CN105287611A - 人参皂苷Rh2在抑制Treg细胞中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参皂苷Rh2的用途,具体地,本发明证实了人参皂苷可用于(a)制备抑制Treg细胞的抑制剂;或(b)制备预防和/或治疗Treg细胞升高性肿瘤的组合物。本发明证明了人参皂苷Rh2还能够通过抑制Treg细胞,从而改善人体内T细胞的平衡,进一步加强自身免疫功能,从而达到抗肿瘤或改善免疫缺陷性疾病的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物制药技术领域,本发明提供了人参皂苷Rh2在抑制Treg细胞中的应用及其制备方法。具体地,本发明公开了人参皂苷Rh2通过抑制Treg细胞,从而增强T细胞抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长,以改善机体免疫功能的方法及应用。
背景技术
肿瘤是目前危害人类健康最严重的疾病之一,据WHO统计,肿瘤已成为威胁人类生命健康的头号杀手。国内外对恶性肿瘤防治的研究投入了大量的人力、物力和财力,但至今尚未取得根本性的突破。传统的化学药物治疗和手术、放疗等结合,虽然成功提高了多种恶性肿瘤的治愈率,但是由于较强的副作用以及耐药性,使得寻找新的***的研究刻不容缓。
中药是中医治病的物质基础,中药在治疗癌症中具有多方位、多靶点、不易产生耐药性等优势,符合肿瘤多因素、多环节治病的机理,但是针对中药抗肿瘤的有效成分的提取及作用机理的研究,较难明确。
人参为五加科植物人参的干燥根,《神农本草经》将人参列为上品,具有主补五脏,安精神,定魂魄,止惊悸,除邪气,明目开心益智,久服轻身延年的功效。人参主要化学成分为人参皂苷、人参多糖和挥发油类。现代药理与临床研究表明,人参的活性成分具有诱导肿瘤细胞凋亡、阻滞肿瘤细胞周期、抑制肿瘤细胞增殖,抑制肿瘤细胞的转移和血管生长、降低肿瘤细胞的多药耐药性。人参的主要活性成分为人参皂苷,人参皂苷按苷元不同可分为:原人参二醇型(PPD)、原人参三醇型(PPT)和齐墩果烷型(OA)。人参中二醇型皂苷较三醇型皂苷含量高。如人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd是白参中主要成分,而人参皂苷Rh2是红参中特有成分,白参中几乎没有。人参皂苷还对肿瘤细胞具有诱导分化作用,但其具体作用机制尚不清。
因此,本领域迫切需要了解人参皂苷在肿瘤治疗领域的作用模式及应用价值,以开发新的肿瘤治疗药物。
发明内容
本发明提供了人参皂苷Rh2通过抑制Treg细胞从而抑制肿瘤的应用。
本发明第一方面,提供了一种人参皂苷Rh2的用途,用于(a)制备抑制Treg细胞的抑制剂;或(b)制备预防和/或治疗Treg细胞升高性肿瘤的组合物。
在另一优选例中,所述抑制Treg细胞包括抑制Treg细胞的分化、增殖、和/或表达。
在另一优选例中,所述的组合物包括药物组合物、食品组合物和/或保健品组合物。
在另一优选例中,所述的组合物包括人参皂苷Rh2作为活性成分,和药学上/食品学上可接受的载体。
在另一优选例中,所述人参皂苷Rh2d在70mg/kg·d的安全剂量内施用于哺乳动物。
在另一优选例中,所述的组合物通过选自下组的用药方式进行给药:口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药;较佳地,所述的组合物通过口服或静脉注射施药。
在另一优选例中,所述的组合物的制剂选自下组:片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。
在另一优选例中,所述的组合物还含有任选的抗肿瘤药物。
在另一优选例中,所述的抗肿瘤药物选自下组的一种或多种:烷化剂、抗代谢物、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物以及相关抑制剂、长春花碱类、表鬼臼毒素(epipodopyvllotoxins)、抗生素、L-天冬酞胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位复合物、大黄素取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕激素、***、抗***、雄激素、抗雄激素以及***-释放激素类似物。
在另一优选例中,所述的人参皂苷Rh2包括:
20(S)-人参皂苷Rh2:即20(S)-原人参二醇-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、20(R)-人参皂苷Rh2:即20(R)-原人参二醇-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、或其组合。
在另一优选例中,所述20(S)-人参皂苷Rh2的结构式如式I所示:
在另一优选例中,所述的20(R)-人参皂苷Rh2的结构式如式II所示:
在另一优选例中,所述的人参皂苷Rh2通过以下步骤制备:
将所述的植物茎叶总皂苷或原人参二醇组皂苷溶入有机酸或无机酸的水溶液或醇溶液中,进行酸水解反应,然后收集反应物。
在另一优选例中,所述的Treg细胞升高性肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
在另一优选例中,所述的人参皂苷Rh2还用于制备治疗Treg细胞升高造成的免疫缺陷性疾病的药物组合物。
在另一优选例中,所述由于Treg细胞升高造成的免疫缺陷性疾病包括自身免疫性胃炎、关节炎、腮腺炎、结肠炎、***反应性脑炎和糖尿病。
在另一优选例中,所述的Treg细胞升高指的是Treg细胞的总数或占T细胞总数白分比分别比正常人群Treg细胞的总数或占T细胞总数百分比高一倍以上。
在另一优选例中,本发明还提供了一种Treg细胞抑制剂组合物,所述的组合物含有安全有效量的人参皂苷Rh2,和药学上和/或食品学上可接受的载体。
本发明第二方面,提供了一种体外非治疗性的抑制Treg细胞的方法,在人参皂苷Rh2存在下培养Treg细胞,或将人参皂苷Rh2与Treg细胞接触,从而抑制Treg细胞。
在另一优选例中,所述人参皂苷Rh2的浓度为0.01-1000μg/ml,较佳地,为5-500μg/ml,更佳地,为20-200μg/ml。
本发明第三方面,提供了一种体外非治疗性的抑制Treg细胞升高性肿瘤的方法,在人参皂苷Rh2存在下培养Treg细胞升高性肿瘤细胞,或将人参皂苷Rh2与Treg细胞接触,从而抑制Treg细胞升高性肿瘤。
在另一优选例中,所述的肿瘤细胞来自以下一种或多种肿瘤:卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
本发明第四方面,提供了一种制备Treg细胞抑制剂的方法,将人参皂苷Rh2与药学上和/或食品学上可接受的载体混合,从而制备成Treg细胞抑制剂。
在另一优选例中,所述的Treg细胞抑制剂还能进一步抑制Treg细胞升高性肿瘤。
本发明第五方面,提供了一种抑制Treg细胞和/或抑制Treg细胞升高性肿瘤和/或抑制Treg细胞升高引起的免疫缺陷性疾病的方法,包括步骤:(i)测定患有肿瘤和/或自身免疫缺陷疾病的对象样本中Treg细胞占T细胞总数的比例V1;和(ii)当V1≥2倍正常值或对照值V0时,向所述的对象施用安全有效量的人参皂苷Rh2。
在另一优选例中,所述的样本为血液样本,较佳地,为全血样本。
在另一优选例中,所述的对照值或正常值V0为正常无患病人群的Treg细胞占T细胞总数的比。
在另一优选例中,所述需要的对象为哺乳动物,较佳地为小鼠、大鼠和人。
在另一优选例中,所述安全有效量的人参皂苷Rh2的剂量为70mg/kg·d。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示TIDA建模方式。实验组1、2的BALB/c小鼠,分别灌胃给予生理盐水、4.5mg/KgRh2单体。在第4天分别在皮下注入LLC细胞(100uL,106细胞/只)建立肿瘤小鼠模型。
图2显示小鼠全血中Treg含量分析图。图2A显示小鼠全血中Treg流式细胞检测结果图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肿瘤小鼠,植入LCC细胞4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。图2B显示小鼠全血中Treg含量统计结果柱状图。正常代表正常小鼠,0mg/kg代表肿瘤小鼠,4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。
图3显示小鼠脾脏中Treg流式结果及Treg含量分析图。图3A显示小鼠脾脏中Treg流式细胞检测结果图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肿瘤小鼠,植入LCC细胞4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。图3B显示小鼠脾脏中Treg流式统计结果柱状图。正常代表正常小鼠,0mg/kg代表肿瘤小鼠,4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。
图4显示各个肿瘤模型小鼠Treg细胞在不同浓度Rh2下的比例。正常代表正常小鼠,LLC肺癌荷瘤小鼠0ug/mL代表肺癌肿瘤小鼠,肾癌荷瘤小鼠0ug/mL代表肾癌肿瘤小鼠;5、10、20、40代表不同浓度的Rh2给药处理。
图5显示小鼠原代Treg细胞在不同Rh2浓度下比例变化图。正常mice代表正常小鼠,LLC肺癌荷瘤小鼠0ug/mL代表肺癌肿瘤小鼠,肾癌荷瘤小鼠0ug/mL代表肾癌肿瘤小鼠;5、10、20、40代表不同浓度的Rh2给药处理。
图6显示小鼠的建模方式。分别为:正常小鼠组、LLC小鼠肺癌细胞植瘤-TIAA(给药后植瘤)建模小鼠组、LLC小鼠肺癌细胞植瘤-TIDA(给药期间植瘤)建模小鼠组、Renca小鼠肺癌细胞植瘤-TIAA(给药后植瘤)建模小鼠组、Renca小鼠肺癌细胞植瘤-TIDA(给药期间植瘤)建模小鼠组。
图7显示小鼠全血中Treg细胞的表达变化。图7为正常小鼠、两种建模方式下LLC、Renca植瘤的四种模型小鼠,及建立在此基础上的给药组小鼠实验结果,图片标明这几组小鼠全血中Treg的变化。图7A显示小鼠全血中Treg细胞流式细胞检测结果图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肺癌肿瘤小鼠,Rencacellimplanted0mg/kg代表肾癌肿瘤小鼠;TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5mg/kg、4.5mg/kg代表Rh2给药浓度。图7B为小鼠全血中Treg细胞统计结果柱状图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肺癌肿瘤小鼠,植入肾癌细胞0mg/kg代表肾癌肿瘤小鼠;TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。
图8显示正常小鼠、两种建模方式下肺癌、肾癌植瘤的四种模型小鼠,及建立在此基础上的给药组小鼠脾脏中Treg细胞的变化趋势。图8A显示小鼠脾脏中Treg细胞流式细胞检测结果图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肺癌肿瘤小鼠,Rencacellimplanted0mg/kg代表肾癌肿瘤小鼠;TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5mg/kg、4.5mg/kg代表Rh2给药浓度。图8B显示小鼠脾脏中Treg细胞统计结果柱状图。正常代表正常小鼠,植入LCC细胞0mg/kg代表肺癌肿瘤小鼠,Rencacellimplanted0mg/kg代表肾癌肿瘤小鼠;TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。
图9显示不同模型小鼠在不同给药浓度下的肿瘤大小。图9显示第十天各组小鼠肿瘤大小,植入LCC细胞0mg/kg代表肺癌肿瘤小鼠,Rencacellimplanted0mg/kg代表肾癌肿瘤小鼠;TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。
图10显示给药后TIAA#肺癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(LLC)生长曲线。纵坐标为肿瘤体积,横坐标为给药天数。
图11显示给药后TIDA#肺癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(LLC)生长曲线。
图12显示给药后TIAA#肾癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(Renca)生长曲线。
图13显示给药后TIDA#肾癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(Renca)生长曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,首次意外地发现,在肿瘤发生诸多复杂的机制中,人参皂苷Rh2除了通过现有技术中已知的促进肿瘤细胞凋亡以外,本发明还证明了人参皂苷Rh2还能够通过抑制Treg细胞,从而改善人体内T细胞的平衡,进一步加强自身免疫功能,从而达到抗肿瘤的效果。实验证明,人参皂苷Rh2在体外及体内均对Treg细胞有较高的抑制作用,且还能够有效地预防荷瘤后的Treg细胞增高,从而达到治疗或预防肿瘤的目的。在此基础上,完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“Treg细胞升高性肿瘤”、或“Treg细胞升高引起的免疫缺陷性疾病”指的是主要由于Treg细胞升高而造成的肿瘤或免疫缺陷性疾病。在应用时,可通过测定确诊肿瘤或免疫缺陷性疾病对象的样本(例如全血样本)中Treg细胞在T细胞中所占的比例(即V1),并将V1与对照值或正常值V0比较,当V1≥2V0时,则说明该对象为Treg细胞升高性肿瘤或为Treg细胞升高引起的免疫缺陷性疾病患者。
优选地,所述的Treg细胞升高性肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、黑色素瘤。
Treg细胞升高引起的免疫缺陷性疾病包括自身免疫性胃炎、关节炎、腮腺炎、结肠炎、***反应性脑炎和糖尿病。
人参皂苷Rh2
在本发明中,人参皂苷Rh2为抑制Treg细胞的活性成分。
人参皂苷Rh2(ginsenosideRh2,简称GS-Rh2)是从人参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。人参皂苷Rh2是人参皂苷主要活性物质经水解后,最后产物中抑制癌细胞增殖作用的能力最强的成分,具备良好的抗肿瘤活性功能,抑制肿瘤癌细胞生长。人参皂苷Rh2可以有效增强单核巨噬细胞的吞噬功能,诱发肿瘤癌细胞凋亡。Rh2的HK细胞活性功能,诱导肿瘤癌细胞分化。
可用于本发明的人参皂苷Rh2优选包括20(S)-人参皂苷Rh2、20(R)-人参皂苷Rh2,其结构式如下所示:
本发明通过大量实验发现,在体外,人参皂苷Rh2可通过直接抑制Treg细胞的分化、增殖从而降低Treg细胞的数量,在体内,人参皂苷Rh2也能够通过抑制Treg细胞,从而有效地预防和治疗恶性肿瘤。因此,本发明证实,人参皂苷Rh2不仅可以用于直接抑制Treg细胞从而***,更可以通过提高免疫力降低放化疗的毒性,有效地减小放化疗的痛苦程度。此外,由于Treg细胞在免疫缺陷性疾病中也起到相同的作用,因此人参皂苷Rh2也能够通过抑制Treg细胞并调节免疫***平衡,从而达到增强人体免疫力的效果。
T细胞
T细胞参与细胞免疫,是淋巴细胞的主要组分,它具有多种生物学功能,如直接杀伤靶细胞,辅助或抑制B细胞产生抗体,对特异性抗原和促有丝***原的应答反应以及产生细胞因子等,是身体中为抵御疾病感染、肿瘤而形成的英勇斗士。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫,细胞免疫的效应形式主要有两种:与靶细胞特异性结合,破坏靶细胞膜,直接杀伤靶细胞;另一种是释放淋巴因子,最终使免疫效应扩大和增强。
T细胞按照功能和表面标志可以分成很多种类,目前,接受较为广泛的T细胞分类如下:
细胞毒T细胞(cytotoxicTcell):消灭受感染的细胞。这些细胞的功能就像一个“杀手”或细胞毒素,因为它们可以对产生特殊抗原反应的目标细胞进行杀灭。细胞毒T细胞的主要表面标志是CD8,也被称为杀手T细胞(NK细胞)。CD8+T细胞,其表面表达CD8,可以通过MHCI与抗原直接结合参与免疫应答。
辅助T细胞(helperTcell)在免疫反应中扮演中间过程的角色:它可以增生扩散来激活其它类型的产生直接免疫反应的免疫细胞。辅助T细胞的主要表面标志是CD4。T细胞调控或“辅助”其它淋巴细胞发挥功能。它们是已知的HIV的目标细胞,在艾滋病发病时会急剧减少。CD4+T细胞,在表面表达CD4(clusterofdifferentiation4),通过与MHCⅡ(主要组织相容性复合体,majorhistocompatibilitycomplex)递呈的多肽抗原反应被激活。一旦激活,可以分泌细胞因子,调节或者协助免疫反应。
调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg):负责调节机体免疫反应。通常起着维持自身耐受和避免免疫反应过度损伤机体的重要作用。调节/抑制T细胞有很多种。
记忆T细胞(memoryTcell):在再次免疫应答中起重要作用。记忆T细胞由于暂时没有非常特异的表面标志,还有很多未知之处。
调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)
调节性T细胞(regulatoryTcell,Treg)是一类具有独特免疫调节功能的T细胞,在肿瘤免疫、抗感染免疫、免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫反应和维持机体免疫平衡等方面具有重要意义。
Treg细胞在体内外具有调节功能,根据其表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同,Treg细胞可分为CD4+Th3、CD4+Tr1、CD4+CD25+Treg、CD4-CD8+Ts和NKT(自然杀伤性T细胞)等多种亚型。在这些种类繁多的调节性T细胞中,CD4+CD25+Treg细胞处于极为重要的地位。CD4+CD25+Treg细胞具有免疫无能性和免疫抑制性两大功能特征,其免疫无能性表现在对高浓度IL-2的单独刺激、固相包被或可溶性抗CD3单抗或抗CD3和抗CD28单抗的联合作用呈无应答状态,也不分泌IL-2,也就是说CD4+CD25+Treg细胞对所有传统的T细胞受体(T-cellreceptor,TCR)介导的实验性刺激因素均表现为无能性。而免疫抑制性则表现在活化后能够强有力地抑制CD4+和CD8+效应T淋巴细胞的活化、增殖及功能,这种免疫抑制不具有MHC限制性。
机体肿瘤状态时Treg细胞往往呈升高趋势,Treg是具有能识别靶细胞MHC分子所提呈的TCR自身抗原肽,并能发挥一定的免疫抑制功能的T细胞。它作为一种专职的Treg细胞亚群,主要发挥免疫抑制功能,通过下调机体对外来抗原或自身抗原的免疫应答水平,来维持自身耐受。
肿瘤患者体内Treg细胞增高的机制:
(1)肿瘤组织分泌的某些细胞因子能将CD4+CD25T细胞直接转变为CD4+CD25+Treg;
(2)肿瘤细胞能表达CCL22趋化因子,促使表达趋化因子C-C-基元受体4(CCR4)、趋化因子C-C-基元受体8(CCR8)的CD4+CD25+Treg迁移到肿瘤微环境;
(3)肿瘤组织大量释放肿瘤相关抗原(TAAs),能被耐受性树突状细胞如pDC或imDC所捕获并提呈给Treg细胞识别,从而引起了Treg细胞的活化、增殖;
(4)经肿瘤抗原刺激后,Treg细胞表达淋巴归巢分子CCR7和CD62L,从外周血回到***,通过细胞***快速积聚。
上述结果导致了由肿瘤抗原诱导的、Treg介导的特异性免疫抑制。
Treg发挥肿瘤免疫抑制作用,主要发生在两个部位:一是在肿瘤引流***内,这些大量增殖的Treg细胞相应地抑制了同一***中效应细胞的增殖;二是在肿瘤组织内,增加的Treg细胞抑制了TIL中效应T细胞杀伤肿瘤细胞的功能。
Treg细胞发挥抑制作用的分子基础主要由:
(1)通过CTLA4依赖的直接细胞接触抑制方式来抑制效应细胞的功能;
(2)分泌抑制性细胞因子如TGF-β或IL-10来抑制CD4+T细胞的活化和增殖,或者CD8+效应细胞及前体;
(3)作用APC增加色氨酸新陈代谢来抑制CD4+T细胞的活化和增殖;
(4)Treg细胞形成使效应细胞转变成免疫抑制细胞的微环境,使一些CD4+CD25T细胞能被CD4+CD25+Treg诱导并分泌TGF-β或IL-10。
Treg细胞可能还依赖这种局部微环境干扰CD8+T细胞的增殖、细胞因子的分泌和细胞毒作用的能力。同时,Treg细胞的增加可以促进肿瘤的生长,抑制肿瘤免疫效应。Treg细胞介导的免疫抑制干预了免疫应答的各个阶段。
目前,已经确定在肿瘤发生或发展过程中会伴随Treg细胞增长的肿瘤包括(但不限于)卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、或黑色素瘤。因此,可采用本发明人参皂苷Rh2对上述Treg细胞升高性的肿瘤进行预防、治疗或辅助治疗。
组合物和施用方法
如本文所用,术语“组合物”包括(a)抑制Treg细胞的抑制剂;或(b)制备预防和/或治疗Treg细胞升高性肿瘤;和/或(c)制备预防和/或治疗由于Treg细胞升高造成的免疫缺陷性疾病的组合物。
人参皂苷Rh2具有抑制Treg细胞的作用。因此,当在治疗上施用或给予人参皂苷Rh2时,可抑制Treg细胞的增殖、分化或表达,进而抑制肿瘤的发生和发展。通常,可将本发明的人参皂苷Rh2配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明还提供了一种药物组合物,它含有安全有效量的本发明的人参皂苷Rh2以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克-10毫克/千克体重,优选地,60kg的成人每天约1微克-180微克。
作为抑制Treg细胞的药物,可以制成口服和非口服制剂。口服给药可制成片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等常用剂型,所用的赋型剂可以为淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羟甲基纤维素等中的一种或几种。崩解剂可以为马铃薯淀粉、羟甲基纤维素等中的一种或几种。粘合剂可以为***胶、玉米淀粉、明胶、糊精等中的一种或几种。口服制剂除上述剂型外,还可以制成乳剂、糖浆剂等。
非口服制剂可以制成注射剂,可以与注射用水、生理盐水、葡萄糖水制成注射剂,也可以在其中加入一定比例的乙醇、丙醇、乙二醇等。
此外,本发明的人参皂苷Rh2还特别适合与其他抗肿瘤的药物联用。尤其是本发明的人参皂苷Rh2可与化疗药物联合使用,降低Treg细胞的同时提升人体免疫力,从而用于肿瘤或免疫缺陷性疾病的治疗。
本发明的进一步目的是提供一种的人参皂苷Rh2的制备方法,该方法包括将所述的植物茎叶总皂苷或原人参二醇组皂苷溶入有机酸或无机酸的水溶液或醇溶液中,进行酸水解反应,然后收集反应物。用相应的赋型剂,按照常规的方法制成口服和非口服制剂,其中的人参皂苷Rh2的用量可以为:成年人每日0.1~2000mg,优选1~1100μg/天,每日服用1~5次;儿童的用量和次数需在成人的基础上酌情递减。
保健品或食品补充剂
本发明还提供了一种人参皂苷Rh2的用途,它被用于制备抑制Treg细胞或预防或抑制Treg细胞升高性肿瘤或Treg细胞升高引起的免疫缺陷性疾病的保健品或食品补充剂。
本发明的保健品或食品补充剂还有食品上可接受的载体以及人参皂苷Rh2。在本发明的保健品或食品补充剂中,人参皂苷Rh2的含量没有特别限制,通常为0.01-95wt%,较佳地为0.1-90wt%。
本发明的保健品或食品补充剂还可含有其他营养成分,例如硒、铁、以及维生素等。
本发明的有益效果:
1)人参皂苷Rh2抑制Treg细胞,从而抑制肿瘤生长,为肿瘤的预防和治疗提供了一种新型疗法;
2)减少放、化疗毒副作用,提高放化疗完成率,增加疗效;技术方案优:副作用小,安全可靠;
3)抑制Treg细胞,从而调整人体免疫平衡,进一步应用于自身免疫性疾病的预防或治疗。
4)为开发新型药物奠定基础。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1:人参皂苷Rh2的制备
1.1原人参二醇组皂苷干粉的制备
取5-15目人参粗粉,用40-100%乙醇回流提取1-4次,每次1-3小时,收集提取液,过滤,滤液回收乙醇,至无乙醇味后,真空浓缩1.5-2小时,浓缩液加入等体积蒸馏水,搅拌均匀,过滤,滤液过大孔吸附树脂柱吸附;用2-4倍量树脂床体积蒸馏水洗去水溶性杂质,吸附人参皂苷的树脂柱备用;将上述吸附树脂柱用20-50%乙醇洗脱,20-50%乙醇用量为1-5倍量树脂床体积,主要分离去除原人参三醇组皂苷,根据需要另行处理;用薄层色谱法跟踪检测,其中的薄层色谱法是:展开剂为30-100∶10-50∶2-20的氯仿∶甲醇∶水下层;显色剂:5-20%硫酸乙醇溶液;当薄层色谱上出现原人参二醇组皂苷斑点后,停止用20-50%乙醇洗脱,改用30-100%乙醇洗脱,并收集洗脱液;用0.5-2%活性炭加热回流0.5-2小时脱色,过滤去除活性炭,滤液过大孔阳、阴离子交换柱,进一步脱色脱盐除杂,并用30-100%乙醇洗脱树脂吸附的原人参二醇组皂苷,回收乙醇,真空浓缩,真空干燥,粉碎,收集原人参二醇组皂苷约为提取物投料量的3-4%;取上述纯化的原人参二醇组皂苷粉溶解于30-70%醋酸、20-50%枸橼酸、20-50%草酸、20-50%丙二酸、0.5-2%盐酸或0.5-2%硫酸的水或乙醇溶液中,控制反应条件:酸浓度为1%-55%,水解温度为20℃-100℃,水解时间为0.5小时-10小时,进行酸水解,反应完成后加入与水解转化液等体积的蒸馏水,用6%氢氧化钠溶液中和至中性,收集水解产物的沉淀,用10倍量蒸馏水,分2-3次洗沉淀,真空干燥,粉碎,备用,收率为投料原人参二醇组皂苷的30-40%;将水解产物溶解于5-10倍量50-140%乙醇中,以60℃-70℃加热,回流加快溶解,过滤,滤液用1%活性炭加热回流0.5-2小时脱色,过滤去除活性炭,滤液过大孔阳、阴离子交换柱,进一步脱色脱盐除杂,并用30-100%乙醇洗脱树脂,回收乙醇至总体积的1/4-1,冷却,放置结晶,真空抽滤,收集结晶,真空干燥,粉碎备用。
1.220(R)-人参皂苷Rh2的制备
批次1
配制60%的醋酸水溶液100毫升,加入前述方法制备的原人参二醇组皂苷干粉20克,在0.1兆帕压力下,搅拌加热,在100℃下进行水解反应2小时,反应完成后,用水将反应混合物洗至中性,过滤,滤物在100℃干燥,得水解产物12克。以硅胶柱层析法,洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化,收集洗脱物于甲醇-水中重结晶,得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体983毫克,收率4.92%。晶体纯度经HPLC法测定为97.6%。经过TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1HCOSY、比旋光度及熔点测定,并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实,确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
批次2
将60毫升冰醋酸加入40毫升95%的乙醇中,加入前述方法制备的原人参二醇组皂苷干粉20克,在0.1兆帕压力下,搅拌加热,在75℃下进行水解反应1.5小时,反应完成后,趁热倒入400毫升25℃水中稀释,减压回收乙醇。反应物继续用水洗至中性,过滤,滤物在80℃下干燥,得水解产物13.6克。以硅胶柱层析法,洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化,收集洗脱物于甲醇-水中重结晶,得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体1082毫克,收率7.95%。其纯度经HPLC法测定为95.3%。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1HCOSY、比旋光度及熔点测定,并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实,确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
批次3
将10毫升36%的盐酸溶入水中,使呈100毫升,加入前述方法制备的原人参二醇组皂苷干粉20克,在0.1兆帕压力下,搅拌加热,在100℃下进行水解反应1.5小时,反应完成后,用水将反应混合物洗至中性,过滤,滤物在100℃干燥,得水解产物11.4克。以硅胶柱层析法,洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化,收集洗脱物于甲醇-水中重结晶,得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体869毫克,收率4.35%。其纯度经HPLC法测定为96.2%。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1HCOSY.比旋光度及熔点测定,并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实,确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
批次4
配制60%的醋酸水溶液10升,加入前述方法制备的原人参二醇组皂苷干粉2公斤,在0.1兆帕压力下,搅拌加热,在100℃下进行水解反应2小时,反应完成后,用水将反应混合物洗至中性,过滤,滤物在100℃干燥,得水解产物1.18公斤。以硅胶柱层析法,洗脱液为氯仿∶甲醇∶乙酸乙酯∶水=2∶2∶4∶1(体积比)层析纯化,收集洗脱物于甲醇-水中重结晶,得到20(R)-人参皂苷Rh2的白色结晶体89克,收率4.45%。其纯度经HPLC法测定为95.8%。经TLC、MS、13C-NMR、1H-NMR、13C-1HCOSY、1H-1HCOSY.比旋光度及熔点测定,并与20(R)-人参皂苷Rh2的文献数据核实,确认该白色晶体为20(R)-人参皂苷Rh2。
实施例2:Rh2降低肿瘤小鼠体内Treg水平
采用给药期间植瘤(以下简称TIDA)的方式建立小鼠模型;提取各组小鼠全血、脾脏中T细胞;检测不同组别小鼠全血和脾脏中Treg在T细胞中的比例。
2.1.细胞培养
在完全培养基,高糖DMEN,10%FBS,4mmol/L谷氨酰胺,双抗的培养条件下,于5%的CO2培养箱中培养LLC小鼠Lewis肺癌细胞系(购自中国科学院细胞库)。
2.2.小鼠建模
选用雄性BALB/c小鼠(由南京大学模式动物研究所提供),分为三组:
i.对照组:BALB/c小鼠,皮下打入100uL生理盐水,灌胃给予安慰剂(生理盐水);
ii.实验组1:BALB/c小鼠,采用TIDA建模方式,灌胃给予安慰剂(生理盐水)。在第4天皮下注入LLC细胞(100uL,106细胞/只)建立肿瘤小鼠模型;
iii.实验组2:BALB/c小鼠,采用TIDA建模方式,灌胃给予Rh2单体(4.5mg/Kg)。在第4天皮下注入LLC细胞(100uL,106细胞/只)建立肿瘤小鼠模型。
TIDA建模方式具体操作见图1。实验组1、2的BALB/c小鼠,分别灌胃给予生理盐水、4.5mg/KgRh2单体。在第4天分别在皮下注入LLC细胞(100uL,106细胞/只)建立肿瘤小鼠模型。
3.第14天取各组小鼠全血、脾脏中T细胞,使用美天旎CD4+T细胞磁珠分选试剂盒(德国美天旎生物技术公司提供)分选出CD4+T细胞。
4.使用eBiosienceTreg流式检测试剂盒(由eBiosience公司提供)在流式细胞仪上检测各组小鼠全血和脾脏中Treg细胞的含量。
具体操作步骤包括:
(1)细胞配置成106/ml的细胞悬液,用stainingbuffer悬浮细胞;
(2)取100ul细胞,标记Fc(1ug/样品)封闭15分钟,4℃;
(3)细胞标记CD4(0.125ug/样品)和CD25(0.06ug/样品)的抗体,4℃孵育30分钟;
(4)用stainingbuffer洗细胞,接着用固定破膜剂通透细胞膜30分钟到18小时,4℃;
(5)通透结束后用通透缓冲液洗细胞,标记Foxp3(0.5ug/样品)的抗体4℃孵育30分钟;
(6)用通透缓冲液洗细胞后,stainingbuffer悬浮细胞,上流式机器检测。
采用LLC小鼠肺癌细胞建立了小鼠肿瘤模型,采用给药期间植瘤(TIDA)的给药方式,各组分别给予安慰剂及Rh2后,检测小鼠全血和脾脏中Treg细胞占T细胞的比例。具体结果如图2和图3所示。
图2A为小鼠全血中Treg流式细胞检测结果图。从图2A可以看出,与正常小鼠(正常)Treg比例(3.20%)相比,肿瘤小鼠(植入LLC细胞0mg/kg)的Treg比例(8.23%)明显升高,说明肿瘤小鼠全血中Treg数量显著增加。再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠(植入LLC细胞4.5mg/kg)Treg比例(4.97%)大幅度降低,有显著性差异,说明Rh2在全血中可显著抑制Treg数量。
图2B为小鼠全血中Treg含量统计结果柱状图。从图2B可以看出,正常代表正常小鼠,0mg/kg代表肿瘤小鼠,4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。与肿瘤组小鼠(0mg/kg)相比,给药组小鼠(4.5mg/kg)全血中的Treg比例显著降低,同时,给药组小鼠Treg比例并不比正常组小鼠低,说明Rh2可以显著抑制全血中Treg比例,使其尽量恢复到正常水平。
图3显示小鼠脾脏中Treg流式结果及Treg含量分析图。
图3A为小鼠脾脏中Treg流式细胞检测结果图。从图3A可以看出,与正常小鼠(正常)Treg比例(14.29%)相比,肿瘤小鼠(植入LCC细胞0mg/kg)的Treg比例(22.53%)明显升高,说明肿瘤小鼠脾脏中Treg数量显著增加。再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠(植入LCC细胞4.5mg/kg)Treg比例(16.92%)大幅度降低,有显著性差异,说明Rh2在脾脏中可显著抑制Treg数量。
图3B为小鼠脾脏中Treg流式统计结果柱状图。从图3B可以看出,正常代表正常小鼠,0mg/kg代表肿瘤小鼠,4.5mg/kg代表给予Rh2的给药组小鼠。与肿瘤组小鼠(0mg/kg)相比,给药组小鼠(4.5mg/kg)脾脏中的Treg比例显著降低,同时,给药组小鼠Treg比例并不比正常组小鼠低,说明Rh2可以显著抑制脾脏中Treg比例,使其尽量恢复到正常水平。
综上所述,与正常小鼠相比,肿瘤小鼠的全血和脾脏中的Treg比例都是明显升高的,说明肿瘤小鼠Treg比例显著增加。再给予高剂量Rh2后,给药组小鼠Treg比例大幅度降低,几乎到了和正常小鼠差不多的水平,Rh2对于降低Treg比例有显著的效果。
实施例3:Rh2直接下调肿瘤小鼠Treg细胞
首先用人参皂苷Rh2单体处理肿瘤小鼠CD4+T细胞;然后采用流式细胞分析方法检测Treg细胞的表达变化。
1.细胞培养
LLC小鼠肺癌细胞(来源于中国科学院细胞库)和Renca小鼠肾癌细胞(来源于中国科学院细胞库)传代培养,消化收集用于小鼠肿瘤模型制备。
i.LLC小鼠肺癌细胞
完全培养基,高糖DMEN,10%FBS,4mmol/L谷氨酰胺,双抗,在5%的CO2培养箱中37℃培养。
ii.Renca小鼠肾癌细胞
完全培养基,高糖DMEN,10%FBS,4mmol/L谷氨酰胺,双抗,在5%的CO2培养箱中37℃培养。
2.小鼠建模
选用BALB/c雄性小鼠(由南京大学模式动物研究所提供),建立肿瘤小鼠模型,分为三组:
i.正常小鼠组:BALB/c小鼠皮下注射100uL生理盐水;
ii.LLC肺癌肿瘤小鼠组:皮下植瘤LLC细胞(100uL,106细胞/只),2周后,观察到小鼠肿瘤明显长出;
iii.Renca肾癌肿瘤小鼠组:皮下植瘤Renca细胞(100uL,106细胞/只),2周后,观察到小鼠肿瘤明显长出。
3.CD4+T细胞的原代细胞培养
使用美天旎CD4+T细胞磁珠分选试剂盒(德国美天旎生物技术公司提供)分选出小鼠原代CD4+T细胞,进行原代细胞培养。
原代细胞培养:采用RPMI1640,12%FBS,4mmol/L谷氨酰胺,1mmol/LHEPES,双抗,在5%的CO2培养箱中培养,包被培养板中加入1μg/mL的小鼠CD3e抗体,培养液中加入1μg/mL的小鼠CD28抗体。待细胞状态稳定后,分别加入不同浓度的Rh2(0,5,10,20,40ug/ml),72小时后,收集细胞备用。
4.使用eBiosienceTreg流式检测试剂盒在流式细胞仪上检测各组小鼠全血和脾脏中Treg细胞在T细胞中的比例。具体操作步骤如实施例1所述。具体结果如图4和图5所示。
从图4可以看出;5、10、20、40代表不同浓度的Rh2给药处理。与正常小鼠CD4+T细胞相比,肿瘤小鼠CD4+T细胞中的Treg比例(12.41%,13.45%)明显升高,在体外用不同浓度的Rh2(5,10,20,40ug/mL)处理肿瘤小鼠的原代提取的CD4+T细胞,发现肺癌、肾癌肿瘤给药组小鼠Treg比例(4.97%)依次降低,说明Rh2直接抑制肿瘤小鼠Treg细胞的比例。
在不同浓度的Rh2下,给药后肺癌肿瘤小鼠Treg比例依次降低,分别为9.50%,7.58%,6.57%及5.69%;给药后肾癌肿瘤小鼠的Treg比例依次降低,分别为9.97%,6.27%,5.25%及3.97%,与空白对照正常小鼠相比,有显著性差异。且给药剂量越大,Treg比例越低。
从图5可以看出,5、10、20、40代表不同浓度的Rh2给药处理。两种肿瘤小鼠Treg细胞在T细胞中的比例远远高于正常小鼠,在体外用不同浓度的Rh2(0,5,10,20,40ug/mL)处理肿瘤小鼠的原代提取的CD4+T细胞,发现随着Rh2剂量的加大,肺癌肿瘤小鼠和肾癌肿瘤小鼠T细胞中高水平的Treg细胞的比例依次降低。
与空白对照正常小鼠(0ug/mL)相比,不同剂量组(5,10,20,40ug/mL)Treg细胞的比例显著性降低,呈现一定的剂量依赖性。
由此可见,Rh2可以直接作用于Treg细胞,降低Treg细胞在T细胞中的比例,且对Treg细胞抑制作用效果呈浓度依赖性,随之Rh2浓度的增加Treg细胞在T细胞中的比例降低。
实施例4:Rh2对小鼠Treg细胞及肿瘤生长的影响
用人参皂苷Rh2单体处理肿瘤小鼠(LLC肺癌肿瘤和Renca肾癌肿瘤),取血和脾脏备用,采用流式检测Rh2单体对小鼠脾脏和血液中的T细胞中Treg水平的影响,并通过测量肿瘤体积,研究Rh2单体对肿瘤生长的影响。
1.细胞培养
LLC肺癌细胞和Renca肾癌细胞传代培养,消化收集细胞用于构建小鼠肿瘤模型。具体培养方式如实施例2所述。
2.小鼠建模
选用BALB/c雄性小鼠(购自南京大学模式动物研究所),建立正常小鼠和肿瘤小鼠的给药模型,分为以下几组,具体建模方式如图6所示:
i.正常小鼠组:BALB/c小鼠皮下注射100uL生理盐水,灌胃给予安慰剂(生理盐水),本组10只小鼠;
ii.LLC小鼠肺癌细胞植瘤-TIAA(给药后植瘤)建模小鼠组:皮下植瘤LLC细胞(100uL,106细胞/只)。采用给药后植瘤(以下简称TIAA)建模方式,分别给予同等剂量安慰剂(10只小鼠)、1.5mg/KgRh2单体(10只小鼠)、4.5mg/KgRh2单体(10只小鼠);
iii.LLC小鼠肺癌植瘤-TIDA(给药期间植瘤)建模小鼠组:皮下植瘤LLC细胞(100uL,106细胞/只)。采用给药期间植瘤(TIDA)建模方式,分别给予同等剂量安慰剂(10只小鼠)、1.5mg/KgRh2单体(10只小鼠)、4.5mg/KgRh2单体(10只小鼠);
iv.Renca小鼠肾癌植瘤-TIAA(给药后植瘤)建模小鼠组:皮下植瘤Renca细胞(100uL,106细胞/只)。采用TIAA建模方式,分别给予同等剂量安慰剂(10只小鼠)、
1.5mg/KgRh2单体(10只小鼠)、4.5mg/KgRh2单体(10只小鼠);
v.Renca小鼠肾癌植瘤-TIDA(给药期间植瘤)建模小鼠组:皮下植瘤Renca细胞(100uL,106细胞/只)。采用TIDA建模方式,分别给予同等剂量安慰剂(10只小鼠)、1.5mg/KgRh2单体(10只小鼠)、4.5mg/KgRh2单体(10只小鼠)。
3.每日定时测量小鼠肿瘤尺寸,并计算体积,体积计算公式为1/6×π×长×宽×宽。
4.处死小鼠后,提取小鼠全血和脾脏中T细胞备用。使用美天旎CD4+T细胞磁珠分选试剂盒(德国美天旎生物技术公司提供)分选出CD4+T细胞。
5.使用eBiosienceTreg流式检测试剂盒在流式细胞仪上检测各组小鼠全血和脾脏中Treg细胞在T细胞中的比例。具体操作步骤如实施例1所述。具体结果如图7和图8所示。
图7显示小鼠全血中Treg细胞的表达变化。图7为正常小鼠、两种建模方式下LLC、Renca植瘤的四种模型小鼠,及建立在此基础上的给药组小鼠实验结果,图片标明这几组小鼠全血中Treg的变化。
图7A为小鼠全血中Treg细胞流式细胞检测结果图。其中TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5mg/kg、4.5mg/kg代表Rh2给药浓度。
以TIAA建模方式为例,与正常小鼠相比(Treg比例3.32%),肿瘤小鼠的Treg比例(8.19%,7.62%)均明显升高,说明肺癌肿瘤小鼠、肾癌肿瘤小鼠中Treg比例显著增加。给予低剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(6.46%,6.14%)大幅度降低;再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(5.39%,5.17%)进一步降低,有显著性差异。
以TIDA建模方式为例,与正常小鼠相比(Treg比例3.32%),肿瘤小鼠的Treg比例(8.15%,7.96%)均明显升高,说明肺癌肿瘤小鼠、肾癌肿瘤小鼠中Treg比例显著增加。给予低剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(5.91%,4.71%)大幅度降低;再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(4.31%,3.21%)进一步降低,有显著性差异。
图7B为小鼠全血中Treg细胞统计结果柱状图。TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。
以TIAA建模方式为例,与肿瘤组小鼠(0mg/kg)相比,低剂量组给药组小鼠(1.5mg/kg)全血中的Treg比例显著降低,高剂量组给药组小鼠(4.5mg/kg)全血中的Treg比例进一步降低,同时,给药组小鼠Treg比例并不比正常组小鼠低,说明Rh2可以使得小鼠全血中Treg比例尽量回复到正常水平。从图7可以看到TIDA模型小鼠全血Treg比例也呈现同样的趋势。
图8显示正常小鼠、两种建模方式下肺癌、肾癌植瘤的四种模型小鼠,及建立在此基础上的给药组小鼠脾脏中Treg细胞的变化趋势。
图8A为小鼠脾脏中Treg细胞流式细胞检测结果图。TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5mg/kg、4.5mg/kg代表Rh2给药浓度。以TIAA建模方式为例,与正常小鼠相比(Treg比例15.26%),肿瘤小鼠的Treg比例(22.35%,21.49%)均明显升高,说明肺癌肿瘤小鼠、肾癌肿瘤小鼠中Treg比例显著增加。给予低剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(19.34%,18.64%)大幅度降低;再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(17.63%,17.26%)进一步降低,有显著性差异。
以TIDA建模方式为例,与正常小鼠相比(Treg比例15.26%),肿瘤小鼠的Treg比例(21.99%,21.09%)均明显升高,说明肺癌肿瘤小鼠、肾癌肿瘤小鼠中Treg比例显著增加。给予低剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(18.11%,16.98%)大幅度降低;再给予高剂量Rh2后,与肿瘤小鼠相比,给药组小鼠Treg比例(16.23%,14.27%)进一步降低,有显著性差异。
图8B为小鼠脾脏中Treg细胞统计结果柱状图。TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。以TIAA建模方式为例,与肿瘤组小鼠(0mg/kg)相比,低剂量组给药组小鼠(1.5mg/kg)脾脏中的Treg比例显著降低,高剂量组给药组小鼠(4.5mg/kg)脾脏中的Treg比例进一步降低,同时,给药组小鼠Treg比例并不比正常组小鼠低,说明Rh2可以使得小鼠脾脏中Treg比例尽量回复到正常水平。同理,从图8可以看到TIDA模型小鼠脾脏中Treg比例也呈现同样的变化趋势。
综上所述,与正常小鼠相比,肿瘤小鼠的全血和脾脏中的Treg比例都是明显升高的,再给予高剂量Rh2后,给药组小鼠Treg比例大幅度降低,几乎到了和正常小鼠差不多的水平,Rh2对于降低Treg比例有显著的效果。
实施例5Rh2对小鼠肿瘤生长的影响
本实施例检测了Rh2对不同模型、不同给药浓度下的肿瘤的影响。
图9为第十天各组小鼠肿瘤大小,TIAA代表给药后植瘤建模小鼠组,TIDA代表给药期间植瘤建模小鼠组;1.5、4.5代表Rh2给药浓度。与对照肺癌肿瘤小鼠组、肾癌肿瘤小鼠组相比,给药组肺癌小鼠、肾癌小鼠肿瘤体积明显较小。高浓度组与低浓度组相比,肿瘤生长速度更慢,尺寸也更小。Rh2可显著抑制肿瘤生长,说明对抑制剂也有一定的剂量依赖性。随之Rh2浓度的增加肿瘤逐渐变小。
图10-图13为不同肿瘤模型小鼠在不同植瘤方式下,分别给予低浓度和高浓度的Rh2后,给药组(Rh2)与对照组(生理盐水)相比,低浓度给药组和高浓度给药组小鼠的肿瘤的生长速度明显变慢,而且肿瘤尺寸明显变小。
图10显示给药后TIAA#肺癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(LLC)生长曲线。纵坐标为肿瘤体积,横坐标为给药天数。从图10可以看出,与对照组(0mg/kg)相比,低剂量给药组(1.5mg/kg)肿瘤生长速度放慢,同一天肿瘤尺寸明显变小;高剂量给药组(4.5mg/kg)的肿瘤生长速度最慢,肿瘤尺寸小于对照组和低剂量给药组。说明Rh2可以抑制肺癌植瘤TIAA#肿瘤模型小鼠的肿瘤生长。
图11显示给药后TIDA#肺癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(LLC)生长曲线。从图11可以看出,与对照组(0mg/kg)相比,低剂量给药组(1.5mg/kg)肿瘤生长速度放慢,同一天肿瘤尺寸明显变小;高剂量给药组(4.5mg/kg)的肿瘤生长速度最慢,肿瘤尺寸小于对照组和低剂量给药组。说明Rh2可以抑制肺癌植瘤TIDA#肿瘤模型小鼠的肿瘤生长。
图12为给药后TIAA#肾癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(Renca)生长曲线。从图12可以看出,与对照组(0mg/kg)相比,低剂量给药组(1.5mg/kg)肿瘤生长速度放慢,同一天肿瘤尺寸明显变小;高剂量给药组(4.5mg/kg)的肿瘤生长速度最慢,肿瘤尺寸小于对照组和低剂量给药组。说明Rh2可以抑制肾癌植瘤TIAA#肿瘤模型小鼠的肿瘤生长。
图13显示给药后TIDA#肾癌肿瘤小鼠在不同给药浓度下的肿瘤(Renca)生长曲线。从图13可以看出,与对照组(0mg/kg)相比,低剂量给药组(1.5mg/kg)肿瘤生长速度放慢,同一天肿瘤尺寸明显变小;高剂量给药组(4.5mg/kg)的肿瘤生长速度最慢,肿瘤尺寸小于对照组和低剂量给药组。说明Rh2可以抑制肾癌植瘤TIDA#肿瘤模型小鼠的肿瘤生长。
综上所述,不论哪种建模方式下,Rh2均能降低两种植瘤小鼠中全血和脾脏中Treg的比例,且Rh2浓度越高,Treg的比例越低,呈现一定的剂量依赖性。同时,给予Rh2后,肿瘤小鼠的肿瘤生长速度明显变缓,同一时间点相比,给药组的肿瘤体积也明显小于对照组(给予生理盐水)肿瘤小鼠。同一模型小鼠相比,给药浓度越高,肿瘤也相对越小。结合以上分析,说明Rh2在降低肿瘤小鼠体内Treg比例和减缓肿瘤生长速度上有正相关关系,也就是说,Rh2通过抑制Treg比例达到抑制肿瘤生长的目的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.人参皂苷Rh2的用途,其特征在于,用于(a)制备抑制Treg细胞的抑制剂;或(b)制备预防和/或治疗Treg细胞升高性肿瘤的组合物。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的组合物包括药物组合物、食品组合物和/或保健品组合物。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的组合物包括人参皂苷Rh2作为活性成分,和药学上/食品学上可接受的载体。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的组合物还含有任选的抗肿瘤药物。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的人参皂苷Rh2包括:
20(S)-人参皂苷Rh2:即20(S)-原人参二醇-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、
20(R)-人参皂苷Rh2:即20(R)-原人参二醇-3-O-β-D吡喃葡萄糖苷、或其组合。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的人参皂苷Rh2通过以下步骤制备:
将所述的植物茎叶总皂苷或原人参二醇组皂苷溶入有机酸或无机酸的水溶液或醇溶液中,进行酸水解反应,然后收集反应物。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的Treg细胞升高性肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、淋巴瘤、或黑色素瘤。
8.一种体外非治疗性的抑制Treg细胞的方法,其特征在于,在人参皂苷Rh2存在下培养Treg细胞,或将人参皂苷Rh2与Treg细胞接触,从而抑制Treg细胞。
9.一种体外非治疗性的抑制Treg细胞升高性肿瘤的方法,其特征在于,在人参皂苷Rh2存在下培养Treg细胞升高性肿瘤细胞,或将人参皂苷Rh2与Treg细胞接触,从而抑制Treg细胞升高性肿瘤。
10.一种制备Treg细胞抑制剂的方法,其特征在于,将人参皂苷Rh2与药学上和/或食品学上可接受的载体混合,从而制备成Treg细胞抑制剂。
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