CN105349607A - 一种高效提取甘露聚糖肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效提取甘露聚糖肽的方法，包括：步骤A，采用β-甘露聚糖酶酶解魔芋飞粉；步骤B，将步骤A得到的酶解液用碱液提取；步骤C，将步骤B得到的飞粉蛋白液进行预超滤分离，除去小分子糖；步骤D，对步骤C得到的预超滤截留液加入蛋白酶进行一级同步酶解超滤；步骤E，对步骤D制备得到的滤出液进行二级超滤分离滤出蛋白酶；步骤F，将步骤E得到的截留液浓缩干燥，得到甘露聚糖肽提取物。本发明最终获得的魔芋飞粉甘露聚糖肽的提取率达2～3%，纯度达70～75%。本发明将酶解过程和多级超滤串联同步连续进行，可显著提高生产效率。本发明无需酶解反应后的灭酶过程，且蛋白酶可循环重复利用，提高了酶的利用率，节能环保。

Description

一种高效提取甘露聚糖肽的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及从天然植物魔芋中提取糖肽物的方法，特别是一种从魔芋飞粉中高效提取甘露聚糖肽的方法。

背景技术

甘露聚糖肽(Mannatide)是我国首创的一种新型免疫增强剂。在临床上，甘露聚糖肽主要作为免疫增强剂使用，用于改善免疫功能低下，增强和调节患者的免疫功能，适用于免疫功能低下的各种疾病。而且，甘露聚糖肽能减轻放疗化疗的毒副作用，可广泛用于肿瘤化疗中的辅助治疗，是一种应用前景广阔的医药原料。目前，制备甘露聚糖肽的方法主要有：发酵法、酶转化法、化学合成法等。近年来，各种植物源多肽因其易吸收、无毒副作用、安全性高等优势，逐渐成为制备生物活性肽的重要来源。

魔芋飞粉(简称飞粉)主要为魔芋的表皮部分，是加工魔芋精粉时，飘落在石臼周围的质量轻，颗粒小的细粉。目前对魔芋粉的利用主要在精粉方面，飞粉的利用率极低。飞粉中含有涩味物质，适口性很不好，还未被食品工业直接利用，极少部分飞粉作为低价饲料或干燥剂出售，大部分被弃掉，这种废弃的粉末状物质同时也对环境造成了污染。目前魔芋精粉的出粉率为52.4%～62.4%，魔芋飞粉的出粉率为36.2%～44.7%，加工魔芋粉产生的飞粉相当于精粉量的60%～80%，飞粉中含粗蛋白22.98％，粗纤维3.23％，是一种高蛋白低纤维的重要资源，也是生产活性多肽的良好原料。因此，利用我国丰富的魔芋飞粉资源，提取具有重要医用价值的甘露聚糖肽，变废为宝，具有重要的经济价值和环保意义。

目前，以魔芋飞粉为原料，主要是提取制备活性多肽，制备方法主要有发酵法和酶解法；而对魔芋飞粉中甘露聚糖肽的提取尚只有零星报道，有定性研究采用共生发酵酶解魔芋飞粉，提取获得了具有生理活性的甘露聚糖肽，但对提取魔芋飞粉甘露聚糖肽的定量研究，包括提取工艺，特别是高效提取工艺、提取率和提取物纯度等都未见诸报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高效提取甘露聚糖肽的方法。本发明方法从魔芋飞粉中提取得到的甘露聚糖肽的提取率高达2～3%，纯度达到70～75%。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种高效提取甘露聚糖肽的方法，包括以下步骤：

步骤A：采用α-淀粉酶和糖化酶酶解魔芋飞粉原料，去除魔芋飞粉中的淀粉，得到飞粉酶解液；

步骤B：用碱液提取步骤A得到的飞粉酶解液中的蛋白，得到飞粉蛋白液；

步骤C：使用截留分子量为2,000Da的中空纤维式超滤膜对步骤B得到的飞粉蛋白液进行预超滤分离，除去小分子糖，得到预超滤截留液；

步骤D：同步酶解超滤，在步骤C得到的所述预超滤截留液中加入蛋白酶，得到截留液-蛋白酶混合液，同时将所述截留液-蛋白酶混合液通过第一超滤柱2进行一级超滤分离，得到截留液I和滤出液I；所述第一超滤柱包含截留分子量为XDa的中空纤维式超滤膜；

步骤E：酶解液二级超滤，使步骤D得到的滤出液I通过温控容器3进入第二超滤柱进行二级超滤分离，得到截留液II和滤出液II；所述第二超滤柱包含截留分子量为YDa的中空纤维式超滤膜；

所述步骤E与所述步骤D同步进行，所述步骤D中得到的截留液I回到进料容器1后再进入所述第一超滤柱2循环往复进行一级超滤分离；所述步骤E中得到的截留液II回到温控容器3后再进入第二超滤柱循环往复进行二级超滤分离;

所述步骤E中得到的滤出液II是包含有蛋白酶的滤出液，所述蛋白酶的分子量为ZDa；所述含有蛋白酶的滤出液收集到酶液收集器中后可以重新添加到进料容器1中使用。

步骤F：将所述温控容器3中的最终收集到的超滤产物浓缩干燥，得到甘露聚糖肽提取物。

上述技术方案中，200,000Da>X>Y>Z>2,000Da。优选地，X为80,000Da，Y为50,000Da，Z为27,000Da。

进一步的，所述步骤A中，魔芋飞粉原料中α-淀粉酶和糖化酶的加酶量分别为26RAU/g和50WU/g。

进一步的，所述步骤B中，所述碱液提取的具体步骤为：采用氢氧化钠将酶解液pH调至6～10，料液比设置为1:15～1:40，提取温度为30～70℃，提取时间10～40min，提取3次，离心得到飞粉蛋白液。

进一步的，所述步骤C中，预超滤条件：压力0.02～0.1Mpa；温度5～45℃；pH值为3～12；膜通量为1～20升/小时。

进一步的，所述步骤D中，第一超滤柱的超滤条件：压力0.02～0.1Mpa，温度20～70℃；pH值为7～10；膜通量为1～20升/小时；

所述步骤E中，第二超滤柱的超滤条件：压力0.02～0.1Mpa；温度5～15℃；pH值为7～10；膜通量为1～20升/小时。

进一步的，所述步骤D和所述步骤E在一个同步酶解多级超滤装置中完成，所述同步酶解多级超滤装置包括进料容器1，第一超滤柱2，温控容器3，第二超滤柱4和酶液收集器5；

所述进料容器1上设置用于添加底物和蛋白酶的加料口11，进料容器出口13，以及截留液I进口12；

所述第一超滤柱2设置第一超滤柱进口21，第一超滤柱截留液I出口22，第一超滤柱滤出液I出口23；所述第一超滤柱进口21与所述进料容器出口13连接；所述第一超滤柱截留液I出口22与进料容器进口12连接；

所述温控容器3设置温控容器第一进口31，温控容器第二进口32，以及温控容器出口33；所述温控容器第一进口31与所述第一超滤柱滤出液I出口23连接；

所述第二超滤柱4设置与所述温控容器出口33连接的第二超滤柱进口41，以及与所述温控容器第二进口32连接的第二超滤柱截留液II出口42。

进一步的，所述步骤E中，所述第二超滤柱4还设置有第二超滤柱滤出液II出口43；所述酶液收集器5设置与第二超滤柱滤出液II出口43连接的进口。

上述技术方案中，所述截留液-蛋白酶混合液通过进料容器加料口进入进料容器，并且通过进料容器出口，第一超滤柱进口进入所述第一超滤柱，经过第一超滤柱超滤后，未完全酶解的截留液经过第一超滤柱截留液出口，进料容器进口回流至所述进料容器。第一超滤柱循环期间保持所述进料容器和所述第一超滤柱温度为30~60℃，使得所述蛋白酶酶解的过程在第一超滤柱循环***中始终同步进行。

经过所述第一超滤柱超滤分离的滤出液经过第一超滤柱滤出液出口进入温控容器，并且通过温控容器出口，第二超滤柱进口进入所述第二超滤柱，经过第二超滤柱超滤后，包含有酶的滤出液经过第二超滤柱滤出液出口收集到酶液收集器中。所述酶液收集器中的酶液可以重新添加到进料容器中使用。经过所述第二超滤柱的截留液经过第二超滤柱截留液出口，温控容器第二进口回流到温控容器中，并再次循环至第二超滤柱中，直到酶全部滤出。最后，在温控容器中收集分子量为Y~XDa的产物。上述技术方案中，控制温控容器和第二超滤柱温度为10~15℃，在不影响超滤效率的同时，钝化酶的活性，防止产物过分酶解。

本发明为一种高效提取甘露聚糖肽的方法，采用淀粉酶解、蛋白碱提、小分子糖预超滤、结合同步酶解多级连续超滤，最终获得魔芋飞粉甘露聚糖肽的提取率达2～3%，纯度达70～75%。本发明与现有技术相比，具有如下优点：

(1)本发明将酶解过程和多级超滤串联同步连续进行，优化了提取工艺，可减少工作时间，降低劳动强度，提高生产效率。

(2)本发明大幅提高了魔芋飞粉甘露聚糖肽的提取率和提取物纯度。

(3)本发明无需酶解反应完毕后的灭酶过程，可减少加热能耗，更加节能环保。

(4)本发明使用的蛋白酶可循环重复利用，提高了酶的利用率，在生产中更加节约成本。

附图说明

图1为本发明同步酶解多级超滤装置的结构示意图。

图中各个附图标记对应的部件名称是：1-进料容器；2-第一超滤柱；3-温控容器；4-第二超滤柱；5-酶液收集器；11-加料口；12-进料容器进口；13-进料容器出口；21-第一超滤柱进口；22-第一超滤柱截留液出口；23-第一超滤柱滤出液出口；31-温控容器第一进口；32-温控容器第二进口；33-温控容器出口；41-第二超滤柱进口；42-第二超滤柱截留液出口；43-第二超滤柱滤出液出口。

具体实施方式

实施例1：同步酶解多级超滤装置的设置

如图1所示，所述同步酶解多级超滤装置包括进料容器1，第一超滤柱2，温控容器3，第二超滤柱4和酶液收集器5。所述进料容器1上设置用于添加样品液的加料口11，进料容器出口13，以及进料容器进口12。所述第一超滤柱2设置第一超滤柱进口21，第一超滤柱截留液出口22，第一超滤柱滤出液出口23；所述第一超滤柱进口21与所述进料容器出口13连接；所述第一超滤柱截留液出口22与进料容器进口12连接。所述温控容器3设置温控容器第一进口31，温控容器第二进口32，以及温控容器出口33；所述温控容器第一进口31与所述第一超滤柱滤出液出口23连接。所述第二超滤柱4设置与所述温控容器出口33连接的第二超滤柱进口41，以及与所述温控容器第二进口32连接的第二超滤柱截留液出口42。所述第二超滤柱4还设置第二超滤柱滤出液出口43；所述酶液收集器5设置与第二超滤柱滤出液出口43连接的进口。

所述第一超滤柱含截留分子量为80,000Da的中空纤维式超滤膜；所述第二超滤柱含截留分子量为50,000Da的中空纤维式超滤膜。

实施例2从魔芋飞粉中提取甘露聚糖肽

步骤A：采用α-淀粉酶和糖化酶酶解魔芋飞粉原料，去除魔芋飞粉中的淀粉，得到飞粉酶解液；魔芋飞粉原料中α-淀粉酶和糖化酶的加酶量分别为26RAU/g和50WU/g。

步骤B：用碱液提取步骤A得到的飞粉酶解液中的蛋白，得到飞粉蛋白液；所述碱液提取的具体步骤为：采用氢氧化钠将酶解液pH调至9，料液比设置为1:20，提取温度为60℃，提取时间20min，提取3次，离心得到飞粉蛋白液。

步骤C：使用截留分子量为2,000Da的中空纤维式超滤膜对所述步骤B得到的飞粉蛋白液进行预超滤分离，除去小分子糖，得到预超滤截留液；预超滤条件：压力0.1Mpa；温度25℃；pH值为7；膜通量为3升/小时。

步骤D和步骤E在实施例1所述的同步酶解多级超滤装置中同步连续进行：

首先，将步骤C得到的预超滤截留液加入蛋白酶，蛋白酶的加酶量为2,900DU/g，得到截留液-蛋白酶混合液；将第一超滤柱一级超滤条件设定为：压力0.1Mpa，温度55℃；pH值为9；膜通量为2升/小时。将第二超滤柱二级超滤条件设定为：压力0.1Mpa；温度12℃；pH值为9；膜通量为3升/小时。

随后，将所述截留液-蛋白酶混合液通过第一加料口11加入到进料容器1中，并且通过进料容器出口13，第一超滤柱进口21进入第一超滤柱超滤，未完全酶解的截留液经过第一超滤柱截留液出口22，进料容器进口12回流至进料容器1。第一超滤柱循环超滤期间保持所述进料容器和所述第一超滤柱温度为55℃，使得所述蛋白酶酶解的过程在进料容器和第一超滤柱循环***中始终同时进行。

经过第一超滤柱2超滤分离的滤出液经过第一超滤柱滤出液出口23进入温控容器3，并且通过温控容器出口33，第二超滤柱进口41进入第二超滤柱4，经过第二超滤柱超滤，包含有酶的滤出液经过第二超滤柱滤出液出口43收集到酶液收集器5中。酶液收集器5中的酶液可以重新添加到进料容器1中使用。经过第二超滤柱的截留液经过第二超滤柱截留液出口42，温控容器第二进口32回流到温控容器3中，并再次循环至第二超滤柱4中，直到酶全部滤出。第二超滤柱循环超滤期间保持所述温控容器和所述第二超滤柱温度为12℃。最后，在温控容器3中收集分子量为50,000~80,000Da的产物。

步骤F：将温控容器3中收集到的分子量为50,000~80,000Da的产物浓缩干燥，得到甘露聚糖肽提取物，其中甘露聚糖肽含量为72.3%。

如上，便可以较好地实现本发明。

Claims (5)

1.一种高效提取甘露聚糖肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：采用α-淀粉酶和糖化酶酶解魔芋飞粉原料，去除魔芋飞粉中的淀粉，得到飞粉酶解液；

步骤B：用碱液提取步骤A得到的飞粉酶解液中的蛋白，得到飞粉蛋白液；

步骤C：使用截留分子量为2,000Da的中空纤维式超滤膜对步骤B得到的飞粉蛋白液进行预超滤分离，除去小分子糖，得到预超滤截留液；

步骤D：同步酶解一级超滤，在步骤C得到的预超滤截留液中加入蛋白酶，得到截留液-蛋白酶混合液，同时将所述截留液-蛋白酶混合液通过第一超滤柱2进行一级超滤分离，得到截留液I和滤出液I；所述第一超滤柱2包含截留分子量为XDa的中空纤维式超滤膜；

步骤E：酶解液二级超滤，使步骤D得到的滤出液I通过温控容器3进入第二超滤柱4进行超滤分离，得到截留液II和滤出液II；所述第二超滤柱4包含截留分子量为YDa的中空纤维式超滤膜；

所述步骤E与所述步骤D同步连续进行，所述步骤D中得到的截留液I回到进料容器1后再进入所述第一超滤柱2循环往复进行一级超滤分离；所述步骤E中得到的截留液II回到温控容器3后再进入第二超滤柱循环往复进行二级超滤分离;

所述步骤E中得到的滤出液II是包含有蛋白酶的滤出液，所述蛋白酶的分子量为ZDa；所述含有蛋白酶的滤出液收集到酶液收集器中后可以重新添加到进料容器1中使用；

步骤F：将所述温控容器3中最终收集到的超滤产物浓缩干燥，得到甘露聚糖肽提取物；

上述技术方案中，200,000Da>X>Y>Z>2,000Da。

2.如权利要求1所述一种高效提取甘露聚糖肽的方法，其特征在于，X为80,000Da，Y为50,000Da，Z为27,000Da。

3.如权利要求1所述一种高效提取甘露聚糖肽的方法，其特征在于，所述步骤A中，魔芋飞粉原料中α-淀粉酶和糖化酶的加酶量分别为26RAU/g和50WU/g；

所述步骤B中，采用氢氧化钠将酶解液pH调至6～10，料液比设置为1:15～1:40，提取温度为30～70℃，提取时间10～40min，提取3次，离心得到飞粉蛋白液；所述步骤C中，预超滤条件：压力0.02～0.1Mpa；温度5～45℃；pH值为3～12；膜通量为1～20升/小时。

4.如权利要求1所述一种高效提取甘露聚糖肽的方法，其特征在于，所述步骤D中，第一超滤柱2的超滤条件：压力0.02～0.1Mpa，温度20～70℃；pH值为7～10；膜通量为1～20升/小时；

所述步骤E中，第二超滤柱4的超滤条件：压力0.02～0.1Mpa；温度5～15℃；pH值为7～10；膜通量为1～20升/小时。

5.如权利要求1所述一种高效提取甘露聚糖肽的方法，其特征在于，所述步骤D和所述步骤E在一个同步酶解多级超滤装置中完成，所述同步酶解多级超滤装置包括进料容器1，第一超滤柱2，温控容器3，第二超滤柱4和酶液收集器5；

所述进料容器1上设置用于添加样品液的加料口11，进料容器出口13，以及进料容器进口12；

所述第一超滤柱2设置第一超滤柱进口21，第一超滤柱截留液出口22，第一超滤柱滤出液出口23；所述第一超滤柱进口21与所述进料容器出口13连接；所述第一超滤柱截留液出口22与进料容器进口12连接；

所述温控容器3设置温控容器第一进口31，温控容器第二进口32，以及温控容器出口33；所述温控容器第一进口31与所述第一超滤柱滤出液出口23连接；

所述第二超滤柱4设置与所述温控容器出口33连接的第二超滤柱进口41，以及与所述温控容器第二进口32连接的第二超滤柱截留液出口42；

所述截留液-蛋白酶混合液通过加料口11进入进料容器1；

所述截留液II从温控容器3中收集。