CN105267355B - 一种药物制剂的提取方法及其预测模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药提取领域，具体涉及一种具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法及其预测模型的建立方法。该提取方法，以干膏率、栀子苷的含量和斯皮诺素的含量为考察指标，通过优化提取时间、提取溶剂的种类、提取溶剂的用量，使得栀子苷和斯皮诺素尽可能最大程度地被提取，并进一步测定其含量，从而可以全面控制该药物制剂的质量，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

Description

一种药物制剂的提取方法及其预测模型的建立方法

技术领域

本发明属于中药提取领域，具体涉及一种具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法及其预测模型的建立方法。

背景技术

心神宁片由东汉医圣张仲景所著《金匮要略》中的酸枣仁汤化裁而来。由炒酸枣仁、远志、茯苓、栀子、神曲、甘草等六味中药组成，收载于国家药品标准(WS-10410(ZD-0410)2002-2012Z)，具有养血除烦，宁心安神的功效，用于心肝血虚，失眠多梦，烦躁而惊，疲倦食少等症。心神宁片疗效显著，临床应用较为广泛。其中炒酸枣仁为方中君药，起着至关重要的作用，投料药材质量的优劣、成分含量的高低，直接影响着心神宁片的药效。

《心神宁胶囊提取及成型工艺的筛选与优化》(《山东医药》，2008，48(28)，103)公开了一种心神宁胶囊的提取方法，以栀子苷为考察目标，包括如下提取步骤：取所述药物制剂适量，提取3次，第1次加10倍量水，提取2h；第2、3次各加8倍量水，每次提取1h。然而，由于心神宁胶囊由炒酸枣仁、远志、茯苓、栀子、神曲、甘草等六味中药组成，仅仅通过该提取方法提取栀子苷、进一步测定其含量，并不能达到全面控制其质量的目的。

因此，建立一种心神宁片的提取方法，对于心神宁片的质量进行全面控制具有重要意义。

发明内容

因此，本发明提出一种具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，进而提供其预测模型的建立方法。

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一种具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁、远志、茯苓、栀子、六神曲、甘草；

该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为60％-80％乙醇，提取次数为1-5次，每次提取0.5h-3h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的6-9倍。

优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为65％-75％乙醇，提取次数为2-4次，每次提取1h-2h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7-8倍。

进一步优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为70％乙醇，提取次数为3次，每次提取1.5h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7.44倍。

进一步优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，

所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁200-300重量份、远志120-210重量份、茯苓120-210重量份、栀子30-140重量份、六神曲30-140重量份、甘草30-140重量份。

进一步优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，

所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁220-280重量份、远志140-190重量份、茯苓140-190重量份、栀子50-110重量份、六神曲50-110重量份、甘草50-110重量份。

进一步优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，

所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁250重量份、远志167重量份、茯苓167重量份、栀子83重量份、六神曲83重量份、甘草83重量份。

本发明还提供上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，包括以下步骤：

(1)Plackett-Burman设计筛选主要影响因素

进行Plackett-Burman设计，选定浸泡时间、以总提取时间计的提取次数、单次提取时间、沸腾程度、提取溶剂为影响因素，以干膏率、栀子苷和斯皮诺素含量为评价指标，对所述影响因素进行显著性分析；

按照Plackett-Burman Design实验设计进行实验，每组实验平行3次，结果取平均值，运用Design expert软件对所述影响因素进行显著性分析；

(2)Box-Behnken效应面法优化提取工艺

设定实验因素X₁为以总提取时间计的提取次数、实验因素X₂为提取溶剂-醇水比、实验因素X₃为加溶剂量，设定评价指标Y₁为干膏率、评价指标Y₂为栀子苷含量、评价指标Y₃为斯皮诺素含量，运用Box-Behnken Design实验优选所述实验因素；

对取值越小越好的指标和取值越大越好的指标，分别采用Hassan方法，求“归一值”OD值，d_min＝(y_max-y_i)/(y_max-y_min)，d_max＝(y_i-y_min)/(y_max-y_min)，OD＝(d₁d₂d₃....d_n)1/n，n为指标数；将所得数据用Design-Expert8.0.0软件进行实验分析，以OD为响应值，分别对各实验因素进行多元线性回归和二项式拟合，经F值检验，总评OD值方差分析结果；

(3)工艺验证实验

以优化后的提取工艺参数，以所述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂为实验对象，进行3次平行实验，进行干膏率测定、栀子苷的含量测定和斯皮诺素的含量测定，并计算总评OD值，以验证实验模型的准确性。

优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，所述斯皮诺素的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25体积份，称定重量，超声10分钟，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取斯皮诺素对照品适量，加甲醇适量，制成含斯皮诺素0.010mg/mL的对照品溶液；

(3)色谱条件：以4.6mm×250mm，5μm的Perkin Elmer C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，以水-0.1％冰乙酸为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为10％：90％；0min-15min，A：B为10％：90％→17％：83％；15min，A：B为17％：83％；15min-25min，A：B为17％：83％→23％：77％；25min，A：B为23％：77％；25min-30min，A：B为23％：77％→35％：65％；30min，A：B为35％：65％；30min-33min，A：B为35％：65％→10％：90％；33min-37min，A：B为10％：90％；检测波长335nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定；

所述重量份与体积份的关系为g/mL。

优选地，本发明上述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，所述栀子苷的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50体积份，称定重量，超声30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇适量，制成含栀子苷0.08mg/mL对照品溶液；

(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，检测波长238nm，流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定；

所述重量份与体积份的关系为g/mL。

本发明的技术方案具有如下优点：

本发明具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，以干膏率、栀子苷的含量和斯皮诺素的含量为考察指标，通过优化提取时间、提取溶剂的种类、提取溶剂的用量，使得栀子苷和斯皮诺素尽可能最大程度地被提取，并进一步测定其含量，从而可以全面控制该药物制剂的质量，有助于提高该药物使用的安全性和稳定性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验例2中提取次数X₁(以总提取时间计)和提取溶剂(醇水比X₂)对OD值(Y)影响的等高线图；

图2为本发明实验例2中提取次数X₁(以总提取时间计)和提取溶剂(醇水比X₂)对OD值(Y)影响的三维曲面图；

图3为本发明实验例2中提取次数X₁(以总提取时间计)和加溶剂量(X₃)对OD值(Y)影响的等高线图；

图4为本发明实验例2中提取次数X₁(以总提取时间计)和加溶剂量(X₃)对OD值(Y)影响的三维曲面图；

图5为本发明实验例2中提取溶剂(醇水比X₂)和加溶剂量X₃对OD值(Y)影响的等高线图；

图6为本发明实验例2中提取溶剂(醇水比X₂)和加溶剂量X₃对OD值(Y)影响的三维曲面图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1心神宁片的制备

【处方】炒酸枣仁250g、远志167g、茯苓167g、栀子83g、六神曲83g、甘草83g。

【制备方法】所述片剂由以下方法制备：

(1)取选定重量份的甘草和六神曲，粉碎，过筛，混匀，得细粉；

(2)取选定重量份的炒酸枣仁、栀子、远志和茯苓，加水煎煮两次，第一次煎煮3小时，第二次煎煮2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至50℃相对密度为1.05-1.20的清膏；

(3)将所述细粉加入至所述清膏中，混匀，加入辅料适量、制颗粒，加入硬脂酸镁适量，混匀，干燥，压制成片，包衣，即得片剂。

实施例2

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为70％乙醇，提取次数为3次，每次提取1.5h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7.44倍。

实施例3

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为65％乙醇，提取次数为4次，每次提取1h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的8倍。

实施例4

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为75％乙醇，提取次数为2次，每次提取2h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7倍。

实施例5

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，包括以下步骤：

(1)Plackett-Burman设计筛选主要影响因素

运用Design expert软件进行Plackett-Burman设计，选定浸泡时间、以总提取时间计的提取次数、单次提取时间、沸腾程度、提取溶剂为影响因素，以干膏率、栀子苷和斯皮诺素含量为评价指标，对所述影响因素进行显著性分析；

按照Plackett-Burman Design实验设计进行实验，每组实验平行3次，结果取平均值，运用Design expert软件对所述影响因素进行显著性分析；

(2)Box-Behnken效应面法优化提取工艺

设定实验因素X₁为以总提取时间计的提取次数、实验因素X₂为提取溶剂-醇水比、实验因素X₃为加溶剂量，设定评价指标Y₁为干膏率、评价指标Y₂为栀子苷含量、评价指标Y₃为斯皮诺素含量，运用Box-Behnken Design实验优选所述实验因素；

对取值越小越好的指标和取值越大越好的指标，分别采用Hassan方法，求“归一值”OD值，d_min＝(y_max-y_i)/(y_max-y_min)，d_max＝(y_i-y_min)/(y_max-y_min)，OD＝(d₁d₂d₃....d_n)1/n，n为指标数；将所得数据用Design-Expert8.0.0软件进行实验分析，以OD为响应值，分别对各实验因素进行多元线性回归和二项式拟合，经F值检验，总评OD值方差分析结果；

(3)工艺验证实验

以优化后的提取工艺参数，以所述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂为实验对象，进行3次平行实验，进行干膏率测定、栀子苷的含量测定和斯皮诺素的含量测定，并计算总评OD值，以验证实验模型的准确性。

实施例6

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，所述斯皮诺素的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声10分钟，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取斯皮诺素对照品适量，加甲醇适量，制成含斯皮诺素0.010mg/mL的对照品溶液；

(3)色谱条件：以4.6mm×250mm，5μm的Perkin Elmer C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，以水-0.1％冰乙酸为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为10％：90％；0min-15min，A：B为10％：90％→17％：83％；15min，A：B为17％：83％；15min-25min，A：B为17％：83％→23％：77％；25min，A：B为23％：77％；25min-30min，A：B为23％：77％→35％：65％；30min，A：B为35％：65％；30min-33min，A：B为35％：65％→10％：90％；33min-37min，A：B为10％：90％；检测波长335nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定。

实施例7

本实施例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，所述栀子苷的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，超声30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇适量，制成含栀子苷0.08mg/mL对照品溶液；

(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，检测波长238nm，流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定。

对比例1

本对比例具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，包括如下提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取3次，第1次加10倍量水，提取2h；第2、3次各加8倍量水，每次提取1h。

实验例1

1、仪器与材料

Agilent1260高效液相色谱仪，蒸发光检测器检测器；VWD检测器；KQ-500DE医用数控超声波清洗器；AE 240十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒。

斯皮诺素对照品(批号111869-201203)由中国食品药品检定研究院购买；乙腈(美国Fisher)、甲醇(美国Fisher)为色谱纯；甲醇(天津佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司)，冰乙酸(天津市光复科技发展有限公司)为分析纯，水(三级反渗法制得纯化水)。

心神宁片(批号492043)、心神宁片阴性对照品、制备心神宁片阴性对照品所用的原料均由颈复康药业集团有限公司提供，由颈复康药业集团有限公司工程师中药鉴别师鉴定为真品。心神宁片按照实施例1的方法制备。

1.1色谱条件

采用Perkin Elmer C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；A(乙腈)-B(0.1％冰乙酸)为流动相，在线梯度洗脱，0-15min-25min-30min-33min-37min，A相为10％-17％-23％-35％-10％-10％；检测波长：335nm；柱温：25℃；流速：1.0mL/min；进样体积：10μL。

1.2对照品溶液的制备

精密称取斯皮诺素对照品适量，加甲醇适量，制成含斯皮诺素0.01mg/mL的对照品溶液。

1.3供试品溶液的制备

取心神宁片数片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，超声10分钟，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

1.4阴性对照品溶液的制备

按处方中的药味比例配制不含酸枣仁药材的阴性样品，依“1.3”项下方法制备阴性对照液。

1.5专属性实验

按上述实验条件，分别将阴性对照品溶液、供试品溶液及对照品溶液注入液相色谱仪测定。

1.6线性关系考察

精密称取对照品适量，加甲醇制成含斯皮诺素0.053424mg/mL的对照品液，采用倍比稀释法制成系列质量浓度溶液，使斯皮诺素的浓度分别为0.026712mg/mL，0.013356mg/mL，0.006678mg/mL，0.003339mg/mL。按照“1.1”项下色谱条件进行HPLC分析。以斯皮诺素的峰面积Y对斯皮诺素的浓度X绘制标准曲线得回归方程Y＝20043X+4.4708，r＝0.9999(n＝5)。

结果表明，心神宁片中的斯皮诺素在3.339-53.424μg/mL范围内线性关系良好。

1.7精密度实验

取含量为0.013356mg/mL的对照品溶液，按照“1.1”项下的色谱条件，重复进样6次，记录每次的色谱峰面积，计算RSD值。

结果表明，心神宁片中的斯皮诺素RSD值为0.75％。即，该检测方法精密度良好。

1.8重复性实验

精密称取同一批号心神宁片(批号492043)，按“1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“1.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积。

结果表明，心神宁片中的斯皮诺素的平均含量为0.1623mg/片，RSD为1.46％(n＝6)。即，该检测方法重现性好。

1.9稳定性实验

取按照“1.3”项下方法制备的供试品溶液，分别在制备后0，2，4，6，8，10，12h进样10μL，记录色谱峰面积。

结果表明，心神宁片中的斯皮诺素色谱峰面积RSD值为1.46％。即，供试品溶液在12h内稳定性良好。

1.10加样回收率实验

精密称取已测定斯皮诺素(0.1530mg/片)含量的心神宁片(批号492043)9份，精密称定0.25g，加入一定量对照品，按照“1.3”项下方法制备供试品溶液，按“1.1”项下色谱条件进行测定，以供试品溶液中绝对质量分数计算加样回收率。可知，心神宁片中的斯皮诺素平均回收率为100.91％，RSD值为1.36％。

实验例2

1、Plackett-Burman设计筛选主要影响因素

1.1因素及水平

运用Design expert8.0.6软件进行Plackett-Burman设计(PBD)，考察各个因素对干膏率、栀子苷和斯皮诺素含量影响的显著性。由于实际大生产中，酸枣仁，栀子等已为粉碎投料，在此暂时不予考虑药材粒度对提取工艺的影响。

根据实际大生产经验，实验设计6个实验因素(A：浸泡时间，B：提取次数(以总提取时间计)，C：单次提取时间，D：沸腾程度，E：提取溶剂(醇水比)，F：加溶剂量)和6个空白因素(G，H，I，J，K，L),共12组实验。根据预实验结果确定每个因素高(代码：1)，低(代码：-1)2个水平。所设计的实验如表1所示。

表1 Plackett-Burman设计影响因素和水平

1.2 Plackett-Burman设计(PBD)实验结果

按照PBD实验设计进行实验，每组实验平行3次，结果取平均值。PBD实验设计表及结果见表2。

表2 PBD实验设计表及结果

运用Design expert 8.0.6软件对各个因素进行显著性分析，具体实验结果见表3。其中，响应值P＜0.05的为显著性影响因素。

表3 PBD实验结果分析

注：P＜0.05为极显著性因素

从分析结果来看，各影响因素对干膏率的影响顺序为：提取次数(以总提取时间计)＞提取溶剂(醇水比)＞沸腾程度＞加溶剂量＞单次提取时间＞浸泡时间；各影响因素对栀子苷的影响顺序为：提取次数(以总提取时间计)＞提取溶剂(醇水比)＞加溶剂量＞浸泡时间＞单次提取时间＞沸腾程度；各影响因素对斯皮诺素的影响顺序为：提取次数(以总提取时间计)＞提取溶剂＞加溶剂量＞沸腾程度＞浸泡时间＞单次提取时间。

取各影响因素交集综合单指标分析，提取次数(以总提取时间计)、提取溶剂(醇水比)和加溶剂量为显著性因素，浸泡时间、单次提取时间和沸腾程度为非显著性因素，以此为依据进行Box-Behnken设计(BBD)。

2、Box-Behnken效应面法优化提取工艺

2.1BBD实验因素、水平和结果

由于提取次数为非连续变量，所以提取次数这个因素变量以总提取时间计，转化为连续变量，提取1次即总提取时间为1.5h,，提取2次及总提取时间为3h，提取3次即总提取时间为4.5h。在浸泡时间固定为0h，单次提取时间固定为1.5h，沸腾程度取剧烈沸腾状态下，设定X₁(提取次数(以总提取时间计))，X₂(提取溶剂(醇水比))，X₃(加溶剂量)为因素变量，Y₁(干膏率)、Y₂(栀子苷含量)、Y₃(斯皮诺素含量)为评价指标，运用BBD实验优选最佳提取工艺参数。

BBD实验因素和水平见表4，所得具体实验结果见表5。

表4 BBD实验因素和水平

表5 BBD实验与结果

2.2模型拟合及数据处理

多指标的数据处理一般采用总评“归一值”法。对取值越小越好的指标和取值越大越好的指标，分别采用Hassan方法，求“归一值”OD值。d_min＝(y_max-y_i)/(y_max-y_min)，d_max＝(yi-ymin)/(y_max-y_min)，OD＝(d₁d₂d₃....d_n)1/n，n为指标数。将所得数据用Design-Expert8.0.0软件进行实验分析，以OD为响应值分别对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，经F值检验。总评OD值方差分析结果见表6。

模型显著(P＜0.01)，失拟项不显著(P＞0.05)，R²＝0.94，结果表明该回归模型拟合情况良好，回归方程的代表性较好，能准确预测实际情况。回归方程如下：Y＝0.70+0.27X₁+0.071X₂+0.19X₃+0.029X₁X₂-0.059X₁X₃-0.18X₂X₃-0.13X₁ ²-0.057X₂ ²-0.100X₃ ²

表6 BBD实验结果方差分析

2.3效应面分析及BBD实验模型预测

根据回归分析结果，应用Design-Expert8.0.6软件，固定3个变量中的某个变量，绘制另外两个变量对总评OD值影响的三维曲面和等高线图，实验结果见图1、2、3、4、5和6。

从图1和图2可以看出，总提取时间和提取溶剂对响应值的交互作用较为不显著；从图3和图4可以看出，总提取时间和加溶剂量对响应值具有一定的交互作用；从图5和图6可以看出，提取溶剂和加溶剂量对响应值的交互作用显著。

经Design Expert8.0.6软件分析筛选，得到心神宁片提取工艺参数最优值为：提取次数为3次(总提取时间为4.5h)，提取溶剂为70％乙醇，加溶剂量为7.44倍，预测值Y₁(干膏率％)＝16.78，Y₂(栀子苷mg/片)＝3.6234，Y₃(斯皮诺素mg/片)＝0.2392，Y(OD值)＝0.8848。

2.4工艺验证实验

通过验证实验模型的准确性，综合考虑实际情况，以提取次数为3次(总提取时间为4.5h)，提取溶剂为70％乙醇，加溶剂量为7.5倍，以优化后的提取工艺参数，按心神宁片组方500片的比例进行3次平行实验，测定干膏率、栀子苷、斯皮诺素的含量，并计算总评OD值。所得实验结果见表7和表8。

表7工艺验证实验结果

表8工艺验证实验结果

由表7和表8可知，干膏率、栀子苷含量和斯皮诺素含量的实测值与预测值偏差均小于2％，实测OD值与预测OD值的平均偏差小于3％。这表明，验证结果与预测结果较为接近。

2.5对比研究

将本次优选工艺中试产品与市场流通工艺产品(颈复康药业集团有限公司：批号392170，492009，492016，492043；某药业有限责任公司：批号140519，140802，140804)进行对比。具体实验结果见表9和表10。

表9优化后工艺实验结果

备注：1、2、3为优化后工艺的中试产品，4、5、6(530011批、530012批和530013批)是大批生产产品，与中试产品使用的中药材为同一批号。

表10市场流通工艺产品的实验结果

由表9和表10可知，心神宁片中栀子苷和斯皮诺素的含量皆有所提高(在中药中，目标成分含量一般只有下限，没有上限，除了一些毒性成分有规定外)。

综上所述，本实验例所建立的预测模型具有较好的预测性，BBD-效应面法分析所得的最佳提取工艺参数可信度较高。

实验例3

分别按照实施例2和对比例1的方法提取实施例1制备的心神宁片的栀子苷和斯皮诺素，并进一步进行对其进行含量测定，具体实验结果如表11所示。

表11栀子苷和斯皮诺素的含量结果

由表11可知，与采用对比例1的方法相比，采用实施例2的方法提取心神宁片的栀子苷和斯皮诺素，其含量更高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，其特征在于，所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁200-300重量份、远志120-210重量份、茯苓120-210重量份、栀子30-140重量份、六神曲30-140重量份、甘草30-140重量份；

该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为60％-80％乙醇，提取次数为1-5次，每次提取0.5h-3h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的6-9倍。

2.根据权利要求1所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，其特征在于，该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为65％-75％乙醇，提取次数为2-4次，每次提取1h-2h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7-8倍。

3.根据权利要求2所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，其特征在于，该提取方法包括如下对栀子苷和斯皮诺素的提取步骤：

取所述药物制剂适量，提取溶剂为70％乙醇，提取次数为3次，每次提取1.5h，每次加入的溶剂量为所述药物制剂的重量倍量的7.44倍。

4.根据权利要求1所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，其特征在于，所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁220-280重量份、远志140-190重量份、茯苓140-190重量份、栀子50-110重量份、六神曲50-110重量份、甘草50-110重量份。

5.根据权利要求4所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法，其特征在于，所述药物制剂的原料药组成为：炒酸枣仁250重量份、远志167重量份、茯苓167重量份、栀子83重量份、六神曲83重量份、甘草83重量份。

6.一种权利要求1-5任一项所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)Plackett-Burman设计筛选主要影响因素

进行Plackett-Burman设计，选定浸泡时间、以总提取时间计的提取次数、单次提取时间、沸腾程度、提取溶剂为影响因素，以干膏率、栀子苷的含量和斯皮诺素的含量为评价指标，对所述影响因素进行显著性分析；

按照Plackett-Burman Design实验设计进行实验，每组实验平行3次，结果取平均值，运用Design expert软件对所述影响因素进行显著性分析；

(2)Box-Behnken效应面法优化提取工艺参数

设定实验因素X₁为以总提取时间计的提取次数、实验因素X₂为提取溶剂-醇水比、实验因素X₃为加溶剂量，设定评价指标Y₁为干膏率、评价指标Y₂为栀子苷含量、评价指标Y₃为斯皮诺素含量，运用Box-Behnken Design实验优选所述实验因素；

对取值越小越好的指标和取值越大越好的指标，分别采用Hassan方法，求“归一值”OD值，d_min＝(y_max-y_i)/(y_max-y_min)，d_max＝(y_i-y_min)/(y_max-y_min)，OD＝(d₁d₂d₃....d_n)1/n，n为指标数；将所得数据用Design-Expert8.0.0软件进行实验分析，以OD为响应值，分别对各实验因素进行多元线性回归和二项式拟合，经F值检验，总评OD值方差分析结果；

(3)工艺验证实验

以优化后的提取工艺参数，以所述具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂为实验对象，进行3次平行实验，进行干膏率测定、栀子苷的含量测定和斯皮诺素的含量测定，并计算总评OD值，以验证实验模型的准确性。

7.根据权利要求6所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，其特征在于，

所述斯皮诺素的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25体积份，称定重量，超声10分钟，放冷，称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取斯皮诺素对照品适量，加甲醇适量，制成含斯皮诺素0.010mg/mL的对照品溶液；

(3)色谱条件：以4.6mm×250mm，5μm的Perkin Elmer C18为色谱柱，以乙腈为流动相A，以水-0.1％冰乙酸为流动相B，按照如下程序进行梯度洗脱：0min，A：B为10％：90％；0min-15min，A：B为10％：90％→17％：83％；15min，A：B为17％：83％；15min-25min，A：B为17％：83％→23％：77％；25min，A：B为23％：77％；25min-30min，A：B为23％：77％→35％：65％；30min，A：B为35％：65％；30min-33min，A：B为35％：65％→10％：90％；33min-37min，A：B为10％：90％；检测波长335nm；柱温25℃；流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定；

所述重量份与体积份的关系为g/mL。

8.根据权利要求6所述的具有养血除烦、宁心安神作用的药物制剂的提取方法的预测模型的建立方法，其特征在于，

所述栀子苷的含量测定包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测药物制剂，精密称定，研细，取0.5重量份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50体积份，称定重量，超声30分钟，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；

(2)对照品溶液的制备：精密称取栀子苷对照品适量，加甲醇适量，制成含栀子苷0.08mg/mL对照品溶液；

(3)色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以体积比为12:88的乙腈-水为流动相，检测波长238nm，流速1.0mL/min；

(4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定；

所述重量份与体积份的关系为g/mL。