CN105301263A - 一种检测鸡肉组织中孕酮残留的酶联免疫试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鸡肉组织中孕酮残留检测酶联免疫试剂盒，其组成成分及比例如下：包括包被板、标准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、浓缩提取液。本发明试剂盒的灵敏度为0.1ppb，精密度：批内变异系数(CV%)，CV%<5%：批间变异系数(CV%)CV<10%：准确度以回收率表示，回收率在80%—110%之间。IC₅₀范围：在0.3—0.5ppb之间，线性相关系数|r|：不小于0.9900，具有使用范围广、使用方便、检测准确的优点。

Description

一种检测鸡肉组织中孕酮残留的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种检测激素类孕酮的酶联免疫试剂盒，其特别适用于鸡肉中孕酮残留的检测。

技术背景

孕酮亦称为***、孕甾酮、黄体甾酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮是一种涉及女性***、妊娠和对人类还又其他动物的胚胎有影响的类固醇。孕酮是一种女性荷尔蒙，参与人类与其他动物的雌性***，支援怀孕与胚胎形成。孕酮是属于一类称为孕激素的荷尔蒙，也是人类最重要的孕激素。激素类药物可提高畜食的饲料转化率，进而达到增重的目的，但因孕酮在体内残留会导致一系列问题，如性征变化，早熟等，对儿童和青少年作用更为明显。目前，激素类物质已被大部分国家禁止在养殖业中使用，并不得在食品中检出。但国内对畜产品中孕酮等违禁药物残留的检测几乎是空白，根据我国对动物源产品残留监控规定及有关进口国的要求，研究各种检测方法已成为当务之急。

目前，检测孕酮残留量的方法主要是高效液相色谱法(HPLC)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于鸡肉中孕酮残留检测酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它含有：

(1)包被有包被原的酶标板(包被原为抗原、抗体或抗抗体)；

(2)酶标记物(为酶标记半抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体)；

(3)孕酮抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标抗原时含有)；

(4)孕酮标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)浓缩复溶液。

本发明提供的检测孕酮残留量的美联免疫试剂盒，包括孕酮特异性抗体工作液及预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液，所述酶标记物为酶标记的抗抗体，酶标记孕酮半抗原或酶标记孕酮特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，酶标记的羊抗鼠抗抗体是采用混合酸酐或碳化二亚胺法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

所述孕酮特异性抗体为孕酮单克隆抗体，他们均是用孕酮半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法得到的偶联物作为免疫原得到的，所述孕酮单克隆抗体优选孕酮鼠单克隆抗体。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括孕酮标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液。

所述洗涤液优选浓缩洗涤液为pH7.1--7.7，含有0.8%~1.2%吐温80和0.03--0.05%硫柳汞防腐剂，0.02--0.04mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

当酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1~2mol/L硫酸或盐酸缓冲液；

所述复溶液为含有0.08--0.12%吐温20、3--8%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为用缓冲液将包被原稀释成0.2~0.3μg/ml，每孔加入100μL，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用稀释后的洗涤液洗涤两次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μL封闭液，37℃温育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明中抗原的合成过程：

1.半抗原的合成

孕酮半抗原是将孕酮和琥珀酸酐通过反应得到的；

2.孕酮抗体的制备

将孕酮半抗原与载体蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原。

本发明所述试剂盒中孕酮标准品溶液；标注品溶液6瓶，为0μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L，24.3μg/L。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被孕酮抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，随即加入酶标二抗，再加入孕酮特异性抗体溶液，样本中残留的孕酮与酶标板上包被的孕酮抗原竞争孕酮特异性抗体，酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与孕酮的含量成负相关，与标准曲线比较可粗略判断样品中孕酮残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测鸡肉中孕酮残留的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

样本前处理主要是为了从样本中获得孕酮溶液，从而用于后续的检测。样本前处理的方法：称取2.0±0.05鸡肉至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5~8mL乙酸乙酯，振荡器振荡10min，3000r以上离心5min，取上清液1~3mL，至10mL干净的玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干，加入1~3mL样本复溶液，用涡旋仪涡旋1min，取50μL用于分析。

本发明中用试剂盒检测时，当包被原为孕酮抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液，随即加入酶标二抗，再加入抗体工作液，温育后洗涤拍干，显色，终止，用酶标仪测定吸光度值。本发明中的结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100%，即百分吸光度值，计算公式为：

百分吸光度值(%)=(B/B₀)×100%

以孕酮标准品的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，用同样的办法计算样品中的百分吸光度值，相对应的每个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中孕酮的残留量。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液的浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需不足1h即可完成。

本发明检测鸡肉组织中孕酮残留的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测出样品中的孕酮的残留量，对样品前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测出大批量样品，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高，灵敏度高，精确度高，准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒结构简单，使用方便，携带便利，检测方法高效准确，适于大批量样品筛选检测。本发明的试剂盒将在孕酮残留的检测中发挥重要作用。

附图说明

附图1孕酮化学结构式。

附图2孕酮酶联免疫试剂盒的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施步例来进一步阐述本发明：

1、酶标板的制备

用包被缓冲液将孕酮抗原稀释成0.20μg/mL，每孔加入100μL，37℃温育两小时，倾去包被液，用稀释的浓缩洗涤液洗涤两次，每次30s，拍干，然后再每孔加入200μL封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密闭保存。

2、组建检测孕酮残留的酶联免疫试剂盒，使其包括下述组分：

(1)包被孕酮抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)孕酮抗体工作液；

(4)孕酮标准品6瓶，浓度分别为0μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L，24.3μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色A液为过氧化脲，底物显色B液为四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L盐酸；

(7)浓缩洗涤液为为pH7.1~7.7，含有0.8%~1.2%吐温80和0.03--0.05%硫柳汞防腐剂，0.02--0.04mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；

(8)浓缩复溶液为含有0.08--0.12%吐温20、3--8%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

3、样品中孕酮残留的检测：

(1)称取2.0+(-)0.5鸡肉至50mL聚苯乙烯离心管中，加入5~8mL乙酸乙酯，振荡器振荡10min，3000r以上离心5min，取上清液1~3mL，至10mL干净的玻璃试管中，于50~60℃水浴氮气流下吹干，加入1~3mL样本复溶液，用涡旋仪涡旋1min，取50μL用于分析。

(2)用试剂盒检测：

向包被有孕酮抗原的酶标板微孔中加入孕酮标准品溶液或样本溶液50μL，随即加入酶标二抗50μL，再加入孕酮抗体工作液50μL，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μL洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此反复操作洗板5次，用吸水纸拍干，每孔加入底物显色A液过氧化脲，底物显色B液四甲基联苯胺，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50μL，轻轻振荡混匀，用酶标仪设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。所绘的标准曲线如附图2所示，IC₅₀=1.9ng/mL。

4、标准品精密度试验：

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定2.7μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

通过上述试验结果可以看出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在4.6%~11.2%之间，符合精密度小于或等于25%的规定。

5、样本准确度实验：

取两个浓度的孕酮标准品分别为10μg/kg，20μg/kg，分别对样本进行添加回收实验，每个浓度做4个平行，分别计算准确度。

结果表明鸡肉样本的添加回收率在82.0%~89.4%之间。

6、交叉反应率实验

选择与孕酮有类似结构和类似功能的药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50%的抑制浓度，用下试计算试剂盒对其他药物的交叉反应率。交叉反应率越大，那么此试剂盒对孕酮的检测特异性就越好。

交叉反应率(%)=(引起50%抑制孕酮的浓度/引起50%抑制的类似物浓度)×100%

7、试剂盒保存条件为2~8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50%抑制浓度、孕酮添加实际测定值均在正常范围内。考虑到在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行加速老化试验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果页表明试剂盒各项指标完全正常，从以上结果可以得出，试剂盒可以在2~8℃可以保存6个月。

Claims (5)

1.一种检测鸡肉组织中孕酮残留的酶联免疫试剂盒，其特征在于：其组成成分及比例如下：

包括包被板、标准品、酶标记物工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩洗涤液、浓缩提取液：所述包被板为孔底包被有孕酮抗原，所述酶标记物为酶标记孕酮抗体。

2.如权利1所述试剂盒，其特征在于所述孕酮抗体为单克隆抗体。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒其特征在于酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶，底物显色液A为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1~2mol/L硫酸或盐酸缓冲液。

4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液为pH7.1-7.7，含有0.8%~1.2%吐温80和0.03--0.05%硫柳汞防腐剂、0.02-0.04mol/L磷酸盐缓冲液：浓缩复溶液为含有0.08-0.12%吐温20、3-8%卵清蛋白、0.2~0.5mol/L磷酸盐缓冲液，孕酮标准品的浓度分别为0μg/L，0.3μg/L，0.9μg/L，2.7μg/L，8.1μg/L，24.3μg/L，所述百分比为重量体积百分比。

5.一种检测鸡肉组织中孕酮残留的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1中酶联免疫试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。