CN105331561A - 一株防治植物根癌病的放射形根瘤菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株防治植物根癌病的放射形根瘤菌及其应用。本发明所提供的放射形根瘤菌具体为放射形根瘤菌(Rhizobium？radiobacter)PAR，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC？No.11639。该菌株与根癌土壤杆菌的营养需求相似，而且生长迅速，可在植物根际能够快速大量定殖，具有生态位优势；且菌株PAR不产生抗生素，可避免根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)产生抗药性，比产抗生素的放射根瘤菌更具有生态位的优势；另外，该菌株可强烈抑制根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染易感植物向日葵、番茄和桃树而形成根癌瘤，具有良好的应用前景。

Description

一株防治植物根癌病的放射形根瘤菌及其应用

技术领域

本发明属于农、林和园艺作物保护技术领域，涉及一株防治植物根癌病的放射形根瘤菌及其应用。

背景技术

根癌病是由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的一种常见细菌性病害。根癌土壤杆菌的寄主范围很广，能侵染93科、331属的643种的植物。在欧洲、北美、南非及亚洲等一些国家普遍发生。在我国桃树栽培区均有不同程度发生，发病率在20％～90％(马德钦,王慧敏.果树根癌病及其生物防治[J].中国果树,1995年02期)。较为严重的根癌病发生区域为河北、山东、辽宁、河南、湖北、江苏等省区。桃树幼苗受害后早衰，植株矮化，甚至死亡；成龄树感染此病后会生长不良、树势变弱、果实小、产量低、树龄缩短，造成了重大的经济损失。我国果树根癌病的发生相当普遍，但此病的明显危害发生在根部，因此很多果农对该病缺乏认识，对及时防治及苗木外调和引进时的检疫措施未予重视，造成病菌的传播和病情逐年加重，防治工作任务艰巨。目前对根癌病最有效的防治措施是轮作和生物防治。但许多果园或苗圃无法实行常年轮作。采用生物防治的方法，提前使用生物菌剂是降低病原菌进入植物体内并干扰其代谢的有效措施。本技术投入低、效率高，是一项农民认可的、可操作强的农产品生产技术。

关于根癌病的生物防治，虽然国内外曾经报道菌根真菌、放线菌、土壤杆菌、假单孢菌、产碱杆菌、芽孢杆菌提取物对根癌病菌有一定的拮抗作用，但除K84及其遗传工程菌株K1026(商品名为Nogall)外，均没有商业化。

针对在果树和其他植物上发生普遍的由A.tumefaciens引起的根癌病，目前我国未见登记注册的生防菌制剂。获得适合我国土壤类型且具有我国自主知识产权的生防菌及其无细胞制剂对根癌病的防控具有重要的实际意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株防治植物根癌病的放射形根瘤菌及其应用。

本发明所提供的放射形根瘤菌具体为放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR，该菌株已于2015年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11639。

本发明还保护活性成分为所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的菌剂。

在所述菌剂中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数可为5～200亿/g所述菌剂。

所述菌剂中还可包括吸附载体；所述吸附载体可为硅藻土、草炭、蛭石、珍珠岩和碳酸钙中的至少一种。

更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述吸附载体具体由草炭和蛭石按照体积比1:1的配比混和而成。

进一步，所述菌剂由所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液和所述吸附载体按照1L:2Kg至1L:4Kg(如1L：2Kg)的配比混和而成。

在本发明的一个实施例中，制备所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液时采用营养肉汤，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)的活菌数为50～80亿/ml(如50亿/ml)所述发酵液。相应的，在所制备得到的所述菌剂中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为5～15亿/g(如10亿/g)所述菌剂；所述菌剂的含水量在3％以内。

在本发明的另一个实施例中，制备所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液时采用大量发酵培养液，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)的活菌数为500～800亿/ml(如500亿/ml)所述发酵液。其中，所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉0.8～1.5％，蛋白胨0.2～0.5％，蔗糖0.8～1.2％，酵母粉0.2～0.6％，NH₄Cl0.3～0.8％，MgSO₄·7H₂O0.03～0.08％；其中，％表示质量百分含量。相应的，在所制备得到的所述菌剂中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为100～200亿/g(如120亿/g)所述菌剂；所述菌剂的含水量在3％以内。

所述菌剂的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述菌剂的制备方法，具体可包括如下步骤：

(1)培养所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR，得到所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液；在所述发酵液中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)的活菌数为500～800亿/ml(如500亿/ml)；

(2)将步骤(1)所得发酵液和所述吸附载体按照1L:2Kg至1L:4Kg(如1L：2Kg)的配比混和，得到所述菌剂。

在步骤(1)中，培养所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的培养基为大量发酵培养液；所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉0.8～1.5％，蛋白胨0.2～0.5％，蔗糖0.8～1.2％，酵母粉0.2～0.6％，NH₄Cl0.3～0.8％，MgSO₄·7H₂O0.03～0.08％；其中，％表示质量百分含量。

更加具体的，所述培养基的溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉1.0％，蛋白胨0.3％，蔗糖1.2％，酵母粉0.4％，NH₄Cl0.4％，MgSO₄·7H₂O0.06％；其中，％表示质量百分含量。

在步骤(1)中，培养所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的培养条件为：将所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的种子液接种到所述大量发酵培养液中，接种量为0.5～5％(体积比)，培养温度28～30℃，转速150rpm，初始pH6.0～7.2，培养时间18～24h。

所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种用于预防和/或治疗植物根癌病的产品。

本发明所提供的用于预防和/或治疗植物根癌病的产品，包括独立包装的所述菌剂，以及杀菌剂和/或消毒剂。

所述杀菌剂和/或消毒剂可为如下中任一种：石硫合剂、双氧水、过氧乙酸、农用链霉素、硫酸亚铁、硫酸铜、高锰酸钾等。

在本发明的一个实施例中，所述杀菌剂和/或消毒剂具体为石硫合剂或双氧水。其中，所述石硫合剂可为45％(质量百分含量)晶体石硫合剂。在本发明的一个实施例中，所述石硫合剂具体为河北双吉化工有限公司产品，其农药登记证号为PD90105-2，产品标准证号为Q/SJHG04-2005，生产许可证号为HNP13089-D0385。所述双氧水具体可为1％(质量百分含量)的双氧水(即双氧水：水(v:v)＝1:99)。

所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR或所述菌剂或所述发酵液在如下1)或2)中的应用也属于本发明的保护范围：

1)预防和/或治疗植物根癌病；

2)制备用于预防和/或治疗植物根癌病的产品；

所述预防和/或治疗植物根癌病的方法包括且不限于：直接施用如拌种、蘸根、浇灌、涂抹等，与化学肥料、有机肥料以及有机无机复混肥料的混和使用，与抗生素、化学杀菌剂、无机盐或铜离子制剂以及熏蒸剂使用的配合使用。

所述根癌病具体为由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的根癌病。

所述植物具体可为因A.tumefaciens感染引起根癌病的果树、林木、园艺作物或作物，如：桃、番茄、向日葵、樱桃、杨树、牡丹、玫瑰等。

本发明还提供了一种预防和/或治疗植株根癌病的方法。

本发明所提供的预防植株根癌病的方法，该方法可为拌种、蘸根、浇灌、涂抹、菌剂施用或者制成生物肥料，直接施用或者配合土壤熏蒸剂施用。

在本发明的实施例中，所述预防植株根癌病的方法具体为如下(A)或(B)：

(A)包括如下步骤：将植物种子与所述菌剂进行混和，拌种后播种；

(B)包括如下步骤：将所述植物的根系置于所述菌剂的稀释液中浸泡，浸泡后栽种。

在所述(A)中，所述菌剂中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为10亿/g；所述植物种子与所述菌剂(所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为10亿/g)的混和配比具体可为1:1(质量比)。进一步，所述拌种具体为：将所述菌剂(所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为10亿/g)与水按照1g：1ml的配比混和成糊状物，再向其中加入与所述菌剂等质量的所述植物种子进行搅拌。

在所述(B)中，所述菌剂的稀释液中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为1亿/ml；所述浸泡的时间为15min。

本发明所提供的治疗植物根癌病的方法，包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹杀菌剂和/或消毒剂，晾干后，涂抹所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理；所述杀菌剂和/或消毒剂为如下中任一种：石硫合剂、双氧水、过氧乙酸、农用链霉素、硫酸亚铁、硫酸铜、高锰酸钾；

更加具体的，所述治疗植物根癌病的方法可为如下(C)或(D)：

(C)包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹1％(质量百分含量)双氧水，晾干后，涂抹所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理；

其中，所述菌剂中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为10亿/g；所述菌剂的稀释液中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为0.2亿/g。

(D)包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹石硫合剂的稀释液，晾干后，涂抹所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理。

其中，所述菌剂中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为10亿/g；所述菌剂的稀释液中所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为0.2亿/g。所述石硫合剂的稀释液中所述石硫合剂的有效含量为0.15％(质量百分含量。

在本发明的一个实施例中，所述石硫合剂可为45％(质量百分含量)晶体石硫合剂。在本发明的一个实施例中，所述石硫合剂具体为河北双吉化工有限公司产品，其农药登记证号为PD90105-2，产品标准证号为Q/SJHG04-2005，生产许可证号为HNP13089-D0385。相应的，所述石硫合剂的稀释液为所述石硫合剂的300倍液。

在所述(C)和所述(D)中，涂抹药剂(所述菌剂或所述石硫合剂的稀释液)的涂抹剂量为50ml。在涂抹了药剂后还包括覆盖湿纸的步骤(可防治药剂蒸发失效)。所述灌根的具体处理方法如下：在发病植物根颈周围做一个圆形的畦，防治药液蔓延，每株沿根颈周围灌药2L。

所述植物具体可为因A.tumefaciens感染引起根癌病的果树、林木、园艺作物或作物，如：桃、番茄、向日葵、樱桃、杨树、牡丹、玫瑰等。

本发明所提供的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639具有如下优势：

1、分离于适于根癌土壤杆菌生长的选择性培养基平板D₁M培养基(参考文献：Schaad,N.W.2001.LaboratoryGuidefortheIdentificationofPlantPathogenicBacteria,3rdEdition.TheAmericanPhytopathologicalSociety,St.Paul,MN.(pp6,9))，与根癌土壤杆菌的营养需求相似，而且生长迅速，可在植物根际能够快速大量定殖，具有生态位优势。

2、不产生抗生素，可避免根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)产生抗药性，比产抗生素的放射根瘤菌更具有生态位的优势，该菌株是一株有潜力的拮抗菌。

3、可强烈抑制根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染易感植物向日葵、番茄和桃树而形成根癌瘤，防效分别达到89.1％、90.0％和56.1％。

本发明所提供的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639是从山东桃树根际土壤分离到一株细菌，该菌株的特点是：在营养培养基平板上培养时，菌落突起粘稠，菌落扩展速度很快，这是生防菌可大规模生产和应用的前提条件之一。用其菌悬液与根癌土壤杆菌菌悬液混和接种向日葵，可明显控制癌瘤的形成，经鉴定为放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，定名为PAR。多次田间防病试验表明，用该菌株发酵液制备的菌剂在田间对桃根癌病的防病效果可达43.7％～56.1％，与农民使用的K84制剂的防病效果相当。由于该菌株在平板抑菌实验中并不产生抑菌圈，因此该菌株并不能产生抗生素，可避免长期应用后可能导致的因根癌土壤杆菌产生抗药性而造成防病效果下降甚至丧失的问题。PAR菌株发酵培养时，生长速度快、20～24之内可完成发酵，发酵结束后活菌数可达到500～800亿/ml，成产成本低。因此PAR是一株非常有潜力的果树或其他植物根癌病生防菌，从而提出了本发明。

保藏说明

菌种名称：放射形根瘤菌

拉丁名：(Rhizobiumradiobacter)

菌株编号：PAR

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年11月9日

保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11639

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的分离与鉴定

一、放射形根瘤菌(R.radiobacter)菌株PAR的筛选

本发明的放射形根瘤菌(R.radiobacter)PAR是从桃树根际土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：

(1)放射形根瘤菌的分离：土样的采集，在山东省泰安市西苑园艺场，分别采集桃园中不同品种健康桃树的须根及粘连的根际土，标明采集地点、时间和采集人。称取1g桃树须根，放入99ml无菌水中，振荡摇匀30min。然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml，加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混和均匀，以此类推分别制成10^-3、10^-4、10^-5不同稀释度的土壤溶液。取100μL土壤悬浮液涂布于选择培养基D₁M平板上，每个梯度涂布三个培养皿，27-30℃培养2-4天。挑取不同形态的细菌，转接到营养琼脂培养基(即NA固体培养基)上划线纯化。

其中，所述选择培养基D₁M组分及配比为：纤维二糖5.0g，NH₄Cl1.0g，MgSO₄·7H₂O0.3g，K₂HPO₄·3H2O3.0g，NaH₂PO₄·H₂O1.0g，孔雀绿0.01g，琼脂18g，蒸馏水1000mL；pH7.0～7.2。

所述NA固体培养基组分及配比为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，酵母膏1g，琼脂18g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0，121℃高压灭菌30分钟。

(2)桃树根癌病高效拮抗根瘤菌的筛选

①致病性鉴定：根癌病菌中有3个区域与致瘤有关：Vir区，参与肿瘤诱导的某些早期过程。T-DNA区，携带的基因控制肿瘤的生长和冠瘿碱(opine)的产生，是最重要的DNA片段。第3个区则控制细菌吸收和利用肿瘤组织内产生的冠瘿碱。采用virD2A/virD2C引物(参考文献：HaasJH,MooreLW,ReamW,etal.UniversalPCRprimersforthedetectionofphytopathogenicAgrobacteriumstrains.AppliedEnvironmentMicrobiology,1995,61(8):2879～2884)和Tip6F/Tip6R引物(参考文献：YakabeLE,MaccreeMM,SudarshanaP,etal.NovelPCRprimersfordetectionofgeneticallydiversevirulentAgrobacteriumtumefaciensbiovar1strains.JournalofGeneralPlantPathology,2012,78:121～126)，分别对所分离细菌的vir区及T-DNA区进行测定，选择未扩增到224bp和243bp目的片段的菌株作为非致病待测菌株。

virD2A：5′-ATGCCCGATCGAGCTCAAGT-3′；

virD2C：5′-TCGTCTGGCTGACTTTCGTCATAA-3′。

Tip6F：5′-GGTCTAATGCGCAGAGGTGT-3′；

Tip6R：5′-CGGCTCAAGGATTAGACAGG-3′。

其中，细菌vir区的扩增体系(总体积：25.0μL)为：DNA模板0.6μL(<1μg)、上下游引物(5pmol/μL)各1.0μL、10×缓冲液2.5μL、dNTPMixture(2.5mMeach)1.5μL、Taq聚合酶(2.5U/μL)0.5μL、超纯水18.0μL。

PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸40s；35循环；72℃补充延伸10min。PCR产物用1.2％的琼脂糖电泳检测。

细菌T-DNA区的扩增体系与vir区扩增体系相同，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸30s；35循环；72℃补充延伸10min。PCR产物用1.2％的琼脂糖电泳检测。

②生物测定：以易感病植物向日葵和番茄进行盆栽防病试验，并以桃核和桃苗为试材进行田间防病试验。具体方法参照实施例3-5。

经过以上筛选，最终获得一株放射形根瘤菌(R.radiobacter)，将该菌株记为PAR。

二、菌株鉴定

1、微生物学特性鉴定

在营养琼脂NA培养基上形成的菌落形态为圆形中凸，透明略带淡黄色，表面光滑粘稠，有粘液，边缘整齐，正反面颜色一致。在NA培养基上28℃下培养两天后，菌体细胞呈杆状，能运动。细胞单一存在或成对存在，大小约为0.6-1.0μm×1.5-3.0μm。革兰氏染色阴性，无芽孢。PAR菌株在pH7.0-7.4，温度26-29℃生长良好，可利用多种碳源生长。

2、分子生物学特性

提取菌株PAR的基因组DNA，用通用引物27f和1492r扩增16SrRNA序列，将该序列测序。

27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；

1492r：5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'。

菌株PAR的16SrRNA的序列详见序列表中序列1。

鉴于上述微生物学特性鉴定和分子生物学特性鉴定结果，将步骤一分离并纯化得到的菌株PAR鉴定为放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)。该放射形根瘤菌(R.radiobacter)PAR已于2015年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.11639。

实施例2、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的抑菌活性测定及菌剂的制备

一、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的抑菌活性测定

将根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308接种于NA(配方见前文)斜面，28℃培养48h。然后将适量无菌水加入到斜面中，制备病原菌菌悬液。取1ml菌悬液(10⁸cfu/ml)置于已灭菌的培养皿内，倒入40-50℃融化的YEB培养基，并摇匀，制成带菌的拮抗测定平板。挑取培养24h的实施例1获得的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639，点接于拮抗测定平板上。28℃培养1-2d后，观察菌落形态以及抑菌圈的形成情况，游标卡尺测量抑菌圈直径(mm)。

所述YEB培养基组分及配比为：蛋白胨5g，酵母膏1g，牛肉膏5g，MgSO40.4936g，蔗糖5g，琼脂15g，水1000ml。调pH到7.0，121℃高压灭菌30分钟。

结果显示，实施例1获得的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308不产生抑菌圈。该结果说明，放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639不产生抗生素。

二、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR菌剂的制备

1、将实施例1获得的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的菌苔移植到营养肉汤中，28～30℃摇床振荡培养22h得到种子液。

其中，营养肉汤的配方为：葡萄糖10g，蛋白胨10g，牛肉膏3g，酵母膏1g，蒸馏水1000ml，pH调至7.0～7.2，121℃高压灭菌30分钟。

2、按0.8％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到营养肉汤中，培养温度28～30℃，转速180rpm，初始pH6.0～7.0，培养时间24h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的活菌数可达50亿/mL。

3、将步骤2获得的放射形根瘤菌发酵液与吸附载体——草炭和蛭石(体积比1:1)按照体积质量比为1:2(即1L：2Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述菌剂中放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的活菌数可达10亿/g，含水量在3％以内。

实施例3、放射形根瘤菌PAR菌株对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染向日葵形成根癌瘤的抑制作用

将在营养肉汤(配方见前文)中培养至对数期的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639和根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308以体积比10:1(V/V)混和，混和液中，放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的活菌数为10⁶个/ml，根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308的活菌数为10⁵个/ml。将混和液接种至出苗10d左右的向日葵子叶处，接种量为20μL。具体方法参考王红艳(参考文献：王红艳.樱桃和樱花根癌病病原及生物防治研究:[硕士论文]中国农业大学,1998，p7.)方法。

以等量无菌水代替放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的菌悬液，与根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308混和作为对照(CK)。

每处理10株向日葵苗，共3个重复，定量结果取平均值±标准差。放置于28℃的培养室内，一周后观察是否出现瘤状物，游标卡尺测量瘤状物直径和向日葵茎粗。统计发病率和病情指数，计算拮抗菌的防病效果。病情级别划分(表1)参考陶铁男和明发源(参考文献：陶铁男,明发源.主要农作物灾害评估[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010)方法。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。

表1向日葵茎上根癌病病情划分标准

结果表明，接种向日葵7d后，对照组(CK组)发病严重，根瘤明显大于放射形根瘤菌PAR处理组(PAR组)根瘤，病情指数为83.3(表2)。PAR菌株处理的病情指数较低，防效达到89.1％。

表2放射形根瘤菌PAR菌株对A.tumefaciens在向日葵上形成根癌瘤的抑制作用

防效(％)＝(CK组病情指数-PAR组病情指数)/CK组病情指数×100％。

实施例4、放射形根瘤菌PAR菌株对根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)侵染番茄形成根癌瘤的抑制作用

将出苗30d番茄苗根茎基部划伤且伤根10条后，用放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PARCGMCCNo.11639的菌悬液(10⁶cfu/ml)蘸根，然后移栽至直径为12cm的花盆中后灌根，每株浇灌100ml菌悬液，对照(CK)用等量的清水处理。第2天用根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)ATCC23308菌悬液(10⁶cfu/ml)灌根，每株浇灌100ml。每处理15株番茄苗，3个重复，定量结果取平均值±标准差。

于2个月后挖根，检查是否有根癌瘤。调查根上结瘤数并测定根瘤大小和茎粗，统计发病率和病情指数，计算拮抗菌的防病效果。病情级别划分(表3)参考陶铁男和明发源(参考文献：陶铁男,明发源.主要农作物灾害评估[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010)的方法。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。

表3番茄苗上根癌病病情划分标准

结果表明，对照组(CK组)番茄根茎基部有明显肿大的根癌瘤，病情指数为88.8，而用PAR菌株处理组(PAR组)的番茄苗未出现根癌瘤或根癌瘤较小，病情指数明显降低，防效达到90.0％(表4)。

表4放射形根瘤菌PAR菌株对A.tumefaciens在番茄上形成根癌瘤的抑制作用

防效(％)＝(CK组病情指数-PAR组病情指数)/CK组病情指数×100％。

实施例5、放射形根瘤菌PAR菌剂对桃根癌病的抑制作用

一、放射形根瘤菌PAR菌剂处理桃核对桃根癌病的抑制作用

将常规层积桃核用实施例2制备的PAR菌剂(活菌数为10亿/g)拌种，首先将PAR菌剂与水按照1g：1ml的配比混和为糊状物，再向其中加入桃核，进行搅拌，PAR菌剂与桃核的配比为1:1(w/w，即质量比)。然后于3月份播种至山东省泰安市徂徕镇的桃树重茬苗圃地中。

以不经PAR菌剂拌种的桃核直接播种做对照处理(CK组)。

每处理150-200粒种子，4次重复，定量结果取平均值±标准差。各处理间起垅分隔，垅边1-2行作为保护行。行距40cm，株距10cm。于当年秋天9-10月份挖根，检查是否有根癌瘤。调查根上结瘤数并测定根瘤大小和茎粗，统计发病率和病情指数，计算PAR菌剂的防病效果。病情级别划分(表5)参考陶铁男和明发源(参考文献：陶铁男,明发源.主要农作物灾害评估[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010)的方法。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。

表5桃苗上根癌病病情划分标准

结果显示，采用放射形根瘤菌PAR菌剂(PAR组)对桃核拌种处理，可明显降低桃树根癌病的发病率和病情指数，对桃树根癌病的防治效果达56.1％(表6)。

表6放射形根瘤菌PAR菌剂处理桃核对桃根癌病的抑制作用

防效(％)＝(CK组病情指数-PAR组病情指数)/CK组病情指数×100％。

二、放射形根瘤菌PAR菌剂对桃实生苗根癌病的抑制作用

将实施例2制备的PAR菌剂(活菌数为10亿/g)用10倍水稀释，然后将健康桃实生苗根部浸泡在上述稀释的PAR菌液中，15分钟后取出，于3月栽种至山东省泰安市青松苗圃的桃树重茬地中。

以直接栽种的桃实生苗(未经菌剂浸泡)做对照处理(CK组)。

每处理100-150棵实生苗，4次重复，定量结果取平均值±标准差。各处理间起垅分隔，垅边1-2行作为保护行。行距50cm，株距30cm。于当年秋天9-10月份挖根，检查是否有根癌瘤。调查根上结瘤数并测定根瘤大小和茎粗，统计发病率和病情指数，计算PAR菌剂的防病效果。病情级别划分(表5)参考陶铁男和明发源(参考文献：陶铁男,明发源.主要农作物灾害评估[M].北京:中国农业科学技术出版社,2010)的方法。病情指数＝Σ(病级株数×代表数值)×100/调查总株数×最高级代表值。

结果显示，采用放射形根瘤菌PAR菌剂(PAR组)处理桃实生苗，可明显降低桃树根癌病的病情指数，对桃树根癌病的防治效果达43.7％(表7)。

表7放射形根瘤菌PAR菌剂对根癌土壤杆菌A.tumefaciens侵染桃苗形成根癌瘤的抑制作用

防效(％)＝(CK组病情指数-PAR组病情指数)/CK组病情指数×100％。

三、桃树根癌病治疗效果比较试验

1、实验方法

试验地点：中国农业科学院廊坊试验基地桃根癌病病圃。

试验材料：2年生人工接种感病毛桃60株；病株行距2m，株距30cm。

处理药剂：双氧水(H₂O₂)；石硫合剂(有效成分：石硫合剂45％结晶，生产厂家：河北双吉化工有限公司；农药登记证：PD90105-2；产品标准证：Q/SJHG04-2005；生产许可证：HNP13089-D0385)；实施例2制备的PAR菌剂(活菌数为10亿/g)，以下简称为PAR菌剂。

处理条件：2015年8月，当地气温25℃-35℃，土壤类型沙壤土，pH值7.2。

测量60株发病(根癌病)桃树的茎粗及根颈处癌瘤的直径，记录数据。将癌瘤切除后使用不同药剂对伤口进行保护处理，处理共分为6组：

(1)涂抹1％双氧水，即双氧水：水(v:v)＝1:99；

(2)涂抹1％双氧水，晾干1h后，涂抹PAR菌剂原液，用PAR菌剂50倍液灌根处理；

(3)涂抹石硫合剂300倍液；

(4)涂抹石硫合剂300倍液，晾干1h后，涂抹PAR菌剂原液，用PAR菌剂50倍液灌根处理；

(5)涂抹清水；

(6)不切除癌瘤。

使用毛刷将各处理药剂均匀涂抹于伤口切除部位(涂抹的药剂量为50mL左右)，涂抹药剂后覆盖湿报纸，防治药剂蒸发失效；灌根处理的病株在根颈周围做一个圆形的畦，防治药液蔓延，每株沿根颈周围灌药2L。

处理后第一个月每周调查一次，观察植株长势及地上部状态，记录桃树恢复正常生长所用的时间。第三个月测量株高，统计植株死亡率，调查根颈处癌瘤的复发情况，如有复发，测量癌瘤直径、病株茎粗。

计算复发率＝处理后复发癌瘤的棵树/处理总棵树

治疗效果＝(处理前癌瘤直径-处理后癌瘤直径)/处理前癌瘤直径×100％。

按照常规方法进行田间管理，但要避免大水漫灌，改为单株畦灌，防治根癌菌蔓延。遇有特殊天气或其他情况，请及时记录并通知。

2、结果与分析

(1)不同药剂对植株的伤害程度

桃树经过癌瘤切除及药剂、生防菌剂处理(即以上(1)-(5)处理组)后生长正常，无萎蔫、黄叶现象，无桃树死亡，证明以上治疗方法均不会对桃树树体造成伤害。

(2)不同药剂及处理方式对根癌病的防治效果

对生长3个月的试验地桃树进行挖根调查，根瘤复发情况及治疗效果见表8。

表8不同药剂及处理方式对根癌病的治疗效果

注：表中的“对照”为处理(5)。

结果表明，癌瘤切除是一种有效可行的治疗已发生的根癌瘤的方法，仅依赖癌瘤切除时，虽然癌瘤复发率依然达100％，但复发瘤径远远小于切除之前的根瘤直径，治疗效果可达62.99％。癌瘤切除后仅用双氧水氧化处理，效果不明显；而用石硫合剂处理有一定的治疗效果，治疗效果可达77.98％。化学药剂配合PAR菌剂治疗则可显著降低桃树根癌病的复发。其中用双氧水消毒处理后，再使用PAR菌剂涂抹保护并灌根处理，癌瘤复发率为80％，防效达83.42％；而石硫合剂+PAR处理治疗效果更好，癌瘤复发率仅为50％，防效高达88.69％。未切除癌瘤的桃树癌瘤平均直径则达68.14mm。以上结果表明，采用癌瘤切除配合石硫合剂杀菌消毒，再施用PAR菌剂涂抹灌根处理对桃树根癌病具有良好的治疗效果，此方法可应用于田间已发生根癌病的核果类果树，是一套有效可行的治疗方案。

实施例6、放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR菌剂的制备方法优化

与实施例2的步骤二相比，仅将其中的营养肉汤替换为大量发酵培养液，其余步骤均相同。具体操作如下：

1、将实施例1获得的放射形根瘤菌PARCGMCCNo.11639的菌苔移植到营养肉汤(配方同上)中，28-30℃摇床振荡培养22h得到种子液。

2、按0.8％比例(体积比)将步骤1获得的种子液接种到大量发酵培养液中，培养温度28～30℃，转速150rpm，初始pH6.0～7.0，培养时间24h。发酵完成后得到发酵液，发酵液中放射形根瘤菌PARCGMCCNo.11639的活菌数可达500亿/mL。

其中，大量发酵培养液配方(质量百分含量)为：玉米粉1.0％，蛋白胨0.3％，蔗糖1.2％，酵母粉0.4％，NH₄Cl0.4％，MgSO₄·7H₂O0.06％，其余为水。

3、将步骤2获得的放射形根瘤菌发酵液与吸附载体——草炭和蛭石(体积比1:1)按照体积质量比为1:2(即1L：2Kg)的比例混和均匀，即得菌剂。所述菌剂中放射形根瘤菌PARCGMCCNo.11639的活菌数可达120亿/g，含水量在3％以内。

由本实施例的实验结果可以看出，本发明中的大量发酵培养液对于放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR菌剂的制备至关重要，采用相同的方法，将实施例2中菌剂的活菌数提高了十多倍。

Claims (10)

1.放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR，它在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.11639。

2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR。

3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于：在所述菌剂中，所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的活菌数为5～200亿/g所述菌剂。

4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂由所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液和吸附载体按照1L：2Kg至1L：4Kg的配比混和而成。

5.权利要求4所述菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)培养权利要求1所述的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR，得到所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液；

(2)将步骤(1)所得发酵液和权利要求2中所述的吸附载体按照1L：2Kg至1L：4Kg的配比混和，得到所述菌剂。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，培养所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的培养基为大量发酵培养液；所述大量发酵培养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：玉米粉0.8～1.5％，蛋白胨0.2～0.5％，蔗糖0.8～1.2％，酵母粉0.2～0.6％，NH₄Cl0.3～0.8％，MgSO₄·7H₂O0.03～0.08％；其中，％表示质量百分含量；或

培养所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的培养条件为：将所述放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的种子液接种到所述大量发酵培养液中，接种量为0.5～5％(体积比)，培养温度28～30℃，转速150rpm，初始pH6.0～7.2，培养时间18～24h。

7.权利要求1所述的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR的发酵液。

8.用于预防和/或治疗植物根癌病的产品，包括独立包装的权利要求2-4中任一所述的菌剂，以及杀菌剂和/或消毒剂；

所述杀菌剂和/或消毒剂为如下中任一种：石硫合剂、双氧水、过氧乙酸、农用链霉素、硫酸亚铁、硫酸铜、高锰酸钾。

9.权利要求1所述的放射形根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)PAR或权利要求2-4中任一所述的菌剂或权利要求7所述的发酵液或权利要求8所述的产品在如下1)或2)中的应用：

1)预防和/或治疗植物根癌病；

2)制备用于预防和/或治疗植物根癌病的产品；

所述根癌病具体为由根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)引起的根癌病。

10.方法I或方法II：

方法I：一种预防植株根癌病的方法，为如下(A)或(B)：

(A)包括如下步骤：向植物种子中加入权利要求2-4中任一所述菌剂，进行拌种后播种；

(B)包括如下步骤：将所述植物的根系置于权利要求2-4中任一所述菌剂的稀释液中浸泡，浸泡后栽种；

方法II：一种治疗植物根癌病的方法，包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹杀菌剂和/或消毒剂，晾干后，涂抹权利要求3或4所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理；所述杀菌剂和/或消毒剂为如下中任一种：石硫合剂、双氧水、过氧乙酸、农用链霉素、硫酸亚铁、硫酸铜、高锰酸钾；

具体的，所述治疗植物根癌病的方法，为如下(C)或(D)：

(C)包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹1％(质量百分含量)双氧水，晾干后，涂抹权利要求3或4所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理；

(D)包括如下步骤：切除根癌病发病植物的癌瘤，然后在切口处涂抹石硫合剂的稀释液，晾干后，涂抹权利要求3或4所述菌剂，然后再用所述菌剂的稀释液进行灌根处理。