CN103215210A - 一种西姆芽孢杆菌及其在制备微生物海藻肥料中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种西姆芽孢杆菌及其在制备微生物海藻肥料中的应用，所述西姆芽孢杆菌L13（Bacillus siamensis）于2013年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.7285。本发明利用筛选到的此高活性西姆芽孢杆菌发酵液用于制备消毒剂和促生剂，而且还可以用于制备高效的微生物海藻肥料，该微生物海藻肥料不仅营养齐全而且抗逆性、抗病虫害、促生长能力突出，可替代农药、化肥、激素，改良土壤性状，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标准。
Description
技术领域
本发明涉及微生物和微生物肥料领域，尤其涉及一株西姆芽孢杆菌及其在微生物海藻肥料中的应用。
背景技术
我国各地在烟叶生产中长期使用化肥，造成土壤贫瘠，土壤板结，营养失衡，导致烟叶内在品质下降，香气质量变差。加之连年轮作，病虫害加重，且抗药性增强，烟田生态失衡，甚至严重影响了烟叶生产的可持续发展。农业的高速发展而引起的农业水土流失、土壤生产力下降、农产品与农业环境污染、生态环境破坏等问题，已经引起社会的广泛关注，特别是农产品质量安全问题，成为公众关注的焦点。为此，相继出现的有机农业、生物农业、自然农业、生态农业及可持续农业等多种形式的替代农业，已经被很多国家作为解决食品安全、保护生物多样性、进行可持续发展等一系列问题的可实践途径。而“无公害”、“绿色”、“有机”也正在成为标示农产品安全、健康、环保的新概念。有机烟叶随着有机农业的发展，不断受到人们的重视和青睐。
微生物肥料在解决化学肥料所带来的问题上有独到的作用，并取得了良好的使用效果，将是我国农业技术发展的重点和依托。微生物肥料中有益微生物的种类、生命活动是否旺盛是其有效性的关键，寻找拮抗致病菌或致病害虫的高活性微生物及其代谢产物来预防和解决土传病害是目前微生物肥料的研究热点和突破口。
发明内容
为了克服传统化学肥料和普通微生物肥料的不足，本发明的目的是提供了一种西姆芽孢杆菌及其在制备微生物海藻肥料中的应用，本发明利用筛选到的一株高活性西姆芽孢杆菌用于制备高效的微生物海藻肥料。该微生物海藻肥料不仅营养齐全而且抗逆性、抗病虫害、促生长能力突出，可替代农药、化肥、激素，改良土壤性状，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标准。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种西姆芽孢杆菌L13，其分类命名为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis，其保藏编号为CGMCC No.7285。
对上述技术方案的进一步改进：所述西姆芽孢杆菌L13的革兰氏染色阴性；菌落直径2-4mm，边缘整齐，湿润光滑，高突起，黏稠，呈纯白色；菌体形态呈短小杆状，芽孢中生或端生。
对上述技术方案的进一步改进：所述西姆芽孢杆菌L13对烟草链格孢菌、烟草普通花叶病毒病、烟草赤星病、烟草黑胫病、尖镰孢菌烟草变种菌有抑菌作用。
本发明还提供了所述的西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备消毒剂中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述西姆芽孢杆菌L13菌株发酵液用于消毒剪叶剪操作器械，发酵液中活菌数≥2亿/mL。
本发明还提供了所述的西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备促生剂中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液对绿豆的鲜重、根长、株高有促生作用，发酵液中活菌数≥2亿/mL。
本发明还提供了所述的西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备微生物海藻肥料中的应用。
对上述技术方案的进一步改进：所述微生物海藻肥料中西姆芽孢杆菌有效活菌数≥2亿/g，有机质≥35%。
对上述技术方案的进一步改进：用于菌株发酵的培养基配方如下：玉米粉6.0-8.0g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，葡萄糖3.0-5.0g/L，蛋白胨1.0-3.0g/L，豆饼粉10.0-12.0g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，碳酸钙3.0-5.0g/L，七水硫酸镁0.8-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，消泡剂1.5-3.0g/L，pH8.0-8.5。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明西姆芽孢杆菌菌株具有很广泛的抗菌谱和很显著的抑菌效果，对烟草链格孢菌[Alternaria alternata（Fries）Keissler]的菌丝生长具有很强的抑制作用，抑制率在80%以上；对烟草普通花叶病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）的抑制作用85%以上；对烟草赤星病（Tobacco blown spot）和烟草黑胫病（Tobacco black shank）也有良好的防治效果，对根腐病、病毒病也都有良好效果，而且菌株的发酵液在生产上亦可对工具起到消毒的作用。
本发明所生产的微生物海藻肥料是将海藻活性提取物、氨基酸、有机质腐殖酸、微量元素硼、锰、铜、锌，按一定比例制备出有效活菌数≥2亿/g，有机质≥35%的高效复合微生物海藻肥料，该海藻肥料不仅营养齐全，而且抗逆性、抗病虫害、促生长能力非常突出，作物增产幅度达25%以上，可替代农药、化肥、激素，避免化学污染，改良土壤性状，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标准。
结合本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
一、西姆芽孢杆菌的分离筛选
2012年7月4日从山东沂水、诸城烟区植烟土壤中共取样50余份根际土壤，分别取2g样品悬浮在20ml生理盐水中，180rpm，震荡30min。分别取100μL样品悬浮液在营养琼脂平板均匀涂布，30℃培养箱中倒置培养16h，挑取形态各异的单菌落用划线法接种到营养琼脂平板上，通过反复多次划线得到纯菌，共筛选出88株纯菌。
所得菌株用接种环接种到液体NB培养基中，28℃，180rpm，培养64h，培养的发酵液于10000rpm，离心10min，离去大部分菌体，收集上清液，将所得上清液进行抗TMV生物学活性测定。选择健康、生长旺盛的6-7叶期三生-NN烟进行接种。将充分发病的TMV烟草嫩叶用灭菌研钵研磨成匀浆，与灭菌后的磷酸缓冲液（PH7.0）1：40比例稀释。左半叶接种NB培养基与病毒等体积混和液作对照，右半叶接种发酵上清液与病毒等体积混和液作处理，接种后立即用水喷洒叶面。每处理接种3-4个叶片，重复3次，3d后观察结果。经初步测试有拮抗活性的菌株采用相同方法重复测试，每处理3株，三次重复。
枯斑抑制率计算公式：
枯斑抑制率实验结果显示菌株L13对TMV的抑制效果最好，对TMV的枯斑抑制率达到94.16％，生防细菌在生长代谢过程中产生了具有抑制病毒活性的抗生物质。
经细菌分子遗传学分类鉴定方法鉴定，菌株L13为芽孢杆菌属，西姆芽孢杆菌。西姆芽孢杆菌生物学特性：革兰氏染色阴性，在平板培养基上形成的菌落直径约3mm，边缘整齐，湿润光滑，高突起，黏稠，纯白色。菌体形态呈短小杆状，芽孢中生或端生。
表1L13对烟草普通花叶病毒的抑制作用
二、对西姆芽孢杆菌的细菌分子遗传学分类鉴定
首先提取菌株L13的DNA，以该DNA为模板，16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株16S rDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属中的Bacillus siamensis的16s rDNA序列同源度最高，同源率达到99%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株L1316S rDNA与Bacillus siamensis同源性最高，因此可以判定该菌株为芽孢杆菌属的西姆芽孢杆菌。
将筛选到的菌株L13进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2013年3月6日；保藏编号为：西姆芽孢杆菌L13（Bacillus siamensis）的编号为CGMCC No.7285。
三、西姆芽孢杆菌对真菌性病害抑制活性的检测
采用平板对峙法测试西姆芽孢杆菌对指示菌的抑菌活性，9cm PDA平板中央接种指示菌菌块，在距离指示菌菌块2.8cm处接种西姆芽孢杆菌单菌落，另一侧不接种西姆芽孢杆菌，以供测量空白指示菌半径，25℃恒温培养5ｄ，观察指示菌菌丝生长情况，测量抑菌结果。
抑菌宽度(mm)＝空白侧指示菌半径－接种L13芽孢杆菌侧指示菌半径
表2西姆芽孢杆菌对烟草真菌性病害的抑制活性
由表2可以看出西姆芽孢杆菌对几种烟草真菌性病害都有良好的抑制作用，其中对烟草黑胫病菌、烟草链格孢菌、尖镰孢菌烟草变种的抑制率分别达到了73%、85%和69%。西姆芽孢杆菌对烟草真菌性病害有广谱的防治效果。
四、西姆芽孢杆菌发酵培养基的优化
制备西姆芽孢杆菌种子液，然后按3%接种比例接种到发酵培养基中，通过调整发酵培养基配方、PH值、发酵温度、接种比例优化发酵条件。
优化的发酵培养基配方如下：玉米粉6.0-8.0g/L，酵母粉0.5-2.0g/L，葡萄糖3.0-5.0g/L，蛋白胨1.0-3.0g/L，豆饼粉10.0-12.0g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0g/L，碳酸钙3.0-5.0g/L，七水硫酸镁0.8-1.0g/L，硫酸锰0.1-0.5g/L，消泡剂1.5-3.0g/L，pH8.0-8.5。
发酵结果：pH7.0左右，有效活菌数为300亿/mL。
五、西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液的消毒作用
灭菌剪刀在40倍TMV汁液中浸泡1min，取出后分别在下述①～④液体中浸泡30sec，在5～6叶期普通烟N89上，剪上部3片叶。每处理9株，3次重复。15d调查病情指数。①L13发酵液，活菌数为2亿/mL以上，②发酵培养基，③清水，④不浸泡，直接剪NC89叶片。
表3西姆芽孢杆菌发酵液对剪叶剪的消毒作用
由表3看出，剪刀浸泡在TMV汁液中，沾取了病毒汁液，再在L13菌株发酵液中浸泡，能杀死全部病毒，发病率仅为0，因此，生产上可以用L13发酵液来消毒剪叶剪等操作器械。试验中还观察到浸泡在发酵培养基和清水中的处理，发病率也低于④不浸泡的处理，是因为稀释了沾取在剪刀上的病毒浓度，降低了侵染力。
六、西姆芽孢杆菌L13菌株发酵液的促生作用
将滤纸修剪适当大小，置于培养皿中，L13发酵液离心去菌体后，分别稀释1倍、5倍、25倍、125倍、625倍，湿润滤纸。选取饱满圆润的绿豆，每个培养皿十粒，并以灭菌培养基做对照，每天观察并保证滤纸湿润。考察发芽率，考察鲜重、根长、株高。
表4L13发酵液灌根对绿豆的促生作用
由表4看出，绿豆经稀释的发酵液处理后，其鲜重，根长、株高明显高于发酵培养基处理，未经稀释的菌液抑制绿豆的生长，发芽率仅有50%，并且芽长度仅有0.5cm。稀释5倍的菌液对绿豆的生根有抑制作用，但是对株高的增加有促进作用。
七、西姆芽孢杆菌与海藻复合肥料的制备
将发酵菌液与海藻活性提取物、氨基酸、有机质腐殖酸、微量元素硼、锰、铜、锌按一定比例制备出一种有效活菌数≥2亿/g，有机质≥35%的高效复合微生物海藻肥料。
八、微生物海藻肥料对烟株生长的影响
取2-3叶期普通烟NC89，移栽至直径10cm的小花盆，移栽时用微生物海藻肥料灌根，每株10ml，间隔3d，再连续灌根2次，以发酵培养基、无菌水灌根为对照，每处理6株，3次重复。末次灌根3d后，调查鲜重，最大叶长、宽。
表5微生物海藻肥料灌根对NC89的促生作用
由表5看出，普通烟NC89，连续三次灌根，微生物海藻肥料处理其鲜重，最大叶长、宽均高于培养基和清水处理，与清水处理差异极显著。其中微生物海藻肥料、发酵培养基灌根处理其烟株生长好于清水处理。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种西姆芽孢杆菌L13，其特征在于：其分类命名为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis，其保藏编号为CGMCC No.7285。
2.根据权利要求1所述的一种西姆芽孢杆菌L13，其特征在于：所述西姆芽孢杆菌L13的革兰氏染色阴性；菌落直径2-4 mm，边缘整齐，湿润光滑，高突起，黏稠，呈纯白色；菌体形态呈短小杆状，芽孢中生或端生。
3.根据权利要求1或2所述的一种西姆芽孢杆菌L13，其特征在于：所述西姆芽孢杆菌L13对烟草链格孢菌、烟草普通花叶病毒病、烟草赤星病、烟草黑胫病、尖镰孢菌烟草变种菌有抑菌作用。
4.根据权利要求3所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备消毒剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备消毒剂中的应用，其特征在于：所述西姆芽孢杆菌L13菌株发酵液用于消毒剪叶剪操作器械，发酵液中活菌数≥2亿/mL。
6.根据权利要求3所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备促生剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备促生剂中的应用，其特征在于：所述西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液对绿豆的鲜重、根长、株高有促生作用，发酵液中活菌数≥2亿/mL。
8.根据权利要求3所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备微生物海藻肥料中的应用。
9.根据权利要求8所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备微生物海藻肥料中的应用，其特征在于：所述微生物海藻肥料中西姆芽孢杆菌有效活菌数≥2亿/g，有机质≥35%。
10.根据权利要求9所述的一种西姆芽孢杆菌L13的菌株发酵液在制备微生物海藻肥料中的应用，其特征在于：用于菌株发酵的培养基配方如下：玉米粉6.0-8.0 g/L，酵母粉0.5-2.0 g/L，葡萄糖 3.0-5.0 g/L，蛋白胨1.0-3.0 g/L，豆饼粉10.0-12.0 g/L，磷酸氢二钾0.5-1.0 g/L，碳酸钙3.0-5.0 g/L，七水硫酸镁0.8-1.0 g/L，硫酸锰0.1-0.5 g/L，消泡剂1.5-3.0 g/L，pH 8.0-8.5。
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