CN105296647A

CN105296647A - 羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒

Info

Publication number: CN105296647A
Application number: CN201510814839.3A
Authority: CN
Inventors: 刘榜; 付明; 王文君; 张静; 甄月然; 吴清清; 向胜男; 刘建建; 徐学文; 张庆德
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-11-20
Filing date: 2015-11-20
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2035-11-20
Also published as: CN105296647B

Abstract

本发明提供了羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒，属于动物种源性成分分子检测技术领域。本发明试剂盒包括SEQ？ID？No.2&3所示引物、反应试剂以及阳性和空白对照。此外还包括普通牛、水牛、猪、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡和鸭的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.4～25所示。采用本发明试剂盒进行分析，可判定样品中是否含有羊源性成分并能有效区分绵羊和山羊，以及是否掺有猪、普通牛、水牛、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭等其他动物成分。本发明为肉类、皮张和饲料中上述动物源性成分的检测提供了有效、精准、可靠的手段，具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

Description

羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒

技术领域

本发明涉及动物分子生物学领域，具体涉及羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的检测试剂盒。

背景技术

羊肉是我国人民食用的主要肉类之一，既能御风寒，又可补身体，是冬季的进补佳品。其肉质与牛肉相似，但肉味较浓，味道鲜美。羊肉肉质细嫩，含有丰富的蛋白质，脂肪和胆固醇较猪肉和牛肉少，矿物质钙、磷、铁、钾、碘等含量较猪牛肉高，营养全面。李时珍在《本草纲目》中说：“羊肉能暖中补虚，补中益气，开胃健身，益肾气，养胆明目，治虚劳寒冷，五劳七伤”，可见羊肉具有极高的食疗价值。

自2012年12331食品药品安全热线开通以来，关注度逐年增加，而食品类反映的主要问题是肉制品掺假，例如牛羊肉中掺入鸭肉、猪肉等。2013年江苏无锡的“掺假羊肉”事件，犯罪嫌疑人用狐狸、水貂、老鼠等未经检验检疫的动物肉制品冒充羊肉，流入了多家知名火锅店；亦或是成为羊肉串的成分。近年来，羊肉掺假事件常有发生，特别是接二连三曝光的制售假羊肉案件，引发社会广泛关注。羊肉掺假的方式一般是：掺杂猪肉、鸭肉、狐狸肉等其他价格较低的肉类；或者直接用猪肉、鸭肉掺上羊油、香精、羊肉粉等。此外，在饲料、皮张中掺假的现象也时有发生；例如某些不法商贩用相对廉价的猪皮冒充羊皮制品，欺骗消费者，从中牟取暴利。因此，针对羊源性制品建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方法是十分必要的。

日常生活中人们通常依靠感官和经验进行动物产品鉴别，但是随着加工方法的改进和各类制品中掺假成分的多元化、种类的复杂化，这种方法已远不能达到对动物源性制品掺假现象进行控制与监管的目的。随着现代分子生物学的发展，以聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术已成为动物源性成分鉴定的核心方法。同时，DNA也因其高稳定性和在不同组织中的同一性被选作比蛋白质更可靠的分析靶点。目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物所建立的PCR方法已有大量报道(GhovvatiS,NassiriMR,MirhoseiniSZ,HeraviMA,JavadmaneshA.FraudidentificationinindustrialmeatproductsbymultiplexPCRassay.FoodControl,2009,20(8):696-699；GirishPS,AnjaneyuluASR,ViswasKN,ShivakumarBM,AnandM,PatelM,SharmaB.Meatspeciesidentificationbypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP)ofmitochondrial12SrRNAgene.MeatScience,2005,70(1):107-112；DooleyJJ,PaineKE,GarrettSD,BrownHM.DetectionofmeatspeciesusingTaqManreal-timePCRassays.MeatScience,2004,68(3):431-438.)，且被列入了中国权威的检测技术标准(步迅，张全芳，刘艳艳.一种同时鉴定山羊、绵羊、猪和鸭肉源性的荧光标记基因复合扩增方法[P]，中国专利：CN103397101A,2013-11-20；张英杰，刘月琴，陈睿赜，刘彦琴，郭云霞，李雪梅，杨佳栋，锡建中.一次性鉴别羊肉、鸡肉、鸭肉、猪肉的PCR检测方法及试剂盒[P]，中国专利：CN104099405A，2014-10-15.)。但是线粒体DNA拷贝数多，在不同组织中含量不同，稳定性差且难以进行定量分析。而动物细胞核基因组DNA序列具有高度的物种特异性，能够避免非特异性扩增，更加适合用作PCR定性和定量分析。目前，国际上以细胞核DNA序列为目标序列，用于鉴别肉源的PCR检测方法大多只能区分开牛、羊、猪、鸡、鸭等常见肉制品(黄明，程欣，杨静，黄继超，周兴虎.一种快速检测血旺中鸡鸭猪血液成分的方法[P]，中国专利：CN103525908A,2014-01-22；黄明，黄玮玲，杨静，徐幸莲，周光宏.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法[P]，中国专利：CN102864243B，2013-9-25)。而肉产品市场掺假的复杂性(例如，我国多地的“混合羊肉”事件中有不法分子将狐狸、水貂、老鼠等动物肉，添加进羊肉里销往江苏、上海等地的农贸市场；欧洲“马肉风波”以马肉冒充高档牛肉等)表明，一种更加快速、简便、准确、全面的肉类掺假的检测方法成为当今市场最为迫切的需求，而目前能用于同时鉴别马、狐狸、水貂、鼠等多种动物种源性成分的PCR检测方法尚未见报道。此外，在饲料、皮张中动物源性成分掺假的现象也时有发生。因此，建立用于鉴别多物种的快速检测方法将对食品安全的监管具有重要的实践意义。

此外，就检测方法而言，目前多采用荧光PCR检测(曹琛福，宗卉，张彩虹等.驴或驴源性成分实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针[P]，中国专利：CN102311999A，2012-1-11；黄明，黄玮玲，杨静，徐幸莲，周光宏.一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法[P]，中国专利：CN102864243B，2013-9-25)、酶切检测(章安，尤金花，解福生，师秀梅.一种鉴定动物皮张的方法[P]，中国专利：CN1294277C，2007-1-10；姚永刚，陈仕毅，刘益平.一种快速鉴别5种家畜肉和肉干制品种类的方法[P]，中国专利：CN101712996,2010-5-26)或者通过扩增片段大小(乔建军，孙艳华，张智禹，关丛笑.多重PCR检测食品中肉类来源的引物组及试剂盒[P]，中国专利：CN101962675B，2013-2-6)等来进行判断。但是荧光检测方法对设备的要求高且花费较大；酶切检测方法则费时费力；而多重PCR通过扩增片段大小来鉴别动物肉源严重限制了可检测物种的数量，且引物间常相互干扰或形成二聚体，影响检测结果的可信度。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种可用于羊源性制品特异性检测的引物；

本发明的第二个目的在于提供用于羊源性制品检测的检测试剂盒；

本发明的目的还在于提供羊源性制品掺假鉴定方法。

为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行羊基因组特异DNA序列的筛选，经过牛科非羊亚科的牛、水牛，非牛科的猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐和水貂等的基因组DNA及不同的羊品种DNA中的检测，筛选在羊中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。

基于此，本发明首先提供一种羊特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。

优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。

优选地，该引物序列如下：

OVIS-F：5′-AGGTTCCAGCCTCACCAGTGA-3′

OVIS-R：5′-ACTGCTTGTGTCTCTGATGCCA-3′；

或该引物向5′、3′端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序列的引物。

进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还进一步包括以下引物中的一种或多种：

(1)对猪基因组DNA进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对Ⅰ：

SUS-F：5′-GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3′

SUS-R：5′-TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3′；

(2)对普通牛基因组DNA进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对Ⅱ：

BOS-F：5′-CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3′

BOS-R：5′-CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3′；

(3)对水牛基因组DNA进行扩增生成水牛特异性扩增片段的引物对Ⅲ：

BUBALUS-F：5′-GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3′

BUBALUS-R：5′-CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3′；

(4)对马属(马、驴)基因组DNA进行扩增生成马属特异性扩增片段的引物对Ⅳ：

EQUUS-F：5′-TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3′

EQUUS-R：5′-GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3′；

(5)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对Ⅴ：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′；

(6)对狐基因组DNA进行扩增生成狐特异性扩增片段的引物对Ⅵ：

VULPES-F：5′-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3′

VULPES-R：5′'-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3′；

(7)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对Ⅶ：

CANIS-F：5′-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3′

CANIS-R：5′-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3′；

(8)对水貂基因组DNA进行扩增生成貂特异性扩增片段的引物对Ⅷ：

MUSTLA-F：5′-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3′

MUSTLA-R：5′'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3′；

(9)对鼠(小鼠、大鼠、仓鼠)基因组DNA进行扩增生成鼠特异性扩增片段的引物对Ⅸ：

MUS_RAT_CRI-F：5′-CATCGTTGACAAGAAGGTGCTC-3′

MUS_RAT_CRI-R：5′-GAAAAAGCTGTACTTGGTGGGG-3′；

(10)对鸡基因组DNA进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅹ：

GALLUS-F：5′'-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3′

GALLUS-R：5′-AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3′；

(11)对鸭基因组DNA进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对Ⅺ：

ANAS-F：5′'-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3′

ANAS-R：5′'-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3′。

优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

所述阳性对照DNA模板为牛科羊亚科的山羊和绵羊基因组DNA模板；

优选地，所述阳性对照DNA模板还包括猪、普通牛、水牛、马、驴、兔、狐、狗、水貂、小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、鸭DNA模板中的一种或多种。

进一步，本发明提供上述的羊特异性引物或检测试剂盒在羊源性成分鉴定或羊源性制品掺假检测中的应用。

本发明还提供一种羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR检测：

A)用所述的羊特异性引物进行PCR扩增，并以羊基因组DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

B)用所述的试剂盒，进行PCR扩增，并以羊基因组DNA模板、猪、牛、水牛、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡或鸭DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。

优选地，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如下：

表1本发明PCR扩增的反应体系

所述的PCR反应程序如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min；

结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出羊源性成分；当PCR反应产物无扩增产物或与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出羊源性成分；如果阳性样品未检测出预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。

对于掺假的检查方法是以上述猪、普通牛、水牛、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭引物对Ⅰ～Ⅺ扩增待检样品DNA，检测是否存在对应的扩增产物，并判断是否存在相应成分，判断方式同上。

本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测；提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。

本发明提供了有效的、精准的、可靠的羊源性成分鉴定或羊源性制品掺假检测的方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品中是否含有羊源性成分，并可根据PCR产物鉴别绵羊和山羊，以及是否掺有猪、普通牛、水牛、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭等动物成分。本发明的方法可以在肉品、饲料和皮张检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

附图说明

图1：是SEQIDNo.1所示的特异序列在羊中具有物种特异性的检测结果。以猪、牛(普通牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的DNA为模板，扩增所述特异片段，所有测试样品中仅在羊(绵羊和山羊)中得到扩增产物，非羊样品中均无扩增产物，且在绵羊中有2条扩增条带，山羊中仅有1条扩增条带。结果表明所扩增片段在羊中具有特异性，且可有效区分绵羊和山羊。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；1-3：空白对照；4-6：绵羊；7-9：山羊；10-12：小鼠；13-15：大鼠；16-18：仓鼠；19-21：豚鼠；22-24：普通牛；25-27：水牛；28-30：猪；31-33：马；34-36：驴；37-39：鸡；40-42：鸭；43-45：鹅；46-48：兔；49-51：狐；52-54：狗；55-57：水貂；58-60：貉子。

图2：是SEQIDNo.1所示的特异序列在羊不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结果。分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的绵羊、山羊DNA为模板，扩增所述特异片段，0.1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；1-4：空白对照；5-8：0.1ng/μL的模板浓度；9-12：1ng/μL的模板浓度；13-16：10ng/μL的模板浓度；17-20：100ng/μL的模板浓度。

图3：是SEQIDNo.1所示的特异性序列在绵羊、山羊不同品种的多个体中的保守性检测结果。以湖羊、杜泊羊、小尾寒羊、南非美利奴羊等绵羊品种的DNA为模板，扩增所述特异片段，所有绵羊中有2条扩增条带；以麻城黑山羊、内蒙古绒山羊等山羊品种的DNA为模板，扩增所述特异片段，所有山羊中仅有1条扩增条带。表明所扩增片段在绵羊不同品种、山羊不同品种中分别具有保守性。如图：A是30个绵羊个体保守性检测结果；B是30个山羊个体保守性检测结果。

图4：是普通牛、水牛、马属(马、驴)、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、猪、鸡、鸭、兔、狗、狐和水貂的各特异性引物所扩增的特异序列在本物种中具有物种特异性的检测结果。采用上述引物对Ⅰ～Ⅺ，以猪、普通牛、水牛、羊(绵羊、山羊)、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的DNA为模板，扩增上述各物种的特异片段，所有引物仅在本物种中得到扩增产物，在非本物种样品中均无扩增产物。结果表明各物种引物以及所扩增片段具有物种特异性。如图：A：普通牛特异性引物扩增结果；B：水牛特异性引物扩增结果；C：马属(马和驴)特异性引物扩增结果；D：鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)特异性引物扩增结果；E：猪特异性引物扩增结果；F：鸡特异性引物扩增结果；G：鸭特异性引物扩增结果；H：兔特异性引物扩增结果；I：狗特异性引物扩增结果；J：狐特异性引物扩增结果；K：水貂特异性引物扩增结果。

图5：是所组装的试剂盒对市场中羊肉制品掺假产品的检测结果。用本发明的试剂盒对市场中获取的21组样品进行了检测，发现有5组产品为鸭肉掺假产品。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；E：空白对照；Y：羊阳性对照；Ya：鸭阳性对照；1-5：羊肉产品中检出鸭源性成分掺假。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润色均属于本发明的范围。

实施例1样品中羊源性成分特异性检测

1.试样的制备与保存

1.1取样

采集羊肉样品1g，于-20℃下保存备用。

1.2DNA模板制备

DNA模板制备采用常用的苯酚-氯仿粗提法(萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南[M].第2版.金冬雁,黎孟枫.北京:科学出版社,1999.465-467)或者公认的、具有相同效力的其他提取方法，这些方法都是报道的常用方法。

2.引物设计

本实施例的引物DNA序列如表2和序列表SEQIDNO：2和3所示。

表2本发明设计的羊PCR扩增引物

预期扩增片段大小为175bp，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。

实验表明，该引物特异性强，在绵羊、山羊各品种中均能分别得到特异性扩增，而在其他非羊物种中都无目的片段扩增；且引物的灵敏度较高，在模板DNA浓度为0.1ng/μL时即可扩增。以上述引物分别向3′、5′延伸一个碱基和两个碱基或修饰形成的引物对进行实验，实验表明仍能进行特异性扩增，从经济性和综合效果来看以表2中的引物最佳。

3.PCR检测

3.1试样PCR反应

3.1.1PCR反应体系同表1。

3.1.2混匀，加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)，在离心机上500g～3000g离心10s，然后取出PCR管，放入PCR仪中。

3.1.3进行PCR反应。程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min。

3.1.4反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测。

3.2对照PCR反应

3.2.1在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照、空白对照。各对照PCR反应体系中，除模板外其余组分及PCR反应条件与3.1相同，且阴性、阳性对照DNA模板浓度也应达到试样DNA模板浓度要求。

3.2.2以牛(普通牛、水牛)、猪、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子基因组DNA作为PCR反应体系的阴性对照模板。

3.2.3以羊(绵羊、山羊)基因组DNA作为PCR反应体系的阳性对照模板。

3.2.4以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。

4.PCR扩增产物的检测及结果判定

按30g/L的质量浓度称量琼脂糖，加入1×TAE缓冲液中，加热溶解，配制成琼脂糖溶液。每100mL琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12μLPCR产物与3μL加样缓冲液(称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h；称取250.0mg二甲苯腈蓝FF，加10mL水溶解；称取50.0g蔗糖，加30mL水溶解。混合以上三种溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存)混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样孔中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm～5V/cm条件下电泳15～30min后检测。

电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪上或紫外透射仪上成像。根据DNA分子量标准判断扩增条带的大小，将电泳结果形成电子文件存档或用照相***拍照。

5结果分析与表述

5.1对照检测结果分析

如图1所示，阳性对照的PCR反应中，羊的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，而阴性对照及空白对照中除引物二聚体外没有任何扩增片段，表明PCR反应体系工作正常。

5.2样品检测结果分析和表述

5.2.1若羊的特异性序列得到扩增，且扩增片段大小与预期片段大小一致，表明样品中检测出羊所述的特异性序列，表述为“样品中检测出羊源性成分”；若出现两条目的条带，判断为样品中检测出绵羊源性成分；若出现一条目的条带，判断为样品中检测出山羊源性成分。

5.2.2若羊的特异性序列未得到扩增，或扩增片段大小与预期片段大小不一致，表明样品中未检测出羊所述的特异性序列，表述为“样品中未检测出羊源性成分”。

实施例2灵敏度试验

分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的羊DNA为模板，按照实施例1的条件，扩增SEQIDNO.1核苷酸特异片段。结果如图2所示，0.1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。

实施例3检测羊源性制品中掺入非羊源性成分的引物组

本发明是对于动物源性成分的检测，通过各物种相应引物PCR扩增的情况，判断是否为或含有某物种的DNA，进而判定是否有某物种的动物源性成分掺入。

1样品中DNA的提取

各物种DNA的提取及保存方法同前实施例1中所述。

2引物的设计和筛选

为了寻找各物种特异的检测序列，我们从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行特异序列的筛选，通过与非本物种及本物种不同品种的核酸序列比对，筛选种内较保守、物种间特异的核苷酸序列作为检测分子。选取其中结果较好的序列分别设计各自物种引物序列，并通过实验进一步筛选特异性较好的引物用于后续试验。

一组猪、普通牛、水牛、羊、马属、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭的PCR鉴定用引物体系，由下列引物对组成：

(1)对猪基因组DNA进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对：

SUS-F：5′-GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3′

SUS-R：5′-TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3′；

(2)对普通牛基因组DNA进行扩增生成牛特异性扩增片段的引物对：

BOS-F：5′-CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3′

BOS-R：5′-CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3′；

(3)对水牛基因组DNA进行扩增生成水牛特异性扩增片段的引物对：

BUBALUS-F：5′-GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3′

BUBALUS-R：5′-CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3′；

(4)对羊基因组DNA进行扩增生成羊特异性扩增片段的引物对：

OVIS-F：5′-AGGTTCCAGCCTCACCAGTGA-3′

OVIS-R：5′-ACTGCTTGTGTCTCTGATGCCA-3′；

(5)对马属(马、驴)基因组DNA进行扩增生成马属特异性扩增片段的引物对：

EQUUS-F：5'-TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3'

EQUUS-R：5'-GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3'；

(6)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对：

OCU-F：5’-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3’

OCU-R：5’-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3’；

(7)对狐基因组DNA进行扩增生成狐特异性扩增片段的引物对：

VULPES-F：5'-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3'

VULPES-R：5'-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3'；

(8)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对：

CANIS-F：5’-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3’

CANIS-R：5’-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3’；

(9)对水貂基因组DNA进行扩增生成貂特异性扩增片段的引物对：

MUSTLA-F：5'-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3'

MUSTLA-R：5'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3'；

(10)对鼠(小鼠、大鼠、仓鼠)基因组DNA进行扩增生成鼠特异性扩增片段的引物对：

MUS_RAT_CRI-F：5’-CATCGTTGACAAGAAGGTGCTC-3’

MUS_RAT_CRI-R：5’-GAAAAAGCTGTACTTGGTGGGG-3’；

(11)对鸡基因组DNA进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对：

GALLUS-F：5'-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3'

GALLUS-R：5'-AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3'；

(12)对鸭基因组DNA进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对：

ANAS-F：5'-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3'

ANAS-R：5'-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3'。

3PCR检测

3.1为了方便检测，我们在保证各引物有效扩增且特异性良好的情况下，将反应体系进行了统一，同上述表1。3.2进行PCR反应的程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30次循环；4℃降温2min。

3.3在试样PCR反应的同时，设置阴性对照、阳性对照、空白对照。

3.4试验中涉及的物种有：羊(绵羊、山羊)、猪、普通牛、水牛、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子等。

3.5以双蒸水作为PCR反应体系的空白对照模板。

3.6反应结束后取出PCR管，对PCR反应产物进行电泳检测：该电泳过程及条件同实施例1中的电泳。

所得凝胶成像结果如图4所示。该方法以各物种特异性引物分别与各物种DNA模板进行PCR扩增反应，很好的验证了各物种特异性引物的有效性和特异性。由图4可以看出，各物种特异性引物均能很好的扩增出其对应物种的特异性大小的条带，而在非本物种中均未扩增出目的条带。

实施例4一种检测动物源性成分的试剂盒

该试剂盒的组成包括：

引物对(各物种引物对SEQIDNo.2&3和Ⅰ～XI各一份)；

2×TaqDNAMasterMix；

阳性对照DNA模板(绵羊、山羊、猪、普通牛、水牛、马、驴、兔、狐、狗、水貂、小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、鸭基因组DNA模板各一份)；

双蒸水。

本试剂盒-20℃储存12个月不影响使用效果。

试剂盒的应用方法：

1.依据以下的PCR反应体系加样，于200μL的EP管：

2×TaqDNAMasterMix(购自北京艾德莱生物科技有限公司)是将PCR反应所需的Taq酶、dNTP混合物、MgCl₂以及反应缓冲液预先配置成2倍浓度的混合物。

2.依据实施例1或实施例3的PCR扩增条件上样。

3.反应结束后取5μLPCR扩增产物，3.0％的琼脂糖凝胶电泳(技术参数：2V/cm～5V/cm，电泳15min～30min)，用溴化乙锭染色，凝胶成像***检测结果。

每个反应需设置空白对照和阳性对照，反应体系及扩增条件同受测样品。

实施例5一种检测动物源性成分试剂盒的应用

1.样品DNA提取、PCR及电泳方法与实施例1相同。

2.将该检测方法应用于市场中羊肉制品的检测，从市场中购买羊肉卷、羊肉串等各种羊肉制品，并记录其品牌等信息，提取总DNA，进行PCR反应，检测其中的真实组分。

3.用本发明的试剂盒对于市场中获取的21组样品(羊肉卷、羊肉串、羊肉泡馍等)进行了检测，所有产品在标签上均注明成分为羊肉，结果显示，其中16个是合格产品，但有5组的PCR检测结果与食品标签有所不同，如图5所示，是该5个产品的检测结果。检测结果表明，这5个产品均为鸭肉。

本发明的方法应用于食品检测将具有广阔的前景。除可对肉制品进行检测外，也可广泛应用于饲料、皮张制品和中药成分检测等领域。

Claims

1.羊特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的特异性引物，其特征在于，该引物序列如下：

OVIS-F：5′-AGGTTCCAGCCTCACCAGTGA-3′

OVIS-R：5′-ACTGCTTGTGTCTCTGATGCCA-3′；

3.含有权利要求1或2所述特异性引物的检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括以下引物中的一种或多种：

(1)对猪基因组DNA进行扩增生成猪特异性扩增片段的引物对：

SUS-F：5′-GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3′

SUS-R：5′-TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3′；

BOS-F：5′-CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3′

BOS-R：5′-CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3′；

BUBALUS-F：5′-GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3′

BUBALUS-R：5′-CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3′；

(4)对马属基因组DNA进行扩增生成马属特异性扩增片段的引物对：

EQUUS-F：5'-TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3'

EQUUS-R：5'-GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3'；

(5)对兔基因组DNA进行扩增生成兔特异性扩增片段的引物对：

OCU-F：5′-TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3′

OCU-R：5′-GCCTTAGAGTAGGGTCTTTTTGG-3′；

(6)对狐基因组DNA进行扩增生成狐特异性扩增片段的引物对：

VULPES-F：5'-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3'

VULPES-R：5'-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3'；

(7)对狗基因组DNA进行扩增生成狗特异性扩增片段的引物对：

CANIS-F：5′-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3′

CANIS-R：5′-GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3′；

(8)对水貂基因组DNA进行扩增生成水貂特异性扩增片段的引物对：

MUSTLA-F：5'-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3'

MUSTLA-R：5'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3'；

(9)对鼠基因组DNA进行扩增生成鼠特异性扩增片段的引物对：

MUS_RAT_CRI-F：5′-CATCGTTGACAAGAAGGTGCTC-3′

MUS_RAT_CRI-R：5′-GAAAAAGCTGTACTTGGTGGGG-3′；

(10)对鸡基因组DNA进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对：

GALLUS-F：5'-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3'

GALLUS-R：5'-AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3'；

(11)对鸭基因组DNA进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对：

ANAS-F：5'-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3'

ANAS-R：5'-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3'。

5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其特征在于，其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl₂、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照DNA模板为牛科羊亚科的山羊和绵羊基因组DNA模板，空白对照为双蒸水。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照DNA模板还包括猪、普通牛、水牛、马、驴、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡、鸭DNA模板中的一种或多种。

8.权利要求1或2所述的羊特异性引物或权利要求3～7任一项所述的检测试剂盒在羊源性成分鉴定或羊源性制品掺假检测中的应用。

9.羊源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的PCR检测方法，其步骤如下所述：

1)提取样品基因组DNA；

2)PCR检测：

A)用权利要求1或2所述的引物进行PCR扩增，并以牛科羊亚科的山羊和绵羊基因组DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

B)用权利要求4-7任一项所述的引物试剂盒进行PCR扩增，并以牛科羊亚科的山羊和绵羊基因组DNA模板、猪、普通牛、水牛、马、驴、兔、狐、狗、水貂、鼠、鸡或鸭DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；

3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。