CN105273050B

CN105273050B - 咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯,其合成,活性及应用

Info

Publication number: CN105273050B
Application number: CN201410327836.2A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 彭玉龙
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-07-10
Filing date: 2014-07-10
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2034-07-10
Also published as: CN105273050A

Abstract

本发明公开了下式的3种3H‑咪唑并[4，5‑c]吡啶‑6‑甲酰‑N^G‑NO₂‑Arg‑AA‑OBzl(式中AA选自L‑Thr，L‑Ser和L‑Asp(OBzl)残基)，公开了它们的制备方法、公开了它们对肿瘤生长的抑制作用，公开了它们的抗炎活性，还公开了它们的体内抗血栓活性。结果表明，它们是具有抗肿瘤，抗炎症和抗血栓三重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。

Description

咪唑并吡啶-6-甲酰-氨基酸苄酯,其合成,活性及应用

发明领域

本发明涉及3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-硝基精氨酰-氨基酸苄酯，涉及它们的制备方法、涉及它们对肿瘤生长的抑制作用，涉及它们的抗炎活性，还涉及它们的抗血栓活性。本发明属于生物医药领域。

背景技术

癌症是一组可影响身体任何部位的多种疾病的通称。使用的其它术语为恶性肿瘤和赘生物。据世界卫生组织统计，癌症是世界上的头号死因之一，尤其是在发展中国家。而全世界癌症死亡人数预计将继续上升，到2030年将超过1310万。因此，开发新的高效，低毒，毒副作用小的抗肿瘤药物一直是新药研究的重要课题之一。

随着对肿瘤特性和发病本质的认识，发明人曾经公开下式代表的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)在1μmol/kg剂量下显示良好的抗肿瘤活性。通过进一步研究发明人认识到，在3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl的6-甲酰基和AA-OBzl基之间***N^G-NO₂-Arg残基，不仅可以延缓它的代谢达到提高抗肿瘤活性的目的，而且可以增加抗炎症和抗血栓活性。炎症和血栓都是危害肿瘤患者预后的并发症。通过这种修饰，获得具有抗肿瘤，抗炎症和抗血栓三重活性的化合物，具有良好的临床应用前景。根据这些认识，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl(式中AA选自L-Thr，L-Ser和L-Asp(OBzl)残基)。

本发明的第二个内容是提供制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl(式中AA选自L-Thr，L-Ser和L-Asp(OBzl)残基)的合成方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4，5，6，7-四氢-3H- 咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸与N^G-NO₂-Arg-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-OBzl；

(6)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-OBzl在NaOH溶液(2N)中皂化成3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg；

(7)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg与L-Thr-OBzl，L-Ser-OBzl和L-Asp(OBzl)-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl。

本发明的第三个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl对肿瘤细胞增殖的抑制作用。

本发明的第四个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl对肿瘤生长的抑制作用。

本发明的第五个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl的抗炎活性。

本发明的第六个内容是评价3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl的抗血栓活性。

附图说明

图1.3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl的合成路线.i)HCHO，H₂O，H₂SO₄，65℃；ii)MeOH，SOCl₂，0℃；iii)DMF，NMM，KMnO₄；iv)NaOH，H₂O，0℃；v)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并***(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF；vi)NaOH，H₂O，0℃；vii)二环己基碳二亚胺(DCC)，1-羟基苯并***(HOBt)，N-甲基吗啉(NMM)，DMF；8a中AA＝L-Thr残基，8b中AA＝L-Ser残基，8c中AA＝L-Asp(OBzl)残基。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)

冰浴下将15.0g(96.8mmol)L-组氨酸置于250mL圆底烧瓶中，加入50mL蒸馏水，再逐滴加入3mL浓硫酸，搅拌均匀，完全溶解后加入15mL甲醛溶液(40％)，60℃反应8小时。反应物冷却至室温，用浓氨水在冰浴下调pH至6，有大量无色沉淀析出，过滤。滤饼用水洗并干燥，得到15g(93％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)167[M+H]⁺。

实施例2 制备6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(3)

冰浴下在500mL茄瓶里加100mL甲醇，用恒压漏斗缓慢滴加10mL二氯亚砜，1小时后加入5.0g(30mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(2)，室温反应3天后，TLC显示反应完全，反应混合物减压浓缩，残留物加甲醇溶解并减压浓缩。该操作重复3次得无色泡状固体，再加***抽干重复3次得无色粉末，最后用甲醇/***重结晶得4.2g(55％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)181[M+H]⁺。

实施例3 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)

冰浴下在100mL茄瓶里加2g(7.9mmol)6S-4，5，6，7-四氢-3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯，加DMF使溶解。向该溶液中滴加1mL三乙胺调pH到8，分三次加入1.5g(9.4mmol)高锰酸钾。反应6小时后，TLC监测反应完毕。反应物减压浓缩至干，得到的黑色固体用1NHCl溶液溶解，冰浴下滴加2N NaOH溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.93g(66.4％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)177[M+H]⁺。

实施例4 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸(5)

冰浴下在100mL茄瓶里加3mL NaOH溶液(1.5N)，10min后加入0.93g(5.3mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酸甲酯(4)，反应1小时后TLC显示反应完毕，冰浴下向反应液中滴加2N HCl溶液调pH到7，析出大量无色固体。该固体以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂用硅胶柱纯化，得0.56g(65％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)163[M+H]⁺。

实施例5 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-OBzl(6)

称取194mg(1.2mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-羧酸于100mL茄形瓶中，加入20mLDMF。在冰浴和搅拌下依次加入211mg(1.6mmol)HOBt及333mg(1.6mmol)DCC，活化30min。称取676mg(1.4mmol)Tos·N^GNO₂Arg-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕后，反应混合物减压浓缩至干，残留物加50mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃水溶液(20mL×3)和饱和NaCl水溶液(20mL×3)各洗3遍，乙酸乙酯层用无水CaCl₂干燥，过滤，滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇为洗脱剂)，得到的淡黄色固体，经二氯甲烷/石油醚重结晶得200mg(37％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e)454[M-H]^-.Mp184-186℃.[α]_D ²⁵＝12.2(c＝0.12，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.19(s，1H)，9.04(s，2H)，8.57(s，1H)，8.52(s，1H)，8.26(s，1H)，7.44(m，5H)，5.18(d，J＝15.0Hz，2H)，4.63(dd，J＝5Hz，J＝15Hz，1H)，3.16(m，2H)，1.95(m，2H)，1.59(s，2H)。

实施例6 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg(7)

称取200mg(0.44mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-OBzl于100mL茄瓶中，加甲醇溶液使原料溶解，冰浴搅拌下滴加2N NaOH溶液调pH到11，冰浴下反应3小时，TLC显示反应完毕。，冰浴下向反应液中滴加饱和硫酸氢钾溶液调pH到7，反应化合物减压浓缩，残留物用甲醇复溶，滤去不溶物，滤液减压浓缩，得74mg(46％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：363[M-H]^-；Mp166-169℃.[α]_D ²⁵＝9.8(c＝0.19，甲醇).¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ/ppm＝13.14(s，1H)，8.99(s，2H)，8.65(s，2H)，8.54(s，1H)，8.53(s，1H)，8.29(m，2H)，4.60(dd，J＝5Hz，J＝15Hz，1H)，3.10(m，2H)，1.79(m，2H)，1.55(m，2H)。

实施例7 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-Thr-OBzl(8a)

称取182mg(0.5mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg于100mL茄形瓶中，加入20mL DMF。在冰浴搅拌下依次加入67.5mg(0.5mmol)HOBt及103mg(0.5mmol)DCC，活化30min。称取190mg(0.5mmol)Tos·Thr-OBzl于25mL小三角瓶中，用DMF溶解后，用NMM调pH至7，然后将该溶液滴加至茄形瓶的反应液中，最后用NMM调反应液pH值至8。室温反应过夜，TLC显示反应完毕，反应混合物减压浓缩至干，残留物加20mL二氯甲烷溶解，过滤除去二环己基脲(DCU)，滤液层依次用饱和NaHCO₃溶液(20mL×3)和饱和NaCl溶液(20mL×3)各洗三遍，有机层用无水CaCl₂干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，得到的黄色油状物经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝9∶1)纯化得124mg(44.9％)无色固体。ESI-MS(m/z)：554[M-H]^-；Mp：124.6.-128.3℃；[α]_D ²⁵＝-6.7(c＝0.19，甲醇)；IR(KBr)：3214，2935，1735，1650，1523，1451，1340，683；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.19(s，1H)，8.97(s，1H)，8.77(s，1H)，8.48(m，3H)，8.25(s，1H)，7.87(m，2H)，7.28(m，5H)，5.10(m，3H)，4.75(m，1H)，4.37(m，1H)，4.17(m，1H)，3.15(m，2H)，1.68(m，2H)，1.52(m，2H)，1.04(m，3H)。

实施例8 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-Ser-OBzl(8b)

按照实施例7的方法，从61mg(0.17mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg和63mg(0.17mmol)Tos·Ser-OBzl得22.7mg(24.8％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：540[M-H]^-；Mp：108.5-112.7℃；[α]_D ²⁵＝-8.2(c＝0.34，甲醇)；IR(KBr)：3209，3035，2345，1739，1643，1523，1454，698；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.17(s，1H)，9.00(s，1H)，8.75(d，J＝6Hz，1H)，8.65(d，J＝6Hz，1H)，8.55(s，2H)，8.25(s，1H)，7.89(m，2H)，7.33(m，5H)，5.14(m，3H)，4.73(m，1H)，4.28(m，1H)，3.75(m，2H)，3.15(m，2H)，1.75(m，2H)，1.55(m，2H)。

实施例9 制备3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg-Asp(OBzl)-OBzl(8c)

按照实施例7的方法，从182mg(0.5mmol)3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-L-N^G-NO₂-Arg和242mg(0.5mmol)Tos·Asp(OBzl)-OBzl得68.2mg(20.7％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/z)：658[M-H]^-；Mp：147.1-148.4℃；[α]_D ²⁵＝17.3(c＝0.22，甲醇)；IR(KBr)：3219，2964，1737，1649，1523，1459，1399，1176，732，628；¹H-NMR(500MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝13.16(s，1H)，8.98(s，1H)，8.78(d，J＝7Hz1H)，8.52(s，2H)，8.22(s，1H)，7.91(m，2H)，7.29(m，10H)，5.04(m，4H)，4.77(m，1H)，4.60(m，1H)，3.11(m，2H)，2.93(m，1H)，2.82(m，1H)，1.73(m，2H)，1.50(m，2H)。

实验例1 测定化合物8a-c的细胞毒作用

1)本发明的化合物8a-c用含0.1％DMSO的培养基配制成所需浓度。

2)实验用的肿瘤细胞为MCF-7(人乳腺癌细胞)，HL60(人早幼粒白血病细胞)，K562(人白血病慢性粒细胞)，S180(小鼠腹水瘤细胞)。

3)实验方法

MCF-7，HL-60，K562和S180细胞选用RPMI-1640培养基；培养基中含10％经灭活的胎牛血清和1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素。

贴壁细胞MCF-7和半贴壁细胞S180的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以3×10⁴个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8a-c与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒。继续培养48小时后，每孔加25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。小心除去上清液后每孔加入100μL的DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

悬浮细胞HL60和K562的培养：分别将生长状态良好，处于对数生长期的细胞以5×10⁴ 个/mL的密度接种于96孔板，每孔100μL，然后按预设的浓度梯度加入经灭菌处理的化合物8a-c与含0.1％DMSO的培养基配制成的溶液，每孔25μL，对照组加入等体积的溶解样品的溶媒，置于37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养48小时后，每孔加入25μL浓度为5mg/mL的MTT溶液，继续置于条件为37℃和5％CO₂的细胞孵育箱中培养4小时。2500rpm离心10min，小心吸出上清液，每孔加入100μL DMSO，振荡约10min溶解紫色残留物(甲瓒)，立即于酶标仪上检测O.D.(吸光度)值，波长为570nm。

按下式求出各个浓度下化合物8a-c抑制肿瘤细胞增殖的活性：

细胞增殖(％)＝(化合物8a-c组平均O.D.值/对照组平均O.D.值)×100％，实验重复3次，以细胞增殖对药物浓度作图，按作图法求出IC₅₀(半数有效抑制浓度)值。

4)结果见表1。结果表明，化合物8a-c抑制四种肿瘤细胞增殖的IC₅₀均大于100μM，没有细胞毒作用。

表1 化合物8a-c的体外抗肿瘤细胞增殖活性(IC₅₀，μM)

实验例2评价化合物8a-c抑制肿瘤生长的活性

1)本发明的化合物8a-c用含吐温80的生理盐水溶解，阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照，含吐温80的生理盐水作为阴性对照；

2)化合物8a-c，含吐温80的生理盐水和阿霉素均为腹腔给药，化合物8a-c的给药剂量为100nmol/kg和20nmol/kg，含吐温80的生理盐水的给药剂量为0-2mL/20g，阿霉素给药剂量为2μmol/kg，连续给药7天，共给药7次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)动物模型与治疗

无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0-2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，并按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0-2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种24h后，治疗组小鼠每日腹腔注射化合物8a-c，剂量为100nmol/kg和20nmol/kg。空白组小鼠每日腹腔注射0.2mL含吐温80的生理盐水。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素，剂量为2mol/kg。实验进行至第8天，称小鼠体重，***麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重，按如下公式计算抑瘤率：抑瘤率％＝(阴性对照组平均瘤重-化合物组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以表示。结果见表2。由表2可以看出，在100nmol/kg剂量下，化合物8a-c治疗小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物8a-c的有效剂量低达100nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低10倍。

由表2还可以看出，在20nmol/kg剂量下化合物8a治疗小鼠的瘤重明显小于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的瘤重，说明化合物8a的有效剂量低达20nmol/kg。这个有效剂量比发明人曾经公开的3H-咪唑并[4，5-c]吡啶-6-甲酰-AA-OBzl(其中AA代表甘氨基酸或其它L-氨基酸残基)的有效剂量1μmol/kg低50倍。

表2 化合物8a-c对S180荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

n＝15；生理盐水是含吐温80的生理盐水；a)与生理盐水组比p＜0.01，与20nmol/kg8组比p＜0.05，与阿霉素组比p＞0.05；b)与生理盐水组比p＜0.01，与20nmol/kg8组比p＜0.05。

实验例3 评价化合物8a-c的抗炎活性

1)实验方法

18-22g ICR雄性小鼠随机分为空白对照组、阳性用药组及给药组，小鼠使用前静息1天，操作间保持室内温度22℃，每组小鼠10只。一次给药30分钟后往小白鼠的左耳外廓涂二甲苯(0.03mL)，2小时后将小白鼠颈椎脱臼处死。将小鼠的左，右耳剪下，用直径7mm的打孔器在两耳的相同位置，取圆形耳片，分别称重，求出两圆耳片的重量差作为肿胀度。

肿胀度＝左耳圆片重量-右耳圆片重量。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.2mL/20g；阳性对照：阿司匹林，给药剂量为1.11mmol/kg；本发明化合物8a-c的给药剂量为20nmol/kg.

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，肿胀度以表示。

4)实验结果列入表3。

结果表明，在20nmol/kg剂量下化合物8a-c治疗小鼠的耳肿胀度明显低于含吐温80的生理盐水治疗小鼠的耳肿胀度。说明化合物8a-c在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有抗炎作用。

表3 化合物8a-c的体内抗炎活性评价

n＝10；生理盐水为含吐温80的生理盐水；在1.67μmol/kg剂量下阿司匹林没有抗炎症活性；a)与含吐温80的生理盐水组比p＜0.01。

实验例4 评价化合物8a-c的体内抗血栓活性

1)实验材料

实验动物：SD雄性大鼠(清洁级)，体重200±20g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，每12只大鼠为一组，空白和阳性对照各一组；

实验用插管由3段构成，中段长8.0cm，内径0.3cm，两端为相同的聚乙烯管，长10.0cm，内径0.1cm，外径0.2cm，该管的一端拉成尖管(用于***大鼠颈动脉或颈静脉)，3段管的内壁使用前均用1％的硅醚硅烷化。将提前称重的长6.0cm的丝线放入中段聚乙烯粗管内，粗管的两端分别与两根聚乙烯细管的未拉细端相套(其中一段将丝线压住0.5mm固定)。用注射器通过尖管端将管中注满肝素生理盐水溶液(50IU/kg)备用。

2)动物模型的建立

灌胃给药30min或腹腔注射后，将大鼠用20％的乌拉坦溶液(6mL/kg，i.p.)进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离出大鼠的左侧颈外静脉，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在暴露的左颈外静脉上小心地剪一斜口，将制备好的插管的未压线端尖管由斜口***左颈外静脉开口的近心端，用注射器通过另一端的尖管推入准确量的肝素生理盐水(50IU/kg)，此时注射器不撤离聚乙烯管，分离右侧颈总动脉，于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，结扎远心端，在离动脉夹不远处将右颈总动脉小心地剪一斜口。从聚乙烯管的尖部拔出注射器，将聚乙烯管的尖部***动脉斜口的近心端。旁路管道的两端都用4号手术缝线结扎固定。打开动脉夹，使血流通过旁路管道从颈动脉流向颈静脉。从开始循环时计时，15min后从旁路管道中取出挂有血栓的丝线，精确称重，丝线前后的质量差即为血栓湿重。

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，栓重以表示。

4)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.6mL/200g；阳性对照：阿司匹林，给药剂量为167μmol/kg；本发明化合物8a-c的给药剂量为20nmol/kg.

5)实验结果见表4。

从表4可以看出，化合物8a-c治疗大鼠的血栓重量明显小于含吐温80的生理盐水治疗大鼠的血栓重量。表明化合物8a-c在发挥体内抗肿瘤作用的剂量下，还具有抗动脉血栓生成的活性。化合物8b，c的抗动脉血栓生成的剂量比阿司匹林低8350倍。

表4 化合物8a-c的体内抗栓评价

n＝12；a)与生理盐水组比较p＜0.01；b)与生理盐水组比较p＜0.01，与阿司匹林组比较p＞0.05。

Claims

1.下式的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl，式中AA选自L-Thr,L-Ser和L-Asp(OBzl)残基

2.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl的制备方法，该方法包括：

(1)L-组氨酸在稀硫酸催化下与甲醛进行Pictet-Spengler缩合生成6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸；

(2)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-羧酸转化为6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(3)6S-4,5,6,7-四氢-3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯用高锰酸钾氧化为3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯；

(4)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸甲酯在浓度为2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸；

(5)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酸与N^G-NO₂-Arg-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-OBzl；

(6)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-OBzl在2N的NaOH溶液中皂化成3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg；

(7)3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg与L-Thr-OBzl,L-Ser-OBzl或L-Asp(OBzl)-OBzl偶联得到3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl。

3.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl在制备抗炎药物中的应用。

5.权利要求1的3H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-甲酰-N^G-NO₂-Arg-AA-OBzl在制备抗血栓药物中的应用。