的不同抗原决定簇。
本发明所提及“样本的发光量”指的是在样本经与生物素标记抗体、亲和素类物质固定的固相和吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体孵育后,形成“固相-生物素标记抗体-样本中的分析物-吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体”复合物,除去未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,接着加入促发液后,化学发光信号产生,利用免疫分析仪检测所述化学发光信号时所测量到的发光量。样本可以是分析物校准品,也可是临床血清或血浆等样品,因此,本发明所提及“样本的发光量”与“分析物免疫分析发光量”的含义相同。本发明中所提及的“校准品的发光量”是指当样本为分析物校准品时的“样本的发光量”。
本发明提供一种提高免疫分析仪检测准确性的方法,其步骤包括:(1)提供免疫分析仪;(2)将样本与生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相孵育,形成反应混合液;(3)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,再进行孵育;(4)除去未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体;(5)加入促发液后,化学发光信号产生,利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量。
进一步地,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
进一步地,所述样本选自校准品、血清或血浆。
进一步地,所述固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.4~0.8μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5~5.0μg/ml。
本发明还提供一种检测样本中分析物浓度的化学发光免疫分析试剂,所述试剂包括生物素标记抗体、亲和素类物质固定的固相、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体、清洗液和促发液,所述生物素标记抗体和所述亲和素类物质固定的固相先于所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体加入到所述样本中。
进一步地,所述生物素标记抗体和所述亲和素类物质固定的固相加入到所述样本后进行孵育,形成反应混合液,然后往所述反应混合液中加入所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体再进行孵育。
进一步地,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
进一步地,所述样本选自校准品、血清或血浆。
进一步地,所述固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.4~0.8μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5~5.0μg/ml。
本发明还提供一种用于检测样本中分析物浓度的试剂盒,所述试剂盒包括生物素标记抗体、亲和素类物质固定的固相、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体、清洗液和促发液,所述生物素标记抗体和所述亲和素类物质固定的固相先于所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体加入到所述样本中。
进一步地,所述生物素标记抗体和所述亲和素类物质固定的固相加入到所述样本后进行孵育,形成反应混合液,然后往所述反应混合液中加入所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体再进行孵育。
进一步地,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
进一步地,所述样本选自校准品、血清或血浆。
进一步地,所述固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.4~0.8μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5~5.0μg/ml。
本发明还提供一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法,其步骤包括:(1)往所述样本中加入生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相,进行孵育,形成反应混合液;(2)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,再进行孵育;(3)加入清洗液除去未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体;(4)加入促发液后,化学发光信号产生,测定其发光量。
进一步地,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
进一步地,所述样本选自校准品、血清或血浆。
进一步地,所述固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
进一步地,所述生物素标记抗体的浓度为0.4~0.8μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为2.5~5.0μg/ml。
附图说明
图1.利用方法1测量不同浓度铁蛋白校准品的发光量,根据发光量与铁蛋白校准品浓度的函数关系制作而成的标准曲线。
图2.利用方法2测量不同浓度铁蛋白校准品的发光量,根据发光量与铁蛋白校准品浓度的函数关系制作而成的标准曲线。
图3.利用方法1测量50例临床血清样品的铁蛋白浓度值,并且通过比较其测量值与Roche的测量值,绘制临床符合性分析曲线图。
图4.利用方法2测量50例临床血清样品的铁蛋白浓度值,并且通过比较其测量值与Roche的测量值,绘制临床符合性分析曲线图。
具体实施方式
基于吖啶酯或吖啶磺酰胺的直接化学发光免疫分析法检测样本中的分析物浓度,所采用的测定样本中分析物浓度的试剂盒包括生物素标记抗体(Biotin-Ab),吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体(AE-Ab),亲和素类物质固定的固相,校准品,清洗液和促发液;所采用的测定样本中分析物浓度的试剂包括生物素标记抗体(Biotin-Ab),吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体(AE-Ab),亲和素类物质固定的固相,校准品,清洗液和促发液。所述样本选自校准品或临床血清或血浆等样品。当所述分析物为铁蛋白时,Biotin-Ab中的抗体和AE-Ab中的抗体均为抗铁蛋白抗体,即为生物素标记抗铁蛋白抗体(Biotin-ferritin-Ab)和吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗铁蛋白抗体(AE-ferritin-Ab);当所述分析物为CA19-9时,Biotin-Ab中的抗体和AE-Ab中的抗体均为抗CA19-9抗体。以下分别对Biotin-Ab、AE-Ab、亲和素类物质固定的固相、校准品、促发液和清洗液展开说明,同时为了便于说明,以Biotin-ferritin-Ab和AE-ferritin-Ab为例进行说明。
对Biotin-ferritin-Ab和AE-ferritin-Ab而言,Biotin-ferritin-Ab和AE-ferritin-Ab识别的铁蛋白抗原决定簇是不相同的。所述Biotin-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体和所述AE-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体可选自抗铁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体,是利用分离的铁蛋白或其片段免疫非人的动物所产生的,另外,所述Biotin-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体和所述AE-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体也可以是抗铁蛋白单克隆抗体或多克隆抗体经化学试剂或酶处理后仍然具有铁蛋白结合活性的片段,如经木瓜蛋白酶消化后所产生的Fab片段,或者经胃蛋白酶消化后产生的F(ab')2,或者是F(ab')2经酶IdeS消化后产生的Fab'片段。所述的非人动物可选自小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、绵羊、山羊、马、骡和骆驼等动物。优选地,所述Biotin-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体和所述AE-ferritin-Ab中的抗铁蛋白抗体选自小鼠抗铁蛋白单克隆抗体或兔抗铁蛋白单克隆抗体。
分离的铁蛋白或其片段可以是利用常规的蛋白分离技术从人血清或血浆等样品中分离出的,也可以是利用常规的基因工程技术让编码人铁蛋白或其片段的DNA片段在原核生物(如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等)或真核生物细胞(如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞等)中表达,然后经过纯化而产生的,还可以是利用体外转录/翻译***中让这种DNA片段表达后,再经纯化而产生的。
在生物素标记抗铁蛋白抗体(Biotin-ferritin-Ab)中,其标记方法可参照美国专利US5089423A揭示的抗体生物素化方法进行。在使用前,利用生物素标记抗体稀释液对Biotin-ferritin-Ab进行稀释,其中所述生物素标记抗体稀释液可选自ddH2O、生理盐水、缓冲范围包括pH7.0的缓冲液,优选自pH7.4的0.01MPBS缓冲液或pH7.4的10mMTris-HCl缓冲液。在所述生物素标记抗体稀释液中,可根据需要加入适量的BSA、明胶蛋白或酪蛋白等稳定剂,也可根据需要加入适量的防腐剂,如叠氮钠、硫柳汞、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300或Proclin-5000等。
另外,在生物素标记抗铁蛋白抗体(Biotin-ferritin-Ab)中,所述生物素(Biotin)的含义为生物素及其衍生物,其常见的衍生物可选自2-亚氨基生物素、长臂活化生物素、生物素酰肼、生物素-N-巯基乙胺、生物素-O-氨基、生物素甲酯、Sulfo-NHS-LC-Biotin、Sulfo-NHS-Biotin、NHS-PEO4-Biotin、PEO3-Amine-Biotin、NHS-LC-LC-Biotin、NHS-LC-Biotin、Sulfo-NHS-Biotin和NHS-Biotin等。
在吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗铁蛋白抗体(AE-ferritin-Ab)中,吖啶酯可选用美国专利US4745181A、US4946958A、US5521103A和US5656500A等所揭示的吖啶酯类化学发光试剂,吖啶磺酰胺可选用美国专利US5783699A、US5669819A、US5565570A、US5545739A和US5468646A等所揭示的吖啶磺酰胺类化学发光试剂。其标记方法可采用交联试剂将吖啶酯或吖啶磺酰胺与抗铁蛋白抗体偶联在一起,所采用的交联剂可选自N-琥珀酰亚胺基-3-(4-羟苯基)丙酸酯[N-succinimidyl-3-(4-hydroxyphenyl)propionate,SHPP]、琥珀酰亚胺吡啶二巯基丙酯[N-Succinimidyl3-(2-pyridyldithio)propionate,SPDP]、4-马来酰亚胺基丁酸-N-琥珀酰亚胺酯(N-γ-maleimidobutyryloxysuccinimideester,GMBS)、S-乙酰巯基丁二酸酐(S-acetylmercaptosuccinicanhydride,AMSA)、二环己基碳(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)、SMCC、Sulfo-SMCC、戊二醛、高碘酸钠和其他常用的交联试剂等。使用前,可以利用吖啶酯标记抗体稀释液将AE-ferritin-Ab溶液按一定比例进行稀释,其中所述吖啶酯标记抗体稀释液可选自ddH2O、生理盐水、缓冲范围包括pH7.0的缓冲液,优选自pH7.4的0.01MPBS缓冲液或pH7.4的10mMTris-HCl缓冲液。在所述吖啶酯标记抗体稀释液中,可根据需要加入适量的BSA、明胶蛋白或酪蛋白等稳定剂,也可根据需要加入适量的防腐剂,如叠氮钠、硫柳汞、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300或Proclin-5000等。
在亲和素类物质固定的固相中,亲和素类物质选自亲和素(avidin)、链霉亲和素(streptavidin)、中性亲和素(neutravidin)或其他可以结合生物素的亲和素类物质,优选地,所述亲和素类物质为链霉亲和素,而固相选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管、塑料珠等。微孔板可选自常见的16孔酶标板、48孔酶标板和96孔酶标板等,而塑料珠可选自深圳纽邦生物科技有限公司的PS02N/PS03N/PS04N/PS05N/PS06N/PS07N/PS08N型号聚苯乙烯微球等。磁珠是以四氧化三铁等顺磁性物质作为内核、表面经过氨基、羧基、羟基、巯基等活性基团修饰的磁性微粒或磁性微球。磁珠直径通常为0.01~100μm,优选为0.1~10μm。
亲和素类物质与固相的固定方法可分为物理吸附和化学交联两种方式,其中物理吸附方法比较简单,让亲和素类物质与固相在4~37℃下孵育,就可让亲和素类物质包被在固相上,而化学交联方法则涉及使用交联试剂,所使用的交联试剂可选自SHPP、SPDP、GMBS、AMSA、DCC、SMCC、Sulfo-SMCC、戊二醛、高碘酸钠和其他常用的交联试剂等。另外,亲和类物质固定的固相也可从现有的供应商购买,如购买自赛默飞世尔科技公司的DynabeadsM-270、M-280、C1和T1等链霉亲和素磁珠,其中,1mgDynabeadsM-270的生物素结合能力为≥950pmol,可结合大约10μg生物素标记抗体,而1mgDynabeadsT1的生物素结合能力为1100~1700pmol,可结合大约20μg生物素标记抗体。
在检测血清或血浆等样品中的铁蛋白浓度时,应先利用铁蛋白校准品制作标准曲线。为此,需要利用校准品稀释液将事先配好的高浓度铁蛋白校准品进行一系列稀释,从而获得不同浓度的铁蛋白校准品,或者直接利用校准品稀释液和铁蛋白直接配制不同浓度的铁蛋白校准品,另外将不含铁蛋白的校准品稀释液作为零浓度的铁蛋白校准品。当检测CA19-9时,则需利用CA19-9和校准品稀释液配制CA19-9校准品。所述校准品稀释液可选自小牛血清、新生牛血清或胎牛血清,也可选自ddH2O、PBS缓冲液、生理盐水、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tricine缓冲液、三乙醇胺-盐酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液等。在所述校准品稀释液中,可根据需要加入适量的BSA、明胶蛋白或酪蛋白等稳定剂,也可根据需要加入适量的防腐剂,如叠氮钠、硫柳汞、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300或Proclin-5000等。
促发液含有过氧化物,包括促发液A和促发液B。促发液A可选自0.01~0.5M硝酸溶液、硫酸溶液、盐酸溶液或柠檬酸-磷酸盐缓冲液;促发液B可选自0.05~1.5M氢氧化钠溶液;过氧化物包含在促发液A或促发液B中,其质量浓度为0.1%~3%,常见的过氧化物有过氧化氢、过氧化脲和过硼酸盐等。另外,为了增强化学发光效率,还可往促发液A或促发液B中加入增强剂,所加入的增强剂在促发液A或促发液B中的体积浓度为0.1~2%,所述增强剂多为表面活性剂,可选自SDS、Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、TritonX-100、Brij、CTAC或者美国专利US4927769A中揭示的其他增强剂。
在实际检测样本时,不论样本是分析物校准品还是临床血清或血浆等样品,本发明发现先让所述样本与Biotin-Ab和亲和素类物质固定的固相孵育后,再加入AE-Ab进行孵育(方法1),还是先让所述样本与Biotin-Ab和AE-Ab孵育后,再加入亲和素类物质固定的固相进行孵育(方法2,即对照方法)是存在显著差别的,而不是两种可以相互替代的方法:相比于方法2(对照方法),方法1能够明显地或更好地将较高浓度校准品的发光量区分开来,而且化学发光背景值显著偏低。更为重要的是,在检测临床样品中分析物免疫分析发光量时,相比于方法2(对照方法),方法1的测量准确性显著提高。通过选择方法1,本发明的临床样品铁蛋白浓度线性检测范围为0~2000ng/ml,本发明的临床样品CA19-9浓度线性检测范围为5~1200U/ml。对方法2(对照方法)和方法1而言,后续的步骤都是一样的,即在经过两次孵育后,加入清洗液除去未结合的Biotin-Ab和未结合的AE-Ab,然后再加入促发液,检测发光量。常见的清洗液可选自ddH2O、PBS缓冲液、生理盐水、HEPES缓冲液、PIPES缓冲液、MOPS缓冲液、Tricine缓冲液、三乙醇胺-盐酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液等。在所述清洗液中,可根据需要加入Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85或TritonX-100使其体积浓度为0.01~1.0%,也可根据需要加入适量的防腐剂,如叠氮钠、硫柳汞、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300或Proclin-5000等。所述清洗液优选自含有0.05~0.1%Tween-20的PBS缓冲液,即PBST缓冲液,或含有0.05~0.1%Tween-20的Tris-HCl缓冲液,即TBST缓冲液。
本发明所提供的测定样本中分析物浓度的试剂盒以及所提供的测定样本中分析物浓度的试剂均适合与免疫分析仪配套使用。所述免疫分析仪可以是半自动的。对于半自动免疫分析仪而言,除了利用半自动免疫分析仪检测发光量之外,其他步骤可以全部是人工的,也可以是部分自动化的,如中国专利CN202854137U和CN201440139U等。所述免疫分析仪也可以是全自动的。在利用全自动免疫分析仪(automatedimmunoassayanalyzer,AIA)进行自动化检测,能够降低手工或半手工操作时产生的人为操作误差,同时也方便利用全自动免疫分析仪高通量检测多种不同样品的分析物浓度
在测定样本中的分析物免疫分析发光量时,如果亲和素类物质固定的固相中的固相为磁珠,那么配套使用的全自动免疫分析仪的具体结构实例可参见美国专利US5637275A、US5358691A、US5863506A、US5849247A;中国专利CN103443629A、CN103399161B、CN103217541A、CN102147406B、CN202075285U、CN104345158A和CN201765226U等。全自动免疫分析仪主要包括样品盘、试剂盘、反应盘、反应杯、样品/试剂转移单元、清洗单元和检测单元等。优选地,反应杯放置在反应盘上。所述样品/试剂转移单元可以是单个转移单元,但能将样品盘中放置的样品和试剂盘中放置的试剂转移到反应杯中,也可以是由样品转移单元和试剂转移单元组成的,其中样品转移单元用于将样品盘中放置的样品转移到反应杯中,试剂转移单元用于将试剂盘中放置的试剂转移到反应杯中,此外试剂转移单元可以是单个试剂转移单元,也可以是多个试剂转移单元,若是多个试剂转移单元,则每个试剂转移单元可以转移一种或多种试剂盘中放置的试剂到反应杯中。分析物校准品根据需要可放置在样品盘或试剂盘中。所述试剂包括Biotin-Ab、AE-Ab、亲和素类物质固定的固相、促发液和清洗液等,其中清洗液可放置在试剂盘中,也可单独放置在清洗液容器中;前面已提及,促发液包括促发液A和促发液B,促发液A和促发液B可同时放置在试剂盘中,也可单独放置在各自的促发液容器中,此外,促发液A或B也可放置在试剂盒盘中而促发液B或A放置在促发液容器中。当分析物校准品或临床血清或血浆等样品通过样品/试剂转移单元转移到反应杯中后,再利用样品/试剂转移单元先将Biotin-Ab和亲和素类物质固定的固相转移到反应杯中进行孵育,然后再利用样品/试剂转移单元将AE-Ab加入到反应杯中再进行孵育。孵育结束后,在磁铁的磁场作用下,利用清洗单元除去反应杯中未结合的Biotin-Ab和AE-Ab,接着往反应杯中加入促发液A,然后将反应杯放置在检测单元中,待加入促发液B后,检测其发光量,或者将反应杯放置在检测单元后,先后加入促发液A和促发液B,检测其发光量。
在测定样本中的分析物免疫分析发光量时,如果亲和素类物质固定的固相中的固相为微孔板,那么配套使用的全自动免疫分析仪的具体结构实例可参见中国专利CN201945557U、CN104142407A和CN103267867A等。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围,而是提供对本发明的进一步理解。
实施例1:生物素标记抗体方法
本实施例以生物素衍生物NHS-LC-Biotin(购买自PierceChemicalCo.)和小鼠抗铁蛋白单克隆抗体(ferritin-mAb)为例进行说明,其标记方法如下所示:
1.取1mgferritin-mAb,加入适量0.01MPBS缓冲液(pH7.2~7.4),获得终浓度为1mg/mL的ferritin-mAb溶液,并加入透析袋中;
2.往透析袋中加入不小于500ml的0.01MPBS缓冲液(pH7.2~7.4)进行透析,每次透析时间不小于4h,重复换透析液3~4次,然后将透析后的Ab溶液转移至Eppendorf管内;
3.称取1mgNHS-LC-Biotin,加入适量水,获得终浓度为2mg/mL的NHS-LC-Biotin溶液;
4.按5~50倍NHS-LC-Biotin与ferritin-mAb的摩尔比例进行标记,取适当体积的NHS-LC-Biotin溶液加入到步骤2中装有ferritin-mAb的Eppendorf管中混匀,并置于旋转反应器上,室温反应30min,形成反应混合液;
5.将步骤4中的反应混合液转移入透析袋中,并将透析袋置入不小于500ml的0.01MPBS缓冲液(pH7.2~7.4)中进行透析,重复更换透析液3~4次,每次透析时间为不小于4h,然后收集生物素标记ferritin-mAb(Bio-ferritin-mAb)原液,其体积为V1;
6.往收集的原液中添加(0.1×V1)体积的含5%BSA的0.01MPBS缓冲液(pH7.2~7.4),获得Bio-ferritin-mAb母液,于2~8℃下保存;
在使用前,利用生物素标记抗体稀释液(选用pH7.4的0.01MPBS缓冲液为例进行说明)对步骤6中所获得的Bio-ferritin-mAb母液进行稀释,获得Bio-ferritin-mAb工作液。
其中,步骤3中的NHS-LC-Biotin溶液最好现配现用;在步骤5中,还可测量所收集的Bio-ferritin-mAb原液的浓度:先检测该溶液的OD280值,计算其浓度。
实施例2:吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体方法
本实施例以吖啶酯和小鼠抗铁蛋白单克隆抗体(ferritin-mAb)为例说明吖啶酯或吖啶磺酰胺标记方法,如下所示:
1.取1mgferritin-mAb,加入适量0.1MNaHCO3溶液(pH8.0~9.6),获得终浓度为1mg/mL的ferritin-mAb溶液,并加入透析袋中;
2.往透析袋中加入不小于500ml的0.1MNaHCO3溶液(pH8.0~9.6)进行透析,每次透析时间不小于4h,重复换透析液3~4次,然后将透析后的ferritin-mAb溶液转移至Eppendorf管内;
3.称取1mg吖啶酯溶于适量的二甲基甲酰胺(DMF)试剂中,获得终浓度为1mg/mL的吖啶酯溶液;
4.按5~50倍吖啶酯与ferritin-mAb的摩尔比例进行标记,取适当体积的吖啶酯溶液加入到步骤2中装有ferritin-mAb的Eppendorf管中轻微混匀,并置于旋转反应器上,室温反应30min,形成反应混合液;
5.将步骤4中的反应混合液转移入透析袋中,并将透析袋置入不小于500ml的0.01MPBS缓冲液(pH6.0~6.5)中进行透析,重复更换透析液3~4次,每次透析时间为不小于4h,然后收集吖啶酯标记ferritin-mAb(AE-ferritin-mAb)原液,其体积为V2;
6.往收集的原液中添加(0.1×V2)体积的含5%BSA的0.01MPBS缓冲液(pH6.0~6.5),获得AE-ferritin-mAb母液,于2~8℃下保存;
在使用前,利用吖啶酯标记抗体稀释液(选用pH7.4的0.01MPBS缓冲液为例进行说明)对步骤6中所获得的AE-ferritin-mAb母液进行稀释,获得AE-ferritin-mAb工作液。
其中,步骤3中的吖啶酯溶液最好现配现用;步骤5中,还可测量所收集的AE-ferritin-mAb原液的浓度:先检测该溶液的OD280值,计算其浓度。
实施例3:检测样本的发光量
在亲和素类物质固定的固相中,固相可选自微孔板、塑胶微粒、磁珠、弹性塑料管或塑料珠。本实施例以链霉亲和素固定的磁珠为例进行说明。当使用链霉亲和素固定的磁珠时,此时相关的免疫反应和化学发光反应可在比色杯、反应杯、试管、酶标板孔或透明小容器等反应容器中进行,本实施例以反应杯为例进行说明。
在本实施例中,样本可以是铁蛋白校准品,也可以是临床血清或血浆等样品。
为了便于说明,本实施例中选择的促发液A为含质量浓度0.25%过氧化氢的0.1N硝酸溶液,触发液B为含体积浓度0.5%TritonX-100的0.25N氢氧化钠溶液;所选择的清洗液为0.01MPBST缓冲液。
方法1的步骤如下所示:
1.按照实施例1中的说明,利用生物素标记抗体稀释液对Bio-ferritin-mAb母液进行稀释,获得终浓度为0.1~5.0μg/ml的Bio-ferritin-mAb工作液,同时利用吖啶酯标记抗体稀释液对AE-ferritin-mAb母液进行稀释,获得终浓度为0.1~5.0μg/ml的AE-ferritin-mAb工作液;
2.往反应杯中加入10μl样本、50μl步骤1中所获得的Biotin-ferritin-mAb工作液和50μl1.0mg/mLDynabeadsM-270链霉亲和素磁珠悬浮液(0.01MPBS缓冲液,pH7.4,含有0.1%BSA和0.02%叠氮钠),在37℃下孵育20min,获得反应混合液;
3.往步骤2中的反应混合液中加入50μl步骤1中所获得的AE-ferritin-mAb工作液,在37℃下孵育10min,随后在磁场的作用下,将磁珠吸附到反应杯的内壁上,除去反应杯内的溶液;
4.往反应杯中加入清洗液重悬磁珠,然后再在磁场的作用下,除去反应杯内的溶液,利用清洗液重复洗涤磁珠3次,从而除去未结合的Biotin-ferritin-mAb和未结合的AE-ferritin-mAb;
5.先后加入250μl促发液A和250μl促发液B,然后检测发光量(RLUs)。
方法2(对照方法)的步骤与方法1的步骤的差别在于步骤2中加入的是样本、Biotin-ferritin-mAb工作液和AE-ferritin-mAb工作液而不是样本、Biotin-ferritin-mAb工作液和DynabeadsM-270链霉亲和素磁珠悬浮液,步骤3加入的是DynabeadsM-270链霉亲和素磁珠悬浮液而不是AE-ferritin-mAb工作液,其他条件保持不变。
实施例4:利用铁蛋白校准品制作标准曲线
本实施例中的样本为铁蛋白校准品。为此,首先利用小牛血清和铁蛋白配制出不同浓度的铁蛋白校准品,其浓度分别为0ng/ml,10ng/ml,25ng/ml,100ng/ml,500ng/ml,1000ng/ml和2000ng/ml。
实施例3步骤2中的Bio-ferritin-mAb工作液浓度选择为0.8μg/ml,实施例3步骤2中的AE-ferritin-mAb工作液浓度选择为5.0μg/ml,然后在反应杯中按照实施例3中的方法2(对照方法)和方法1检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光量(RLUs),其中每个浓度的铁蛋白校准品平行检测两次,求其平均发光量检测结果分别如表1和表2所示,然后利用与铁蛋白校准品浓度的函数关系,制作标准曲线,分别如图1和图2所示。
为了叙述方便,用A1代表1000ng/ml铁蛋白校准品溶液的发光量,A2代表2000ng/ml铁蛋白校准品溶液的发光量,Bio代表Bio-ferritin-mAb工作液,AE代表AE-ferritin-mAb工作液。
表1方法1中的不同浓度铁蛋白校准品的检测结果
表2方法2中的不同浓度铁蛋白校准品的检测结果
通过比较表1和表2中的数据可知,方法1中,平行检测1(RLUs)、平行检测2(RLUs)以及平均发光量的A2/A1比值分别为1.704、1.615和1.658,而且A2相对A1分别增加了70.4%、61.5%和65.8%;而在方法2(对照方法)中,平行检测1(RLUs)、平行检测2(RLUs)以及的A2/A1比值分别为1.352、1.243和1.298,而且A2相对A1分别仅仅增加了35.2%、24.3%和29.8%。鉴于2000ng/ml铁蛋白校准品浓度是1000ng/ml铁蛋白校准品浓度的2倍,而且铁蛋白校准品的发光量与其浓度成正比关系,因此理论上,2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量应是1000ng/ml铁蛋白校准品的2倍,但是实际上受限于检测仪器灵敏度等因素的制约,总是存在一些偏差,但是这一比值应当接近于2。基于此,可知方法1的A2/A1比值均接近于2,能够显著将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来,而方法2(对照方法)的A2/A1比值都远小于2,不能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来。
与此同时,根据表1和表2的数据还可知,方法2(对照方法)中的化学发光背景值(即0ng/ml铁蛋白校准品的发光量)比方法1中的化学发光背景值(即0ng/ml铁蛋白校准品的发光量)显著增加,就平均发光量而言,增加幅度高达60.98%。
另外,在两次平行检测不同浓度的铁蛋白校准品的发光值时,方法1的%CV均远远小于10%,因此检测精密度良好。而方法2(对照方法)的%CV相对而言偏高一些,其中100.00ng/ml铁蛋白校准品的%CV甚至还大于10%,因此,方法2(对照方法)的检测精密度较差。
实施例5:Bio-ferritin-mAb和AE-ferritin-mAb不同浓度组合
本实施例中,A1、A2、Bio和AE的含义与实施例4相同。
在实施例4中,本发明发现方法1能够将高浓度的铁蛋白校准品产生的发光量显著区分开。在此基础上,通过更改Bio和AE的浓度,按照方法1测量A1和A2,其结果如下表3所示。
表3不同浓度组合的平均发光量
可知表3中不同浓度的Bio和AE组合均能有效地将1000ng/ml和2000ng/ml铁蛋白校准品的发光量区分开来。
实施例6:临床样品铁蛋白浓度检测
本实施例中的样本为临床血清或血浆等样品。
实施例3步骤2中的Bio-ferritin-mAb工作液浓度选择为0.8μg/ml,实施例3步骤2中的AE-ferritin-mAb工作液浓度选择为5.0μg/ml,然后在反应杯中按照实施例3中的方法2(对照方法)和方法1检测50例不同临床血清样品的铁蛋白浓度。此外,鉴于罗氏(Roche)的铁蛋白电化学发光免疫分析检测准确性比较高,因此也利用Roche的铁蛋白电化学发光免疫分析试剂盒和与其配套使用的罗氏电化学发光免疫分析仪E170对这50例临床样品进行检测,并用以评估方法2(对照方法)和方法1的测量准确性,其结果如表4所示:
表4临床样品铁蛋白浓度检测结果
对表4中方法1的测量值与Roche的测量值进行临床符合性分析,其结果如图3所示。
对表4中方法2(对照方法)的测量值与Roche的测量值进行临床符合性分析,其结果如图4所示。
由表4中的数据可知,在测量低浓度铁蛋白(样品1~6)的临床血清样品时,方法1的测量值与罗氏的测量值比值在0.82~0.95浮动,与Roche的测量值偏差在-18%~-5%,达到业内规定的正常范围,而方法2(对照方法)的测量值与罗氏的测量值比值在0.58~0.77浮动,与Roche的测量值偏差-42%~-23%,可知方法2(对照方法)的测量值显著偏低,达不到业内规定的正常范围;对测量中浓度铁蛋白的临床血清样品(样品16~37)时,方法1的测量值与罗氏的测量值比值在0.92~1.16浮动,与Roche的测量值偏差在-8%~+16%,达到业内规定的正常范围,而方法2(对照方法)的测量值与罗氏的测量值比值在0.93~1.50浮动,除了极少数样品的测量值在正常范围内,绝大多数样品的测量值与Roche的测量值偏差至少+21%,最高达+50%,可知方法2(对照方法)的测量值显著偏高,不符合业内规定的正常范围;在测量高浓度铁蛋白(样品47~50)的临床血清样品时,方法1的测量值与罗氏的测量值比值在0.88~0.98浮动,与Roche的测量值偏差在-12%~-2%,达到业内规定的正常范围,而方法2(对照方法)的测量值与罗氏的测量值比值在0.76~0.89浮动,与Roche的测量值偏差-11%~-24%,可知除样品48和样品50的测量值勉强能接受外,方法2(对照方法)对样品47和样品49的测量值显著偏低,达不到业内规定的正常范围。
再根据图3和图4中,图3的斜率为0.995,非常接近1.0,R值大于0.99,因此方法1的测量值与Roche的测量值吻合性更好,准确性更好,而图4的斜率为0.919,明显小于1.0,而且R值小于0.99,因此方法2(对照方法)的测量值与Roche的测量值吻合性较差,测量误差显著偏大。
综上所述,基于实施例4、实施例5和实施例6中的结果可知,若选择方法2(对照方法)检测不同浓度的铁蛋白校准品,那么较高浓度的铁蛋白校准品产生的发光值之间的差值幅度过小,而不能将它们有效地区分开来;而且,若选择方法2(对照方法)检测临床血清或血浆样品,那么它不能准确地检测低浓度和高浓度铁蛋白的临床样品,而且在检测中浓度铁蛋白的临床样品时,方法2(对照方法)的检测结果显著偏高。这就意味着方法2(对照方法)的检测准确性比较差。反之,若选择方法1检测不同浓度的铁蛋白校准品,则可将较高浓度的铁蛋白校准品产生的发光值有效地区分开;而且利用方法1临床血清或血浆样品中的铁蛋白浓度时,不仅能够准确地检测低浓度铁蛋白的临床样品和中浓度铁蛋白的临床样品,而且也能够准确地检测高浓度铁蛋白的临床样品,这就表明方法1的检测准确性相比于方法2(对照方法)显著提高,而且方法1的线性检测范围显著增加。
再者,采用方法1检测不同浓度的铁蛋白校准品时,其化学发光背景值会显著降低,从而会极大提高检测准确性和信噪比,因此有助进一步提高临床样品的检测准确性。相反,方法2(对照方法)的化学发光背景值显著偏高,会进一步降低临床样品的检测准确性。
实施例7:临床样品CA19-9浓度检测
本实施例选择糖类抗原CA19-9进行说明。按照实施例1中的方法制备生物素标记小鼠抗CA19-9单克隆抗体(Bio-CA199-mAb),按照实施例2中的方法制备吖啶酯标记小鼠抗CA19-9单克隆抗体(AE-CA199-mAb)。
利用pH7.4的0.01MPBS缓冲液和CA19-9配制浓度分别为5U/ml、50U/ml、200U/ml、600U/ml和1200U/ml的CA19-9校准品,Bio-CA199-mAb工作液浓度选择为0.65μg/ml,AE-CA199-mAb工作液浓度选择为3.0μg/ml,然后在反应杯中按照实施例3中的方法2(对照方法)和方法1检测不同浓度的CA19-9校准品的发光量(RLUs),其中每个浓度的CA19-9校准品平行检测两次,求其平均发光量检测结果如表5所示。记600U/mlCA19-9校准品的平均发光量为A11,记1200U/mlCA19-9校准品的平均发光量为A12。
表5
由表5可知,方法1的A12/A11比值为1.722,大于方法2(对照方法)的1.600,这意味着相对于方法2(对照方法),方法1能够更好地将高浓度CA19-9校准品的发光值区分开来。
Bio-CA199-mAb工作液浓度选择为0.65μg/ml,AE-CA199-mAb工作液浓度选择为3.0μg/ml,然后按照实施例3中的方法2(对照方法)和方法1检测7例临床血清样品中的CA19-9浓度。此外,鉴于罗氏(Roche)的CA19-9电化学发光免疫分析检测准确性比较高,因此也利用Roche的CA19-9电化学发光免疫分析试剂盒和与其配套使用的罗氏电化学发光免疫分析仪E170对这7例临床样品进行检测,并用以评估方法2(对照方法)和方法1的测量准确性,其结果如表6所示,其中Roche的临床样品CA19-9浓度线性检测上限为1000U/ml。
表6临床样品CA19-9浓度检测结果
由表6数据可知,方法2(对照方法)和方法1在检测中低浓度CA19-9血清样品(样品1~2)时相差不大,但在检测高浓度CA19-9血清样品(样品3~7)时,方法1的检测结果更为准确,而方法2(对照方法)的检测结果显著偏低。由此可知,利用方法1检测高浓度CA19-9血清样品中CA19-9浓度的准确性更好,而且能显著提高其线性检测范围。
Claims (10)
1.一种提高免疫分析仪检测准确性的方法,其步骤包括:(1)提供免疫分析仪;(2)将样本与生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相孵育,形成反应混合液;(3)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,再进行孵育;(4)除去未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体;(5)加入促发液后,化学发光信号产生,利用所述免疫分析仪检测所述化学发光信号的发光量。
2.如权利要求1所述的方法,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
3.如权利要求1所述的方法,所述样本选自校准品、血清或血浆。
4.如权利要求1-3之一所述的方法,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
5.一种用于检测样本中分析物浓度的化学发光免疫分析试剂,所述试剂包括生物素标记抗体、亲和素类物质固定的固相、吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体、清洗液和促发液,其特征在于,所述生物素标记抗体和所述亲和素类物质固定的固相先于所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体加入到所述样本中。
6.如权利要求5所述的试剂,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
7.如权利要求6所述的试剂,所述样本选自校准品、血清或血浆。
8.如权利要求5-7之一所述的试剂,所述生物素标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml,所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体的浓度为0.1~5.0μg/ml。
9.一种提高样本中分析物化学发光免疫检测线性范围的方法,其步骤包括:(1)往所述样本中加入生物素标记抗体和亲和素类物质固定的固相,进行孵育,形成反应混合液;(2)往所述反应混合液中加入吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体,再进行孵育;(3)加入清洗液除去未结合的生物素标记抗体和未结合的吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体;(4)加入促发液后,化学发光信号产生,测定其发光量。
10.如权利要求9所述的方法,所述生物素标记抗体中的抗体和所述吖啶酯或吖啶磺酰胺标记抗体中的抗体同时选自抗铁蛋白抗体或抗CA19-9抗体。
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---|---|
CN (1) | CN105353138A (zh) |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107367620A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-11-21 | 苏州新波生物技术有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法 |
WO2018006269A1 (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒 |
CN107703291A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-02-16 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 用于发光免疫分析法的浓缩缓冲液及其制备方法 |
CN109001472A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-14 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 人促甲状腺素受体抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 |
CN109239358A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
CN111579765A (zh) * | 2019-02-19 | 2020-08-25 | 北京北方生物技术研究所有限公司 | 一种提高吖啶酯发光信噪比的激发液*** |
CN114113610A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-03-01 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶酯标记复合物和检测试剂盒 |
CN115494244A (zh) * | 2022-11-21 | 2022-12-20 | 保定佳瑞源生物芯片有限公司 | 一种癌抗原ca724的吖啶酯抗体标记稀释液及其应用 |
CN115950969A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-04-11 | 中国计量科学研究院 | 一种血清中游离***特异抗原的定值方法 |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030027234A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-06 | Pandian Murugan R. | Methods for detecting Down's syndrome |
CN101324579A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 清华大学 | 一种检测糖类抗原的磁性微粒子化学发光酶免疫分析试剂盒及其使用方法 |
CN101373188A (zh) * | 2007-09-26 | 2009-02-25 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101539576A (zh) * | 2008-03-21 | 2009-09-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒前s1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101545910A (zh) * | 2008-03-25 | 2009-09-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 |
CN102095845A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒 |
CN102323253A (zh) * | 2011-08-16 | 2012-01-18 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 铁蛋白(ferritin)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN102426256A (zh) * | 2011-08-16 | 2012-04-25 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 糖类抗原19-9(ca19-9)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
-
2015
- 2015-12-17 CN CN201510952436.5A patent/CN105353138A/zh active Pending
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030027234A1 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-06 | Pandian Murugan R. | Methods for detecting Down's syndrome |
CN101324579A (zh) * | 2007-06-13 | 2008-12-17 | 清华大学 | 一种检测糖类抗原的磁性微粒子化学发光酶免疫分析试剂盒及其使用方法 |
CN101373188A (zh) * | 2007-09-26 | 2009-02-25 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 肿瘤相关抗原19-9化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101539576A (zh) * | 2008-03-21 | 2009-09-23 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 乙型肝炎病毒前s1抗原化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 |
CN101545910A (zh) * | 2008-03-25 | 2009-09-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 铁蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法 |
CN102095845A (zh) * | 2009-12-11 | 2011-06-15 | 上海裕隆生物科技有限公司 | 糖链抗原19-9化学发光定量检测试剂盒 |
CN102323253A (zh) * | 2011-08-16 | 2012-01-18 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 铁蛋白(ferritin)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN102426256A (zh) * | 2011-08-16 | 2012-04-25 | 内蒙古科慧生物科技有限责任公司 | 糖类抗原19-9(ca19-9)定量测定试剂盒及其检测方法 |
CN102565405A (zh) * | 2011-08-24 | 2012-07-11 | 苏州长光华医生物试剂有限公司 | 一种用吖啶酯标记技术结合通用型磁颗粒进行免疫学检测的方法 |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2018006269A1 (zh) * | 2016-07-05 | 2018-01-11 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶标记结合物及其制备方法、化学发光免疫检测试剂盒 |
CN107367620A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-11-21 | 苏州新波生物技术有限公司 | 一种检测血液中降钙素原的试剂盒及降钙素原的检测方法 |
CN107703291A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-02-16 | 中山市创艺生化工程有限公司 | 用于发光免疫分析法的浓缩缓冲液及其制备方法 |
CN109001472A (zh) * | 2018-08-03 | 2018-12-14 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 人促甲状腺素受体抗体化学发光检测试剂盒及其制备方法和使用方法 |
CN109239358A (zh) * | 2018-09-12 | 2019-01-18 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 铁蛋白化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
CN111579765A (zh) * | 2019-02-19 | 2020-08-25 | 北京北方生物技术研究所有限公司 | 一种提高吖啶酯发光信噪比的激发液*** |
CN111579765B (zh) * | 2019-02-19 | 2023-05-23 | 北京北方生物技术研究所有限公司 | 一种提高吖啶酯发光信噪比的激发液*** |
CN114113610A (zh) * | 2021-12-08 | 2022-03-01 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶酯标记复合物和检测试剂盒 |
CN114113610B (zh) * | 2021-12-08 | 2023-08-11 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 吖啶酯标记复合物和检测试剂盒 |
CN115950969A (zh) * | 2022-11-08 | 2023-04-11 | 中国计量科学研究院 | 一种血清中游离***特异抗原的定值方法 |
CN115950969B (zh) * | 2022-11-08 | 2023-09-01 | 中国计量科学研究院 | 一种血清中游离***特异抗原的定值方法 |
CN115494244A (zh) * | 2022-11-21 | 2022-12-20 | 保定佳瑞源生物芯片有限公司 | 一种癌抗原ca724的吖啶酯抗体标记稀释液及其应用 |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |