CN105268023B - 小口径人造血管及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种小口径人造血管，其特征在于：所述小口径人造血管采用鱼鳔材料制成，其口径范围是约1mm‑6mm。本发明还提供一种制备如权利要求1所述的人造血管的方法，其特征在于，包括以下步骤：原材料预处理，取鱼鳔，去除表面***及血管，使用戊二醛溶液微压固定；材料裁剪，将固定后的材料裁剪成预定大小；缝合，将裁剪好的材料缠绕于支承件上，边缘对齐并缝合，形成所述人造血管。根据本发明的小口径人造血管，由于其采用了鱼鳔材料作为制作材料，经过实验证明由其制成的小口径人造血管与传统的使用牛心包制成的人造血管相比，具有更好的力学特性，更好的血管新生内膜覆盖，更佳的通畅性，更好的血液相容性，无钙化，无血管瘤形成。

Description

小口径人造血管及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种小口径人造血管，本发明还涉及一种制造小口径人造血管的方法，属于生物技术领域。

背景技术

人工血管在替代大动脉方面已取得满意的效果，然而在中、小动脉和静脉外科上，尚难以满足临床的要求。小动脉和静脉指直径<6mm的血管。由于因其材料生物相容性不佳导致的血栓形成和远期通畅率低等原因，离实际应用还有很大的距离。

血管壁的三层结构中，邻近管腔最内层为内膜,主要是内皮细胞；它们不仅是介于血管壁和血液之间的屏障结构，而且是体内一种代谢十分活跃的内分泌器官，能合成和分泌多种生物活性物质，如分泌一氧化氮、前列环素等活性物质，可有效防止血栓形成，维持血管收缩与舒张、凝血与抗凝血等平衡，在血管腔的表面形成一个抗凝血和抗血栓***，另外内皮细胞同血细胞一样表面带负电荷，因而具有抗血小板聚集、防止血液凝固和血栓形成的作用，从而保持血液的正常流动和血管的长期通畅。人工血管与自体血管的主要区别是无内皮细胞衬里，所以如何使人工血管内皮化显然尤为重要。人工血管内表面不能自发形成完整的内皮细胞覆盖层有关，当血液与人造内腔接触时，会引发血小板富集型血栓。因此，目前人们在设想构建人造血管时都主要考虑如何提高其内皮覆盖率或是直接使用可塑性强的物质作为内膜。

理想的人造血管应有良好的组织相容性、抗血栓性、物理稳定性、抗感染性和易使用性，而优良的力学性能和良好的血液组织相容性，则是人造血管技术突破的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种优良的力学性能和良好的血液组织相容性并且通畅性好的小口径人造血管。

为达到此目的，本发明采用了如下技术方案：

一种小口径人造血管，其特征在于：所述小口径人造血管采用鱼鳔材料制成，其口径范围是约1mm-6mm。

优选的，本发明的小口径人造血管，还可以具有这样的特征：

其中，所述鱼鳔取自鲤鱼。

另外，本发明的小口径人造血管，还可以具有这样的特征：

其中，所述鱼鳔取自鲢鱼。

另外，本发明的小口径人造血管，还可以具有这样的特征：

其中，所述鲤鱼的重量为4-4.5kg。

一种制备如权利要求1所述的人造血管的方法，其特征在于，包括以下步骤：原材料预处理，取鱼鳔，去除表面***及血管，使用戊二醛溶液微压固定；材料裁剪，将固定后的材料裁剪成预定大小；缝合，将裁剪好的材料缠绕于支承件上，边缘对齐并缝合，形成所述人造血管。

另外，本发明所提供的制备人造血的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述戊二醛溶液的浓度为0.625％。

另外，本发明所提供的制备人造血的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述预定大小为15mm×6mm。

另外，本发明所提供的制备人造血的方法，还可以具有这样的特征：其中，所述缝合步骤采用8-0丙烯线进行所述缝合，针距为1mm。

发明作用与效果

根据本发明的小口径人造血管，由于其采用了鱼鳔材料作为制作材料，经过实验证明由其制成的小口径人造血管与传统的使用牛心包制成的人造血管相比，具有更好的力学特性，更好的热稳定性，更好的血管新生内膜覆盖，更佳的通畅性，更好的血液相容性，无钙化，无血管瘤形成。

附图说明

图1是新鲜及交联处理后的鱼鳔的周、纵向单抽拉伸试验的应力-应变曲线；

图2是新鲜及交联处理鱼鳔与牛心包的周、纵向力学指标比较结果；

图3是戊二醛交联处理后的鱼鳔周、纵向和牛心包εf值比较结果；

图4是新鲜及交联后鱼鳔DSC曲线；

图5是使用鱼鳔材料制备好的人造血管；

图6是人造血管植入之后的后续实验的总实验流程图；

图7是鱼鳔和牛心包增厚的对比图；

图8是扫描电镜观察结果的内皮细胞覆盖情况图；

图9是人造血管Von Kossa染色结果；以及

图10是通畅人造血管管腔中段HE、VB染色结果。

具体实施方式

以下结合附图来说明本发明的具体实施方式。

实施例中所使用的试剂的配制

1、0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)：NaCl8.00g,KCl0.20g,Na2HPO4.12g,H2O3.22g,KH2PO 40.20g溶于900ml去离子水内，PH值调整至7.35，加入去离子水，体积调整至1000ml后，过滤消毒，分装后4℃保存。

2、0.625％戊二醛溶液：量取25％戊二醛溶液25ml，溶于975mlPBS缓冲液中，过滤消毒，分装后4℃保存。

3、0.2％戊二醛溶液：量取25％戊二醛溶液8ml，溶于992mlPBS缓冲液中，过滤消毒，分装后4℃保存。

4、肝素溶液：肝素钠1支(12500u)加之250ml生理盐水。4℃冰箱保存。

5、0.3％戊巴比妥钠溶液：1.2g戊巴比妥钠粉，生理盐水定容至40ml。4℃冰箱保存备用。

6、1％硝酸银溶液：硝酸银1g加蒸馏水至100ml。

7、3％硫代硫酸钠溶液：硫代硫酸钠3g，蒸馏水加至100ml。

8、0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0±0.1)：A液：0.1M柠檬酸：取21.01g柠檬酸加水至1000mL，B液：0.1M柠檬酸三钠：2.94g柠檬酸三钠加水至1000ml，取A液9ml和B液41ml加450ml蒸馏水(调pH至6.0±0.1)。

9、DSC溶液：4％甲醛溶液40ml，22％乙醇溶液220ml，tween-80试剂12ml，用ddH2O定容至1000ml。

一、取材

1.实验组取材

苏州市阳澄湖渔场挑选重量4-4.5kg的野生活鲤鱼，敲击处死，立即剖开腹部；获取鱼鳔并迅速置于无菌冰生理盐水中；取鱼鳔前部分并仔细除去表面附着脂肪及血管组织；冰生理盐水漂洗3次，每次10分钟；冰生理盐水中保存立即送至实验室；将新鲜鱼鳔平铺固定完全浸没于新鲜配置0.625％戊二醛溶液中，室温下，48小时；按周向、纵向裁剪成中间部分长1cm、宽0.7cm的哑铃形状；0.2％戊二醛溶液中室温保存备用。

2.对照组取材：戊二醛交联处理的小牛心包拉力样本

苏州市阳澄湖小牛屠宰场获得初生小牛；放血处死；立即开胸；获取完整心包膜并迅速置于无菌冰生理盐水中；仔细除去表面附着脂肪***；鱼鳔作为新型心血管外科手术生物材料的试验研究；冰生理盐水漂洗3次，每次10分钟；冰生理盐水中保存立即送至实验室；与鱼鳔同法固定，完全浸没于新鲜配置0.625％戊二醛溶液中，室温，48小时；向心方向裁剪成中间部分长1cm、宽0.7cm的哑铃形状；0.2％戊二醛溶液中室温保存备用。

以上样本均留取新鲜样本并裁剪成相同形状作为参照组。

二、检测物理性能

(一)单轴拉伸试验

试验目的

(1)由预试验中新鲜鱼鳔组织学染色、透射电镜结果表明，鱼鳔是由丰富的胶原纤维和弹力纤维组成的膜性结构。Victoria blue-van Gieson(维多利亚蓝-苦味酸酸性复红)染色可见鱼鳔胶原纤维排列规则有序，较致密，其中分布弹力纤维，排列致密。透射电镜显示胶原纤维主要呈周向排列，并可见完整弹力纤维及断端，推测弹力纤维在周向和纵向均有分布。戊二醛交联剂主要通过对胶原纤维进行交联固定，提高其力学强度，但无法交联弹力纤维，单轴拉伸试验即通过比较新鲜及交联后鱼鳔各项力学指标，验证胶原纤维分布特点。

(2)戊二醛处理后的牛心包已作为目前临床应用的主要生物瓣膜材料，本试验也通过单轴拉伸试验测定戊二醛交联后的牛心包力学参数，并与同样处理的鱼鳔进行比较。

(二)主要力学参数的定义和计算原理

(1)阿尔曼西应变(Almansi strain，ε)：该参数为如图1A所示的应力-应变曲线中横轴的读数。通过相对拉伸比(stretch ratio)λ经由公式ε＝0.5*(1-λ^-2)计算得来，其中，λ＝l/l₀，表示某一时刻试样的拉伸长度相对于其无张力下的初始长度的相对位移比率。上述公式中，l为拉伸试验过程中某个时间点试样的瞬时长度，l₀为试样的初始长度。

(2)柯西应力(Cauchy stress，σ)：该参数为如图1A所示的应变-应力曲线中纵轴的读数。表示拉伸过程中某一时刻力学试样单位截面积上所承受的载荷大小(N/cm²)，经由拉压力传感器记录到的某时刻瞬时应力载荷乘以此时的相对位移。比率λ＝l/l₀(l为拉伸试验过程中某个时间点试样的瞬时长度，l₀为试样的初始长度)，再除以试样的初始厚度和宽度的乘积获得，计算公式为σ＝(F*λ)/(w₀*t₀)。其中，F为瞬时应力载荷，w₀和t₀分别为试样的初始宽度和厚度。由于本实验材料是变形材料，所以在拉伸过程中，沿拉力方向显著拉长变形的同时横截面积随拉长而减少。如假设泊松比为0.5，管壁在拉伸过程中体积相对恒定，因此某一时刻试样对应的瞬时横截面积应为S＝(w₀*t₀*l₀)/l，简化得到S＝(w₀*t₀)/λ。因此，σ＝(F*λ)/(w₀*t₀)＝F/[(w₀*t₀)/λ]＝F/S，即某一时刻试样所承受的瞬时应力大小。

(3)弹性模量(Elastic modulus，M)：该参数为如图1A所示的应变-应力曲线中，具体某一点对应的斜率值，以及图1-3的弹性模量-应力曲线中纵轴的读数。M表示在该应变程度时，单位应变所对应的单位面积所承受应力变化。

(4)屈服点(Yield point)：即组织毁损点(Failure point)：在如图1B所示的正常生物材料的应力-弹性模量曲线上，我们可以发现该曲线由两部分组成，前面一部分其x和y轴数据呈线性关系，表示在单位面积在承受该范围内的载荷时，等量应力的增加将伴随等量弹性模量的增加，二者呈线性正比关系，提示在材料拉伸并承受载荷的初始阶段，其主要表现出的力学特性是组织微观结构完好的情况下所具有的正常拉伸-弹性模量关系。而在该曲线的后半部分，应力和弹性模量的增加不再呈现线性的增长关系，具体表现为：应力即使再进一步增加，材料的弹性模量也不再有对应量的增加，M随应力增加的步伐放缓。这提示在这一应变及载荷范围内，管壁组织开始有了一定程度的毁损，直至最后完全断裂。由第一阶段向第二阶段转变的拐点即所谓屈服点。该点所对应的柯西应力大小，阿尔曼西应变大小以及弹性模量分别记做σy、εy及M在应变-应力曲线上，屈服点之前的应变ε和应力σ关系服从以Levenberg Marquardt法则行最小二乘法拟合的指数函数σ＝σ⁰+a*e^bε，且M₀＝-σ₀*b。其中，M₀和b分别是应变-弹性模量曲线上纵轴的截距和对应的斜率，分别代表在没有附加载荷的情况下或外力拉伸时，试验样本组织固有的僵硬度。屈服点反映在上述公式上，即经拟合上述函数可得到最大的相关系数R所对应的点。相反的，在应力-弹性模量曲线中，应力和弹性模量的非线性关系段始于在弹性屈服点，并终止于所谓组织毁损点，该点所对应的柯西应力大小，阿尔曼西应变大小以及弹性模量分别记做ε_f、σ_f及M_f，表示组织在拉伸至毁损前的极限拉伸程度，可承受的最大载荷以及毁损时所对应的弹性模量。在二者之间，尚存在一特征性的力学点，即在应力-弹性模量曲线中，非线性段组织毁损前弹性模量的绝对值到达最高的点，该点所对应的柯西应力大小，阿尔曼西应变大小以及弹性模量分别记做σp、εp及Mp。

(三)单轴拉伸试验的实施

(1)设备：Shore Western306拉扭复合生物力学试验机，精度为0.1N的50NInterface拉压力传感器，组织夹具。

(2)具体操作步骤

1)开启Shore Western 306拉扭复合生物力学试验机，校零，调试设备，确保微机上的其他参数设定合理。

2)将预先修剪好的纵向或周哑铃状鱼鳔及牛心包组织拉伸试样用电子游标卡尺测定其中间部分的长度、宽度以及厚度，共测3次取均值，并将数据输入微机以用于在拉伸至组织断裂后计算εf、σf及Mp等力学参数。

3)将试样两端包好砂纸以防止滑脱后放于合适位置。开启夹具，使样本组织在非拉伸状态固定于上下两个机械手臂之间，具体固定方法参照以往文献。而后，下方机械臂静止不动，上方机械臂以预先设定好的5mm/min的匀速拉伸速率单轴向上拉伸试样直至其中间部分断裂。微机将拉压力传感器感受到的外力大小正好大于0的那个瞬间两机械手臂之间的距离默认为试样的初始长度。

4)在拉伸试样的同时，微机将实时记录应力-应变曲线(Strain-stress curve)直至试样中间的细窄部分出现撕裂毁损并导致微机上所记录到的应力突然减小为标志。在该曲线中，横坐标为ε；纵坐标为某一时刻传感器感受到的实际拉力的大小此时拉伸试样的横截面积，即σ，其单位为MPa。

(3)主要测定参数

微机根据记录到的应变-应力曲线(S-S曲线)的实时数据，后期拟合获得应力-弹性模量曲线(Elastic modulus-stress curve)。由此计算得到某个试样(周向和纵向的力学试样)在拉伸至毁损前的εf、σf及Mp等力学参数。其中，弹性模量为应变-应力曲线中某一时刻曲线的斜率。

(4)、注意事项：

1)为确保组织新鲜，所有标本的力学拉伸试验均应在获取标本后24小时内进行。

2)使用Shore Western 306拉扭复合生物力学试验机必须现对机器校零，并测试拉力传感器是否感受良好。

3)试样两端用于夹具固定处应报以沙皮纸，以防止组织在拉伸过程中滑脱或撕裂。

4)为消除生物组织的应力松弛效应对试验结果的影响，在每个样品试件在正式实验前，均以5mm/min的拉伸速度进行了3次小范围的加载拉伸和卸载松弛，以减少其应力松弛效应。

5)由于本实验组织较薄且光滑，且组织较为脆弱；夹具对其固定有时并不十分牢固，故有可能在拉伸过程中出现试样滑脱，或因夹具固定过紧而导致试样首先在夹具固定处断裂，从而记录到无效的力学参数。试验时必须记录在拉伸过程中未发生标本滑脱，且组织最终从中间较窄处断裂的标本对应的力学参数用于统计。

6)对每一例测试的试样，必须明确记录其组织名称、方向、以及中间部分的精确宽度、厚度。

7)在拉伸过程中必须均匀向标本两侧喷洒PBS液或生理盐水保持组织湿润。

8)每一例试样测试完毕后均应做好标本的后处理工作。

(二)、差示量热扫描的实施

(1)设备：DSC204F1差示量热扫描仪

(2)具体操作步骤

1)开机准备：打开氮气钢瓶阀门，调节减压阀使工作压力为0.03-0.04MPa；开启仪器背后电源，待仪器左侧Close绿灯亮后，按下仪器上部INIT键；打开计算机电源，打开“NETZSCH Proteus”，进入“DSC 204F1 Phoenix on USBc1”软件操作界面。

2)样品准备：样品放入坩埚中，每次试验样品量5-10mg；同时按下仪器左侧“open/close”按钮和仪器右侧的“safety”按钮来控制炉体开关，放入坩埚，参比侧使用空坩埚，参比坩埚置于传感器左边，样品坩埚在右侧。

3)实验方法：选择“文件”菜单中“新建”进入编程文件；选择测量类型为“杨平”，输入样品名称、编号；选择默认的标准温度校正文件，然后打开；进入“温度程序”部分编辑测试方法，设定温度范围：0-100℃，升温速率：10℃/min，开启吹扫气和保护气，流量分别设定为20ml/min和60ml/min；确认后按“start”键开始测量。

(3)主要测定参数

设定向上为放热，记录出现吸热峰的顶点温度为材料热变性温度，即热皱缩温度。

(4)注意事项

1)为确保组织新鲜，所有标本的该项试验均应在获取标本后24小时内进行。

2)吸水纸吸取样本表面多余分水，裁剪合适大小。

3)为保证试验结果，样本需取自不同鱼鳔鱼鳔。

4)每一例试样测试完毕后均应做好标本的后处理工作。

数据统计

两组中所有数值型数据以均数±标准差表示，统计学处理采用独立样本T检验两两比较相应处理鱼鳔及牛心包，若方差不齐，则采用t’检验进行比较。所有统计学计算均采用Graphpad统计制图软件处理。P>0.05认为无统计学差异，P<0.05认为统计学差异显著，P<0.01则认为统计学差异十分显著。

一、单轴拉伸试验

鱼鳔在周、纵向的纤维分布不同，牛心包纤维排列方向性不明显，通过单轴拉伸试验得出其S-S曲线，如图1所示，最终得到各鱼鳔样本周向、纵向以及牛心包向心方向力学参数，即断裂时最大拉伸程度ε_f、断裂强度σ_f及断裂时所对应的弹性模量Mp，见表1-1、表1-2、表1-3、表1-4。对比分析新鲜及交联处理后鱼鳔组周、纵向的力学差异，如图1-8所示，以及对比交联后鱼鳔和交联后牛心包力学差异如图3所示。结果显示：(1)无论新鲜或是戊二醛交联后鱼鳔在周向的三个力学结果均高于纵向。(2)戊二醛处理后鱼鳔周向的σ_f、MP均高于同方向的新鲜鱼鳔，两者ε_f无显著统计学差异。(3)戊二醛交联后鱼鳔纵向ε_f大于同方向新鲜鱼鳔，两者σ_f、MP无显著统计学差异。(4)戊二醛处理后牛心包σ_f、MP均高于新鲜牛心包，两者εf无统计学差异。(5)两材料经戊二醛处理后，鱼鳔周向及纵向σ_f、MP均低于牛心包，ε_f显著高于牛心包。

(一)、新鲜及交联后鱼鳔的εf在周、纵向的力学测试结果，如表1-1所示

(1)新鲜鱼鳔周、纵向的εf测试结果

单轴拉伸力学测试结果显示新鲜鱼鳔在拉伸至毁损前的周向εf为53.37±5.03(％)，高于纵向值30.25±2.23(％)(P<0.001)，提示新鲜鱼鳔在周向具有更好的可拉伸性及扩张储备力。

(2)戊二醛交联处理后鱼鳔周、纵向的εf测试结果

经戊二醛交联的鱼鳔，周向的最大拉伸程为51.20±9.61(％)高于纵向值40.45±3.56(％)(P<0.05)。

(3)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔周向的εf测试结果

新鲜及交联两组鱼鳔在周向的εf并无统计学差异。提示戊二醛处理对该方向的可拉伸性并无显著影响。

(4)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔纵向的εf测试结果

两组鱼鳔在纵向的εf存在统计学差异。

(二)新鲜及交联后鱼鳔的σf在周、纵向的力学测试结果，见表1-2

(1)新鲜鱼鳔周、纵向的σf测试结果

单轴拉伸力学测试结果显示新鲜鱼鳔的周向极限断裂强度为8.72±1.25MPa高于纵向5.84±0.99MPa(P<0.01)，提示新鲜鱼鳔在周向具有更大力学强度，表明胶原纤维主要在周向分布排列。

(2)戊二醛交联处理后鱼鳔周、纵向的σf测试结果

在戊二醛交联后的鱼鳔中，周向的极限断裂强度为13.14±1.68MPa高于纵向值7.27±1.31MPa(P<0.001)。提示戊二醛处理后，周向、纵向这一差异更明显。

(3)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔周向的σf测试结果

处理后鱼鳔周向极限断裂强度高于处理前，可见戊二醛加固了该方向上排列的纤维，进一步正式该方向排列以胶原纤维为主。

(4)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔纵向的σf测试结果

本组结果显示，鱼鳔纵向处理前后并无统计学差异。可见戊二醛交联对该方向的纤维力学强度影响不大。

(三)新鲜及交联后鱼鳔的MP在周、纵向的力学测试结果，见表1-3

(1)新鲜鱼鳔周、纵向的Mp测试结果

如图2所示，通过拟合计算出Mp值，结果显示新鲜鱼鳔的周向模量Mp34.66±6.75MPa高于纵向值24.30±4.23(P<0.05)，提示新鲜鱼鳔在周向上刚性更大，具有更大的抗弹性形变能力。

(2)戊二醛交联处理后鱼鳔周、纵向的Mp测试结果

如图2所示，在戊二醛交联后的鱼鳔中，周向的Mp52.93±3.57MPa高于纵向28.29±3.43MPa(P<0.001)。表明戊二醛处理后，周向刚度仍大于纵向。

(3)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔周向的Mp测试结果

处理后鱼鳔周向Mp值高于处理前，表明戊二醛对周向排列纤维的固定影响交大。

(4)新鲜鱼鳔、交联后鱼鳔纵向的Mp测试结果

如图2所示，本组结果显示，鱼鳔纵向处理前后并无统计学差异。可见戊二醛交联对该方向的纤维刚度影响并不大。

四)、交联后鱼鳔周向、纵向及牛心包向心方向的εf、σf、MP比较结果对比戊二醛交联后鱼鳔和牛心包材料各力学参数(表1-4)可以得到以下结果：1：戊二醛处理后鱼鳔在周向及纵向的最大拉伸程度均显著高于牛心包(图3)，可见鱼鳔在两个方向上延展性能均优于牛心包；2：交联后的鱼鳔无论在周向或是纵向，其最大断裂强度显著低于牛心包(图3)，可见鱼鳔材料的最大力学强度弱于牛心包；3：交联后的鱼鳔无论在周向或是纵向，其断裂时所对应的弹性模量均显著低于牛心包，如图3所示，故牛心包材料刚性较强，并显著高于鱼鳔，也说明牛心包比鱼鳔相比经戊二醛处理后更僵硬。

(五)新鲜及交联后牛心包向心方向的εf、σf、MP测试结果

对比新鲜及戊二醛交联后牛心包向心方向各力学参数可见，见表1-4，戊二醛处理后牛心包断裂时的最大拉伸程度εf并无明显改变，但其断裂时最终断裂强度σf及弹性模量MP均增加，可见经戊二醛交联处理后，牛心包材料延展性并未增加，但其抗拉伸性能增强，刚性增加，与新鲜心包材料相比，更加僵硬。

表1-1各组鱼鳔不同方向ε_f测试结果(mean±SD，n＝5)

表1-2各组鱼鳔不同方向σf测试结果(mean±SD，n＝5)

表1-3各组鱼鳔不同方向Mp测试结果(mean±SD，n＝5)

表1-4牛心包单轴拉伸试验结果(n＝5)

二、差示量热扫描试验的结果

将样本行差示量热扫描检测后，每一样本均得到DSC曲线，见图4，图4中实线代表新鲜鱼鳔，虚线代表交联后鱼鳔。若以向上为放热方向，则可记录到一明显吸热峰，该峰顶点温度即材料热变性温度。如表1-5所示。新鲜鱼鳔热变性温度为63.56±0.94℃，经戊二醛处理后鱼鳔热稳定性升高，变性温度升高至81.89±0.60℃，且两组统计学差异显著。

表1-5新鲜及戊二醛处理后鱼鳔热皱缩温度

^#：mean±SD，n＝5，***：P＜0.001

单抽拉伸试验中生物材料断裂强度主要反应胶原纤维性质，即与胶原纤维排列方向一致时力学强度大，经戊二醛交联后，胶原纤维之间连接更稳定，进一步增加其力学强度，但无法对弹力纤维起到交联作用。本实验中拉力结果显示，鱼鳔周向力学强度显著高于纵向，且戊二醛交联后差异更显著，表明其胶原纤维以周向排列为主，与牛心包相比，鱼鳔交联后最大拉伸程度高于牛心包，表明两种材料虽然均经戊二醛交联，但鱼鳔延展性能显著优于牛心包；交联后牛心包断裂时拉伸强度及弹性模量均显著高于鱼鳔，表明牛心包比鱼鳔力学强度大，刚性强。热稳定性方面鲤鱼来源的鱼鳔可以达到人体内温度要求，且戊二醛交联处理后热稳定性进一步提高。

四、体外细胞毒性试验

按照第一部分中所提供的取材和处理方法，得到戊二醛交联后鱼鳔及牛心包进行试验。

根据ISO 10993医疗器械生物相容性评价内容第一部分《评价与试验》，本实验部分选取其第四部分《与血液相互作用试验选择》以及第五部分《体外细胞毒性试验》作为检测鱼鳔作为新型心血管生物材料以及动物实验前体外生物相容性评价的内容。

试验分组及样品制备

本试验根据ISO 10993建议，分别使用0.5％苯酚溶液、高密度聚乙烯作为阳性及阴性对照。无菌操作按下表比例(样品材料面积：浸提液体积)用含10％胎牛血清的MEM培养液浸提样品，于37℃，5％CO2培养箱中浸提24小时。同法制备空白对照、阴性对照样品和阳性对照样品

实验步骤

在含10％胎牛血清和抗生素(青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml)的MEM培养液中培养L929细胞，37℃，5％CO2培养箱中；用0.5％胰酶(含EDTA)消化细胞制备成单细胞悬液离心(200g，3min)；将细胞重新分散于培养基中，调整细胞密度为1x10⁵个/ml的细胞悬液；接种上述细胞悬液到1个96孔培养板中，每孔100μL；5％CO2，37℃，大于90％湿度培养24小时；待细胞长成单层后，吸出原来的培养液，分别加入100μl不同浓度的试验样品浸提夜100％、75％、50％、25％、空白对照液、阳性对照(100％)和阴性对照液(100％)每组做5个平行样；37℃，5％CO2培养24小时

细胞形态学观察：

取出96孔板显微镜下观察；吸出原来的培养液，每孔加50μLMTT(1mg/ml)，培养2小时；吸弃上清，加100μL99.9％纯度的异丙醇溶解结晶。

测定吸光度值：

酶标仪上以570nm为主吸收波长；

计算细胞活力百分比：

细胞活力％＝试验(或阳性及阴性)样品组[OD570-OD650]/空白对照组[OD570-OD650]×100％。

戊二醛交联后鱼鳔及牛心包试剂样品浸提液与生长旺盛的L929细胞培养，37℃，5％CO2条件下，24小时后，观察细胞形态，细胞裂解情况，采用MTT法测定材料的潜在细胞毒性。24小时结果显示100％鱼鳔样品浸提液的细胞活力为85.7％，100％牛心包样品浸提液的细胞活力为94.2％，对照组结果显示本次试验结果有效。试验标准细胞活力＜空白组70％，说明样品具有潜在的细胞毒性，因此得出结论，在本次试验条件下，新鲜鱼鳔及牛心包浸提液对L929细胞均无毒性影响。

表2-1体外细胞毒性试验分组

新鲜鱼鳔实验组	新鲜鱼鳔	含10％胎牛血清的MEM培养液浸提
			新鲜牛心包实验组	新鲜牛心包	含10％胎牛血清的MEM培养液浸提
阳性对照组	0.5％苯酚溶液	含10％胎牛血清的MEM培养液为溶液
			阴性对照组	高密度聚乙烯	含10％胎牛血清的MEM培养液浸提

表2-2样品没提条件

五、体外血小板激活试验

实验步骤

对照管：5μl全血经100μlPBS稀释后分别加入同型对照IgG1-PE和CD61-FITC各10μl；

试验管：5μl全血经100μlPBS稀释后分别加入CD62P-PE和CD61-FITC各10μl；

对照管和试验管各自轻轻混匀，室温避光孵育20分钟；各管中加入1ml冷1％多聚甲醛PBS缓冲液，温度为2-8℃；24小时内送样上机分析，收集2万个血小板，荧光强度以对数放大。分组见表2-3。

采用CD62P检测法的原理：

血小板外形呈圆盘形，平均直径为2-4μm，厚度约1μm。电镜下超微结构显示：有细胞膜及外衣组成，细胞膜由类脂双分子层和糖蛋白构成；外衣主要由糖蛋白的糖链部分组成，包含着与血小板粘附和聚集功能密切相关的一些重要受体。作为黏附分子中选择素家族的一员，CD62P参与构成血小板α颗粒的细胞膜，静止血小板胞浆内α颗粒含有CD62P，当血小板被刺激活化后，颗粒内糖蛋白向膜外释放，CD62P就会迅速在细胞表面高表达。本实验中使用CD62P-PE作为血小板活化后期的标志物，特异地与活化血小板结合，CD61-FITC作为特异的泛血小板表面标记，既与活化血小板结合，也与未活化血小板结合，通过两者定量分析，计算活化血小板百分比。目前CD62P检测已被ISO 10993推荐作为公认的检测血小板激活程度的方法，是检测刺激、活化血小板的敏感指标。

按照ISO10993试验原则，本实验使用健康正常人血浸提样品，测定鱼鳔及牛心包实验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组的CD62P含量，见表2-5。鱼鳔试验组、牛心包试验组、阴性对照组、阳性对照组和空白对照组的结果分别为0.94±0.27％、1.73±0.35％、1.19±0.26％、7.52±0.50％和1.13±0.26％，方差分析显示P＜0.0001，组间差异有统计学意义。进一步行Dunnett-t检验两两比较，牛心包试验组与阴性对照组差异有统计学意义，鱼鳔试验组与阴性对照组差异无统计学意义，鱼鳔试验组及牛心包试验组与阳性对照组差异均有统计学意义。结合参考标准，可以认为在本实验条件下0.625％戊二醛处理鱼鳔和牛心包对体外人血血栓形成没有影响。

表2-3血小板激活试验分组及浸提要求

组别	材料	浸提比例	培养条件
				鱼鳔实验组	交联处理鱼鳔	6cm2鱼鳔∶1ml全血浸提	37℃60mins
牛心包实验组	交联处理牛心包	6cm2牛心包∶1ml全血浸提	37℃60mins
				阳性对照组	Zymosan A	0.01gZymosan A∶1ml全血浸提	37℃60mins
阴性对照组	人血γ球蛋白	0.01g球蛋白∶1ml全血浸提	37℃60mins

表2-5各组测得CD62P百分率(％)

六、体外溶血试验

游离血红蛋白直接测定法原理：

溶血发生时，血浆游离血红蛋白量增高，血浆游离血红蛋白浓度是一种测定红细胞损伤的简易方法，本实验根据其中的“游离血红蛋白直接测定法”对鱼鳔的溶血性进行评定，且使用最理想的溶血材料——人血红细胞进行试验。

实验组1、2于无菌操作环境下，取试管3支，按下表加入试验样品及0.9％氯化钠注射液，按表2-4比例(样品面积：浸提液体积)用0.9％氯化钠浸提样品，于37℃培养箱中浸提30mins。阴性对照组：取试管3支，每管加入10ml0.9％氯化钠注射液；阳性对照组：取试管3支，每管加入蒸馏水10ml。

表2-4体外溶血样品分组及浸提条件

组别	材料	浸提比例	实际取样	浸提条件	浸提液pH值
						实验组1	0.625％处理鱼鳔	6cm2∶1ml	18cm2∶3ml	37℃，30mins	6.8
实验组2	0.625％处理牛心包	6cm2∶1ml	18cm2∶3ml	37℃，30mins	6.8
						阳性对照	蒸馏水
阴性对照	0.9％氯化钠

实验步骤：

将实验组、阴性对照、阳性对照组各3支试管全部放入恒温水浴中，37℃，30mins；每支试管加入0.06ml稀释人血，轻轻混，37℃，60mins；倒出管内液；离心，2500rpm，5mins；吸出上清液倒入比色皿；测量吸光度值：分光光度计在545nm波长处测量各组3管吸光度。

各组吸光度值如表2-6所示，方差分析显示组间差异有统计学意义，P＜0.0001，进一步行Dunnet-t检验两两比较，鱼鳔试验组、牛心包试验组与阳性对照组差异均有统计学意义；与阴性对照组差异均无统计学意义。根据前述公式计算溶血率显示戊二醛处理后鱼鳔溶血率为0.2％，牛心包溶血率为0.6％，参考评价标准可以认为0.625％戊二醛处理后鱼鳔及牛心包材料均对溶血性能没有影响。

表2-6各组吸光度值

七、大鼠皮下埋植钙化实验

一、试验动物及材料制备

(一)试验动物：

选取3周龄雄性SD大鼠21只，体重40-50g，第二军医大学动物中心提供

(二)原材料获取：

(1)新鲜鲤鱼(4-4.5kg)鱼鳔：参见第一部分内容。

(2)新鲜雄性小牛心包：参见第一部分内容。

(三)原材料后处理：

(1)原理：

在戊二醛处理的基础上加用失活剂乙醇、表面活性剂Tween80和交联剂***配制成的DSC溶液处理材料，已实验证明该法可减轻牛心***下埋植钙化程度。

(2)处理步骤：

新鲜鱼鳔及牛心包，冰生理盐水中，4小时内送至实验室；去除表面***及血管，修剪，冷生理盐水漂洗3次，每次10min；平铺材料，新鲜配置0.625％戊二醛溶液微压固定，室温，48小时；无菌生理盐水振荡清洗1小时；新鲜配制的“DSC”溶液，37℃，9h；无菌生理盐水振荡清洗1小时；无菌环境下裁剪两种生物材料成大小1x1cm²片状。

二、皮下埋植手术操作

(一)、手术步骤：

(1)动物麻醉：采用戊巴比妥钠(pentobarbitalum natricum)腹腔内注射麻醉，剂量为30mg/kg体重；

(2)术野皮肤剪毛、碘伏消毒、铺消毒巾。

三、样本取出

(1)时间点：分别于术后第7天、21天、56天处死大鼠，取出样本；

(2)只数：每次7只大鼠；

(3)样本数：每只大鼠背部可得到2块鱼鳔样本和2块牛心包样本，每个时间点总共可得到14块鱼鳔样本及14块牛心包样本。

实验结果：

一、样本大体外观

不同时间点皮下样本均可见表面被覆大鼠的纤维***，样本完整。观察7天鱼鳔及牛心包样本与埋植时无明显差别，质软；21天取出鱼鳔样本可见局灶钙化斑块形成，同期牛心包片几乎完全被钙化斑块覆盖，仅边缘小部分可见柔软的正常心包组织；56天取出鱼鳔样本可见钙化斑块较前融合增大，但周围仍有正常鱼鳔组织，同期牛心包材料严重钙化，质脆易裂，未见正常柔软组织。

二、组织形态学研究

HE染色示对照组牛心包纤维排列较鱼鳔致密，两者纤维排列连续、均匀。皮下埋植7天后样本染色结果显示两种材料纤维排列连续均匀，牛心包中出现宿主细胞浸润。21天结果显示鱼鳔材料纤维排列仍连续均匀，比较7天时变化不大，但同期牛心包纤维排列出现紊乱，断裂现象，主要因为钙化破坏；56天结果显示鱼鳔纤维局部因钙化破坏，周围大部分仍为正常组织，但牛心包纤维完全断裂、钙化破坏严重。

DSC试剂是减轻牛心包钙化的试剂，本发明所使用的材料仅在与牛心包进行对比实验时，为了保持对照条件一致使用此试剂，在制作小血管的过程中完全不需要采用此种试剂，但钙化却比牛心包低。

七、人造血管制备方法

试验动物及材料制备

(一)试验动物：

选取成年雄性SD大鼠24只，体重250-300g(第二军医大学动物中心提供)。

(二)原材料获取：

(1)新鲜鲤鱼(4-4.5kg)鱼鳔：参见第一部分内容。

(2)新鲜雄性小牛心包：参见第一部分内容。

(三)原材料后处理：

新鲜鱼鳔及牛心包，冰生理盐水中，4小时内送至实验室；去除表面***及血管，修剪，冷生理盐水漂洗3次，每次10min；平铺材料，新鲜配置0.625％戊二醛溶液微压固定；0.2％戊二醛溶液中常温保存备用。“微压”指将鱼鳔材料平铺后，其自然回缩的力。

血管移植手术操作：

(一)人工血管制备，见图5：

将生物材料裁剪成长度大于15mm，宽度约6mm长方形条；缠绕于直径1.4mm无菌针头，边缘对齐；8-0丙烯线间断缝合，针距约1mm；0.2％戊二醛溶液中室温保存备用。

(二)、手术步骤

1、大鼠采用戊巴比妥钠(pentobarbitalum natricum)腹腔内注射麻醉，剂量30mg/kg；

2、腹部术野皮肤剪毛、碘伏消毒、铺消毒巾；

3、腹部正中纵行剪开长约4cm切口，撑开器撑开固定，暴露腹主动脉；

4、镜下仔细游离自肾动脉远端至髂动脉分叉近端的腹主动脉，并结扎其分支；

5、使用胰岛素针经下腔静脉注射肝素，10单位/100g体重；

6、准备人造血管，使用前需无菌生理盐水反复冲洗；

7、紧贴肾动脉远端及髂总动脉分支近端阻断腹主动脉，剪去合适长度腹主动脉；

8、肝素生理盐水冲洗动脉断端；

9、显微镜下用8-0丙烯线间断缝合，将人造血管与腹主动脉近远端切口行端端吻合；

10、松开阻断夹，观察动脉搏动是否良好，吻合口止血；

11、常规逐层关腹；

12、术后连续三天给予阿莫西林150mg/kg，2次/天，无任何抗凝处理。

(三)、注意事项

(1)血管缝制及手术过程严格按照无菌操作原则。

(2)按照ISO 10993要求，小口径人造血管长度至少为口径的10倍。

(3)注射肝素时避免出血，应使用胰岛素注射器等小口径针头注射肝素。

(4)吻合完毕开放前注意排气，防止气栓，仔细止血。术后注意保暖。按照《实验动物管理条例》正常饲养。

三、试验设计人造血管植入后总的实验流程见图6

(一)、分组及样本取出

(1)分组：鱼鳔材料及牛心包材料分别行血管移植，每种材料12只；共分成4组；

(2)处死时间点：分别于术后第30天、60天取出血管；

(3)样本数：每只大鼠可得到一根人造血管样本，每个时间点总共可得到6根鱼鳔血管及6根牛心包血管。

术后早期通畅率评估

(1)原理：采用多普勒超声机器加血管探头，可在无创条件下大致评估人工血管通畅情况，并记录管腔最大流速，由此评估其是否有手术导致的狭窄情况，以排除人为因素对试验结果的影响。同时也避免了反复有创操作对试验动物的伤害，简便易行。

3％戊巴比妥钠大鼠腹腔麻醉(30mg/kg)；超声室行腹主动脉超声检查；鉴定通畅与否，并记录管腔内最大血流速度；统计分析两组流速值并判断是否存在人为因素引起血管狭窄

血管CTA三维重建

(1)原理：有创操作造影剂静脉注射后行320排高分辨率CT断层扫描并进行三维重建，可清晰反应血管通畅、闭塞、吻合口及管腔有无狭窄。

(2)步骤：

3％戊巴比妥钠大鼠腹腔麻醉(30mg/kg)；颈静脉插管：纵行切开右侧颈部皮肤约2cm，分离颈静脉；远端结扎，近端套线以备固定；静脉留置针穿刺，进针约1.5cm，套线固定，肝素封管；腹主动脉320CT螺旋扫描：碘普罗胺造影剂0.5ml/kg；三维重建；通畅率计算、狭窄情况评估。

术后早期通畅率评估结果

超声检查结果显示，两组实验动物3天时腹主动脉通畅率均为100％，鱼鳔组人造血管管腔最大流速为63.50±4.99cm/s，牛心包人造血管管腔最大流速为62.55±6.89cm/s。两组数值经独立样本T检验显示，差异无统计学意义。

因此，术后早期未发生因手术因素的人造血管管腔闭塞，小口径人工血管置换术后早期效果均良好，通畅率满意。且该两组间并未因手术因素出现明显峰值流速差别，为各时间点组间比较提供了可比性基础，使人为因素减小到最低。

七、小血管组织形态学研究

(1)原理：苏木精-伊红(HE)染色，明确血管样本大体形态及管壁纤维排列。VG染色胶原纤维红染，弹力纤维蓝染,可借此判断有无新生弹力纤维层形成及初步评估增生程度。

(2)步骤：

取出人造血管；若官腔通畅，将其套于细针头上以维持形态；10％***溶液室温固定12小时；脱水、石蜡包埋、切片。

不同时间点血管表面均可见宿主纤维薄膜覆盖，样本完整，各时间点鱼鳔血管均通畅，血管搏动良好，未见血管瘤形成。闭塞的牛心包血管未见搏动，血管完整，周围形成丰富侧支循环。截面观察鱼鳔血管管腔通畅，内膜面未见附壁血栓，无明显增厚，通畅牛心包血管管腔狭窄，内膜增厚，如图7B；闭塞牛心包血管可见内膜明显向心性增厚，如图7C、图7D。

30天两种材料通畅的人工血管HE染色显示吻合口内膜移行连续，愈合良好，管腔通畅，两种材料差异不明显。VB染色显示鱼鳔血管中新生弹力纤维分布较牛心包中丰富。如图10所示，图中三角显示新生弹力纤维，左图鱼鳔中含量多于右图牛心包，白箭头显示为大鼠对血管的炎性反应包裹。60天两者HE染色结果显示，牛心包内膜明显增厚，吻合口处更为显著，且牛心包周围出现大量炎性细胞浸润以及组织坏死现象，同期VB染色显示，鱼鳔新生内膜弹力纤维丰富，牛心包内膜虽然较鱼鳔增厚明显，但仅可见少量弹力纤维排列。堵塞牛心包HE染色可见组织坏死，炎性细胞浸润明显。

八、扫描电镜

(1)原理：高倍放大并直观观察血管内膜有无铺路石样内皮覆盖。

(2)步骤：

植入的小血管取出后，立即剪下近远端吻合口处、管腔中段组织数块；PBS缓冲液冲洗去表面残留,四角丙烯线缝合于固定材料；2.5％戊二醛固定液固定24小时；100％、90％、80％、70％、50％酒精浓度梯度脱水；自然晾干；喷金镀膜；上镜观察并摄片。

扫面电镜结果显示，30天、60天通畅的鱼鳔及牛心包人工血管均可见铺路石样内皮细胞粘附，吻合口缝线已被新生内膜覆盖，见图8，图中A1、A2表示:鱼鳔血管，B1、B2表示：牛心包血管内膜，箭头表示：吻合口丙烯线。

九、小血管体内钙化评估

(一)X线摄影：

(1)原理：体外观察0.1毫米的微小钙化点及钙化簇，作为30天时钙化的初步筛查。

(2)步骤：

3％戊巴比妥钠大鼠腹腔麻醉，30mg/kg；将大鼠侧卧位置于钼靶摄影台；摄片、分析钙化。

(二)冯库萨(Von kossa)染色：

原理：将矿化基质中的磷酸盐(钙)转变为碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银，组织切片直观观察钙盐沉积情况。

2)步骤：

石蜡切片脱蜡至水；1％硝酸银溶液浸没，紫外线灯下照射40mins；蒸馏水洗2mins；3％硫代硫酸钠溶液处理5min；水漂洗5min；中性红复染5min；乙醇漂洗；二甲苯透明，中性树胶封固。钙盐沉积呈现黑色，其余红色

(三)Micro CT断层扫描

(1)原理：显微CT分辨率可达到12微米，用该技术扫描离体标本，利用经典的Feldkamp锥束算法将断层扫描图像进行重建，并将CT数超过200的钙离子图像自动提取出来。作为60天时样本微小钙化点检测。

(2)步骤：

大鼠体内取出植入的小血管；PBS漂洗；将样本长度剪成不大于1cm；60℃烘箱烘干至恒重；上机扫描；三维重建断层图像。

钙化评估结果

将30天大鼠麻醉后行毫米级X线摄影，结果显示血管区域未见明显钙化点。60天大鼠人造血管取出后，行乳腺钼靶摄影后仍未见钙化点，将人造血管离体修减成长度小于1cm，行微米级MicroCT断层扫描，三维重建后两者均未见钙化点。由于样本量有点，60天牛心包以Von kossa观察钙化为主，行Von Kossa染色显示，所有通畅血管均可见吻合口处钙盐沉积，30天鱼鳔及30天牛心包通畅血管未见钙盐沉积，仅60天牛心包血管壁可见钙盐沉积，并导致纤维破坏断裂，如图9所示，图中三角表示：丙烯线孔，白箭头表示：大鼠自身血管，黑箭头表示：人造血管，丙烯线针孔处可见钙盐沉积，仅右下图中的60天牛心包通畅血管壁可见黑色钙盐沉积。

十、免疫组化染色：

(一)第八因子相关抗原免疫组化的测定

(1)原理:第八因子相关抗原是一种糖蛋白，广泛存在于血管内皮、***内皮细胞等处，是血管内皮及其内源性良恶性肿瘤的特异性标记。利用抗原抗体特异性结合的原理，检查细胞或组织内的相应抗原，确定组织中某种抗原的定位。

(2)步骤：

组织切片在60℃恒温箱中烘烤20分钟；石蜡切片常规脱蜡至水；蒸馏水冲洗干净；胃蛋白酶消化方法抗原修复：滴加0.4％胃蛋白酶液，置于孵育盒中，37℃消化30分钟；切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,切片上滴加正常非免疫动物血清，室温下孵育10分钟；除去血清，切片上滴加鼠抗人第八因子相关抗原抗体，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,切片上滴加链霉菌生物素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色；自来水冲洗终止显色，苏木素复染，盐酸分化，返蓝，无水酒精脱水，中性树脂封片；镜下观察及摄片

(二)α-SMA免疫组化的染色

(1)原理:α-SMA是一种标记平滑肌的肌动蛋白，可以与平滑肌肌动蛋白α异构体反应，用于标记平滑肌及其来源的肿瘤。利用抗原抗体特异性结合的原理，可用来检查人工血管平滑肌增值情况。

(2)步骤：

组织切片在60℃恒温箱中烘烤20分钟；石蜡切片常规脱蜡至水；蒸馏水冲洗干净；柠檬酸抗原修复液微博抗原修复：取适量0.01M柠檬酸抗原修复液于微波盒中，将微波盒置于微波炉，高档加热至沸腾；将切片置于耐高温染色架上，放入沸腾的修复液中，盖上盖，调至中-低档继续加热20分钟；将微波盒取出，冷却至室温，取出切片，PBS冲洗干净；切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3×3分钟；除去PBS,切片上滴加正常非免疫动物血清，室温下孵育10分钟；除去血清，切片上滴加鼠抗人α-SMA抗体，室温下孵育60分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS，切片上滴加生物素标记的第二抗体，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,切片上滴加链霉菌生物素蛋白-过氧化物酶试剂，室温下孵育10分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；除去PBS,切片上滴加新鲜配制的DAB显色试剂显色。

免疫组化结果观察及鱼鳔两时期内膜增厚计算：

(1)第八因子相关抗原染色结果显示，两种材料通畅的血管均可见自吻合口处有新生内皮细胞移行黏附，向人造血管管腔延伸，30天时鱼鳔内皮排列较牛心包连接紧密排列均匀。60天时两材料内皮细胞染色显示排列均匀致密，染色清晰。血管平滑肌染色显示两组吻合口处平滑肌都有增生，30天时两组材料吻合口增生程度接近，但管腔增生牛心包更明显，与CTA结果一致。60天结果显示牛心包人造血管内膜明显增厚，几乎堵塞管腔，约为人造血管壁厚度的4-5倍。闭塞的牛心包血管行平滑肌细胞免疫组化染色显示吻合口处平滑肌显著增生。

两时期鱼鳔内膜增厚比较：

以鱼鳔血管中段管腔截面切片α-SMA染色100倍照片为对象，以像素作为度量单位，每张切片量取圆周5个不同部位测量后取平均值代表管腔增生平滑肌厚度。除行MicroCT标本无法切片，其余鱼鳔样本两个时期分别可得5个结果，以独立样本T检验计算统计学差异，结果见表4-2。结果表明两时期内膜增厚未见显著统计学差异。

表4-2不同时间点鱼鳔增生平滑肌厚度比较(n＝5)

十一、通畅率计算、内膜增厚情况对比及相关统计方法：

(1)通畅率：分别计算两种材料血管30天及60天通畅率并对比，采用Fisher精确概率法进行计算。

(2)内膜增厚情况对比：镜下量取30天及60天鱼鳔通畅血管管腔中段新生内膜厚度，以像素表示，采用独立样本T检验。

(3)以上计算设定P＜0.05为统计学差异显著。

根据CTA结果计算两材料30天、60天通畅率，根据Fisher精确概率法可得出两者统计学差异显著(P值＜0.05)。结果见表4-1。

表4-1两个时间点不同材料人造血管通畅率对比

实施例作用与效果

本实施例中，虽然60天时鱼鳔及牛心包内皮覆盖程度接近，但是30天时鱼鳔血管已有内皮细胞粘附并形成完整内皮层，并且覆盖程度高于通畅的牛心包血管。

晚期内膜增生是小口径人造血管堵塞的另一重要原因，本试验中CTA评估血管通畅情况可以看出，各时间点牛心包较鱼鳔官腔细，采用α-actin对平滑肌细胞特异性染色表明60天时牛心包内膜增厚明显。

实施例结果显示，鱼鳔作为小口径人造血管2个月未见血管瘤形成、钙化率低，并且与牛心包相比，通畅率出色，内皮细胞粘附整齐致密且平滑肌增生程度较牛心包轻。且前、后两时期对鱼鳔增生内膜进行比较显示两者无明显差异，表明鱼鳔后期内膜增生不明显。

本实施例的缝合方法，试验证明出血率低，几乎无漏血现象发生，可以作为小口径血管缝合方法。

本实施例的结果表明使用鱼鳔材料制成的人造血管与牛心包相比有更好的血液相容性。

鱼鳔物理学性质与牛心包相比，虽然力学强度略逊，但其延展性好，僵硬度低。

鱼鳔无体外细胞毒性且血液相容性良好，无致血栓形成及溶血影响。

与对照组牛心包材料组相比，鱼鳔血管在拟定时间点通畅率高，无血管瘤等并发症，扫描电镜及免疫组化结果显示，鱼鳔血管内皮化程度满意，内皮覆盖完全，且新生内膜增生程度低于牛心包，两组影像学检查均未见明显钙化灶，切片染色显示仅60天牛心包组可见血管壁钙化点。

以上结果说明鱼鳔材料制成的人造血管比牛心包制成的人造血管具有更好的效果。

当然，本发明中固定所用的试剂除戊二醛外，还可以采用目前在心血管人工材料中应用广泛的固定剂Rothamel D、Speer DP、Wiebe D。

所述血管除实施例中的直筒形外，还可以制成分叉形，例如Y形分叉或者血管两端均为Y形分叉的形状。

直径范围不仅是实施例中所提供的1.4mm，而是可以在1mm-6mm中根据需要进行制造，方法与实施例中所提供的方法基本相同，只需要把支撑的结构相应变大即可。

除鲤鱼外，本发明的材料还可以使用鲢鱼，并且对于鲤鱼来说，鲢鱼更好得到合适大小的鱼鳔。鲢鱼鱼鳔的机械性能不如鲤鱼，但是仍然强于牛心包，并且其它生化指标也强于牛心包。

Claims (7)

1.一种制备人造血管的方法，其特征在于，包括以下步骤：

原材料预处理，取鱼鳔，去除表面***及血管，在室温下将鱼鳔平铺固定完全浸没于新鲜配置的预定浓度的戊二醛溶液中进行交联、微压固定48小时；

材料裁剪，将交联固定后的材料裁剪成预定大小；

缝合，将裁剪好的材料缠绕于支承件上，边缘对齐并缝合，形成所述人造血管，该人造血管的口径范围为1mm-6mm，

所述预定浓度的戊二醛溶液为将25ml25％戊二醛溶液溶于975ml磷酸盐缓冲溶液制成的戊二醛溶液。

2.如权利要求1所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述戊二醛溶液为由25％的戊二醛溶液溶于0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液中过滤消毒制成的并保存于4℃的戊二醛溶液。

3.如权利要求1所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述预定大小为15mm×6mm。

4.如权利要求1所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述缝合步骤采用8-0丙烯线进行所述缝合，针距为1mm。

5.根据权利要求1所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述鱼鳔取自鲤鱼。

6.根据权利要求1所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述鱼鳔取自鲢鱼。

7.根据权利要求5所述的制备人造血管的方法，其特征在于：

其中，所述鲤鱼的重量为4-4.5kg。