CN105296454B - 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 - Google Patents
一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105296454B CN105296454B CN201410353590.6A CN201410353590A CN105296454B CN 105296454 B CN105296454 B CN 105296454B CN 201410353590 A CN201410353590 A CN 201410353590A CN 105296454 B CN105296454 B CN 105296454B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- algin
- algin catenase
- polynucleotides
- sequence
- algp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010004131 poly(beta-D-mannuronate) lyase Proteins 0.000 title abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 6
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 63
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 33
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 33
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 33
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 14
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 claims description 12
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 11
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 6
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 6
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 9
- 241000590028 Pseudoalteromonas haloplanktis Species 0.000 abstract description 7
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 abstract description 2
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 abstract description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 47
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 45
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 13
- 241000607284 Vibrio sp. Species 0.000 description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 6
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 6
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 4
- 239000000306 component Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N 0.000 description 1
- AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid;(2s)-2-aminopropanoic acid Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O.CC(C)C[C@H](N)C(O)=O AUXMWYRZQPIXCC-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ala-His Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O WQVFQXXBNHHPLX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N Arg-Gln-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PTVGLOCPAVYPFG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N Asn-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PTNFNTOBUDWHNZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N Asn-Asn-Glu Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LJUOLNXOWSWGKF-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KHCNTVRVAYCPQE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N Asp-Asp-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FANQWNCPNFEPGZ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000206575 Chondrus crispus Species 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000206672 Gelidium Species 0.000 description 1
- NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Cys Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NUSWUSKZRCGFEX-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N Ile-Leu-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IOVUXUSIGXCREV-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N WEMYTDDMDBLPMI-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N Phe-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YTILBRIUASDGBL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N Phe-Tyr-Tyr Chemical compound N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(O)=O KIQUCMUULDXTAZ-HJOGWXRNSA-N 0.000 description 1
- QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QMCDMHWAKMUGJE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N Ser-Ser-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DKGRNFUXVTYRAS-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 1
- ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N Tyr-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N ARJASMXQBRNAGI-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 1
- 241001609897 Vibrio sp. QY102 Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229920001284 acidic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004805 acidic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003766 bioinformatics method Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229910052927 chalcanthite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229910000357 manganese(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 229910052603 melanterite Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- -1 object Chemical class 0.000 description 1
- 238000010525 oxidative degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。揭示了一种海洋弧菌来源的褐藻胶裂解酶,其蛋白稳定性好,生物活性高。本发明还公开了褐藻胶裂解酶基因algp、含有褐藻胶裂解酶基因algp的载体和宿主细胞,以及重组表达褐藻胶裂解酶的方法。本发明的技术方案可以实现以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域,更具体地,本发明涉及一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。
背景技术
广袤无垠的海洋占据着地球71%的面积,是一个巨大的宝库,蕴藏的巨量的生物资源。海藻是其中一种重要的海洋植物,它是无机物的天然富集器,也是许多海洋活性物质的制造者。海藻多糖就是海藻中的一大类重要活性物质,目前国际上应用最广泛最多的海藻多糖是褐藻胶,卡拉胶和琼胶。
褐藻胶是源自于褐藻植物的细胞壁的水溶性酸性多糖,其主要由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸组成。随着研究的发现,褐藻胶的降解产物具有特别的化学活性与生物活性,在医药卫生、食品工业及化妆品行业等均存在巨大的应用价值。制备褐藻胶降解产物有多种方法,如酸法降解、超声降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相较于化学法制备反应温和、易于控制,耗能低,产物回收率较高以及不会产生严重的污染等优点,更多的研究聚焦于酶法降法制备褐藻胶低聚糖。
但是,目前由于大多数产褐藻胶裂解酶的菌株的活性较低,产量较低,阻碍了褐藻胶低聚糖的制备,进一步阻碍了研究与应用的深入进展。
因此,开发活性高、产量高的褐藻胶裂解酶、提高产褐藻胶裂解酶的菌株的活性成为了本技术领域的当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。
在本发明的第一方面,提供一种褐藻胶裂解酶,其是:
(a)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽;或
(b)将SEQ ID NO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个;较佳地1-10个;更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的,且具有(a)多肽活性的由(a)衍生的多肽;
(c)氨基酸序列与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90%以上(较佳地95%以上;更佳地98%以上;更佳地99%以上)相同性且具有(a)多肽活性的多肽;或
(d)具有(a)多肽功能的SEQ ID NO:2的蛋白片段。
在一个优选例中,所述的褐藻胶裂解酶来源于海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102。
在本发明的另一方面,提供一种分离的多核苷酸,该多核苷酸编码所述的褐藻胶裂解酶的多核苷酸。
在一个优选例中,所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明的另一方面,提供一种表达载体,它含有所述的多核苷酸。
在一个优选例中,所述的表达载体来源于pet28。
在本发明的另一方面,提供一种遗传工程化的宿主细胞,它含有所述的载体,或基因组中整合有所述的多核苷酸。
在一个优选例中,所述的宿主细胞是原核细胞,较佳地为大肠杆菌细胞,更佳地为HMS174(DE3)。
在本发明的另一方面,提供所述的褐藻胶裂解酶的用途,用于酶解褐藻胶。
在本发明的另一方面,提供一种生产褐藻胶裂解酶的方法,包括步骤:
(1)培养所述的宿主细胞,获得培养物;和
(2)从培养物中分离褐藻胶裂解酶。
在一个优选例中,所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞,所述的方法包括:
使所述宿主细胞在5L发酵罐中采用发酵培养基生长,生长到OD600=3±0.5时,开始补稀料,根据溶氧反馈缓慢提升补料速率,待1±0.2L稀料补完换成浓料进行补料;整个发酵过程控制溶氧在30±10%(较佳地30±5%);菌体生长到OD600=40±3时暂停补料,此时溶氧迅速回升,待停补料约10min后进行IPTG诱导,添加IPTG后维持30±5min后再进行补料,待菌体生长缓慢、酶活不再增长后停止发酵。
在另一优选例中,所述的发酵培养基的组分为:酵母粉2g/L,甘油5g/L,泡敌60μl/L,Na2HPO4 6g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,CaCl2溶液2ml/L,微量元素2ml/L;
所述的稀料的组分为:蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,甘油60g/L,MgSO41.25g/L;
所述的浓料的组分为:蛋白胨80g/L,酵母粉40g/L,甘油240g/L,MgSO45g/L;
所述各组分的用量在所指定数值基础上可浮动±20%(较佳地,浮动±10%;更佳地,浮动±5%)。
在本发明的另一方面,提供一种用于酶解褐藻胶的试剂盒,所述的试剂盒中包含所述的褐藻胶裂解酶。
本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、褐藻胶裂解酶基因algp的核苷酸序列。
图2、根据褐藻胶裂解酶基因algp的核苷酸序列推测的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明人经过长期的研究,首次揭示了一种海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102来源的褐藻胶裂解酶,其编码基因命名为algp。本发明的褐藻胶裂解酶蛋白稳定性好,生物活性高。本发明还公开了含有algp基因的表达载体和宿主细胞,以及表达该褐藻胶裂解酶的方法。根据本发明的技术方案,可以实现以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。
如本文所用,所述的“褐藻胶裂解酶活性”是以酶的活力单位来定义的。酶活力单位(U)定义为:在实验条件下,每分钟催化底物产生lμg还原糖所需的酶量。发酵液酶活力单位定义为:每毫升发酵液含酶活单位(U/m1)。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
如本文所用,“分离的褐藻胶裂解酶或多肽(蛋白)”是指褐藻胶裂解酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化褐藻胶裂解酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的褐藻胶裂解酶多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物,或是化学合成的产物,或使用重组技术从宿主(例如,细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。
本发明还包括褐藻胶裂解酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然褐藻胶裂解酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽,而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的,或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽,或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列,或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中,术语“褐藻胶裂解酶”指具有裂解褐藻胶的活性的SEQ ID NO:2序列的多肽。该术语还包括具有与褐藻胶裂解酶相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-20个,更佳地1-10个,还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括褐藻胶裂解酶的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与褐藻胶裂解酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽,如包含褐藻胶裂解酶或其片段的融合蛋白。
发明还提供褐藻胶裂解酶或多肽的类似物。这些类似物与天然褐藻胶裂解酶的差别可以是氨基酸序列上的差异,也可以是不影响序列的修饰形式上的差异,或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到,如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变,还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物,以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解,本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
在本发明中,“褐藻胶裂解酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
本发明还提供了编码本发明褐藻胶裂解酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质,但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO:2的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体,其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和***变异体。如本领域所知的,等位变异体是一个多核苷酸的替换形式,它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或***,但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少80%(如85%,90%,95%,99%)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用,“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸,较好是至少30个核苷酸,更好是至少50个核苷酸,最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码褐藻胶裂解酶的多聚核苷酸。
本发明的褐藻胶裂解酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据本发明所公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或褐藻胶裂解酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的褐藻胶裂解酶。一般来说有以下步骤:
(1).用本发明的编码褐藻胶裂解酶的多核苷酸(或变异体),或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞;
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞;
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中,褐藻胶裂解酶多核苷酸序列可***到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之,只要能在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含褐藻胶裂解酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如植物细胞。代表性例子有:大肠杆菌,链霉菌属、农杆菌;真菌细胞如酵母;植物细胞等。
在本发明的优选实施例中,将本发明的褐藻胶裂解酶基因algp用于制备大肠杆菌表达载体pet28-algp,进而制备获得大肠杆菌重组株SW(DE3)。本发明制备的大肠杆菌重组表达菌株SW(DE3)表达水平高,能稳定分泌至胞外上清中,更利于纯化。且多次传代后表达量未有降低。因此,这是一株较为理想的高产菌株。
如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明提供的来源于海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102的褐藻胶裂解酶是首次被揭示的。本发明基于新发现的褐藻胶裂解酶提供的表达***和表达方法,用其生产的褐藻胶裂解酶稳定性好,活性高。
本发明的大肠杆菌重组菌株SW(DE3)所表达的重组褐藻胶裂解酶表达水平高,能稳定分泌至胞外上清中,更利于纯化。且多次传代后表达量未有降低,所以通过本发明可以以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施列1、褐藻胶裂解酶基因algp部分序列的克隆
使用简并引物以海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102的基因组为模板进行聚合酶链反应(PCR)克隆褐藻胶裂解酶基因algp,具体操作为:在LB培养基中过夜培养Vibrio sp.QY102,使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。使用如下简并引物(其中,N=A或C或G或T,R=A或G,Y=C或T,B=C或G或T):
p1:5’-CGNTCNGARCTNCGNGARATG-3’(SEQ ID NO:3),
p2:5’-YTGRTTRTABACBCCBGCYTT-3’(SEQ ID NO:4);
进行梯度PCR反应,条件为:95℃预变性5min,随后95℃30s、45℃-65℃30s、72℃1min进行30个循环,最后在72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在550bp左右有一明亮的特异性条带。将该条带切下,经琼脂糖凝胶电泳回收后连接pMD19-T载体(Takara)中后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌top10菌株中,涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上,过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养,使用通用引物M13进行PCR验证,正确后将阳性转化子送去测序。通过生物信息学分析该质粒所含的片段确为褐藻胶裂解酶基因的部分序列。
将该阳性转化子命名为pMD19-T-algpp/Top10,将其含有的质粒命名为pMD19-T-algpp。
实施列2、褐藻胶裂解酶基因algp全长的克隆
根据得到的褐藻胶裂解酶algp的部分序列设计染色体步移引物,获取下游片段的引物分别为:
ald1:5’-AGGTCGTTTCATTATCGGTCAG-3’(SEQ ID NO:5),
ald2:5’-AGATCCATGACCAAGATGATGAG-3’(SEQ ID NO:6),
ald3:5’-AGCCAATTCGTTTGTACTACCG-3’(SEQ ID NO:7)。
获取上游片段的引物分别为:
alu1:5’-CGGTAGTACAAACGAATTGGCTC-3’(SEQ ID NO:8),
alu2:5’-TCATCATCTTGGTCATGGATCTG-3’(SEQ ID NO:9),
alu3:5’-TGACCGATAATGAAACGACCTAC-3’(SEQ ID NO:10)。
根据Takara公司的染色体步移试剂盒说明书对获取上下游片段分别进行3轮PCR反应,经凝胶电泳后获得褐藻胶裂解酶基因algp的部分序列的上游片段约1800bp,下游片段约2500bp。将2个片段分别连接pMD19-T载体后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌Top10菌株中,涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上,过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养,使用通用引物M13进行PCR验证,正确后将阳性转化子送去测序。
将测序结果与已获得的褐藻胶裂解酶基因algp的部分序列进行比对拼接,再通过生物信息学方法确定褐藻胶裂解酶基因algp的开放阅读框,得到褐藻胶裂解酶基因algp的序列(图1),序列全长(含终止子)1581bp(SEQ ID NO:1),编码一个含有526个氨基酸的蛋白质(图2)(SEQ ID NO:2)。
实施列3、褐藻胶裂解酶基因algp表达载体的构建
根据得到的褐藻胶裂解酶基因algp全序列设计:
上游引物algexf:5’-AACCGGATCCATGAAACATATTTTTCTAAA-3’(SEQ ID NO:11),
下游引物algexr:5’-GCATCTCGAGTTTACCAGTGTATGTATCATG-3’(SEQ ID NO:12)。
用PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因全序列。该PCR条件为95℃预变性5min,随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环,最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1550bp左右处有一特异性条带,将其从琼脂糖凝胶上切下,用BamHI和XhoI酶切,琼脂糖凝胶电泳回收1550左右的DNA片段。
将大肠表达载体pET-28a同样用BamHI和XhoI酶切,琼脂糖凝胶电泳回收5300bp的DNA片段,将其与上述所得1550bp的DNA片段连接后,按照标准的氯化钙法转化入大肠杆菌Top10中,筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证,PCR验证程序为95℃预变性5min,随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环,最后在72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳显示在1600bp左右有正确条带的为阳性转化子,将对应的正确的菌株送测序,测序显示序列正确,质粒构建正确。
将该阳性转化子命名为pET28a-algp/Top10,含有的质粒命名为pET28a-algp。
实施例4、能高效表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌株SW(DE3)的构建
将表达载体pET28a-algp按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌HMS174(DE3)(购自上海宜腾生物科技有限公司)中,筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证,PCR验证程序为95℃预变性5min,随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环,最后在72℃延伸10min。
琼脂糖凝胶电泳显示,在1600bp左右有正确条带的为阳性转化子,将阳性转化子命名为SW(DE3)。
实施例5、利用大肠杆菌重组株SW(DE3)生产重组褐藻胶裂解酶
挑取大肠杆菌重组株SW(DE3)单克隆接种在5mL含有硫酸卡那霉素的LB培养基中,37℃,200r/min培养过夜,再将过夜培养的菌株1:100接种于3个100mL含有硫酸卡那霉素的LB培养基中培养5小时后1:10接种于5L发酵罐中。
5L发酵罐装液量3L。
发酵培养基组分为:酵母粉2g/L,甘油5g/L,泡敌60μl/L,Na2HPO46g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,CaCl2溶液2ml/L,微量元素2ml/L。
CaCl2溶液:10g无水CaCl2溶于1L去离子水中。
微量元素:FeSO4·7H2O 4.8g/L,MnSO4·H2O 2.4g/L,ZnSO4·7H2O 2.4g/L,CuSO4·5H2O 0.96g/L,1M H2SO4 2ml/L。
补料培养基:
稀料:蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,甘油60g/L,MgSO4 1.25g/L。
浓料:蛋白胨80g/L,酵母粉40g/L,甘油240g/L,MgSO4 5g/L。
发酵调控过程为:首先进行批培养,利用发酵培养基原有的营养成分进行培养,待菌体生长到约OD600=3左右,培养基初始营养耗完此时开始补稀料,根据溶氧反馈(使溶氧保持在30%左右波动)缓慢提升补料速率,待稀料补完换成浓料进行补料(5L罐发酵时,稀料配1L,待1L稀料都补完时换成浓料进行补料)。整个发酵过程控制溶氧在30%左右。菌体生长到OD600=40左右暂停补料,此时溶氧迅速回升,待停补料约10min后进行IPTG添加,添加后维持30min后再进行补料,期间进行酶活与菌浓的测定,待菌体生长缓慢、酶活不再增长后下罐放料。
酶活测定方法为:
800μl底物(0.3%(w/v)褐藻酸钠溶解于50mM pH7.1磷酸盐缓冲液中,加入200μl酶液,在40℃反应10min后加入0.5ml DNS试剂沸水浴煮沸5min后流水冷却,加入4ml去离子水。最后测定反应体系在540nm的光吸收值。空白对照:800μl底物中加入200μl去离子水测定。
最终胞外蛋白酶活数据最高达到 1941U/ml,为海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102菌株(野生型的QY102菌株)所产酶活的22.37倍,胞内蛋白酶活数据最高达到2731U/ml,为海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102菌株所产酶活的31.48倍,胞内胞外蛋白总酶活数据最高达到4276U/ml,为海洋弧菌(Vibrio sp.)QY102菌株所产酶活的49.29倍。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种褐藻胶裂解酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶。
3.如权利要求2所述的多核苷酸,其特征在于,该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.一种表达载体,其特征在于,它含有权利要求2所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞,其特征在于,它含有权利要求4所述的载体,或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。
6.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的用途,用于酶解褐藻胶。
7.一种生产褐藻胶裂解酶的方法,其特征在于,包括步骤:
(1)培养权利要求5所述的宿主细胞,获得培养物;和
(2)从培养物中分离褐藻胶裂解酶。
8.如权利要求7所述的方法,其特征在于,所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞,所述的方法包括:
使所述宿主细胞在5L发酵罐中采用发酵培养基生长,生长到OD600=3±0.5时,开始补稀料,根据溶氧反馈缓慢提升补料速率,待1±0.2L稀料补完换成浓料进行补料;整个发酵过程控制溶氧在30±10%;菌体生长到OD600=40±3时暂停补料,此时溶氧迅速回升,待停补料约10min后进行IPTG诱导,添加IPTG后维持30±5min后再进行补料,待菌体生长缓慢、酶活不再增长后停止发酵;其中,所述的稀料的组分为:蛋白胨20g/L,酵母粉10g/L,甘油60g/L,MgSO4 1.25g/L;所述的浓料的组分为:蛋白胨80g/L,酵母粉40g/L,甘油240g/L,MgSO4 5g/L,所述各组分的用量在所指定数值基础上在±20%浮动。
9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基的组分为:酵母粉2g/L,甘油5g/L,泡敌60μl/L,Na2HPO4 6g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1g/L,NaCl 0.5g/L,MgSO4 0.5g/L,CaCl2溶液2ml/L,微量元素2ml/L;所述各组分的用量在所指定数值基础上在±20%浮动。
10.一种用于酶解褐藻胶的试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒中包含权利要求1所述的褐藻胶裂解酶。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410353590.6A CN105296454B (zh) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201410353590.6A CN105296454B (zh) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105296454A CN105296454A (zh) | 2016-02-03 |
CN105296454B true CN105296454B (zh) | 2019-06-07 |
Family
ID=55194286
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410353590.6A Expired - Fee Related CN105296454B (zh) | 2014-07-23 | 2014-07-23 | 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105296454B (zh) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107083379B (zh) * | 2017-06-16 | 2020-10-02 | 江西天元药业有限公司 | 一种制备高特异性褐藻寡糖的酶 |
CN109295043B (zh) * | 2018-10-19 | 2021-02-05 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 |
CN110331122B (zh) * | 2019-07-24 | 2021-05-28 | 江南大学 | 一种分泌表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌及其应用 |
CN110257410B (zh) * | 2019-07-24 | 2023-06-13 | 江南大学 | 一种编码褐藻胶裂解酶的基因 |
CN111304181B (zh) * | 2020-02-17 | 2021-11-23 | 华东理工大学 | 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用 |
CN111500565A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-07 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 褐藻胶裂解酶alb00773及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用 |
CN111518795A (zh) * | 2020-05-06 | 2020-08-11 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 褐藻胶裂解酶alb02668及基因、重组质粒、工程菌株和在拮抗病原微生物中的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102586216A (zh) * | 2012-03-15 | 2012-07-18 | 华东理工大学 | 一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法 |
-
2014
- 2014-07-23 CN CN201410353590.6A patent/CN105296454B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102586216A (zh) * | 2012-03-15 | 2012-07-18 | 华东理工大学 | 一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
alginate lyase [Vibrio litoralis];GenBank;《GenBank:WP_027696597》;20140612;第1页 |
海洋弧菌Vibrio sp.QY102产褐藻胶裂解酶的发酵工艺优化;周久顺;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140615(第06期);摘要 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN105296454A (zh) | 2016-02-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105296454B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达 | |
CN111748549B (zh) | 新的赖氨酸脱羧酶突变体及其应用 | |
CN108239633A (zh) | 一种催化活性得到提高的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 | |
CN114181321B (zh) | 花鲈fgf6a、fgf6b以及fgf18重组蛋白及其制备方法和应用 | |
CN105713883A (zh) | 一种l-脯氨酸-4-羟基化酶及其应用 | |
CN107177641A (zh) | 新的赖氨酸脱羧酶及其应用 | |
CN107937408B (zh) | 斜带石斑鱼insulin基因、编码蛋白及其应用 | |
CN101942422B (zh) | 粘质沙雷氏菌d-乳酸脱氢酶基因,克隆、表达重组菌株及重组酶的研究 | |
CN104278015B (zh) | 一株高效过表达内源虾青素合成酶基因的法夫酵母菌株 | |
CN108239632A (zh) | 一种热稳定性得到改善的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体及其应用 | |
CN104119445A (zh) | 含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用 | |
CN102747060B (zh) | D-氨甲酰水解酶的突变体及其制备方法和应用 | |
CN112522222B (zh) | 一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用 | |
CN106701800B (zh) | 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用 | |
CN108753810B (zh) | 一种转录调节蛋白基因orf2的用途 | |
CN108424943A (zh) | 一种生产2’-脱氧-2’-氟-β-D-***糖腺苷酸的方法 | |
CN105693835B (zh) | 一种水稻粒型相关蛋白gif1及其编码基因与应用 | |
CN111849949B (zh) | 一种甘露糖醛酸c-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用 | |
KR101724614B1 (ko) | 신규 카탈라아제 신호서열 및 이를 이용한 카탈라아제 발현방법 | |
CN106318920A (zh) | 黄酮‑6‑羟化酶及其在灯盏乙素合成中的应用 | |
KR20110123949A (ko) | 토마토로부터 유래한 3’-o-메틸전이효소, 그의 유전자 및 그들의 제조방법과 이들을 이용하여 만든 미생물로부터 크리소에리올, 아이소람네틴을 생산하는 방법 | |
CN104119448A (zh) | 含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用 | |
TWI313300B (en) | Saponin-decomposing enzyme, gene thereof and large-scale production system for producing soyasapogenol | |
CN104119447A (zh) | 含有富含亮氨酸重复序列的融合蛋白及其制法和应用 | |
CN109517814A (zh) | 有机磷降解酶的突变体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20190607 |