CN105319283A - 检测三联吡啶含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的方法，该方法为标准加入法，先称取样品，加入氢氧化钠及乙酸乙酯，振荡，超声提取，得到待测样品溶液；再将2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液分别以等体积比与待测样品溶液混合均匀，然后用气相色谱质谱仪测定加标混合液的响应值，以浓度和响应值分别为横、纵坐标，制作曲线并计算出样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量。本发明的方法具有前处理过程简单快速、廉价、检出限低以及定量准确的优点。

Description

检测三联吡啶含量的方法

技术领域

本发明属于农业除草技术领域，具体涉及一种检测2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的方法。

背景技术

百草枯、敌草快属于联吡啶类除草剂，近年来各地在茶园、果园、蔗田、橡胶园等经济作物上试用，取得很好的效果，是我国大量应用的除草剂之一，也是我国除草剂出口较多的品种。2，2′：6′，2"-三联吡啶是百草枯、敌草快生产过程中产生的杂质。由于其具有强致癌作用，目前FAO严格控制其在百草枯、敌草快中的含量。

目前一般采用提取、净化、测定等步骤对百草枯、敌草快中的2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量进行检测，而国际农药分析协作委员会(CIPAC)标准采用LC/MS/MS方法进行检测。但是LC/MS/MS仪器购买和使用费用都非常昂高，国内普通农药厂家甚至很多专门的检测机构都不具备这种资金实力；其次，其检测步骤还涉及提取、固相萃取柱净化以及异构体的定性确认等，步骤繁琐。因此，LC/MS/MS检测方法在国内的可推广性的前景较差。

百草枯、敌草快中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的检测在我国还没有标准。有研究人员采用乙酸乙酯提取，基本步骤如下：先用纯度标准物质配制标准曲线；再称取约2g样品，加入氢氧化钾、氯化钠、6mL乙酸乙酯，振荡，超声提取10min，重复5次；最后GC/MS进样分析，采用外标法制作标准曲线计算出2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量。该技术存在的主要问题是提取步骤繁琐，要反复提取5次，且GC/MS定量时由于基质效应的影响，会导致定量不准确，通常会使检测结果显著偏高。

发明内容

本发明针对现有技术中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的检测比较昂贵、步骤繁琐或检测结果不准确的技术问题，目的在于提供一种新的检测2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量的方法。

本发明的检测样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的方法为标准加入法，包括如下步骤：

步骤A)称取样品，加入氢氧化钠和/或氢氧化钾以及乙酸乙酯，振荡，超声提取，得到待测样品溶液；

步骤B)将2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液分别以等体积比与待测样品溶液混合均匀得到系列浓度的加标混合液，然后用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列浓度的加标混合液的响应值，以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，制作曲线并计算出样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量。

其中，所述样品为百草枯和/或敌草快样品。

步骤A)中，每1g样品，加入1～2mL1mol/L氢氧化钠和/或氢氧化钾，振荡后加入2mL的乙酸乙酯，再震荡1～2min，超声15～30min，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤B)中，将2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液分别以1∶1的体积比与待测样品溶液混合均匀。

所述的标准加入法的加标回收率为70％～120％。所述的标准加入法的最低检出限为0.1mg/kg。

所述的响应值为峰面积。

本发明的标准加入法的精密度在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10％。在再现性条件下获得的两次独立性测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20％。

本发明的检测样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的方法具有简单快速、准确、廉价、检出限低等优点。

附图说明

图1是实施例1中标准加入法的标准曲线图；

图2是比较实施例2中的外标法的标准曲线图；

具体实施方式

实施例1标准加入法检测敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

步骤1)2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液的配制

称取0.0250g(精确至0.0001g)的2，2′：6′，2"-三联吡啶于25mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，配制成浓度约1000mg/L的标准溶液。以此溶液为母液，用移液管取适量于100mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10mg/L的标准工作溶液。

用移液管分别吸取0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL的标准工作溶液于10mL容量瓶中，以丙酮定容，得成浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的系列标准溶液。

步骤2)待测样品溶液的制备

称取2.00g(精确至±0.01g)敌草快样品，放入25mL具塞比色管中，加2mL1mol/L的氢氧化钠溶液，小心振荡(不能沾到瓶盖上)后再加入4.0mL乙酸乙酯，用力震荡1min，超声15min，冷却至室温，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤3)定量

取2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液，分别以1∶1体积比与待测样品溶液混合均匀，将得到系列浓度的加标混合液，使用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列浓度的加标混合液的响应值。

GC/MS的操作条件如下：

色谱柱：DB-XLBms，30m×0.25mm，0.25μm膜厚毛细管柱；

柱温：100℃20℃/min270℃(4min)；

进样器温度：260℃；

离子源温度：200℃；

接界温度：260℃；

载气：高纯氦；

柱流速：1.9mL/min；

扫描方式：SIM；

进样量：1.0μL；

进样方式：不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀；

溶剂去除时间：3.5min；

离子对：定量离子233，定性离子232，205；

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶约9.2min。

以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。

得到线性方程Y＝aX+b，计算当Y＝0时X的值，待测样品溶液中的2，2′：6′，2"-三联吡啶含量c₀＝-X

敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

式中：

C₀-待测样品溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量(mg/L)

v-定容体积，即加入乙酸乙酯的体积(mL)

w₀-样品质量(g)

经过测定得到如下数据

表1标准加入法的加标浓度与对应的峰面积

标准加入法的标准曲线如图1所示，得到的方程为Y＝1.0375×10⁶X+2.5415×10⁵r＝0.9995

结果：敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量的检测结果为0.50mg/kg。

实施例2标准加入法的加标回收率

步骤1)2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液的配制

称取0.0250g(精确至0.0001g)的2，2′：6′，2"-三联吡啶于25mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，配制成浓度约1000mg/L的标准溶液。以此溶液为母液，用移液管取适量于100mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10mg/L的标准工作溶液。

用移液管分别吸取0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL的标准工作溶液于10mL容量瓶中，以丙酮定容，得成浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L、4.00mg/L的系列标准溶液。

步骤2)待测样品溶液的制备

称取2.00g(精确至±0.01g)敌草快样品15份，放入25mL具塞比色管中，分别准确添加0.02mL、0.20mL、0.40mL浓度为10mg/L的标准工作溶液，每个添加体积重复5次，得到敌草快添加样品，加2mL1mol/L的氢氧化钠溶液，小心振荡(不能沾到瓶盖上)后再加入4.0mL乙酸乙酯，用力震荡1min，超声15min，冷却至室温，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤3)定量

取2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液，分别以1∶1体积比与各份待测样品溶液混合均匀，得到系列浓度的加标混合液，使用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列浓度的加标混合液的响应值。

GC/MS的操作条件如下：

色谱柱：DB-XLBms，30m×0.25mm，0.25μm膜厚毛细管柱；

柱温：100℃20℃/min270℃(4min)；

进样器温度：260℃；

离子源温度：200℃；

接界温度：260℃；

载气：高纯氦；

柱流速：1.9mL/min；

扫描方式：SIM；

进样量：1.0μL；

进样方式：不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀；

溶剂去除时间：3.5min；

离子对：定量离子233，定性离子232，205；

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶约9.2min。

以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。

得到线性方程Y_i＝a_iX_i+b_i，计算当Y_i＝0时X_i的值，第i份待测样品溶液中的2，2′：6′，2"-三联吡啶含量c_i＝-X_i

第i份敌草快添加样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

式中：

i表示第1份、第2份......第15份样品

c_i-第i份待测样品溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量(mg/L)

v-定容体积，即加入乙酸乙酯的体积(mL)

w_i-第i份样品质量(g)

加标回收率 $P_i=\frac{Q_i\×w_i-Q_0\×w_i}{A}\×100\%$

式中：

P_i-第i份敌草快样品的加标回收率

Q_i-第i份敌草快添加样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量(mg/kg)

Q₀-实施例1测得的敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量(mg/kg)

A-步骤2)中2，2′：6′，2"-三联吡啶的加标量，添加的标准工作溶液的浓度与体积的乘积(μg)

表2加标回收率

允许的回收率范围为70％～120％

实施例3标准加入法的精密度

步骤1)2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液的配制

称取0.0250g(精确至0.0001g)的2，2′：6′，2"-三联吡啶于25mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，配制成浓度约1000mg/L的标准溶液。以此溶液为母液，用移液管取适量于100mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10mg/L的标准工作溶液。

用移液管分别吸取0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL的标准工作溶液于10mL容量瓶中，以丙酮定容，得成浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的系列标准溶液。

步骤2)待测样品溶液的制备

称取2.00g(精确至±0.01g)敌草快样品5份，放入25mL具塞比色管中，加2mL1mol/L的氢氧化钠溶液，小心振荡(不能沾到瓶盖上)后再加入4.0mL乙酸乙酯，用力震荡1min，超声15min，冷却至室温，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤3)定量

取2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液，分别以1∶1体积比与各份待测样品溶液混合均匀，得到系列浓度的加标混合液，使用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列浓度的加标混合液的响应值。

GC/MS的操作条件如下：

色谱柱：DB-XLBms，30m×0.25mm，0.25μm膜厚毛细管柱；

柱温：100℃20℃/min270℃(4min)；

进样器温度：260℃；

离子源温度：200℃；

接界温度：260℃；

载气：高纯氦；

柱流速：1.9mL/min；

扫描方式：SIM；

进样量：1.0μL；

进样方式：不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀；

溶剂去除时间：3.5min；

离子对：定量离子233，定性离子232，205；

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶约9.2min。

以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。

得到线性方程Y_j＝a_jX_j+b_j，计算当Y_j＝0时X_j的值，第j份待测样品溶液中的2，2′：6′，2"-三联吡啶含量c_j＝-X_j

第j份敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

式中：

j表示第1份、第2份......第5份样品

c_j-第j份待测样品溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量(mg/L)

v-定容体积，即加入乙酸乙酯的体积(mL)

w_j-第j份样品质量(g)

表3精密度

在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10％。

实施例4标准加入法的最低检出限

步骤1)2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液的配制

称取0.0250g(精确至0.0001g)的2，2′：6′，2"-三联吡啶于25mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，配制成浓度约1000mg/L的标准溶液。以此溶液为母液，用移液管取适量于100mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10mg/L的标准工作溶液。

用移液管分别吸取0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、的标准工作溶液于10mL容量瓶中，以丙酮定容，得成浓度分别为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L的系列标准溶液。

步骤2)待测样品溶液的制备

称取2.00g(精确至±0.01g)敌草快样品，放入25mL具塞比色管中，加2mL1mol/L的氢氧化钠溶液，小心振荡(不能沾到瓶盖上)后再加入4.0mL乙酸乙酯，用力震荡1min，超声15min，冷却至室温，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤3)定量

取2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液，分别以1∶1体积比与待测样品溶液混合均匀，将得到系列浓度的加标混合液，使用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列浓度的加标混合液的响应值。

GC/MS的操作条件如下：

色谱柱：DB-XLBms，30m×0.25mm，0.25μm膜厚毛细管柱；

柱温：100℃20℃/min270℃(4min)；

进样器温度：260℃；

离子源温度：200℃；

接界温度：260℃；

载气：高纯氦；

柱流速：1.9mL/min；

扫描方式：SIM；

进样量：1.0μL；

进样方式：不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀；

溶剂去除时间：3.5min；

离子对：定量离子233，定性离子232，205；

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶约9.2min。

以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程，并读取仪器工作站上的系列浓度标准曲线2，2′：6′，2"-三联吡啶峰的信噪比。

在上述条件下，浓度为0.05mg/L的2，2′：6′，2"-三联吡啶标准溶液信噪比为10，则将此点作为最低点，计算得2，2′：6′，2"-三联吡啶最小检出量为0.05ng，敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶最低检测浓度为0.1mg/kg。

结论：采用本发明的方法测定敌草快样品具有简单、方便、精确度和精密度好等优点，且最低检出限符合要求。

比较实施例1采用CIPAC法检测敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

a：校准溶液的制备：称取12.5±0.5mg(精确至0.1mg)的2，2′：6′，2"-三联吡啶2份，放入25mL容量瓶，乙腈稀释至刻度待用，准确移取该溶液1mL至10mL容量瓶并用乙腈稀释至刻度，得到2，2′：6′，2"-三联吡啶标准储备液。分别准确移取0.5mL上述储备液至50mL容量瓶并用乙腈-水-二乙胺溶液稀释至刻度，为校准溶液。

b：样品制备：取2.0g敌草快样品，放入14mL的带盖玻璃瓶中，加0.1mL二乙胺、2.0mL1mol/L的氢氧化钠溶液，准确加入10mL乙酸乙酯，塞进盖子，上下颠倒数次以确保完全混匀，静置5min。将此玻璃瓶放入一个抗溶剂腐蚀的带盖子的并且密封的塑料试管中，以2500rpm离心2min，上清液备用。

c：取MCX固相萃取柱(60mg/3mL)两支，分别依次用3mL乙腈、2mL水、3mL饱和氯化钠溶液、3mL水、3mL乙腈活化。取5mL备用上清液，分两次加到一支固相萃取柱上，控制流速使其在约15s内滴完，收集洗脱液于洁净干燥的玻璃试管中，加入2mL乙酸乙酯洗脱，控制流速使其在约10s内滴完，抽干，收集洗脱液于同一个玻璃试管中，加入750μL三氟乙酸，然后将此溶液加入第二支固相萃取柱中，自然滴落，弃去流出液；向玻璃试管中加入2mL洗脱液A(乙酸乙酯体积/三氟乙酸体积＝20/1)，转入第二支固相萃取柱中，自然滴落，弃去流出液；向固相萃取柱中加入2mL洗脱液B(乙腈体积/水体积/三氟乙酸＝70/30/1)，控制流速使其在约10s内滴完，抽干，弃去流出液；最后，以2mL洗脱液C(乙腈体积/水体积/二乙胺＝70/30/5)洗脱固相萃取柱，抽干，收集流出液，待测。

d：以LC/MS/MS检测，基本操作条件如下。

色谱柱：AgilentC8(150mm×3mmi.d.粒径3μm)

流动相A：1L水中加入2mL二乙胺

流动相B：1L乙腈中加入2mL二乙胺

表3流动相梯度

流速：0.5mL/min

柱温：40℃

进样量：20μL

监测方式：选择离子监测(MRM)

检测离子对：234/78、234/130、234/155、234/207

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶保留时间约3.6min

e：三联吡啶异构体定性

按下式计算校准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶MRM响应因子：

$R^{\mathrm{MRM}}=\frac{(H_{S234/78}+H_{S234/155})}{(H_{S234/207}+H_{S234/130})}$

其中：

H_s234/78＝校准溶液中离子对234/78MRM监测通道的响应峰面积

H_s234/155＝校准溶液中离子对234/115MRM监测通道的响应峰面积

H_s234/207＝校准溶液中离子对234/207MRM监测通道的响应峰面积

H_s234/130＝校准溶液中离子对234/130MRM监测通道的响应峰面积

R^MRM＝MRM响应因子

对样品中每一个峰计算R^MRM，若某一个峰的R^MRM与校准溶液R^MRM平均值相差在±50％之内，则认为是2，2′：6′，2"-三联吡啶的异构体。

f：结果计算

按步骤c确认2，2′：6′，2"-三联吡啶异构体，将所有异构体峰面积加和，按照校准溶液的校正因子计算样品中三联吡啶含量

表5本发明的标准加入法与CIPAC法对同一个样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的检测结果比较

结果：采用本法测定的样品方法简便，步骤简单，节约时间，与国际标准方法结果一致。

比较实施例2外标法检测敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量即基质效应的影响

步骤1)2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液的配制

称取0.0250g(精确至0.0001g)的2，2′：6′，2"-三联吡啶于25mL容量瓶中，用丙酮稀释至刻度，配制成浓度约1000mg/L的标准溶液。以此溶液为母液，用移液管取适量于100mL容量瓶中，以丙酮定容，配制成浓度为10mg/L的标准工作溶液。

用移液管分别吸取0.05mL、0.10mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL的标准工作溶液于10mL容量瓶中，以丙酮定容，得成浓度分别为0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L、2.00mg/L的系列标准溶液。

步骤2)待测样品溶液的制备

称取2.00g(精确至±0.01g)敌草快样品，放入25mL具塞比色管中，加2mL1mol/L的氢氧化钾溶液和2gNacl，小心振荡(不能沾到瓶盖上)后再加入6.0mL乙酸乙酯，用力震荡1min，超声波提取10min，静置30min，重复提取5次，取上层溶液作为待测样品溶液。

步骤3)定量

待仪器稳定后，按照以下试验条件，使用气相色谱串联质谱仪(GC/MS)测定系列标准溶液和样品溶液的响应值。

GC/MS的操作条件如下：

色谱柱：DB-XLBms，30m×0.25mm，0.25μm膜厚毛细管柱；

柱温：100℃20℃/min270℃(4min)；

进样器温度：260℃；

离子源温度：200℃；

接界温度：260℃；

载气：高纯氦；

柱流速：1.9mL/min；

扫描方式：SIM；

进样量：1.0μL；

进样方式：不分流进样，1.5min后打开分流阀和隔垫吹扫阀；

溶剂去除时间：3.5min；

离子对：定量离子233，定性离子232，205；

保留时间：2，2′：6′，2"-三联吡啶约9.2min。

以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程，并依此计算待测样品溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量c。

敌草快样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量

式中：

c-待测样品溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量(mg/L)

v-定容体积，即加入乙酸乙酯的体积(mL)

w-样品质量(g)

表6外标法的标准工作溶液的浓度与对应的峰面积

外标法的标准曲线如图2所示，得到的方程为Y＝5.3097×10⁵X+4.9430×10⁴r＝0.9990

结论：采用外标法定量敌草快样品中的2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量，检测结果为1.2mg/kg，其结果明显高于使用国际标准方法得到的检测结果。

Claims (7)

1.一种检测样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶含量的方法，该方法为标准加入法，包括如下步骤：

步骤A)称取样品，加入氢氧化钠和/或氢氧化钾以及乙酸乙酯，振荡，超声提取，得到待测样品溶液；

步骤B)将2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液分别以等体积比与待测样品溶液混合均匀得到系列浓度的加标混合液，然后用气相色谱串联质谱仪测定系列浓度的加标混合液的响应值，以系列标准溶液中2，2′：6′，2"-三联吡啶的浓度为横坐标，以响应值为纵坐标，制作曲线并计算出样品中2，2′：6′，2"-三联吡啶的含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品为百草枯和/或敌草快样品。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤A)中，每1g样品，加入1～2mL1mol/L氢氧化钠和/或氢氧化钾，振荡后加入2mL的乙酸乙酯，再震荡1～2min，超声15～30min，取上层溶液作为待测样品溶液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤B)中，将2，2′：6′，2"-三联吡啶系列标准溶液分别以1∶1的体积比与待测样品溶液混合均匀。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的标准加入法的加标回收率为70％～120％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的标准加入法的最低检出限为0.1mg/kg。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的响应值为峰面积。