CN103592403B - 一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及食品安全检测领域，提供一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，所述五种防腐保鲜剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-二氯苯氧乙酸、乙萘酚和4-苯基苯酚；所述同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法包括以下步骤：样品提取、浓缩、净化以及液相色谱质谱测定。该方法前处理简单易操作，分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，检测限低于1.0μg/kg，能满足防腐保鲜剂定性、定量检测的要求。
Description
技术领域
本发明涉及食品安全检测领域，尤其涉及一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法。
背景技术
《食品添加剂使用标准》（GB2760-2011）对鲜水果中允许使用的保鲜剂种类及最大使用量、残留量作了明确的规定。化学防腐保鲜剂虽然具有防腐保鲜的作用，但是大多会对人体产生有不同程度的毒害作用，给健康带来不利影响，甚至出现致癌、致畸、致突变等情况，为此加强对水果防腐保鲜剂残留监测具有重要意义。对羟基苯甲酸酯类（甲酯、乙酯）、乙萘酚、4-苯基苯酚、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是比较常用的水果保鲜剂，它们对人体有一定的毒性。
现有技术中有高效液相色谱法对对羟基苯甲酸酯类、乙萘酚、2,4-D和4-苯基苯酚残留量进行分别测定的方法，但检测过程繁琐，耗费人力物力。也有采用利用气相色谱质谱法同时测定对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、乙萘酚、4-苯基苯酚和联苯醚残留量的报道，但是最低检测限较高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，旨在解决现有技术中对防腐保鲜剂的检测过程繁琐的问题。
本发明提供一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，所述五种防腐保鲜剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-二氯苯氧乙酸、乙萘酚和4-苯基苯酚；所述同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法包括以下步骤：
样品提取：将待测样品捣碎，加入待测样品质量4～7倍的***后振荡，超声，再加入样品质量0.8～1.2倍的氯化钠振荡，离心，取有机相；
浓缩：重复所述样品提取步骤2～3次，合并所述有机相后浓缩至其体积的1/15～1/20，得待净化液；
净化：将所述待净化液倒入固相萃取柱后用体积比为1:1的丙酮和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液用氮气吹至干，甲醇定容至1mL，0.45μm滤膜过滤后，得待测液；
样品测定：液相色谱质谱仪器测定，其中，液相色谱条件为色谱柱：ThermoHYPERSIL ODS-2C18柱，4.6×150mm×5μm，流动相梯度洗脱条件见表1；柱温为40℃；进样量为2μL。
表1
质谱条件为：电喷雾离子源：ESI-，碰撞气CAD：6psi，气帘气压力CUR：24psi，雾化气压力GS1：55psi，辅助加热器GS2：55psi，喷雾电压IS：-4500V，离子源温度TEM：600℃，五种鲜水果保鲜剂的多反应监测质谱参数见表2，其中，带*的为定量离子。
表2
本发明所提供的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，通过液相色谱质谱法对五种防腐保鲜剂的残留量实现同时定性、定量测定，该检测方法分析时间短，并且线性范围宽，灵敏度高，检测结果准确，检测限低于1.0μg/kg，能满足防腐保鲜剂定性、定量检测的要求。
附图说明
图1为五种鲜水果保鲜剂混标（0.4μg/mL）的LC-MS/MS图谱，其中，1代表2,4-D；2代表对羟基苯甲酸甲酯；3代表对羟基苯甲酸乙酯；4代表乙萘酚；5代表4-苯基苯酚。
图2为苹果的LC-MS/MS图谱。
图3为苹果加标（0.4μg/mL）的LC-MS/MS图谱，其中，1代表2,4-D；2代表对羟基苯甲酸甲酯；3代表对羟基苯甲酸乙酯；4代表乙萘酚；5代表4-苯基苯酚。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，所述五种防腐保鲜剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-二氯苯氧乙酸、乙萘酚和4-苯基苯酚；所述同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法包括以下步骤：
S01：样品提取：将待测样品捣碎，加入待测样品质量4～7倍的***后振荡，超声，再加入样品质量0.8～1.2倍的氯化钠振荡，离心，取有机相；
S02：浓缩：重复所述样品提取步骤2～3次，合并所述有机相后浓缩至其体积的1/15～1/20，得待净化液；
S03：净化：将所述待净化液倒入固相萃取柱后用体积比为1:1的丙酮和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液吹干，甲醇定容至1mL，0.45μm滤膜过滤后，得待测液；
S04：样品测定：液相色谱质谱仪器测定，其中，液相色谱条件为色谱柱：Thermo HYPERSIL ODS-2C18柱，4.6×150mm×5μm，流动相梯度洗脱条件见表1；柱温为40℃；进样量为2μL。
表1
质谱条件：电喷雾离子源：ESI-，碰撞气CAD：6psi，气帘气压力CUR：24psi，雾化气压力GS1：55psi，辅助加热器GS2：55psi，喷雾电压IS：-4500V，离子源温度TEM：600℃，五种鲜水果保鲜剂的多反应监测质谱参数见表2，其中，带*的为定量离子。
表2
步骤S01中，优选地将待测样品捣碎，加入待测样品质量5～6倍的***后振荡，超声，再加入样品质量1倍的氯化钠振荡，离心，取有机相。具体步骤可以为将100g鲜水果放入捣碎机中捣碎，搅拌均匀后待用。称取2.0g样品（精确至0.001g）放入50mL离心管中，加入10mL***，涡旋振荡2min后再超声提取4～8min，加入2.0g氯化钠再次涡旋2min，4000～5000r/min离心4～8min，取有机相。
步骤S02中，重复步骤S01，提取2～3次，优选提取2次，合并有机相。将有机相于平行蒸发仪（压力689mbar）上浓缩至约1mL，用于净化处理。平行蒸发仪例如选用瑞士BUCHI。
步骤S03中，优选地采用活性炭小柱（SupelcleanTM ENVITM-Carb SPE Tubes，3mL，0.25g）净化。活性炭小柱先用2mL丙酮：乙酸乙酯溶液（体积比为1:1）活化，将待净化液倒入固相萃取柱后用5mL丙酮：乙酸乙酯溶液（体积比为1:1）洗脱。洗脱液用氮气吹至近干，用甲醇定容至1mL，0.45μm滤膜过滤后供高效液相色谱分析。
步骤S04中，液相色谱仪可选用岛津LC-30系列，日本岛津公司；质谱仪可选用API4000配有电喷雾离子源（ESI）及Analysit1.6数据处理***，美国应用生物***公司（ABI）。本发明比较了Thermo HYPERSIL BDS-2Column（2.1×100mm×5μm）、Thermo HYPERSIL ODS-2Column（4.6×150mm×5μm）、Agilent ZORBAX Extend Column（4.6×150mm×5μm）三种柱子，发现以HYPERSIL ODS柱对5种保鲜剂，尤其是2,4-D的保留性、灵敏度和峰型表现出明显的优势。
采用乙腈和50%甲醇水溶液为流动相进行梯度洗脱，5种保鲜剂均分离良好，峰型尖锐对称，10min内就能完成5种保鲜剂的检测，且目标峰没有基质干扰（见图1）。乙腈、甲醇及去离子水是实验室常备试剂，省去了配置流动相的步骤，同时对柱子的损耗小，同时节省冲洗柱子的时间，大大提高了工作效率。
本发明采用0.8μg/mL的混标溶液，以蠕动泵样方式在电喷雾负离子模式下进行母离子全扫描，找出准确的分子离子作为母离子，然后以分子离子为母离子对其子离子进行全扫描，最后选取丰度较强的2个子离子，优化其锥孔电压、碰撞能量等质谱参数。选取丰度较大并且响应稳定的来做定量离子。
标准曲线、线性范围及检出限
标准溶液配制：准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-D、乙萘酚和4-苯基苯酚标准品各0.05g（精确到0.001g），用甲醇配制成浓度为1.0mg/mL的标准品储备液，4℃冰箱保存备用。储备液用甲醇逐级稀释，配制系列工作液。
在确定的色谱条件下对质量浓度为0.0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.2μg/mL的混合标准品分别进行测定，以各组分的峰面积（Y）对其质量浓度（X,μg/mL）进行线性回归，结果见表3。5种标准物质在0.05～0.8μg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数均可达到0.99以上。以信噪比S/N=3计算5种标准物质的检测限，2,4-D的检测限为0.1μg/kg，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯的检测限为0.5μg/kg，4-苯基苯酚、乙萘酚的检测限为1.0μg/kg。
表3
回收率及精密度分析
在苹果、梨、葡萄、橙子、草莓和猕猴桃6种鲜水果样品中添加0.1、0.2、0.4、0.8μg/mL的混合标物，经上述方法提取、净化处理后进行HPLC-MS/MS测定，苹果样品和样品加标的高效液相色谱串联质谱图分别如图2和图3所示。结果表明：在此色谱条件下能很好的将5种目标物质分离。本研究按测量值和真实值计算回收率，5次重复计算变异系数，加标回收率及精密度结果见表4。6种水果中联苯醚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、乙萘酚和4-苯基苯酚的本底值均为0mg/kg，5种标准物质的平均回收率在81.2%～104.5%，相对标准偏差(RSD)为1.41%～6.76%，符合残留检测方法对回收率与精密度的要求。
实际样品的测试
为了验证本方法的可行性，分别从水果批发市场、超市和商店中购买了柑橘、苹果、葡萄、梨、猕猴桃、草莓、桃子、黑布李、樱桃和小番茄10种鲜水果样品。运用本文建立的HPLC-MS/MS分析方法，对鲜水果样品进行处理并测定其中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-D、乙萘酚和4-苯基苯酚的含量。结果表明，所测样品中均未检出该5种鲜水果保鲜剂。
本发明实施例提供的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，通过对鲜水果样品***提取，固相萃取活性炭柱净化，C18色谱柱分离，以乙腈和50%甲醇水为流动相进行梯度洗脱，电喷雾负离子（ESI-）模式电离，液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）测定后，结果表明：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-D、乙萘酚和4-苯基苯酚标准物质在0.05～0.8μg/mL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2均大于0.99。在此范围内加标回收率为81.2%～104.5%，相对标准偏差（RSD）为1.41%～6.76%，2,4-D的检测限为0.1μg/kg，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的检测限为0.5μg/kg，4-苯基苯酚和乙萘酚的检测限为1.0μg/kg。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述五种防腐保鲜剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、2,4-二氯苯氧乙酸、乙萘酚和4-苯基苯酚；所述同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法包括以下步骤：
样品提取：将待测样品捣碎，加入待测样品质量4～7倍的***后振荡，超声，再加入样品质量0.8～1.2倍的氯化钠振荡，离心，取有机相；
浓缩：重复所述样品提取步骤2～3次，合并所述有机相后浓缩至其体积的1/15～1/20，得待净化液；
净化：将所述待净化液倒入固相萃取柱后用体积比为1:1的丙酮和乙酸乙酯混合液洗脱，洗脱液用氮气吹至干，甲醇定容至1mL，0.45μm滤膜过滤后，得待测液；
样品测定：液相色谱质谱仪器测定，其中，液相色谱条件为色谱柱：Thermo HYPERSIL ODS-2C18柱，4.6×150mm×5μm，流动相梯度洗脱条件见表1；柱温为40℃；进样量为2μL；
表1
质谱条件：电喷雾离子源：ESI-，碰撞气CAD：6psi，气帘气压力CUR：24psi，雾化气压力GS1：55psi，辅助加热器GS2：55psi，喷雾电压IS：-4500V，离子源温度TEM：600℃，五种鲜水果保鲜剂的多反应监测质谱参数见表2，其中，带*的为定量离子；
表2
2.根据权利要求1所述的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述样品提取为将待测样品捣碎，加入待测样品质量5～6倍的***后振荡，超声，再加入样品质量1倍的氯化钠振荡，离心，取有机相。
3.根据权利要求1或2所述的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述超声的时间为4～8min，所述离心的速度为4000～5000r/min，所述离心的时间为4～8min。
4.根据权利要求1所述的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述有机相浓缩采用平行蒸发仪浓缩。
5.根据权利要求1所述的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述固相萃取柱为活性炭小柱SupelcleanTM ENVITM-CarbSPE Tubes。
6.根据权利要求5所述的同时测定五种鲜水果保鲜剂残留量的检测方法，其特征在于，所述活性炭小柱先用体积比为1：1的丙酮乙酸乙酯混合溶液活化后再进行净化液洗脱。
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