CN105274225B - 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点 - Google Patents

一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点 Download PDF

Info

Publication number
CN105274225B
CN105274225B CN201510690126.0A CN201510690126A CN105274225B CN 105274225 B CN105274225 B CN 105274225B CN 201510690126 A CN201510690126 A CN 201510690126A CN 105274225 B CN105274225 B CN 105274225B
Authority
CN
China
Prior art keywords
chst6
gene
patch shape
corneal dystrophy
disease
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510690126.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105274225A (zh
Inventor
陈鹏
郝晓丹
孙大鹏
赵晓雯
王瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Original Assignee
SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV filed Critical SPECIALTY OF OPHTHALMOLOGY RESEARCH INSTITUTE SHANDONG PROV
Priority to CN201510690126.0A priority Critical patent/CN105274225B/zh
Publication of CN105274225A publication Critical patent/CN105274225A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105274225B publication Critical patent/CN105274225B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的是提供种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点，为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250‑272位碱基。本发明提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变位点的快速检测。

Description

一种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点
技术领域
本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点。
发明背景
斑状角膜营养不良(macular corneal dystrophy,MCD)是一种常染色体隐性遗传病，以双侧角膜基质进行性雾状混浊及中央角膜变薄为特征，在临床上较为少见，但发病较严重，早期即明显影响视力。患者通常在10岁以前就双眼较对称发病，视力下降，约在20岁时病情已比较明显，有畏光、流泪及视力下降的症状，角膜病变初期表现为角膜中央浅基质层的细小云雾状浑浊，有的为半透明环状。以后这些细小浑浊逐渐融合为多形、不规则的灰白样，随病情进展向角膜周边延伸和角膜深基质层发展。当角膜混浊的区域向表面扩展形成凸出角膜表面呈结节状，造成角膜不规则散光，而当混浊区域向弹力层发展时，裂隙灯下可见角膜后有大量的内皮赘疣。与其他的角膜营养不良不同，斑块状角膜营养不良在病程发展至晚期，均可出现角膜变薄。
当视力下降明显、影响工作与生活时，可行板层或穿透性角膜移植术进行治疗，但术后都存在复发的可能。根据ELISA法检查病人血清中硫酸角质素(keratan sulfate,KS)抗原浓度的高低及对角膜组织的免疫组化检查，将斑状角膜营养不良分为三型，I型患者的血清和角膜中没有KS的免疫反应，ⅠA型患者的血清中没有KS的免疫反应，但角膜中存在KS的免疫反应，而II患者血清和角膜中都存在KS的免疫反应。
斑块状角膜营养不良发病较早，病情逐渐进展，常双眼发病，对视力影响严重，常合并角膜上皮糜烂而有刺激症状，除了角膜移植手术，目前尚无更好的治疗方法，而手术供体匮乏，术后并发症多并且容易复发，加之手术费用昂贵，给患者家庭和社会带来沉重的经济和精神负担。建立斑块状角膜营养不良的相关的基因突变检测***，并应用于临床工作和优生优育，有助于遗传性斑块状角膜营养不良的基因诊断和相应的基因治疗，有助于突变基因携带者的检出，有助于通过产前检查降低疾病的发生率，有助于有效地控制这种疾病的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测斑块状角膜营养不良病的SNP位点，从而弥补现有技术的不足。
申请人从一个5代呈常染色体隐性遗传的斑块状角膜营养不良家系中，对该家系全部成员进行了CHST6基因的测序，找到了该家系的致病基因CHST6存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。
本发明提供一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点，为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基。
其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
本发明提供了CHST6基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行斑块状角膜营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行CHST6基因突变位点的快速检测。
附图说明
图1：实施例1的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A：参考序列；B：患者。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基发生了纯合突变，其碱基CG发生缺失。
图2：实施例2的斑块状角膜营养不良家系内患者CHST6测序图，其中A：参考序列；B：正常人。该家系中三名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失。
具体实施方式
申请人在一个斑块状角膜营养不良家系中发现CHST6基因的突变位点，并证实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。
CHST6基因位于染色体16q22，可转录成大约1188bp的mRNA(NCBI登录号为NM_021615.4)，直接翻译形成395个氨基酸组成的蛋白质。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：从斑块状角膜营养不良家系中筛选CHST6基因的突变位点
1、提取外周血基因组DNA：
在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。
加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
加入l/10体积3mol/L、pH5.2醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。
向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。
对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。
2、直接测序法寻找该家系内患者CHST6基因的突变
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，57℃40se，72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(TAKARA LA Taq polymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该CHST6引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT,CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC,CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTG,CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGAT，在该家系中八名患者CHST6基因编码区域由起始密码子起第463-464位碱基发生了纯合突变，其碱基CG发生缺失(图1)。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。该突变为一新生突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了CHST6蛋白长度截短，从而引起了患者斑块状角膜营养不良的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
通过上述的分析，证明CHST6基因可以用来检测患者是否具有潜在患斑块状角膜营养不良的危险。通过将检测者的CHST6基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病风险。
根据CHST6的基因组序列设计扩增其各外显子的引物对，其正反引物的序列信息如下：
CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT
CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC
CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTC
CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCT
CHST6-2F:GACGTGTTTGATGCCTATCTGCCTTG
CHST6-2R:TCCGTGGGTGATGTTATGGAT
分别应用上述的每一对引物进行CHST6基因的检测。
实施例2：从斑块状角膜营养不良家系中筛选CHST6基因的突变位点
收集斑块状角膜营养不良家系：在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院收集诊断明确的斑块状角膜营养不良的家系。
提取外周血基因组DNA：
分别抽取斑块状角膜营养不良家系中所有成员的外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，应用实施例1中说述的常规酚氯仿法从家系内各成员外周血中提取基因组DNA。
PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
(1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，57℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
(2)反应体系：(TAKARA LA Taq polymerase)
应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板分别与CHST6基因的4对引物的扩增反应。
PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对该家系三名成员的基因组DNA模板分别与CHST6基因的4对引物的扩增产物进行测序，其中用引物对CHST6-F:CCACAAACTCCTTGGTCAAT,CHST6-R:TGTCTTAAGGCCACATTTCC,CHST6-1F:GCCCCTAACCGCTGCGCTCTC,CHST6-1R:GGCTTGCACACGGCCTCGCT，在患者中检测到了CHST6基因的纯合突变：CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位碱基发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失(图2)，该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，Hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，该突变导致了CHST6蛋白长度截短，从而引起了患者斑块状角膜营养不良的发生。而在200例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。
上述的检测结果表明CHST6基因的突变位点能够用于检测斑块状角膜营养不良。

Claims (2)

1.一种与斑块状角膜营养不良疾病相关的SNP位点在制备用于检测斑块状角膜营养不良疾病的制品中的应用；所述的SNP位点为CHST6基因编码区域由起始密码子起第250-272位的碱基发生了纯合突变，其碱基AGCGCCGCAACGCTGCACATGGC发生缺失。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的制品为用于PCR扩增的引物对。
CN201510690126.0A 2015-10-22 2015-10-22 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点 Active CN105274225B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510690126.0A CN105274225B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510690126.0A CN105274225B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105274225A CN105274225A (zh) 2016-01-27
CN105274225B true CN105274225B (zh) 2019-01-18

Family

ID=55144052

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510690126.0A Active CN105274225B (zh) 2015-10-22 2015-10-22 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105274225B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022614A (zh) * 2017-04-21 2017-08-08 唐旌生物科技（上海）有限公司 一种检测基因突变的方法和试剂盒
CN110714066A (zh) * 2019-10-22 2020-01-21 福州福瑞医学检验实验室有限公司 一种检测诊断角膜营养不良致病基因的dna文库及其应用
CN114693622B (zh) * 2022-03-22 2023-04-07 电子科技大学 一种基于人工智能的斑块侵蚀自动检测***

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009100159A2 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 Bipar Sciences, Inc. Methods of diagnosing and treating parp-mediated diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009100159A2 (en) * 2008-02-04 2009-08-13 Bipar Sciences, Inc. Methods of diagnosing and treating parp-mediated diseases

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Novel mutations in the carbohydrate sulfotransferase gene (CHST6) in American patients with macular corneal dystrophy;Aldave AJ et al.;《American Journal of Ophthalmology》;20040331;第137卷(第3期);465-473
Novel mutations in the CHST6 gene causing mcorneal dystrophyacular;Abbruzzese C et al.;《Clinical Genetics》;20040129;第65卷(第2期);120-125
Sequencing of the CHST6 gene in Czech macular corneal dystrophy patients supports the evidence of a founder mutation;Liskova,P et al.;《British Journal of Ophthalmology》;20071025;第92卷(第2期);265-267
斑状角膜营养不良CHST6基因突变及组织病理学研究;李璇;《大连医科大学硕士论文》;20111231;摘要

Also Published As

Publication number Publication date
CN105274225A (zh) 2016-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lam et al. Truncations in the TIGR gene in individuals with and without primary open-angle glaucoma
Maubaret et al. Autosomal dominant retinitis pigmentosa with intrafamilial variability and incomplete penetrance in two families carrying mutations in PRPF8
Liang et al. Differentiation of exudative age-related macular degeneration and polypoidal choroidal vasculopathy in the ARMS2/HTRA1 locus
Tuo et al. The HtrA1 promoter polymorphism, smoking, and age-related macular degeneration in multiple case-control samples
CN105274225B (zh) 一种用于检测斑块状角膜营养不良病的snp位点
Ferrini et al. CRYBA3/A1 gene mutation associated with suture-sparing autosomal dominant congenital nuclear cataract: a novel phenotype
Avila-Fernandez et al. CERKL mutations and associated phenotypes in seven Spanish families with autosomal recessive retinitis pigmentosa
CN106282383B (zh) Krt12基因在检测圆锥角膜中的应用
Reinstein et al. A founder mutation in ADAMTSL4 causes early-onset bilateral ectopia lentis among Jews of Bukharian origin
CN107312859A (zh) Aqp5基因在制备检测先天性白内障制品中的应用
Riazuddin et al. A new locus for autosomal recessive nuclear cataract mapped to chromosome 19q13 in a Pakistani family
CN106282197B (zh) 一种遗传性视网膜色素变性疾病的致病突变及其检测试剂
Valverde et al. Spectrum of the ABCA4 gene mutations implicated in severe retinopathies in Spanish patients
CN102732607B (zh) 一种检测高度近视的试剂盒
CN105274235B (zh) Abca3基因在检测先天性ccmc中的应用
CN105803078B (zh) Cryba4基因在检测先天性ccmc中的应用
CN105256029B (zh) Chst6基因在制备检测斑块状角膜营养不良制品中的应用
CN105624167B (zh) 一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂
CN103820548B (zh) Myo18a基因在制备先天性小眼球诊断制品中的应用
CN106399564A (zh) Ercc8基因在先天性白内障合并圆锥角膜检测中的应用
CN108866067B (zh) 一种雷伯氏先天性黑矇的致病突变及其检测试剂
CN104357551B (zh) TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良制品中的应用
CN106434933A (zh) Crybb2基因在制备检测先天性白内障制品中的应用
CN106755446B (zh) 一种与先天性ccmc相关的snp位点
CN106521020B (zh) 一种crybb1基因的snp位点

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant