CN105273057B

CN105273057B - 一种制备卡非佐米的方法

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Publication number: CN105273057B
Application number: CN201410343409.3A
Authority: CN
Inventors: 陈晓航; 余美平; 路杨; 杨东晖; 方晨; 周亮
Original assignee: Hangzhou Arnold Biomedical Technology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Feiteng Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2014-07-18
Filing date: 2014-07-18
Publication date: 2019-03-19
Anticipated expiration: 2034-07-18
Also published as: CN105273057A

Abstract

本发明涉及一种制备卡非佐米的方法。本发明的具体步骤为：A）在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc‑Phe‑OH偶联得到Fmoc‑Phe‑树脂；B）通过固相合成法，依次偶联Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Homophe‑OH、Fmoc‑Gly‑OH，偶联完毕，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二（2‑氯乙基）醚合成***啉环，肽树脂裂解得到化合物Ⅰ；C）化合物Ⅰ与化合物Ⅱ发生缩合反应，即得卡非佐米。该工艺直接在载体上合成修饰有效的构件，避免了直接购买或者液相合成昂贵的有效构件，有效地提高了收率、降低生产成本。

Description

一种制备卡非佐米的方法

技术领域

本发明涉及一种多肽类药物的制备方法，具体涉及一种卡非佐米的合成方法。

背景技术

卡非佐米，英名为：Carfilzomib，是含有环氧骨架的四肽，结构式如下：

多发性骨髓瘤是一种浆细胞不正常增生，致使侵犯骨髓的一种恶性肿瘤。恶性骨髓瘤产生时，会引发蚀骨细胞活化，伴随着骨骼外部的硬骨被破坏，引发骨骼疼痛的症状。目前，最常见的治疗多发性骨髓瘤的药物主要有沙立度胺，或来那度胺和***配合使用以及第一代蛋白酶抑制剂硼替佐米。2012年7月20日，美国食品与药物管理局（FDA）批准了ONYXPHARMSINC 公司产品卡非佐米 (carfilzomib) 注射用冻干粉针剂的上市。卡非佐米是一种四肽基环氧骨架蛋白酶体抑制剂，通过不可逆地结合到N-末端含有苏氨酸的20S蛋白酶体活性位点发挥抗肿瘤细胞增殖和凋亡作用。在动物中，卡非佐米抑制蛋白酶体活性的血液和组织中以及多发性骨髓瘤模型中，血液和实体肿瘤的肿瘤生长延迟。卡非佐米为第二代蛋白酶抑制剂，具有以下优点：首先，它对蛋白酶的抑制作用更加持久且不可逆，因此药效更好，病人产生抗药性的可能性更低；另外，卡非佐米与周围神经突变关系较小且抑制作用更有针对性，因而副作用更小。

卡非佐米现有的合成方法为直线合成法，专利US20050245435 中，卡非佐米合成步骤如下：N-Boc亮氨酸和苯丙氨酸苄酯缩合反应，然后在三氟乙酸作用下脱保护得到其三氟乙酸盐，之后在N,N-二异丙基乙胺、1-羟基苯并三氮唑的催化下与氨基酸缩合生成二肽胺，所得二肽胺脱保护后与氯乙酰氯、碘化钠、吗啉反应，再通入氢气，在钯碳催化下还原得到化合物，所得化合物与侧链缩合即得卡非佐米粗品。这种方法能最终合成卡非佐米，但应用于大规模生产时仍存在一些问题，如直线合成法反应收率较低，所用碘化钠氯取代反应收率不高，因此消耗较多的起始原料；而且此合成方法中由于用到氯乙酰氯，污染较大；此外，此合成方法中反应类型较多，反应条件复杂多样，可控性差，不适用于大规模工业生产。

因此，研发一种收率高、反应简单可控、适用于工业化生产的卡非佐米新的合成方法具有重要的意义。

发明内容

本发明人用现有的合成方法，制备卡非佐米，发现现有技术存在的技术问题是：合成收率低，反应类型较多，反应条件复杂多样，可控性差，不适用于大规模工业生产。为此，本发明人对卡非佐米的合成方法进行了研究，从而得到了本发明的技术方案。

本发明的目的是提供一种制备卡非佐米的方法。本发明的合成路线如图1所示：在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc-Phe-树脂；通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二（2-氯乙基）醚合成***啉环，肽树脂裂解得到化合物Ⅰ；化合物Ⅰ与化合物Ⅱ发生缩合反应，即得卡非佐米。

本发明中一些常用的缩写具有以下含义；

Fmoc ：芴甲氧羰基

Fmoc-AA ：芴甲氧羰基保护的氨基酸

DIC ：N,N′-二异丙基碳化二亚胺

EDCI.HCl ：1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐

PyBOP ：六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基磷

HATU ：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯

HOBt ：1-羟基苯骈***

Gly ：甘氨酸

Phe ：苯丙氨酸

Leu ：亮氨酸

Homophe ：高苯丙氨酸

DMF ：N,N′-二甲基甲酰胺

MeOH ：甲醇

DCM ：二氯甲烷

NMP ：N-甲基吡咯烷酮

DMSO ：二甲基亚砜

TFA ：三氟醋酸

EDT ：乙二硫醇

Piperidine ：六氢吡啶

DMAP ：4-二甲氨基吡啶

DIEA ：N,N′-二异丙基乙胺

TMP ：2,4,6-三甲基吡啶

NMM ：N-甲基吗啉

为此本发明提供一种卡非佐米的合成方法，其步骤如下：

步骤1，在活化剂***的存在下，由树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联得到Fmoc-Phe-树脂；

步骤2，通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH，偶联完毕，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二（2-氯乙基）醚合成***啉环，肽树脂裂解得到化合物Ⅰ；

步骤3，化合物Ⅰ与化合物Ⅱ发生缩合反应，即得卡非佐米。

其中，步骤1所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用2-CTC树脂，所述活化剂***选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Phe-树脂为0.10~0.90 mmol/g取代度的Fmoc-Phe-CTC树脂。

其中，步骤1所述的固相合成方法，所述树脂固体载体采用王树脂，所述活化剂***由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Phe-王树脂为0.10~0.90 mmol/g取代度的Fmoc-Phe-王树脂。

本发明中，所述的树脂的取代度是采用紫外吸光光度法测定的树脂的取代度，用体积比为1:4的哌啶和DMF混合溶液将偶联Fmoc保护型氨基酸的树脂上的Fmoc保护基脱保护下来，用紫外吸光光度法测定其浓度，然后采用含Fmoc的氨基酸标准化合物例如Fmoc-Leu-OH，以外标法标定树脂上的Fmoc的mmol数值，除以树脂重量，即得到树脂的取代度或称之为替代度。

其中，步骤2所述的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：

1）采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Gly-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Gly-树脂；

2）在偶联剂***的存在下，H-Phe-树脂和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-Phe-树脂；

3）重复步骤1）、2），依次偶联Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Homophe-Leu-Phe-树脂；

4）偶联完毕，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二（2-氯乙基）醚合成***啉环，肽树脂裂解得到化合物Ⅰ。

其中，上述固相合成方法步骤2）所述偶联剂***包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或他们之间的任意组合。

其中，上述固相合成方法步骤4）在三乙胺条件下往树脂中加入二（2-氯乙基）醚合成***啉环中，树脂、二（2-氯乙基）醚和三乙胺的摩尔比优选为：1:1:3~1:1.2:3，反应温度为15~35℃，反应时间为3~5小时；更优选，树脂、二（2-氯乙基）和三乙胺醚摩尔比优选为：1:1:3，反应温度为15℃，反应时间为3小时。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

1）摩尔比的选择：树脂、二（2-氯乙基）醚和三乙胺的摩尔比优选为：1:1:3和1:1.2:3；

2）反应温度的选择：

15℃和35℃；

3）反应时间的选择：

3小时和5小时。

为此提出了8种实验条件：

实验条件1：取20.07g H-Gly-Homophe-Leu-Phe-树脂(10mmol)、14.30g 二（2-氯乙基）醚(10 mmol) 和3.03g 三乙胺(30mmol)加入200mL DMF中搅拌溶解，冷却到0℃，加入上述溶液中，在15℃反应3小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后，按TFA:苯甲醚=95:5的体积比配置裂解液200mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，得到4.42g化合物Ⅰ；称取0.69g化合物Ⅱ(4mmol) 加入10ml DMF中，冰水浴下加入2.27g化合物Ⅰ(4mmol)、0.51g DIC(4mmol)和0.54g HOBt(4mmol) 25℃反应12小时，在反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取并用饱和碳酸氢钠、饱和氯化铵、饱和食盐水水洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得到卡非佐米粗肽2.24g；称取上述2.24g卡非佐米粗肽，使用体积比为1:4的乙酸乙酯和石油醚混合溶剂过柱纯化，浓缩后得到2.00g白色固体，经乙酸乙酯和石油醚重结晶得到卡非佐米精肽1.06g，总收率为37%，HPLC纯度99.75%。

实验条件2-8，实验操作如实验条件1所示，不同的实验条件及其实验结果如下面的表1所示：

表1对比实验结果

实验条件	摩尔比	温度	时间	总收率	纯度
						实验条件1	1:1:3	15℃	3小时	33%	99.75%
实验条件2	1:1:3	15℃	5小时	33%	99.61%
						实验条件3	1:1:3	35℃	3小时	33%	99.75%
实验条件4	1:1:3	35℃	5小时	32%	99.72%
						实验条件5	1:1.2:3	15℃	3小时	33%	99.54%
实验条件6	1:1.2:3	15℃	5小时	32%	99.64%
						实验条件7	1:1.2:3	35℃	3小时	33%	99.73%
实验条件8	1:1.2:3	35℃	5小时	31%	99.66%

以上结果表明，实验条件1-8的结果差别不大，但是实验条件1合成成本相对较低、反应时间较短，效率最高，所以实验条件1的综合结果最优。

本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势，有关对比实验如下表2所示：

表2 对比实验结果

专利	总收率/%	纯度/%
			本发明技术	33	99.75
CN201310703497.9	19	99.70

本发明的有益效果是：在树脂依次偶联上Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Leu-OH 、Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH、然后加入二（2-氯乙基）醚合成***啉环，直接在肽树脂上合成了化合物Ⅰ，避免了直接购买或者液相合成昂贵的有效构件，有效地提高了收率、降低生产成本。

附图说明

图1本发明卡非佐米的合成路线；

图2化合物Ⅰ的HPLC谱图；

图3化合物Ⅰ的质谱谱图；

图4卡非佐米粗肽的HPLC谱图；

图5卡非佐米精肽的HPLC谱图；

图6卡非佐米精肽质谱谱图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

具体地，关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段，以及各商购树脂，其生产厂家和商品型号如下：

Fmoc保护基氨基酸原料、和王树脂均为常规的市售试剂（厂家：吉尔生化（上海）有限公司；化学纯）；化合物Ⅰ是本专利描述合成的。

有机溶剂和其它原料来源均为市售品（厂家：国药集团化学试剂有限公司；化学纯）。

另外，下面实施例中提到的“旋蒸浓缩”以及“冻干”以及测定HPLC和质谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下：

旋蒸浓缩设备：旋转蒸发仪R-200/205（瑞士Buchi(布奇)公司）；

旋蒸浓缩条件：30℃下，真空（-0.1Mpa）条件下旋蒸浓缩，浓缩后体积在旋蒸前总体积75%以下。

HPLC：Dionex高效液相色谱仪；用十八烷基硅烷键合硅胶（5μm，250×4.6mm）为填充剂；以0.1%TFA溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0mL；检测波长为220nm；柱温30℃。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

质谱： MALDI-TOF-MS 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱；仪器型号为AUTOFLEX SPEED TOF-TOF。

实施例一：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Phe-CTC树脂的合成

称取取代度为0.40mmol/g的2-CTC树脂25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取19.37g Fmoc-Phe-OH(50mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入6.46gDIEA(50mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入200mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Phe-CTC树脂，检测替代度为0.10mmol/g。

实施例二：取代度为0.90mmol/g的Fmoc-Phe-CTC树脂的合成

称取取代度为1.25mmol/g的2-CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取48.43g Fmoc-Phe-OH(125mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入16.15g DIEA(125mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入200mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Phe-CTC树脂，检测替代度为0.90mmol/g。

实施例三：取代度为0.10mmol/g的Fmoc-Phe-王树脂的合成

称取取代度为0.40mmol/g的王树脂25g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取19.37g Fmoc-Phe-OH(50mmol)、6.76g HOBt(50mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入6.31g DIC(50mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入0.61g DMAP(5mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用体积比为1:1醋酸酐100mL和吡啶100mL反应封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Phe-王树脂，检测替代度为0.10mmol/g。

实施例四：取代度为0.90mmol/g的Fmoc-Phe-王树脂的合成

称取取代度为1.25mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀树脂30分钟后，取48.43g Fmoc-Phe-OH(125mmol)、16.89g HOBt(125mmol)用DMF溶解，冰水浴下加入15.78g DIC(125mmol)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入1.53g DMAP(12.5mmol)，反应2小时后，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，用100mL醋酸酐/吡啶封端过夜，甲醇收缩干燥，得到Fmoc-Phe-王树脂，检测替代度为0.90mmol/g。

实施例五：化合物Ⅰ的制备

称取16.67g（10mmol）取代度为0.60mmol/g的Fmoc-Phe-王树脂，加入固相反应柱中，用DMF洗涤1次，用DCM溶胀Fmoc-Phe-王树脂30分钟后，用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，称取10.60g Fmoc-Leu-OH（30mmol）、4.05g HOBt（30mmol）加入体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入3.79g DIC（30mmol）活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，室温下反应2小时后，以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需要再反应1小时，此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，依次完成Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH的偶联。用DMF:吡啶体积比为4:1的混合溶液脱去Fmoc保护，然后用DMF洗涤6次，取14.30g 二（2-氯乙基）醚(10mmol) 和3.03g 三乙胺(30mmol)加入200mL DMF中搅拌溶解，冷却到0^oC，加入上述溶液中，在15^oC反应3小时，用DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，DCM洗涤3次，MeOH洗涤3次，干燥后得到20.70g树脂，加入到500mL的三口圆底烧瓶中，按TFA:苯甲醚=95:5的体积比配置裂解液200mL，将裂解液加入上述树脂中，室温反应2小时，过滤，用少量TFA洗涤裂解后的树脂3次，合并滤液，浓缩，将浓缩后的液体加入到冰***中沉淀1小时，离心，无水***离心洗涤6次，真空干燥，得到4.42g化合物Ⅰ，其HPLC谱图如图2所示，HPLC纯度92.30%（面积归一化法），化合物Ⅰ收率78%（收率计算：10mmol为5.66g，4.42/5.66=78%）。其质谱如图3所示，[M+Na]⁺：589.605、[M+K]⁺：605.255，化合物Ⅰ的理论精确分子量为：566.31，样品质谱结果与理论分子量相符，结构正确。

实施例六：卡非佐米的制备

称取1.35g化合物Ⅱ(7.8mmol) 加入20ml DMF中，冰水浴下加入4.42g化合物Ⅰ(7.8mmol)、0.99g DIC(7.8mmol)和1.05g HOBt(7.8mmol) 25℃反应12小时，在反应体系中加入乙酸乙酯和水，用乙酸乙酯萃取并用饱和碳酸氢钠、饱和氯化铵、饱和食盐水水洗，无水硫酸钠干燥，旋蒸浓缩后得到卡非佐米粗肽4.37g，其HPLC谱图如图4所示，HPLC纯度83.98%，卡非佐米粗肽合成收率78%（收率计算：7.8 mmol为5.60g，4.37/5.60=78%）。使用体积比为1:4乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂过柱纯化，浓缩后得到白色固体，再经乙酸乙酯和石油醚重结晶得到卡非佐米精肽2.40g，纯化收率：55%（卡非佐米精肽/卡非佐米粗肽=2.40/4.37），总收率为33%（收率计算：化合物Ⅰ收率×卡非佐米粗肽合成收率×纯化收率=78%×78%×55%=33%），其HPLC谱图如图5所示，HPLC纯度99.75%（面积归一化法），其质谱如图6所示，[M]⁺：718.738，卡非佐米的理论精确分子量为：718.43，样品质谱结果与理论分子量相符。

以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种制备卡非佐米的方法，其特征在于，所示方法包括以下步骤：

步骤2，通过固相合成法，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH，偶联完毕，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二(2-氯乙基)醚合成***啉环，肽树脂裂解得到化合物I：

步骤3，化合物I与化合物II：发生缩合反应，即得到卡非佐米，其中，所述步骤2中树脂、二(2-氯乙基)醚和三乙胺的摩尔比为：1:1:3-1:1.2:3，反应温度为15-35℃，反应时间为3-5小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：

其中，步骤1所述的树脂固体载体采用2-CTC树脂，所述活化剂***选自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Phe-树脂为0.10-0.90mmol/g取代度的Fmoc-Phe-CTC树脂。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：

其中，步骤1所述的树脂固体载体采用王树脂，所述活化剂***由DIC、HOBt和DMAP组成，所述Fmoc-Phe-树脂为0.10-0.90/g取代度的Fmoc-Phe-树脂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：

其中，步骤2所述的固相合成方法，所述方法包括以下步骤：

1)采用由体积比为1:4的哌啶和DMF组成的去保护液脱除Fmoc-Phe-树脂上的Fmoc保护基，得到H-Phe-树脂；

2)在偶联剂***的存在下，H-Phe-树脂和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-Phe-树脂；

3)重复步骤1)、2)，依次偶联Fmoc-Homophe-OH、Fmoc-Gly-OH，得到Fmoc-Gly-Homophe-Leu-Phe-树脂；

4)偶联完毕，脱除Fmoc保护基，在三乙胺条件下往树脂中加入二(2-氯乙基)醚合成***啉环；

5)肽树脂裂解得到化合物I。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是：

树脂、二(2-氯乙基)醚和三乙胺摩尔比为：1:1:3，反应温度为15℃，反应时间为3小时。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是：

所述活化剂***由DIC、HOBt和DMAP组成；所述偶联剂***包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂选自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反应溶剂选自DMF、DCM、NMP、DMSO或它们之间的组合。