CN105264092A - 用于诊断和疗法的外来体中的miRNA生物发生 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过使用包含miRNA和其前体的外来体来诊断和治疗癌症的方法。例如，在一些方面，癌症可通过确定来自受试者的样品中外来体的miRNA含量或通过检测外来体中的miRNA加工来进行诊断或评估。

Description

用于诊断和疗法的外来体中的miRNA生物发生
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/791,301的优先权权益，所述临时申请的完整内容以引用的方式并入本文。
本发明在政府支持下根据由美国国立卫生研究院授权的授权号EB003472、EB006462、CA135444、CA125550、CA155370、CA151925、DK081576以及DK055001和由美国国家科学基金会授权的授权号EFRI-1240410、CBET-0922876以及CBET-1144025进行。政府对本发明享有某些权利。
发明背景
发明领域
本发明大体来说涉及分子生物学、肿瘤学以及医学的领域。更具体说来，其涉及通过癌症的独特的外来体含量来检测癌症的方法和用于基于增强的抑制RNA的疗法的方法。
相关技术的描述
所有细胞经由多种不同途径与其周围环境通讯，所述途径包括生长因子、细胞因子、激素、趋化因子、膜结合蛋白以及脂质。外来体能够介导所述通讯并且在长距离内实现此举(Mathivanan等人,2010；Kahlert和Kalluri,2013)。经由外来体的通讯可能克服与生长因子/细胞因子/趋化因子/激素的稳定性和扩散有关的限制(Mathivanan等人,2010)。外来体为30-140nm大小的纳米囊泡，其含有由脂质双层保护的蛋白、mRNA以及微RNA(miRNA)(Cocucci等人,2009；Simons和Raposo,2009；Simpson等人,2008；Thery等人,2002)。若干新近研究证明，外来体由多种细胞类型分泌，包括癌细胞、干细胞、免疫细胞以及神经元(Simpson等人,2008；Thery,2001)。应注意，癌细胞比正常细胞分泌更多的外来体(Taylor和Gercel-Taylor,2011)。此外，与正常受试者相比，外来体在癌症患者的循环中增加(Logozzi等人,2009；Taylor和Gercel-Taylor,2008)；然而，功能作用仍然未知。最近有迹象表明，外来体可在癌症进展和转移中发挥重要作用(Luga等人,2012；Peinado等人,2012；Yang等人,2011)。
外来体介导细胞之间的RNA和miRNA转移的观点进一步增加了体内细胞-细胞通讯的复杂性。RNAi为活细胞内参与基因表达和活性的控制的天然生物过程。细胞外miRNA最初仅被认为含于外来体内部(Valadi等人,2007)。其后，数项报告确认了凋亡小体(Zernecke等人,2009)、高密度和低密度脂蛋白(Vickers等人,2011)(HDL/LDL)、大的细胞外囊泡(称为微囊泡并且与AGO2有关)(Arroyo等人,2011；Li等人,2012；Turchinovich等人,2011)中miRNA的存在。然而，最近的报告提出在人类血清和唾液中检测到的大多数miRNA主要集中在外来体内部(Gallo等人,2012)。外来体中miRNA的存在提供了在远端位点处调节细胞的基因表达的可能性(Guescini等人,2010；Valadi等人,2007；Mittelbrunn等人,2011；vanBalkom等人,2013)。经由其对mRNA翻译的调节，miRNA协调整个基因集合的表达并且使生物体的转录组成形(Bartel,2009)。
miRNA在源于多种不同细胞类型的外来体中富集(Valadi等人,2007)。其为18-24个核苷酸(nt)长的小的非编码RNA，所述RNA控制转录后基因表达。其经由Drosha和Dicer核酸内切酶的顺次作用合成并且装载于所述RISC(RNA诱导的沉默复合物)中以靶向mRNA(Bartel,2009；Maniataki和Mourelatos,2005)。在Dicer基因敲除小鼠中，miRNA生物合成的失败导致归因于缺陷型胚胎干细胞增殖和分化的致死性(Bernstein等人,2003；Fukagawa等人,2004)。
微RNA经由miRNA相关RISC(由Dicer、TRBP以及AGO2蛋白构成)与靶标mRNA的序列特异性相互作用和配对操作(Bartel,2009)。这种作用因此抑制翻译和/或引起mRNA去稳定化(Filipowicz,2005)。所述miRNA与其mRNA靶标的互补性程度指示经由mRNA去稳定化/降解或通过抑制翻译所致的mRNA沉默过程(Ambros,2004；Bartel,2009)。如果在所述miRNA与靶标mRNA序列之间遇到完全互补，那么所述RISC复合物用于裂解结合的mRNA以实现降解(Ambros,2004；Bartel,2009)。如果未遇到绝对互补，如在动物细胞中的miRNA的大多数情况下，那么防止翻译以实现基因沉默(Ambros,2004；Bartel,2009)。
为了使miRNA具功能性并且实现有效的miRNA介导的基因沉默，其必须与RLC(RISC装载复合物)蛋白Dicer、TRBP以及AGO2复合。在所述RLC内，在Dicer和TRBP经由输出蛋白-5从细胞核显露出来后，需要其加工前体miRNA(pre-miRNA)，以产生miRNA并且与AGO2缔合。结合于成熟miRNA的AGO2构成最小RISC并且可随后从Dicer和TRBP解离(Chendrimada等人,2005；Gregory等人,2005；Haase等人,2005；MacRae等人,2008；Maniataki和Mourelatos,2005；Melo等人,2009)。单链miRNA本身极不良地并入RISC中并且因此无法有效地导向其靶标mRNA用于转录后调节(Tang,2005；Thomson等人,2013)。
合成siRNA(双链)通过与其靶标mRNA的完全碱基配对引起mRNA衰变(Ambros,2004；Bartel,2009)。所述siRNA归因于其双链性质直接装载于RISC蛋白Dicer、TRBP以及AGO2中(Tang,2005)。单链miRNA无法并入RISC中并且因此无法导向其靶标mRNA用于翻译抑制或降解(Tang,2005)。
一些报告已经提出，含于外来体中的miRNA可影响靶标细胞中的基因表达(Ismail等人,2013；Kogure等人,2011；Kosaka等人,2013；Narayanan等人,2013；Pegtel等人,2010；Valadi等人,2007；Zhang等人,2010)，但问题仍然存在，即如果这些miRNA未作为用于适当mRNA识别和有效翻译抑止的前体miRNA并入RISC中，那么这些miRNA在使mRNA沉默方面有多有效。虽然成熟miRNA(单链)无法与靶标细胞的RISC缔合，但外来体的前体miRNA可通过增选所述靶标细胞的RISC蛋白而在某种程度上诱导基因沉默。然而，所述过程归因于靶标细胞的miRNA生物发生途径中所牵涉的蛋白的潜在饱和状态而极其低效并且缓慢。最近的报告显示在来自HIV-1感染细胞和HIV患者血清的细胞培养物上清液的外来体中Drosha和Dicer的存在(Narayanan等人,2013)。另外，另一项研究显示在晚期内体/MVB(多泡体)中Dicer、TRBP以及AGO2的共同分离(Shen等人,2013)。
发明概述
由癌细胞分泌的外来体相对于非癌症外来体为独特的，所述癌症外来体包含miRNA的独特谱系以及活性RNA加工RISC复合物。所述封装的RNA-RISC复合物也可能用于靶标细胞中的细胞独立miRNA生物发生和高度有效mRNA沉默。
在一个实施方案中，本公开提供一种检测受试者中的癌症生物标志物的方法，所述方法包括(a)从所述受试者获得生物样品；(b)测量以下各物的水平：(i)在所述样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)在所述样品的外来体部分中的RISC蛋白；或(iv)在所述样品的外来体部分中的miRNA加工活性(例如初级miRNA和/或前体miRNA加工活性)；以及(c)基于所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。在一些方面，所述方法包括测量所述miRNA中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10者的水平。在其它方面，所述方法包括测量AGO2、TRBP或DICER蛋白的水平。
在一些方面，所述生物样品基本上不含细胞。例如，所述样品可具有少于10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个细胞。一方面，所述生物样品不含细胞。在某些方面，所述生物样品可为淋巴、唾液、尿液或血液(例如血浆)样品。另一方面，所述方法可进一步包括纯化所述样品的外来体部分和/或增加所述样品的外来体部分的产量。
在某些方面，所述癌症为乳癌、肺癌、头颈癌、***癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。在某些方面，所述癌症为乳癌。一方面，所述受试者先前已经针对癌症进行治疗或先前具有手术去除的肿瘤。
在一些方面，鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物进一步包括使所述测量的miRNA水平、前体miRNA水平、RISC水平或miRNA加工活性与癌症风险相关联。另一方面，鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物进一步包括使用算法分析所述测量的miRNA水平、前体miRNA水平、RISC水平或miRNA加工活性。在一些情况下，分析可通过计算机执行。
在某些方面，所述实施方案的所述方法进一步包括测量以下各物的水平：(i)在所述样品和参考样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)在所述样品和参考样品的外来体部分中的RISC蛋白；或(iv)在所述样品和参考样品的外来体部分中的miRNA加工活性；以及(c)通过比较来自所述受试者的所述样品中miRNA、前体miRNA、RISC或miRNA加工活性的所述水平与所述参考样品中miRNA、前体miRNA、RISC、miRNA加工活性的所述水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。
在一些方面，测量RISC蛋白水平包括执行蛋白印迹、ELISA或结合于抗体阵列。在其它方面，测量miRNA水平包括测量加工过的miRNA水平。在一些情况下，测量miRNA水平包括执行RT-PCR、RNA印迹或阵列杂交。
在一些方面，所述方法进一步包括报告所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。报告可包括制备书面、口头或电子报告。例如，所述报告可提供给所述患者、医生、医院或保险公司。
在另一实施方案中，本公开提供一种治疗受试者的方法，所述方法包括选择根据所述实施方案被鉴定为具有癌症生物标志物的受试者和向所述受试者施用抗癌疗法。例如，所述方法可包括(a)在来自所述受试者的样品的外来体部分中获得以下各物的水平：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA，(ii)RISC蛋白；或(iii)miRNA加工活性；(b)基于所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述水平来选择具有癌症生物标志物的受试者；以及(c)用抗癌疗法治疗所述选择的受试者。在某些方面，所述抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术疗法。
在另一实施方案中，本公开提供一种针对诊断程序选择受试者的方法，所述方法包括(a)在来自所述受试者的样品的外来体部分中获得以下各物的水平：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA水平，(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；(b)基于所述mRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述水平来选择具有癌症生物标志物的受试者；以及(c)对所述受试者执行诊断程序。一方面，所述诊断程序包括诊断成像。所述成像可为活组织检查、X射线、CT、MRI或PET成像。
在又一实施方案中，本公开提供一种包含计算机可读代码的有形的计算机可读介质，所述代码在由计算机实施时使所述计算机执行操作，所述操作包括：(a)接收对应于在来自所述受试者的样品的外来体部分中以下各物的水平的信息：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA，(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；以及(b)确定所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性中的一者或多者与参考水平相比的相对水平，其中与参考水平相比改变的水平指示所述受试者具有癌症生物标志物。
在某些方面，所述有形的计算机可读介质的操作进一步包括接收对应于在不具有癌症的受试者的外来体部分中以下各物的参考水平的信息：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性。
在某些方面，所述有形的计算机可读介质进一步包含在由计算机实施时使所述计算机执行一种或多种额外操作的计算机可读代码，所述操作包括：向有形的数据存储器件发送对应于miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述相对水平的信息。
另一方面，所述参考水平存储于所述有形的计算机可读介质中。一方面，接收信息包括从有形的数据存储器件接收对应于来自受试者的样品中以下各物的水平的信息：miRNA；前体miRNA水平、RISC蛋白或miRNA加工活性。在一些方面，接收信息进一步包括接收对应于来自受试者的样品中所述miRNA中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10者的水平的信息。
在一些方面，所述计算机可读代码在由计算机实施时使所述计算机执行操作，所述操作进一步包括(c)计算所述样品的诊断评分，其中所述诊断评分指示所述样品来自具有癌症的受试者的可能性。
在另一实施方案中，本公开提供一种检测受试者中的癌症生物标志物的方法，所述方法包括(a)从所述受试者获得生物样品；(b)测量所述样品中一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA或其前体miRNA的水平；以及(c)基于所述miRNA的所述测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。一方面，所述生物样品基本上不含细胞。在某些方面，所述生物样品可为淋巴、唾液、尿液或血浆样品。一方面，所述方法可进一步包括纯化体液的外来体部分。
在又一实施方案中，本公开提供一种用于活性抑制RNA的递送的方法，所述方法包括使细胞与联合RISC蛋白复合物提供的抑制RNA接触。一方面，所述RISC蛋白复合物包含TRBP、DICER以及AGO2。在一些方面，所述抑制RNA为siRNA或shRNA。一方面，所述抑制RNA为人类miRNA。
在某些方面，所述抑制RNA和RISC蛋白复合物包含于包含脂质双层的脂质体、纳米粒子或微胶囊中。一方面，所述微胶囊为外来体。
在一些方面，所述方法进一步包括用所述抑制RNA和RISC蛋白复合物转染细胞。另一方面，所述方法进一步包括向受试者施用所述抑制RNA和RISC蛋白复合物。
在又一实施方案中，本公开提供一种包含与RISC蛋白复合物联合的重组或合成抑制RNA的组合物，所述复合物包含于脂质体、纳米粒子或微胶囊中。一方面，所述RISC蛋白复合物包含TRBP、DICER以及AGO2。在一些方面，所述抑制RNA为siRNA或shRNA。在一些方面，所述抑制RNA为人类miRNA。在某些方面，所述复合物包含于合成脂质体、纳米粒子或微胶囊中。一方面，所述微胶囊为外来体。
如上文详述的所述实施方案的某些方面涉及测量在样品的外来体部分中一种或多种选自表5中所提供的那些miRNA的miRNA(或miRNA前体)的水平。例如，一种方法可包括测量选自由以下组成的组的一种或多种miRNA的水平：mmu-miR-709、hsa-miR-1308、mmu-miR-615-3p、hsa-miR-1260b、mmu-miR-1937a、mmu-mir-321-A、hsa-miR-615-3p、hsa-miR-1979、mmu-miR-1937b、hsa-mir-373、mmu-miR-1937c、hsa-miR-1273d-P、mmu-miR-720、mmu-miR-1274a、hsa-mir-565-A、mmu-miR-1931、hsa-miR-1246、hsa-mir-594-P、hsa-mir-321-A、mmu-miR-2145-1-P、hsa-mir-639-P、hsa-miR-720、hsa-miR-1280、mmu-miR-3473、hsa-miR-1260、hsa-miR-1281、mmu-miR-1224-P、mmu-miR-690、hsa-miR-375-P、hsa-miR-4301、mmu-miR-700、mmu-miR-125b-5p、mmu-miR-1191-P、hsa-miR-1274a、hsa-miR-3197、mmu-miR-1935、hsa-miR-1975-P、hsa-miR-4324、hsa-miR-886-3p、hsa-miR-1274b、mmu-miR-1957、hsa-miR-933、hsa-mir-675、hsa-miR-595、mmu-miR-2137、hsa-mir-572-P、mmu-miR-1195、hsa-miR-4294-P、mmu-mir-1899-P、mmu-miR-689-P、hsa-miR-199b-3p、hsa-miR-3117-P、mmu-mir-321-P、mmu-miR-1961-P、hsa-mir-10a、mmu-miR-669d-P、mmu-miR-1937b-2-P、hsa-miR-3125-P、mmu-miR-1934-P、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-718、mmu-miR-1198、mmu-miR-2182-P、hsa-miR-1273、mmu-miR-2133-P、hsa-miR-92b*、hsa-miR-1290、hsa-miR-448、mmu-miR-689、mmu-miR-449a、mmu-miR-1937b-4-P、hsa-miR-4286、mmu-miR-1947、mmu-miR-342-3p、hsa-miR-1303-P、mmu-miR-2132、hsa-miR-4321-P、hsa-miR-4256-P、hsa-miR-4311、mmu-miR-130a、mmu-miR-1939、hsa-miR-1268-P、mmu-miR-31、mmu-miR-99b、mmu-miR-2141、hsa-miR-1202-P、mmu-miR-466b-3p、mmu-miR-2133、hsa-miR-1268、hsa-miR-466、mmu-miR-494、hsa-miR-1289、hsa-miR-320b、hsa-miR-4254、hsa-mir-7-3-P、hsa-miR-923、hsa-miR-764、mmu-miR-291a-3p、mmu-miR-883b-3p、hsa-mir-594-A、mmu-miR-1948-P、hsa-miR-206、hsa-mir-565-P、mmu-miR-467e*、hsa-miR-1826、mmu-miR-467a*、mmu-miR-1983、hsa-miR-324-5p、mmu-let-7c、mmu-miR-1965、hsa-mir-632-P、hsa-miR-181a*MM2GT/AC、hsa-miR-1265、hsa-miR-323b-5p、hsa-mir-1914、hsa-mir-1910、hsa-miR-21、hsa-miR-431*、hsa-miR-3135-P、mmu-miR-187-P、mmu-miR-126-3p、mmu-miR-669a-P、hsa-miR-367、mmu-mir-320-P、hsa-miR-181a*MM1G/C、mmu-miR-484-P、mmu-miR-467c-P、hsa-miR-3154、mmu-miR-466d-3p、hsa-miR-3162-P、mmu-miR-201、mmu-miR-1946a、hsa-miR-937、hsa-miR-3147、hsa-mir-596-P、hsa-miR-3148、hsa-miR-1304、hsa-miR-222MM2GG/AC、mmu-miR-125a-5p、hsa-miR-1272-P、hsa-miR-638、hsa-mir-320、hsa-miR-545*、hsa-mir-1908-P、hsa-let-7d-v2-P、mmu-mir-30d-P、hsa-miR-4297、mmu-miR-182、hsa-miR-3166-P、hsa-miR-494、mmu-miR-669o-P、hsa-miR-566、mmu-miR-1188、mmu-miR-2134-AP、hsa-miR-4259-P、mmu-miR-152、mmu-miR-2134、hsa-miR-3193-AP、hsa-miR-125b、hsa-miR-3124-P、hsa-miR-10b、hsa-miR-455-5p、mmu-miR-144、hsa-miR-130a、hsa-miR-1285、hsa-miR-516b*、hsa-miR-27a、hsa-miR-138-1*、mmu-miR-471、hsa-miR-4298-P、hsa-miR-301b、hsa-mir-147-P、hsa-miR-362-5p、mmu-mir-471-P、mmu-miR-466a-3p、hsa-miR-561、hsa-miR-486-5p、mmu-miR-2861、hsa-miR-587、mmu-miR-375、hsa-mir-329-2-P、mmu-miR-2861-P、hsa-miR-144*、hsa-miR-1255a-P、hsa-mir-519a-2-P、hsa-miR-34c-5p、mmu-miR-466e-3p、mmu-miR-743b-5p、mmu-mir-350-P、mmu-miR-181d、hsa-miR-376a*、hsa-miR-1308-P、mmu-miR-467g、mmu-miR-1946a-P、hsa-miR-147-P、hsa-miR-923-P、mmu-miR-465c-5p、hsa-miR-891a、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-4292、mmu-miR-677-P、hsa-miR-4257、hsa-miR-4326、hsa-miR-17*MM2GG/AA、hsa-miR-939-P、mmu-miR-2182、hsa-miR-220c-P、hsa-miR-3132-P、hsa-miR-532-5p、mmu-miR-1947-P、mmu-miR-29a、hsa-miR-3162、hsa-miR-375MM1C/G、hsa-miR-768-3p、mmu-miR-182-P、mmu-miR-205-P、hsa-miR-505、hsa-miR-3146-P、mmu-miR-721、mmu-miR-376c、hsa-miR-1179-P、mmu-miR-1970、hsa-miR-3133-P、hsa-miR-200c、hsa-miR-220a、mmu-miR-100、hsa-miR-1255b、hsa-miR-222MM1G/A、hsa-miR-885-3p、hsa-miR-517b、hsa-miR-200a、hsa-miR-3141、mmu-miR-669h-3p、hsa-miR-1301、hsa-miR-877、hsa-mir-941-2、hsa-mir-487b-P、hsa-miR-4302、hsa-miR-99b、hsa-miR-1253、hsa-let-7a*、hsa-miR-34aMM2CT/TC、hsa-miR-3181-P、hsa-miR-3200、hsa-miR-3129-P、hsa-miR-93*、hsa-miR-548q-P、mmu-miR-466g、mmu-miR-155、hsa-miR-2278-P、hsa-miR-3065-5p、hsa-miR-633、hsa-miR-4265、mmu-miR-2135-P、hsa-miR-190、mmu-miR-669f、hsa-miR-1323、hsa-miR-588、mmu-miR-183*、hsa-mir-941-4、hsa-mir-1913、hsa-miR-2116*、hsa-miR-1178、mmu-miR-196a、mmu-miR-574-3p、hsa-miR-346、mmu-miR-1199、mmu-miR-681、hsa-miR-4292-P、hsa-miR-522、hsa-mir-611-P、hsa-miR-3171、hsa-miR-635、hsa-miR-1197-P、hsa-miR-604、mmu-let-7a*、hsa-miR-335、mmu-miR-466c-3p、mmu-miR-466i、hsa-miR-1297、mmu-miR-338-5p、hsa-mir-526a-2-P、hsa-miR-181aMM2GC/AG、hsa-miR-18、hsa-miR-924-P、mmu-miR-190-P、hsa-miR-345、mmu-miR-711、hsa-miR-3116-2-P、hsa-miR-99a、mmu-miR-26a、hsa-miR-1248-P、mmu-miR-721-P、mmu-miR-801-P、hsa-miR-1826-P、hsa-miR-1236、hsa-miR-339-5p、mmu-miR-804、mmu-miR-467d*、mmu-miR-1191、hsa-miR-148a、hsa-miR-141、mmu-miR-1937a-P、mmu-miR-696以及hsa-miR-302a(即，表5中所列的那些)。
如本文说明书中所用，“一(a)”或“一(an)”可意味着一种或多种。如本文权利要求书中所用，当联合措辞“包含(comprising)”使用时，措辞“一(a)”或“一(an)”可意味着一种或超过一种。
除非明确指示为仅指代替代物或所述替代物互相排除，否则在权利要求书中术语“或”的使用是用于意味“和/或”，不过本公开支持仅指代替代物和“和/或”的定义。如本文所用，“另一”可意味至少第二种或更多种。
在本申请中，术语“约”用于指示一个值包括针对用于确定所述值的器件、方法的固有误差变化，或在研究受试者之间存在的变化。
本发明的其它目标、特征以及优点将根据以下详细描述变得显而易知。然而，应了解所述详细描述和具体实施例虽然指示本发明的优选实施方案，但仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改根据这个详细描述对于所属领域技术人员将变得显而易知。
附图简述
以下图式形成本说明书的一部分并且包括在内以进一步证明本发明的某些方面。本专利或申请文件含有至少一个以彩色制成的图式。具有彩色图式的本专利或专利申请公布的拷贝将在要求并支付必要的费用后由办事处提供。本发明可通过与本文提供的具体实施方案的详细描述组合参考这些图式中的一个或多个来更好地理解。
图1A-F。外来体的表征—与正常发生小体相比，癌小体富集致癌miRNA。(A)癌小体的透射电子显微照片(左上方照片和左下方照片以及***图像放大；虚线描绘图像放大区域)。右下方图像通过使用抗CD9抗体的免疫胶体金标记和透射电子显微术产生。金粒子以黑斑点描绘。图形表示由112幅TEM图片分析的外来体制剂的平均尺寸。(B)来自乳癌细胞的外来体的原子力显微镜图像。中间图形表示盖玻片中具有外来体的尺寸范围的粒子的分散。右方图形表示由26幅AFM图片分析的外来体制剂的平均尺寸。(C)在从以下收集的外来体中使用抗Dicer抗体的免疫印迹：非致癌小鼠(NMuMG)和人类(MCF10A)细胞系(左方印迹，第一图)；小鼠癌细胞系67NR和4T1(中间印迹，第一图)；人类癌细胞系MCF7和MDA-MB231(右方印迹，第一图)。所用的对照为：相继用TritonX、蛋白酶K(Triton+PK)处理的外来体，以诱导外来体的溶解和外来体蛋白的后续降解；用蛋白酶K处理以使外来体外蛋白降解的外来体(PK)；超速离心以收集外来体后的上清液(上清液)。TSG101(第二行)和CD9(第三行)免疫印迹用于确认外来体的存在。(D)使用与0.4μm珠粒结合的MDA-MB231源性外来体的外来体标志物TSG101、CD9、浮舰蛋白-1以及CD63抗体的流式细胞术分析。(E)使用光散射光谱(LSS)对外来体定尺寸。使用来自具有24nm和100nm标称直径的玻璃微球和具有119nm、175nm、356nm以及457nm标称直径的聚苯乙烯微球的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)悬浮液的信号进行***的校准。针对具有100nm标称直径的玻璃微球和具有356nm标称直径的聚苯乙烯微球的实验光谱和所产生的拟合在左方图形中示出。右方图形表示癌症外来体的PBS悬浮液的尺寸测量。插图示出比例扩大至10μm的相同图形以排除具有细胞和细胞碎片的外来体制剂中的潜在污染。(F)使用NanoSight的外来体尺寸分布。左方图形表示溶液中粒子的尺寸分布，示出105nm平均尺寸并且还示出在较大尺寸处无峰。右方图形表示通过NanoSight获得的溶液中粒子的尺寸分布和浓度。本图中表示的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果，并且表示为±s.d。
图2A-F。癌小体富集miRNA。(A)在MDA-MB231外来体和MCF10A外来体中表达的miRNA的相关图形。(B)在72h无细胞培养后使用在正常发生小体与癌小体之间差异表达的miRNA中的6种(miR-10a、miR-10b、miR-21、miR-27a、miR-155以及miR-373)在细胞和相应外来体中的miRNA之间的相关图形。(C)正常发生小体和癌小体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养物中维持24和72h。24和72h后，回收外来体并且通过qPCR定量15种miRNA(参见表4)。72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。所述图表表示72h后收集的外来体中肿瘤抑制因子(TS)和致癌(ONC)miRNA相对于24h后收集的那些外来体的倍数变化的平均值。(D)来自24和72h无细胞培养后的正常发生小体和无培养和具有24h、72h以及96h无细胞培养的癌小体的miR-10b和miR-21的RNA印迹。tRNAMet用作装载对照。使用ImageJ软件进行定量。(E)在72h无细胞培养后在MCF10A、MDA-MB231以及4T1细胞和其相应外来体中15种定量的miRNA之间的相关图。与正常发生小体(左方图形)相比，癌小体提供与其起源细胞的低相关值(中间和右方图形)。(F)正常发生小体和癌小体的外来体RNA含量的以荧光单位(FU)/秒(s)描绘的生物分析仪图示和凝胶图像。
图3A-E。外来体含有前体miRNA。(A)使用MCF10A和MDA-MB231外来体的qPCR定量对应于所研究的成熟miRNA的15种前体miRNA。对针对各前体miRNA的ΔCt值的倒数绘图以反映其丰度并且值表示为±s.d。(B)癌小体和正常发生小体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种前体miRNA。图形示出72h无细胞培养后在MCF10A和MDA-MB231外来体中各前体miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化并且表示为±s.d。(C)使用在24h和72h无细胞培养后的MCF10A正常发生小体和具有0h、24h、72h以及96h无细胞培养的MDA-MB231癌小体的前体miR-10b和前体miR-21的RNA印迹。tRNAMet用作装载对照。使用ImageJ软件进行定量。(D)上方图形：在24h和72h无细胞培养条件后定量癌小体(MDA-MB231)的致癌前体miRNA(左方图形)和致癌miRNA(右方图形)。对在不同时间点针对各前体miRNA(左方图形)和miRNA(右方图形)的ΔCt值的倒数绘图以反映其丰度并且注意指数趋势。所提供的数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。底部图形：在6h、12h、24h、36h、48h、72h以及96h无细胞培养条件后定量癌小体(MDA-MB231)的前体miRNA(左方图形)和成熟miRNA(右方图形)。对在不同时间点针对各前体miRNA(左方图形)和miRNA(右方图形)的ΔCt值的倒数绘图并且注意指数趋势。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果，并且表示为±s.d。(E)癌小体和正常发生小体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持0h、24h、72h以及96h。从不同时间点萃取外来体并且通过qPCR定量前体miRNA。对在不同时间点针对各前体miRNA的ΔCt值的倒数绘图以反映其丰度。
图4A-N。癌小体含有RLC蛋白。(A)在从以下收集的外来体中使用抗Dicer抗体的免疫印迹：非致癌小鼠(NMuMG)和人类(MCF10A)细胞系；小鼠癌细胞系67NR和4T1；以及人类癌细胞系MCF7和MDAMB231。所用的对照为：相继用TritonX、蛋白酶K处理(Triton+PK)处理的外来体以诱导外来体的溶解和外来体蛋白的后续降解；以及用蛋白酶K处理以使外来体外蛋白降解的外来体(PK)。TSG101(第二行)和CD9(第三行)免疫印迹用于确认外来体的存在。(B)在癌小体(MDA-MB231)中使用抗Dicer抗体的免疫胶体金标记的透射电子显微照片。右上方图像是从所述萃取的一个新的独立图像数字化放大。阴性对照是指IgG。在底部图像中金粒子描绘为黑斑点并且由黑色箭头指示。图形表示左侧两个上部图像的定量。(C)在从用空载体(pCMV-Tag4B；分别为第一和第三泳道)和Flag-Dicer载体(第二和第四泳道)转染的细胞收集的MCF10A和MDA-MB231外来体中使用抗flag抗体(上部图)的免疫印迹。CD9免疫印迹用于确认外来体的存在并且用作装载对照(下部图)。(D)在从用钙离子载体A23187处理的MCF10A和MDA-MB231细胞收集的外来体中针对Dicer的免疫印迹(上部图)。从未处理细胞萃取的外来体用作对照。CD9免疫印迹(下部图)用作对照以显示增加的外来体分泌。(E)在从MCF10A和MDA-MB231亲本细胞和用shScramble和shDicer质粒转染的细胞萃取的外来体中针对Dicer的免疫印迹(上部印迹)。CD9免疫印迹用于示出外来体存在并且用作装载对照(下部印迹)。使用ImageJ软件进行免疫印迹定量。(F)在源于MDAMB231shDicer细胞的癌小体中使用抗Dicer抗体的免疫胶体金标记的透射电子显微照片。金粒子以黑斑点描绘。右方图形描绘EM图片中金粒子的定量。(G)在从癌小体(MCF7和MDA-MB231)和正常发生小体(MCF10A)收集的外来体中使用抗AGO2抗体的免疫印迹。所用的对照为：相继用TritonX、蛋白酶K(TritonX+PK)处理的外来体以诱导外来体的溶解和外来体蛋白的后续降解；用蛋白酶K处理以使外来体外蛋白降解的外来体(PK)；以及超速离心以收集外来体后的上清液(上清液)。TSG101(第二行)和CD9(第三行)免疫印迹用于确认外来体的存在。(H)在从癌小体(MCF7和MDA-MB231)和正常发生小体(MCF10A)收集的外来体中使用抗TRBP抗体的免疫印迹。所用的对照为：相继用TritonX、蛋白酶K(TritonX+PK)处理的外来体以诱导外来体的溶解和外来体蛋白的后续降解；用蛋白酶K处理以使外来体外蛋白降解的外来体(PK)；以及超速离心以收集外来体后的上清液(上清液)。TSG101(第二行)和CD9(第三行)免疫印迹用作外来体标志物。(I)在用GFP-AGO2质粒转染的MCF10A和MDA-MB231细胞中使用抗GFP抗体的免疫印迹(上部图)。β肌动蛋白用作装载对照(下部图)。(J)在从用GFP-AGO2质粒转染的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取的外来体中使用抗GFP抗体的免疫印迹(上部图)。TSG101(中间图)和CD9(下部图)用作外来体标志物和装载对照。(K)在用siAGO2转染的MCF10A和MDA-MB231细胞中的AGO2mRNA表达。MCF10A和MDA-MB231亲本细胞用作相对对照以用于倍数变化比较。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(L)在从MCF10A和MDA-MB231亲本细胞或用si对照或siAGO2转染的细胞萃取的外来体中使用AGO2抗体的免疫印迹(上部图)。TSG101(中间印迹)和CD9(下部印迹)用作外来体标志物和装载对照。使用ImageJ软件进行定量。(M)在从用Dicer抗体或IgG免疫沉淀的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取的外来体蛋白中使用AGO2抗体的免疫印迹(上部图)。从MDA-MB231细胞萃取的外来体的5％的裂解液输入用作对照。Dicer的免疫印迹用作免疫沉淀的对照(下部图)。(N)在从用Dicer抗体或IgG免疫沉淀的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取的外来体蛋白中使用抗TRBP抗体的免疫印迹(上部图)。从MDA-MB231细胞萃取的外来体的裂解液输入(5％)用作对照。Dicer的免疫印迹用作对照(下部图)。
图5A-E。癌小体加工前体miRNA以产生成熟miRNA。(A)外来体从MCF10A、MCF10AshScramble、MCF10AshDicer细胞(上部图形)、MDA-MB231、MDA-MB231shScramble以及MDA-MB231shDicer细胞(下部图形)收集并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，回收外来体并且通过qPCR定量15种前体miRNA。图形示出72h无细胞培养后在不同外来体中各前体miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化并且表示为±s.d。(B)外来体从MCF10A、MCF10AshScramble、MCF10AshDicer细胞(上部图形)、MDA-MB231、MDA-MB231shScramble以及MDA-MB231shDicer细胞(下部图形)收集并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种miRNA。图形示出72h无细胞培养后在不同外来体中各miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化并且表示为±s.d。(C)使用抗兔和抗小鼠二次抗体来检测在MDA-MB231细胞的外来体中电穿孔的重链(HC)和轻链(LC)原发Dicer抗体和原发肌动蛋白抗体的免疫印迹。不具有源于MDA-MB231细胞的抗体的电穿孔的外来体用作阴性对照。蛋白酶K处理在电穿孔后执行以确保未纳入外来体中的抗体的缺乏。(D)癌小体(MDA-MB231)一式两份(底部图形)或一式四份(顶部图形)收集。样品用抗Dicer抗体、抗肌动蛋白抗体或抗TRBP抗体进行电穿孔。所述样品加对照留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量6种致癌前体miRNA(顶部图形)或15种前体miRNA(底部图形)。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各前体miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同前体miRNA定量。所述图表表示相对于24h外来体在72h外来体中前体miRNA的平均倍数变化(在底部图形中—TS＝肿瘤抑制因子；ONC＝致癌的)并且表示为±s.d。(E)癌小体(MDAMB231)一式四份(顶部图形)或一式两份(底部图形)收集。样品用抗Dicer抗体、抗肌动蛋白抗体或抗TRBP抗体进行电穿孔。所述样品加对照留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量6种致癌miRNA(顶部图形)或15种miRNA(底部图形)。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。所述图表表示相对于24h外来体在72h外来体中miRNA的平均倍数变化(在底部图形中－TS＝肿瘤抑制因子；ONC＝致癌的)并且表示为±s.d。
图6A-F。癌小体加工前体miRNA以产生成熟miRNA。(A)收集来自MDA-MB231细胞的外来体并且用格尔德霉素进行电穿孔。所述样品留在无细胞培养条件中持续24和72h，之后萃取外来体并且通过qPCR定量6种miRNA。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。所述图表表示相对于24h外来体在72h外来体中miRNA的平均倍数变化并且表示为±s.d。(B)合成的前体miRNA-10b、-21以及-cel-1电穿孔至从MCF10A(MCF10A电穿孔)、MCF10AshDicer(MCF10AshDicer电穿孔)、MDAMB231(MDA-MB231电穿孔)以及MDA-MB231shDicer(MDAMB231shDicer电穿孔)细胞收集的外来体中。在无细胞培养条件下持续72h后回收外来体。在72h电穿孔和培养之前和之后通过qPCR定量前体miR-10b、-21以及-cel-1。所述图表上的各条形示出相对于电穿孔后0h在电穿孔后72h前体miR-10b、-21以及-cel-1的倍数变化并且表示为±s.d。在前体miRNA不存在下电穿孔的MCF10A和MDA-MB231外来体用作对照以突显基础水平。(C)合成的前体miRNA-10b、-21以及-cel-1电穿孔至从MCF10A(MCF10A电穿孔)、MCF10AshDicer(MCF10AshDicer电穿孔)、MDA-MB231(MDA-MB231电穿孔)以及MDAMB231shDicer(MDA-MB231shDicer电穿孔)细胞收集的外来体中。在无细胞培养条件下持续72h后回收外来体。在72h电穿孔和培养之前和之后通过qPCR定量MiR-10b、-21以及-cel-1。所述图表上的各条形示出相对于电穿孔后0h(顶部图形)或24h(底部图形)在电穿孔后72hmiR-10b、-21以及-cel-1的倍数变化并且表示为±s.d。在前体miRNA不存在下电穿孔的MCF10A和MDA-MB231外来体用作对照以确定基础水平。(D)使用来自切割测定的样品，无检测探针的RNA印迹。不同的外来体蛋白萃取物和用生物素内部标记的合成的前体miR-10b用于所述切割测定。所用的样品为MCF10A、MCF10AshDicer、MDA-MB231外来体(MDA231外来体)、来自MDA-MB231shDicer克隆1和克隆2的外来体(分别为MDA231shDicer1外来体和MDA231shDicer2外来体)、MDA-MB231shDicer细胞以及用Dicer抗体电穿孔的MDA-MB231外来体(MDA231外来体+DicerAB)。(E)使用来自切割测定的样品，无检测探针的RNA印迹。不同的外来体蛋白萃取物和用生物素内部标记的合成的前体miR-21用于所述切割测定。所用的样品为MCF10A、MCF10AshDicer、MDA-MB231外来体(MDA231外来体)、来自MDA-MB231shDicer克隆1和克隆2的外来体(分别为MDA231shDicer1外来体和MDA231shDicer2外来体)、MDA-MB231shDicer细胞以及用Dicer抗体电穿孔的MDA-MB231外来体(MDA231外来体+DicerAB)。(F)使用来自切割测定的样品，无检测探针的RNA印迹。不同的外来体蛋白萃取物和用生物素内部标记的合成的前体cel-miR-1用于所述切割测定。所用的样品为MCF10A、MCF10AshDicer、MDA-MB231外来体(MDA231外来体)、MDA-MB231shDicer外来体(MDA231shDicer外来体)以及用Dicer抗体电穿孔的MDAMB231外来体(MDA231外来体+DicerAB)。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。
图7A-H。癌小体在受体细胞中诱导转录组改变并且以Dicer依赖性方式诱导肿瘤形成。(A)使用抗PTEN抗体和在无细胞培养后用MDA-MB231癌小体处理0、30min、1h、12h以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(B)使用抗HOXD10抗体和在无细胞培养条件后用MDA-MB231癌小体处理0、30min、1h、12h以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(C)图形示出用3’UTR-PTEN-WT、3’UTRPTEN-Mut、3’UTR-HOXD10-WT以及3’UTR-HOXD10-Mut短暂转染并且用源于MDA-MB231细胞的癌小体处理的MCF10A细胞的荧光素酶报告基因活性。(D)使用抗PTEN抗体(上部图)和抗HOXD10抗体(中间图)以及来自在无细胞培养条件后用由Dicer抗体电穿孔的MDAMB231癌小体处理0、30min、1h、12h以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(E)使用抗Smad4抗体(上部图)以及MCF10A细胞和用具有抗miR-182-5p的MDA-MB231外来体和不具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(F)细胞活力在MCF10A细胞、用不具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A+MDA231外来体)、用具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体培养)以及用由Dicer抗体电穿孔并具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体DicerAB)的5天培养期间通过MTT测定测量并且表示为±s.d。*p＝0.0027。(G)所述集落形成测定示出在8天MCF10A细胞培养、用不具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A+MDA231外来体)、用具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体培养)以及用由Dicer抗体电穿孔并具有无细胞培养时间的MDA-MB231外来体处理的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体DicerAB)后在培养板上并且用MTT试剂标记的集落的形成。(H)顶部图形：MCF10A细胞、暴露于MDA-MB-231癌小体的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体培养)、暴露于用Dicer抗体电穿孔的MDA-MB231癌小体的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体DicerAB)以及暴露于用肌动蛋白抗体电穿孔的MDAMB231癌小体的MCF10A细胞(MCF10A细胞+MDA231外来体肌动蛋白AB)原位注射至无胸腺裸小鼠的乳腺垫中。图形描绘关于时间的肿瘤体积并且表示为±s.d。*p＝0.005。底部图形：MCF10A细胞、MDA-MB231细胞以及暴露于癌小体(MDA-MB231)的MCF10A细胞原位注射于无胸腺裸小鼠的乳腺垫中。图形描绘关于时间的肿瘤体积。
图8A-I。来自乳癌患者的血清含有Dicer并且加工前体miRNA。(A)使用识别人类和小鼠Dicer的抗Dicer抗体和来自从异种移植人类肿瘤(如图18A中所示)的小鼠收集的血清外来体的蛋白萃取物的免疫印迹。OVA1-5表示人类卵巢异种移植物；END1-3表示人类子宫内膜异种移植物；以及BRST1和2表示人类***异种移植物。4T1外来体和细胞用作用于鼠类Dicer的对照。hsa-Dicer表示人类Dicer分子量并且mmu-Dicer表示鼠类Dicer分子量。关于作为装载对照的膜的考马斯染色，参见图18D。(B)NanoSight粒子跟踪分析示出从8个健康供体(左侧图形)和11个乳癌患者(右侧图形)的血清萃取的外来体的尺寸分布。使样品的浓度标准化以较好地示出尺寸。(C)从乳癌患者的血清收集的外来体的透射电子显微照片。(D)通过NanoSight粒子跟踪分析所分析的来自8个健康供体和11个乳癌患者的血清的外来体的浓度。*p＝0.012(E)外来体从来自8个健康供体和11个乳癌患者的新鲜血清收集。所萃取的样品留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，回收外来体并且通过qPCR定量6种前体miRNA。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各前体miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同前体miRNA定量。所述图解点图表示相对于24h外来体在72h外来体中前体miRNA的平均倍数变化并且表示为±s.d。(F)外来体从来自8个健康供体和11个乳癌患者的新鲜血清收集。所萃取的样品留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，回收外来体并且通过qPCR定量6种miRNA。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。所述图解点图表示相对于24h外来体在72h外来体中miRNA的平均倍数变化。图E和F均为三个独立实验(各具有三次重复)的结果并且表示为±s.d。(G)MCF10A细胞、与来自健康供体的外来体(H1-8)混合的MCF10A细胞以及与来自乳癌患者的外来体(BC1-11)混合的MCF10A细胞原位注射至无胸腺裸小鼠的乳腺垫中。根据体重计算所用的外来体的数目，反映从血清收集的初始浓度。尚未形成肿瘤的样品看起来在所述图形的x轴中重叠。这一图形描绘关于时间的肿瘤体积并且表示为±s.d。(H)使用抗Dicer抗体和来自从5个健康个体(C46、C45、C44、C43以及C41)和4个转移性乳癌(Met219、Met354、Met299以及Met356)收集的血清外来体的蛋白萃取物的免疫印迹，使用CD9印迹作为装载对照。(I)HDF和用癌小体(MDA-MB231)处理的HDF的倍增时间。*p＝0.0114。使用ImageJ软件进行免疫印迹定量。
图9A-B。Dicer存在于多泡体中并且细胞质CD43将Dicer动员至外来体中。(A)在用Dicer抗体(IPDicer)或用IgG(上部图，分别为右侧和中间泳道)免疫沉淀的MDA-MB231细胞的蛋白萃取物中CD43的免疫印迹。Dicer单独免疫印迹用作对照(下部图)。(B)在MDA-MB231源性外来体和MDA-MB231siCD43源性外来体的蛋白萃取物中Dicer的免疫印迹。CD9免疫印迹用作装载对照。使用ImageJ软件进行定量。
图10A-E。外来体表征。(A)在超速离心管的底部，PKH26染色的外来体的照片。插图表示所述外来体的数字放大图像。(B)用于收集LSS光谱的实验***的图示。(C)在MCF10A、NMuMG、MDA-MB231以及4T1细胞的5天培养期间通过MTT测定测量的细胞活力。(D)针对MDA-MB231和4T1细胞的碘化丙啶(PI)和AnexinV的流式细胞术分析。用依托泊苷处理的MDA-MB231细胞用作细胞凋亡的阳性对照。(E)外来体中细胞色素C的免疫印迹分析，使用MDA-MB231细胞作为外来体的阳性对照并且使用TSG101作为装载对照。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果，并且表示为±s.d。
图11A-E。与正常发生小体相比，癌小体富集miRNA。(A)人类***MCF10A(非致癌)和MDA-MB231(乳癌)细胞系的RNA含量的以荧光单位(FU)/核苷酸(nt)描绘的生物分析仪图示(图形)和凝胶图像(右侧图像)。(B)从4T1、MCF10A以及MDA-MB231细胞收集的外来体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，回收外来体并且通过qPCR定量15种miRNA(参见表4)。图形示出分别相对于24和72h无细胞培养后的正常发生小体，24h(上部图形)和72h(下部图形)无细胞培养后在癌小体中各miRNA的倍数变化。所表示的数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(C)在MCF10A(左侧图形)、MDA-MB231(中间图形)以及4T1(右侧图形)细胞和其相应外来体中通过qPCR定量15种成熟miRNA(参见表4)。外来体中各miRNA的倍数变化相对于细胞中的相同miRNA定量。TS：肿瘤抑制因子miRNA；ONC：致癌miRNA。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(D)从MCF10A、MDA-MB231以及4T1细胞收集的外来体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种miRNA(参见表4)。72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。数据对应于图2C中的倍数变化平均值图形的详细图形。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果，并且表示为±s.d。(E)在72h无细胞培养后在MCF7和67NR细胞以及其相应外来体中15种定量的miRNA之间的相关图。
图12A-E。外来体含有前体miRNA。(A)在NMuMG和4T1外来体中通过qPCR定量对应于先前所定量的成熟miRNA的15种前体miRNA(参见表4)。对针对各前体miRNA的ΔCt值的倒数绘图以反映其丰度。数据为三次生物重复的结果并且表示为±s.d。(B)从NMuMG和4T1细胞收集的外来体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种前体miRNA。图形示出72h无细胞培养后在NMuMG和4T1外来体中各前体miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(C)MDAMB231细胞中的XPO5mRNA表达，其中两种短暂转染的siRNA靶向XPO5与对照细胞相比较以作为倍数变化。(D)MDA-MB231细胞用XPO5siRNA构建体转染并且在转染12h后的若干时间点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h以及96h)分析miR-21表达。作为比较以示出长离心时期的效果，用XPO5siRNA构建体转染的MDA-MB231细胞在4℃下离心3h并且放回培养物中。在离心后的若干时间点(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h以及96h)分析MiR-21表达。在离心的细胞中前体miR21加工为miR-21有所延迟(绿色条形)。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果，并且表示为±s.d。(E)从NMuMG和4T1细胞收集的外来体再悬浮于DMEM培养基中并且在无细胞培养条件下维持0、24、72以及96h。从不同时间点萃取外来体并且通过qPCR定量前体miRNA。对在不同时间点针对各前体miRNA的ΔCt值的倒数绘图以反映其丰度。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。
图13A-H。癌小体含有Dicer。(A)在MCF10A细胞源性外来体中使用抗Dicer抗体(右侧照片)和阴性对照(左侧照片)通过免疫胶体金标记产生的透射电子显微照片图像。与关于MDA-MB231外来体的阳性免疫胶体金标记的图4B相比较。(B)使用抗GFP抗体MDA-MB231源性外来体通过免疫胶体金标记产生的透射电子显微照片图像。(C)在用空载体(pCMV-Tag4B；分别为第一和第三泳道)和Flag-Dicer载体(第二和第四泳道)转染的MCF10A和MDAMB231细胞中使用抗flag抗体(上部图)的免疫印迹。β肌动蛋白免疫印迹用作装载对照(下部图)。(D)在MCF10A、MCF10AshScramble以及分别MCF10AshDicer克隆1和2(MCF10AshDicer克隆1和MCF10AshDicer克隆2)细胞中使用抗Dicer抗体(上部图)的免疫印迹。β肌动蛋白免疫印迹用作装载对照(下部图)。(E)在MDA-MB231、MDA-MB231shScramble以及分别MDA-MB231shDicer克隆1和2(MDA-MB231shDicer克隆1和MDA-MB231shDicer克隆2)细胞中使用抗Dicer抗体(上部图)的免疫印迹。β肌动蛋白免疫印迹用作装载对照(下部图)。使用ImageJ软件进行免疫印迹定量。(F)在从用Dicer抗体或IgG免疫沉淀的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取的外来体蛋白中使用AGO2抗体的免疫印迹(上部图)。从MDA-MB231细胞萃取的外来体的5％的裂解液输入用作对照。Dicer的免疫印迹用作免疫沉淀的对照(下部图)。(G)在从用Dicer抗体或IgG免疫沉淀的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取的外来体蛋白中使用抗TRBP抗体的免疫印迹(上部图)。从MDA-MB231细胞萃取的外来体的裂解液输入(5％)用作对照。Dicer的免疫印迹用作免疫沉淀的对照(下部图)。(H)在来自A549(人类肺癌)、SW480(人类结肠癌)、HeLa(人类子***)以及4T07(鼠类乳癌)细胞系的癌小体中Dicer的免疫印迹(上部图)。TSG101免疫印迹用于确认外来体的存在并且用作装载(下部印迹)。
图14A-F。外来体中的Dicer检测。(A)在4T1、4T1shScramble以及4T1shDicer细胞和从4T1(4T1外来体)和4T1shDicer(4T1shDicer外来体)细胞收集的外来体中使用抗Dicer抗体的免疫印迹(上部印迹)。GADPH免疫印迹用作装载对照(下部印迹)。使用ImageJ软件进行定量。(B)从4T1、4T1shScramble以及4T1shDicer细胞收集外来体并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种前体miRNA。图形示出72h无细胞培养后在不同外来体中各前体miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(C)从4T1、4T1shScramble以及4T1shDicer细胞收集外来体并且在无细胞培养条件下维持24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种miRNA。图形示出72h无细胞培养后在不同外来体中各miRNA相对于24h无细胞培养的倍数变化。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(D)一式两份从MDA-MB231细胞收集外来体。所述样品之一用抗Dicer抗体电穿孔。两份样品均留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种前体miRNA(参见表4)。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各前体miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同前体miRNA定量。所述图表表示相对于24h外来体在72h外来体中前体miRNA的倍数变化并且为图5D中所表示的图形的详细分析。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(E)一式两份从MDA-MB231细胞收集外来体。所述样品之一用抗Dicer抗体电穿孔。两份样品均留在无细胞培养条件中持续24和72h。24和72h后，再一次萃取外来体并且通过qPCR定量15种miRNA(参见表4)。在各样品中，72h无细胞培养后外来体中各miRNA的倍数变化相对于24h无细胞培养后外来体中的相同miRNA定量。所述图表表示相对于24h外来体在72h外来体中miRNA的倍数变化并且为图5E中所表示的图形的详细分析。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(F)与MDA-MB231外来体(MDA-MB231外来体)相比在用Dicer电穿孔的MDA-MB231外来体(MDA-MB231外来体DicerAB)中下调的miRNA的类别(致癌、肿瘤抑制因子以及关于癌症未确定)的图示。微RNA基于文献归属于各类别。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果并且表示为±s.d。
图15A-C。外来体中的Dicer检测。(A)外来体从MCF10、MCF10AshDicer、MDA-MB231以及MDA-MB231shDicer细胞收集并且用合成的前体miRNA-10b、-21以及-cel-1电穿孔。在电穿孔的外来体中各前体miRNA通过qPCR定量并且表示为相对于仅用电穿孔缓冲液电穿孔的外来体的倍数变化。(B)生物素内部标记的前体miR-21、-10b以及-cel-1的斑点印迹。(C)用前体miR-10b、-21以及-cel-1转染的MCF10A细胞的miR-10b、-21以及-cel-1表达分析。各条形表示与未转染细胞相比转染细胞的倍数变化。本图中提供的数据为三个独立实验(各具有三次重复)的结果并且表示为±s.d。
图16A-I。Dicer存在于多泡体中并且细胞质CD43将Dicer动员至外来体中。(A)图形表示如使用imageJ软件所定量的在共焦图像中共定位的百分比。(B)在使用用于Hrs和TSG101的两种不同siRNA和用于BiG2的两种不同sh克隆下调后的Hrs、TSG101以及BiG2mRNA表达。未转染和shScramble转染的细胞用作对照。(C)通过从MCF10A、MCF10AsiHrs、MDA-MB231以及MDA-MB231siHrs(左侧图形)、MCF10shScramble、MCF10AshBiG2、MDA-MB231shScramble、MDA-MB231shBiG2(中间图形)以及MCF10AsiTSG101和MDA-MB231siTSG101(右侧图形)萃取的外来体的Bradford测定进行的蛋白定量。亲本未转染细胞用作相对对照以用于倍数变化分析。数据通过细胞数目标准化并且为三次生物重复的结果，表示为SD。(D)在MCF10A、MCF10AsiTSG101(siTSG101)、MCF10AsiHrs(siHrs)以及MCF10AshBiG2(shBiG2)细胞的外来体蛋白萃取物中CD9的免疫印迹(上部印迹)；在MDA-MB231、MDA-MB231siTSG101(siTSG101)、MDA-MB231siHrs(siHrs)以及MDA-MB231shBiG2(shBiG2)细胞的外来体蛋白萃取物中CD9的免疫印迹(下部印迹)。(E)MDA-MB231、MDA-MB-231siTSG101、-siHrs以及shBiG2源性外来体的NanoSight粒子跟踪分析，示出在Hrs、TSG101以及BiG2下调的细胞中外来体数目的下调和所述外来体预期的尺寸分布。(F)在MCF10A、MCF10AshScramble、MCF10AsiHrs、MCF10AshBiG2、MCF10AsiTSG101、MDA-MB231、MDA-MB231shScramble、MDA-MB231siHrs、MDA-MB231shBiG2、MDA-MB231siTSG101、4T1、4T1siHrs、4T1shBiG2以及4T1siTSG101细胞中Dicer的mRNA表达。亲本细胞用作相对对照以用于倍数变化比较。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(G)在用抗Dicer抗体(上部印迹，两个左侧泳道)连同对应于用于免疫沉淀的蛋白裂解液的输入的5％(上部印迹，两个右侧泳道)免疫沉淀的MDA-MB231和4T1癌细胞的蛋白萃取物中Dicer的免疫印迹。在用抗Dicer抗体(下部印迹，两个左侧泳道)连同对应于用于免疫沉淀的蛋白裂解液的输入的5％(下部印迹，两个右侧泳道)免疫沉淀的MDA-MB231和4T1细胞的蛋白萃取物中多聚泛素的免疫印迹。(H)在MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA-MB231以及MDA-MB231siCD43细胞中CD43的mRNA表达。MCF10A和MDA-MB231亲本细胞用作相对对照以用于倍数变化比较。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。(I)在MCF10A、MCF10AsiCD43、MDA-MB231以及MDA-MB231siCD43细胞中Dicer的mRNA表达。MCF10A和MDA-MB231亲本细胞用作相对对照以用于倍数变化比较。数据为三次生物重复的结果并且表示为SD。
图17A-G。癌小体在接受细胞中诱导转录组改变并且以Dicer依赖性方式诱导肿瘤形成。(A)源于MDA-MB231CD63-GFP细胞的外来体的NanoSight粒子跟踪分析。黑线表示总的外来体群体的量度并且绿线使用配备有488nm激光束的NanoSight描绘用CD63-GFP标记的外来体的群体。浅灰色和浅绿色表示各量度的误差棒。(B)使用抗PTEN抗体和用新鲜萃取的MDA-MB231癌小体处理0、30min、1h、12h以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(C)使用抗HOXD10抗体和用新鲜萃取的MDA-MB231癌小体处理0、30min、1h、12h以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。β肌动蛋白用作装载对照。(D)MCF10A细胞由用于XPO5的siRNA转染以下调从细胞核流入细胞质中的前体miRNA。在MCF10AsiXPO5细胞和用具有和不具有Dicer抗体的MDA-MB231外来体处理的MCF10AsiXPO5细胞中分析前体miR15的加工，从而测量miR-15随时间(6h、12h、24h、36h以及48h)的水平。未指示显著变化。(E)在MDA-MB231源性外来体中随时间(0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h以及96h)监测miR182-5p表达。各条形表示与0h相比各时间点的倍数变化。未注意到显著差异。(F)图形提供图7G的集落数目定量。*p＝0.0006。(G)使用抗Dicer抗体和在无细胞培养条件后用由Dicer抗体电穿孔的MDA-MB231癌小体处理0、30min、1、12以及24h的MCF10A细胞的蛋白萃取物的免疫印迹。α微管蛋白用作装载对照。
图18A-D。乳癌患者-外来体含有Dicer，加工前体miRNA并且进入不同器官中的细胞中。(A)源于裸小鼠中的新鲜原发人类卵巢、子宫内膜以及***肿瘤的片段的原位异种移植物的代表性照片。(B)卵巢癌、子宫内膜癌以及乳癌原位异种移植物的苏木精-伊红(HE)染色。(C)从具有原位肿瘤异种移植物的小鼠收集的血清外来体的透射电子显微照片。(D)图8A中描绘的免疫印迹的膜的考马斯染色。
说明性实施方案的描述
癌症进展依赖于肿瘤中的细胞之间的有效通讯。外来体为所有细胞类型所分泌的纳米囊泡并且含有蛋白和核酸。由癌细胞分泌的外来体具体说来含有与RNA诱导的沉默复合物(RISC；Dicer/TRBP/AGO2)缔合的微RNA(miRNA)并且具有细胞自主能力以将前体微RNA(前体miRNA)加工成成熟miRNA。RISC缔合的miRNA而非裸miRNA的存在允许靶标细胞中mRNA的高度有效并且快速沉默，从而有效地改变其转录组。癌细胞中的RISC蛋白具体说来被导向多泡体(MVB)中并且随后以CD43依赖性方式被导向外来体中。外来体的RISC并入的miRNA刺激非致癌上皮细胞以经由致癌途径的特异性诱导形成肿瘤并且激活基质成纤维细胞。这项研究阐明了癌症外来体在诱导致癌“场效应”方面的可能作用，所述“场效应”进一步抑制正常细胞以参与癌症发展和进展。此外，miRNA生物发生可以细胞独立方式出现于外来体中，这提供了工程改造用于多种疾病的有效的miRNA介导的靶向疗法的新机会。
I.癌症源性外来体
肿瘤含有癌细胞和基质要素(Tse和Kalluri,2011)。新出现的证据表明，在肿瘤和其周围环境的细胞之间的通讯还决定了癌症的全身扩散的速率和强度(Luga等人,2012)。一些研究表明，原发肿瘤可经由癌细胞分泌因子培养并且准备继发肿瘤位点以用于将来转移(Hood等人,2011；Peinado等人,2012)。已经鉴定了若干所述介体，其包括可溶性生长因子、葡萄糖代谢物、趋化因子、酶、微粒、微囊泡、外来体以及游离核酸(Guermonprez等人,2002；Luga等人,2012；Peinado等人,2012；Simons和Raposo,2009；Thery和Casas,2002)。
近年来可见涉及外来体和其与癌症的相关性的过多公布(Yang和Robbins,2011)。大多数研究显示与正常细胞相比，癌细胞分泌较多数目的外来体(Yang和Robbins,2011)。缺氧癌细胞比含氧量正常的癌细胞脱落更多外来体(King等人,2012)。推测癌症源性外来体携带特定有效载荷的蛋白和核酸，包括miRNA(Valadi等人,2007)。尽管引起争论，所述研究无法解释蛋白和miRNA如何可诱导靶标细胞(无论近或远)中的显著功能变化。大多数研究已经鉴定外来体中的成熟miRNA，但其功能大部分尚未可知。此外，单链miRNA在无RISC并入的情况下使靶标mRNA沉默以促进mRNA识别的效率极低。RLC的蛋白识别前体miRNA并且将其加工成22个核苷酸的RNA双链体。AGO2选择一条链用于后续基因沉默，而另一条链通常降解。总体反应为自发的并且不需要超出三种蛋白和所并入的前体miRNA的任何因素(Maniataki和Mourelatos,2005)。因此，为了使miRNA具有充分功能性，其需要RLC并入的其前体miRNA的加工和AGO介导的mRNA识别和沉默。
本文中，探测来自癌细胞(癌小体)和对照细胞(正常发生小体)的外来体的miRNA谱并且评估外来体miRNA实现靶标细胞转录组的基因沉默和改变的功能能力。癌小体具体说来含有Dicer、TRBP以及AGO2作为具有将前体miRNA加工成miRNA的能力的功能复合物。所述前体miRNA存在于所有外来体中，但由于RLC的存在仅在癌小体中被加工。有趣的是，致癌前体miRNA/miRNA偏好积聚于癌小体中并且这可能仅仅反映癌细胞的前体miRNA含量，癌细胞一般富集致癌miRNA/前体miRNA(Bartels和Tsongalis,2009；Nicoloso等人,2009)。
先前的报告表明外来体中miRNA的存在并且推测了其功能(Valadi等人,2007；Zhang等人,2010)。假定miRNA需要以化学计量浓度存在以用于mRNA靶标的适当沉默，看起来循环中的外来体将不可能提供充足浓度的成熟miRNA来阻遏靶标转录组。源自受体细胞中的外来体的前体miRNA的加工为不可能的事件，因为受体细胞中的miRNA生物发生为速率限制性的，这不仅归因于已经存在于细胞内部的可用于加工的前体miRNA的总量，而且归因于所需酶的速率限制性量。因此，更有效的是使成熟miRNA进入受体细胞以用于转录后基因表达的直接改变而不必通过加工途径，后一种情形将在前体miRNA而非相应的成熟miRNA转移至受体细胞的情况下发生。外来体中的特异性miRNA生物发生解决了关于癌细胞的这个难题。癌小体高度富集与RISC缔合的成熟miRNA的子集并且可在使靶标细胞的表型成形方面发挥重要的生物作用。
此外，癌细胞过度表达具有致癌潜能的miRNA，如miR-21和miR-155，这使其具有增殖和生存优势并且导致晚期临床阶段、转移以及不良预后(Yan等人,2008)。先前也已经报告，这些miRNA在癌症患者的循环中过度表达(Mao等人,2013)。细胞中miRNA的合成为酶促反应并且因此取决于存在于其细胞质中的关键酶的量，如Dicer。Dicer已经被描述为在乳癌细胞和肿瘤中下调(Grelier等人,2009；Martello等人,2010)。因此，这些癌细胞可合成的miRNA的量受到限制。因为外来体产生为持续过程，所以假设癌细胞用RLC蛋白包装特异性前体miRNA以允许成熟miRNA在外来体中富集并且同时，使这些miRNA在起源细胞中保持上调。癌小体高度富集与RISC缔合的成熟miRNA并且可在使靶标细胞的表型成形方面发挥重要的生物作用。同时，起源细胞维持其有利的致癌miRNA的过度表达，同时受体细胞不可见由于前体miRNA通过外来体进入而过饱和的其生物发生途径。
本发明研究揭露了RISC依赖性机制，通过所述机制，癌症外来体富集miRNA的子集。使用针对癌细胞中的Dicer的siRNA/shRNA并非探测外来体中miRNA的含量的可行性选项，因为外来体miRNA的任何降低均可能仅仅反映归因于Dicer抑制的低含量miRNA。因此，开发电穿孔方法以将中和抗体直接递送至外来体。这种方法有效地用于抑制外来体中的Dicer活性并且防止前体miRNA的加工。
虽然某些miRNA在特定肿瘤中上调(Volinia等人,2006)，但也报告了在人类癌症中出现miRNA的整体减少(Kumar等人,2007；Lu等人,2005；Melo等人,2011；Melo等人,2010；Melo等人,2009；Ozen等人,2008)。Dicer被描述为在癌细胞中受到抑制，但低含量足以维持肿瘤生长(Kumar等人,2009)。经由miR-103/107实现的部分Dicer下调会增强癌细胞侵袭性而不影响细胞增殖(Martello等人,2010)。Dicer的完全损失对细胞生存有害(Fukagawa等人,2004)。而低含量的Dicer导致肺癌和卵巢癌患者的不良生存(Karube等人,2005；Merritt等人,2008)。同样，Dicer的杂合损失导致乳癌患者中的转移(Martello等人,2010)。乳癌中Dicer的下调还在转录后发生，因为mRNA含量保持不变(Grelier等人,2009；Wiesen和Tomasi,2009)。在癌细胞中，一部分Dicer以CD43依赖性方式靶向内体/MVB。最终，Dicer经由外来体分泌。外来体生物发生途径的组分Hrs、BiG2以及TSG101的下调导致Dicer蛋白的细胞定位的急剧变化。关于癌细胞中受到抑制的Dicer含量的一种可能的解释可为归因于经由外来体的活性输出。如果外来体分泌途径被关闭，那么癌细胞感知Dicer蛋白的增加并且下调其mRNA表达。另外，其使所述蛋白穿梭至细胞核隔室中，其中所述蛋白无法再有助于成熟miRNA的产生。在这点上，在侵袭性癌细胞中的Dicer上调使其更不积极(Park等人,2011)。
CD43为主要存在于白血球中的跨膜蛋白。在一些癌细胞中，在细胞质和细胞核中观察到截短的CD43(Shelley等人2012)。先前已经显示CD43可能使某些膜蛋白靶向外来体(Shen等人,2011a)。在原位乳癌的小鼠模型中对CD43的抑制会使肿瘤负荷降低76％(Shelley等人,2012)。临床研究表明，CD43表达导致乳癌患者的不良生存(deLaurentiis等人,2011)。这项报告确定，CD43在功能上牵涉于将Dicer导向癌小体中。
最近的研究显示，黑素瘤源性外来体在转移中发挥作用并且源自成纤维细胞的外来体在乳癌细胞的迁移中发挥作用(Luga等人,2012；Peinado等人,2012)。源自癌细胞的外来体具有与mRNA和促血管生成蛋白的转移有关的原致癌作用(Luga等人,2012；Peinado等人,2012；Skog等人,2008)。源自癌细胞的外来体也可促进致癌基因的水平转移，如EGFRvIII(Skog等人,2008)。癌小体经由RISC缔合的miRNA介导靶标细胞中的显著转录组改变。靶标细胞中的多种生物过程受到影响，从而诱导增殖并且将非致癌细胞转化成肿瘤形成细胞。尽管如此，癌小体对受体细胞的可能的体内效应有可能取决于若干其它环境参数和可达性屏障。
癌小体也激活基质成纤维细胞以获得肌成纤维细胞表型。例如，说明癌小体分别经由癌小体源性miR-21和miR-10b使肿瘤抑制因子PTEN和HOXD10沉默的能力(Ma等人,2007；Maehama,2007)。这些结果突显了癌细胞用于实现恶性肿瘤的通讯的复杂性质。这些数据说明癌细胞可使用外来体来操纵周围的正常细胞以加速癌症进展并且募集反应性基质。
多项研究已经显示，成纤维细胞和正常上皮细胞也展现肿瘤抑制因子的下调和致癌基因的激活而无明显突变。总起来说，这项研究阐明了癌症外来体在诱导致癌“场效应”方面所发挥的可能作用，所述“场效应”进一步抑制邻近的正常细胞以参与癌症发展和进展。癌小体可经由致癌途径的激活将非致癌细胞转化成肿瘤形成细胞。另外，癌小体也可参与产生反应性基质。此举有可能无需规定的基因突变即实现并且解释了突变的癌细胞如何延长其进程以从其微环境和大环境募集支持的复杂性质。
II.生物标志物检测
生物标志物或基因的表达可通过本领域中众所周知的多种技术来测量。对生物标志物的信使RNA(mRNA)的含量定量可用于测量所述生物标志物的表达。或者，对生物标志物的蛋白产物的含量定量可用于测量所述生物标志物的表达。关于下文所讨论的方法的额外信息可发现于Ausubel等人(2003)或Sambrook等人(1989)中。本领域技术人员应直到可操纵何种参数来优化所关注的mRNA或蛋白的检测。
在一些实施方案中，所述获得表达信息可包括RNA定量，例如cDNA微阵列、定量RT-PCR、原位杂交、RNA印迹或核酸酶保护。所述获得表达信息可包括蛋白定量，例如蛋白定量包括免疫组织化学、ELISA、放射性免疫测定(RIA)、免疫放射测定、荧光免疫测定、化学发光测定、生物发光测定、凝胶电泳、蛋白印迹分析、质谱分析或蛋白微阵列。
核酸微阵列可用于定量多种生物标志物的差异表达。微阵列分析可使用市面上有售的设备，根据制造商的协议，如通过使用Affymetrix技术(SantaClara,CA)或来自Incyte的MicroarraySystem(Fremont,CA)来执行。例如，单链核酸(例如cDNA或寡核苷酸)可接种于或排列于微芯片衬底上。排列的序列接着与来自所关注的细胞的特异性核酸探针杂交。荧光标记的cDNA探针可通过利用由所关注的细胞萃取的RNA的反转录并入荧光标记的脱氧核苷酸来产生。或者，所述RNA可通过体外转录来扩增并且用如生物素的标志物标记。标记的探针接着在高度严格条件下杂交至微芯片上的固定核酸。在严格洗涤以去除非特异性结合的探针后，通过共焦激光显微镜或通过另一种检测方法，如CCD照相机来扫描所述芯片。杂交文件中的原始荧光强度数据一般用稳健多芯片平均(RMA)算法预处理以产生表达值。
定量实时PCR(qRT-PCR)也可用于测量多种生物标志物的差异表达。在qRT-PCR中，RNA模板一般反转录至cDNA中，cDNA接着经由PCR反应扩增。逐周期实时跟踪PCR产物的量，这允许确定mRNA的初始浓度。为了测量PCR产物的量，所述反应可在结合于双链DNA的荧光染料存在下执行，如SYBRGreen。所述反应也可用对所扩增的DNA具特异性的荧光报告基因探针执行。
荧光报告基因探针的非限制性实例为探针(AppliedBiosystems,FosterCity,CA)。当在PCR延伸循环期间去除淬灭剂时，所述荧光报告基因探针发荧光。可通过使用多种基因特异性报告基因探针来执行多重qRT-PCR，所述探针各含有不同的荧光团。在各循环期间记录荧光值并且所述荧光值表示扩增至扩增反应中的所述点的产物的量。为了最小化误差并且减少任何样品与样品的变化，可使用参考标准执行qRT-PCR。理想的参考标准在不同组织中以恒定含量表达，并且不受实验处理影响。合适的参考标准包括但不限于用于管家基因甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白的mRNA。初始样品中mRNA的水平或各生物标志物的表达的倍数变化可使用本领域中众所周知的计算来确定。
免疫组织化学染色也可用于测量多种生物标志物的差异表达。这种方法使得能够通过蛋白与特异性抗体的相互作用使所述蛋白定位于组织切片的细胞中。为此，所述组织可固定于甲醛或另一种合适的固定剂中，包埋于蜡或塑料中，并且使用切片机切割成薄切片(约0.1mm至若干mm厚)。或者，所述组织可使用低温恒温器冷冻并且切割成薄切片。所述组织切片可排列于并且贴附于固体表面(即，组织微阵列)上。所述组织切片与对抗所关注的抗原的原发抗体一起孵育，随后洗涤以去除未结合的抗体。所述原发抗体可结合至检测***，或所述原发抗体可用结合至检测***的二次抗体检测。所述检测***可为荧光团，或其可为酶，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，所述酶可将底物转化成比色、荧光或化学发光产物。染色的组织切片一般在显微镜下进行扫描。因为来自具有癌症的受试者的组织样品可为异质的，即一些细胞可为正常的并且其它细胞可为癌性的，所以可确定组织中阳性染色的细胞的百分比。这种测量连同染色强度的定量可用于产生所述生物标志物的表达值。
酶联免疫吸附测定或ELISA可用于测量多种生物标志物的差异表达。ELISA测定存在多种变化形式。所有变化形式均基于抗原或抗体在固体表面(一般为微量滴定板)上的固定。初始ELISA方法包括制备含有所关注的生物标志物蛋白的样品，用所述样品涂覆微量滴定板的孔，使各孔与识别特异性抗原的原发抗体一起孵育，洗去未结合的抗体，以及接着检测抗体-抗原复合物。所述抗体-抗体复合物可直接进行检测。为此，使所述原发抗体结合于检测***，如产生可检测产物的酶。所述抗体-抗体复合物可间接进行检测。为此，通过结合于如上文所述的检测***的二次抗体检测所述原发抗体。接着扫描所述微量滴定板并且原始强度数据可使用本领域中已知的方式转化成表达值。
抗体微阵列也可用于测量多种生物标志物的差异表达。为此，多种抗体排列并且共价连接于所述微阵列或生物芯片的表面。含有所关注的生物标志物蛋白的蛋白萃取物一般用荧光染料或生物素标记。标记的生物标志物蛋白与抗体微阵列一起孵育。在洗涤以去除未结合的蛋白后，扫描所述微阵列。原始荧光强度数据可使用本领域中已知的方式转化成表达值。
Luminex复用微球也可用于测量多种生物标志物的差异表达。这些显微聚苯乙烯珠粒内部用荧光染料进行颜色编码，使得各珠粒具有独特的光谱特征(其中存在至多100种)。具有相同特征的珠粒用将结合所关注的靶标(即，分别为生物标志物mRNA或蛋白)的特异性寡核苷酸或特异性抗体标记。所述靶标接着也用荧光报告基因标记。因此，存在两种颜色来源，一种来自珠粒并且另一种来自所述靶标上的报告基因分子。所述珠粒接着与含有所述靶标的样品一起孵育，其中在一个孔中可检测到至多100种珠粒。所述珠粒的小尺寸/表面积和所述珠粒三维暴露于所述靶标允许结合反应期间几乎溶液相的动力学。所捕捉的靶标通过基于流式细胞术的高科技射流技术检测，其中激光激发鉴定各珠粒的内部染料以及在所述测定期间捕捉的任何报告基因染料。来自采集文件的数据可使用本领域中已知的方式转化成表达值。
原位杂交也可用于测量多种生物标志物的差异表达。这种方法允许所关注的mRNA定位于组织切片的细胞中。关于这种方法，所述组织可冷冻，或固定并且包埋，并且接着切割成薄切片，所述切片排列并且贴附于固体表面上。所述组织切片与将与所关注的mRNA杂交的标记的反义探针一起孵育。所述杂交和洗涤步骤一般在高度严格条件下执行。所述探针可用荧光团或可通过另一种蛋白或抗体检测的小标签(如生物素或地高辛)标记，使得标记的杂合物可在显微镜下检测并且目测。多种mRNA可同时检测，条件是各反义探针具有可区别的标记。杂交的组织阵列一般在显微镜下进行扫描。因为来自具有癌症的受试者的组织样品可为异质的，即一些细胞可为正常的并且其它细胞可为癌性的，所以可确定组织中阳性染色的细胞的百分比。这种测量连同染色强度的定量可用于产生各生物标志物的表达值。
在另一实施方案中，所述标志物水平可与来自对照的所述标志物的水平相比较，其中所述对照可包含取自一名或多名患者的一个或多个肿瘤样品，所述患者被确定为具有某种转移性肿瘤或不具有某种转移性肿瘤或这两种情形。
所述对照可包含同时(例如，在同一杂交实验中)获得的数据作为患者的个别数据，或可为存储的值或值的集合，例如存储于计算机上，或存储于计算机可读介质上。如果使用后一种情形，那么从初始或跟踪样品获得的关于所选标志物的新患者数据可与关于相同标志物的存储数据相比较而无需额外对照实验。
III.定义
如本文所用，“获得生物样品”或“获得血样”是指接受生物样品或血样，例如直接地或间接地。例如，在一些实施方案中，生物样品(如血样或含有外周血单核细胞(PBMC)的样品)直接地在实验室或其中将分析所述生物样品的位置中或其附近从受试者获得。在其它实施方案中，所述生物样品可通过第三方抽出或取得并且接着转移至例如独立实体或位置以用于分析。在其它实施方案中，可获得所述样品并且在相同位置使用现场即时测试来测试。在这些实施方案中，所述获得是指例如从患者、从实验室、从医生的办公室、从邮件、快递或邮局等接受样品。在一些其它方面，所述方法可进一步包括向受试者、卫生保健付款人、主治医师、药剂师、药品福利管理者或可关注所述确定的任何人报告所述确定。
“受试者”或“患者”意味着需要疗法或诊断测试的任何单个受试者。本案中，所述受试者或患者一般是指人类。还意图作为受试者包括在内的为任何牵涉于临床研究实验但未显示疾病的任何临床征象的受试者，或牵涉于流行病学研究的受试者，或用作对照的受试者。
如本文所用，“增加的表达”是指相对于合适的对照(例如，非癌性组织或细胞样品、参考标准)在癌症样品中升高或增加的表达水平，其中基因表达水平的升高或增加在统计学上为显著的(p<0.05)。相对于对照在癌症样品中基因表达的增加是否在统计学上为显著的可使用适当的t测试(例如，单样品t测试、双样品t测试、韦尔奇氏t测试)或本领域技术人员已知的其它统计学测试来确定。在癌症中过度表达的基因可为例如已知或先前已经确定在癌症中过度表达的基因。
如本文所用，“降低的表达”是指相对于合适的对照(例如，非癌性组织或细胞样品、参考标准)在癌症样品中减少或降低的表达水平，其中基因表达水平的减少或降低在统计学上为显著的(p<0.05)。在一些实施方案中，所述减少或降低的基因表达水平可为基因表达的完全缺乏，或表达水平零。相对于对照在癌症样品中基因表达的降低是否在统计学上为显著的可使用适当的t测试(例如，单样品t测试、双样品t测试、韦尔奇氏t测试)或本领域技术人员已知的其它统计学测试来确定。在癌症中表达不足的基因可为例如已知或先前已经确定在癌症中表达不足的基因。
本文中的术语“抗原结合片段”以最广泛意义使用并且具体说来涵盖完整单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段。
如本文所用，术语“引物”意味着涵盖任何能够在模板依赖性过程中启动初生核酸的合成的核酸。引物可为十至二十和/或三十个碱基对长的寡核苷酸，但可采用更长的序列。引物可以双链和/或单链形式提供，不过单链形式为优选的。
IV.实施例
包括以下实施例以证明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应了解，以下实施例中所公开的技术表示由本发明人发现在本发明的实践中运作良好的技术，并且因此可被视为构成优选的其实践模式。然而，本领域技术人员根据本公开应了解，在所公开的特定实施方案中可进行多种改变并且所述改变仍获得类似或相似的结果而不偏离本发明的精神和范围。
实施例1-实验程序
外来体分离和纯化。外来体通过如先前所述的差速离心(Thery等人,2006；Luga等人,2012)来纯化。简而言之，来自培养24h的细胞的上清液经受800g和2000g的连续离心步骤并且上清液使用培养瓶中的0.2μm过滤器过滤。外来体在100,000g下在SW40Ti浮桶式转头中集结成粒持续2h(Beckman)。弃去上清液并且添加PBS以用于1h洗涤步骤。分析团粒的外来体。使用于RNA萃取的外来体再悬浮于500ulTrizol中；使用于蛋白萃取的外来体再悬浮于250ul溶解缓冲液(8M尿素/2,5％SDS、5μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂以及1mM苯基甲基磺酰氟)中；以及使用于处理的外来体再悬浮于PBS中。冷冻的血清样品在冰上解冻并且500μl添加至12mLPBS中并且遵循相同的上文提及的程序。通过离心纯化的外来体用溶解于无RNase水中的500g/mL蛋白酶K(Sigma-Aldrich)处理(37℃，60分钟)，随后使所述蛋白酶热灭活(60℃，10分钟)并且与2g/mL无蛋白酶RNaseA(Sigma-Aldrich)一起孵育(37℃，15分钟)，随后添加10X浓缩的RNase抑制剂(Ambion)。关于外来体处理，外来体一式两份进行纯化并且所述团粒中的一者用于蛋白定量。
外来体的流式细胞术分析。外来体制剂(5-10μg)与5μl4-μm直径醛/硫酸盐乳胶珠粒(InterfacialDynamics,Portland,OR)一起孵育并且再悬浮于含有2％BSA的400μlPBS中。外来体涂覆的珠粒(20μl)与以下抗体一起孵育：在4℃下抗CD63(SantaCruz)、抗CD9(abcam)、抗TSG101(abcam)、抗浮舰蛋白-1(SantaCruz)持续30分钟，需要时随后与FITC结合的二次抗体一起孵育并且在FACSCalibur流式细胞仪(BDBiosciences)上进行分析。
外来体电穿孔。总蛋白浓度为100μg(通过Bradford测定所测量)的外来体和5μgDicer抗体(多克隆SC-30226,SantaCruz,CA)、5ug肌动蛋白抗体或10μg前体miRNA-21、-10b以及-cel1在400μl电穿孔缓冲液(1.15mM磷酸钾pH7.2、25mM氯化钾、21％Optiprep)中混合并且在4mm比色皿中使用如先前所述(Alvarez-Erviti等人,2011)的GenePulserXcell电穿孔***(Biorad)进行电穿孔。在电穿孔后，外来体在适当时用蛋白酶K和/或RNAse处理。
光散射光谱(LSS)。使用图10B中所述的实验***收集LSS光谱。FianiumSC-450-2宽频带超连续激光用作白光的来源。来自所述超连续激光的光用长焦距透镜聚焦至样品中。由外来体或微球的液体悬浮液组成的样品放置于定制的立方形石英样品夹持器中。从不具有外来体或微球的溶剂样品收集背景信号。由外来体或微球以90°散射成入射光束的光由另一长焦距透镜收集并且递送至与高效AndorTechnologyiXonDV885EMCCD检测器连接的PrincitonInstrumentActon2300i成像光谱仪。所述检测在470-870-nm波长范围内执行。所述检测器由计算机控制，数据被转移、存储至所述计算机中并且进行处理。
为了校准所述***并且建立其精确地检测可小于所述波长的粒子尺寸的能力，测量来自具有24nm和100nm标称直径的玻璃微球和具有119nm、175nm、356nm以及457nm标称直径的聚苯乙烯微球的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)悬浮液的信号。使用先前开发的最小二乘最小化方法(Fang等人,2003)使通过米氏理论(Mietheory)预测的光谱与数据拟合。针对具有100nm标称直径的玻璃微球和具有356nm标称直径的聚苯乙烯微球的实验光谱和所产生的拟合在图1E中示出。此处，示出瑞利散射的偏差乘以所述波长的四次方以强调LSS光谱的非瑞利行为。通过比较LSS产生的微球的尺寸分布与制造商提供的说明书，推断出所述LSS方法的精确度据估计为10nm。还确定重建的尺寸分布对微球和溶剂的折射率不敏感。此处应指出，由于小粒子的光散射与其尺寸的六次方成比例，在较大粒子存在下小于50nm的粒子的检测将需要所述实验***的信噪比的实质增加。
接着执行使用外来体的PBS悬浮液的LSS实验。所述外来体的实验LSS光谱和相应的米氏拟合提供于图1B中。重建的光谱的拟合为优良的。使用上文提及的重建技术(Fang等人2003；Itzkan等人2007；Fang等人2007)，发现外来体的尺寸分布(参见图1R右侧图形和插图)，其在104nm下达到峰值。这一推断出的尺寸分布与对相似的外来体样品的TEM照片执行的形态测量(图1A)进行比较。由于所述TEM照片上的粒子数目并未大到足以对统计学上有意义的分布绘图，由所述TEM照片计算大于50nm的粒子的平均尺寸并且发现等于95nm。因此，LSS重建的尺寸分布和对外来体的TEM照片执行的形态测量与所有数据一致。
N-Rh-PE处理。细胞通过与稀释于冰冷1X汉克斯缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中的8μMN-Rh-PE(AvantiPolarLipids,Alabaster,AL)一起在冰上孵育1h而用N-Rh-PE标记。细胞接着用冰冷汉克斯缓冲液洗涤3次，随后将其接种回DMEM培养基中。在标记后约24h，N-Rh-PE细胞用于共焦成像。
免疫胶体金标记和电子显微术。将最佳浓度的固定样本滴至300目碳/弗姆瓦(formvar)涂覆的栅格上并且使其吸收至弗姆瓦持续最少1分钟。关于免疫胶体金染色，将所述栅格放置于阻断缓冲液中用于阻断/渗透步骤持续1h。不进行冲洗，所述栅格立即放置于在4℃下在适当稀释度下的原发抗体(多克隆抗Dicer1:10SC-30226,SantaCruz；单克隆抗CD91:10,Abcam)中过夜。作为对照，一些栅格未暴露于所述原发抗体。次日，所有栅格均用PBS冲洗并且接着在室温下在与10nm金粒子(AURION,Hatfield,PA)连接的适当二次抗体的液滴上浮动持续2小时。栅格用PBS冲洗并且放置于0.1M磷酸盐缓冲液中的2.5％戊二醛中持续15分钟。在PBS和蒸馏水中冲洗后，使所述栅格干燥并且用乙酸铀酰染色以显影。所述样品用TecnaiBioTwin透射电子显微镜(FEI,Hillsboro,OR)和用AMTCCD照相机(AdvancedMicroscopyTechniques,Danvers,MA)拍摄的图像进行观察。
蛋白印迹和抗体。为了监测内源基因反应，将细胞收集于RIPA缓冲液中并且将外来体收集于8M尿素/2.5％SDS、5μg/ml亮肽素、1μg/ml胃蛋白酶抑制剂以及1mM苯基甲基磺酰氟缓冲液中。根据Bradford定量将蛋白装载至丙烯酰胺凝胶上并且通过湿式电泳转移而转移至PVDF膜(ImmobilonP)上。关于从原位异种移植物模型收集的血清外来体的蛋白样品，使用具有15cm高度的4％丙烯酰胺凝胶来拆分人类和小鼠Dicer频带。一般来说，印迹在RT下用PBS/0.05％Tween中的5％脱脂奶粉阻断1h并且在4℃下与以下原发抗体一起孵育过夜：1:500抗Dicer(SC-30226)SantaCruz；1:1000抗泛素化蛋白，克隆FK2Millipore；1:500抗FlagM2-过氧化物酶克隆M2Sigma；1:500抗CD43ab9088Abcam；1:500抗PTEN,ab32199,Abcam；1:300抗CD9ab92726,Abcam；1:500抗GADPHab9483,Abcam；1:250抗TRBPab72110,Abcam；1:300抗TSG101ab83,Abcam；1:400抗AGO2ab32381,Abcam；1:4000抗β-肌动蛋白过氧化物酶克隆AC-15,Sigma；1:500抗GFPab6556,Abcam；1:500抗HOXD10ab76897Abcam。二次抗体在RT下孵育1h。在抗体孵育后在定轨振荡器上用1XPBS0.05％Tween20以10min时间间隔洗涤四次。印迹用来自Pierce的化学发光试剂显影。
实时PCR分析。在用Trizol(Invitrogen)进行总RNA纯化后，DNase处理的RNA用MultiScribe反转录酶(AppliedBiosystems)和oligo-d(T)引物进行反转录。使用SYBRGreenMasterMix(AppliedBiosystems)和作为对照的β-肌动蛋白在ABIPRISM7300HT序列检测***仪器上进行关于mRNA的实时PCR。引物列于表1中。
使用150ngDNase处理的RNA和SuperScriptIII铂单步骤RT-qPCR试剂盒(Invitrogen)对前体miRNA进行定量(Schmittgen等人,2004)。引物列于表1中。
关于miRNA表达分析，使10ngRNA与含有特异性miRNA引物的TaqMan微RNA反转录试剂盒试剂混合并且根据制造商的说明书(AppliedBiosystems)进行反转录。反应混合物在16℃下孵育30分钟，在42℃下孵育30分钟并且在85℃下孵育5分钟。使用ABIPRISM7300HT序列检测***仪器(AppliedBiosystems)使用市面上有售的针对所研究的各miRNA的Assay-on-Demand(AppliedBiosystems)执行实时PCR。miRNA的表达针对用作内部对照的18SrRNA(TaqMan预先开发的测定试剂；AppliedBiosystems)的表达标准化以用于RNA量和完整性。一式三份执行各测量。确定循环阈值(Ct)，即扩增的靶标的量达到固定阈值时的分数循环次数，并且如先前所报告(Livak和Schmittgen,2001)，使用2-ΔCt式测量表达。
表1.qPCR引物序列。
RNA印迹。使用与作为探针的成熟miRNA反向互补的3’Bio[TEG]DNA寡核苷酸执行RNA印迹(参见表2)。在95℃下2分钟，随后在冰上2分钟时期后，尿素/丙烯酰胺15％凝胶用于装载40μg外来体RNA(DNase处理)连同1XRNA装载染料。根据制造商的说明书(N2102,NewEnglandBioLabs)使用微RNA标志物。在4℃下在3h期间使用TBE1X进行电泳。在4℃下在2h期间使用Whatman印迹纸和BrightStar-Plus带正电尼龙膜(Ambion)用TBE0.5X进行转移。使用UV透照器使所述RNA交联至所述膜持续20分钟。通过在42℃下在Ambion's-Oligo杂交溶液(Ambion)中旋转1h使膜预杂交。所述探针在冰上解冻并且在95℃下孵育5分钟后添加150ng/mL杂交缓冲液，之后使膜在42℃下旋转过夜。进行以下洗涤：2XSSPE/0.5％SDS-两次，持续15分钟；0.2SSPE/0.5％SDS-两次，持续30分钟以及2XSSPE-5分钟。这些初始洗涤步骤之后有数次洗涤并且接着使用BrightStarBioDetect试剂盒根据制造商的说明书(Ambion)使印迹显影。用两张堆叠膜使所述印迹暴露过夜。成功地剥离印迹并且再探测两次。
表2.Northern探针序列。
细胞培养、质粒、前体miRNA以及siRNA。MCF10A、MCF7、MDA-MB231、A549、SW480和HeLa人类细胞系以及NMuMG、67NR和4T1小鼠乳腺细胞系在DMEM10％FBS中培养(所有细胞均源自美国菌种保藏中心–ATCC)。使用用于siRNA的Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)执行转染。关于合成的前体miRNA转染，在所有细胞系中均使用RNAiFect(Qiagen)。siRNA的序列列于表3中。
表3.siRNA序列。
质粒。p-CMV-Tag4B-Dicer(Melo等人,2009)；来自Origene的p-CMV6-CD63-GFP(RG217238)；来自Addgene的GFP-hAGO2(质粒11590)；来自Origene的pGFP-shBiG2(TG314697)；来自Origene的pGFP-shDicer(TG304991)；合成的前体miR-10b、-21以及-cel-1购自Ambion；3’UTR-WTPTEN、3’UTR-突变型PTEN(JoshuaMendell博士实验室)、3’UTR-WTHOXD10以及3’UTR-突变型HOXD10(RobertWeinberg博士实验室)来自Addgene。
免疫细胞化学和共焦显微术。细胞以适当融合接种于12孔板中的***的盖玻片上并且培养过夜。次日，细胞用冷PBS洗涤1次并且在RT下用4％PFA/PBS固定20min。载玻片在RT下用PBS0.5％TritonX-100渗透10min，在RT下用BSA5％阻断1h，并且在4℃下与PBST(PBS、0.1％Triton)2％BSA中的原发抗体一起孵育过夜：1:100抗Dicer(SC-30226)SantaCruz；1:500抗FlagSigma；1:50抗CD43ab9088(Abcam)；1:100抗TSG101ab83(Abcam)；1:500抗GFPab6556(Abcam)；1:100抗LAPM-1ab25630(Abcam)；1:100抗Hrsab56468(Abcam)；1:100抗BiG2ab75001(Abcam)；1:500抗生物素ab66233(Abcam)。二次抗体山羊抗兔Alexa543或山羊抗小鼠Alexa-488在RT下孵育1h，以1:200稀释于PBST2％BSA中。DAPI用于对细胞核染色。关于外来体分析，所收集的外来体在RT下与TritonX-0.05％一起孵育15min并且随后与5％BSA一起孵育1h。第一种原发抗体(抗CD9，1:50)在100ulPBST中在4℃下孵育过夜并且次日添加第二种原发抗体抗flag(1:50)并且在RT下孵育1h。连续地添加二次抗体并且也在RT下孵育1h。将外来体接种于12孔板中的盖玻片上面的4％PFA中持续45min并且用冷PBS洗涤。用ZeissLSM510Upright共焦***使用再循环工具以维持同样的设定来获得图像。聚集的外来体导致在共焦显微镜中可见大于200nm的结构。关于数据分析，从由至少两个独立实验抽出的池选择图像。各图示出代表场。
体外切割测定。外来体蛋白萃取物(10μg)在37℃下在3mMMgCl2、30mMNaCl以及100mMHepes(pH7.5)存在下与3pmol前体miR-10b、-21以及-cel-1生物素内部标记的发夹一起孵育。各反应的最终体积为10μl。反应通过添加10μl甲酰胺凝胶装载缓冲液来停止。RNA使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来拆分并且用BrightStarBioDetect试剂盒根据制造商的说明书(Ambion)来显影。
细胞活力和集落形成测定。将细胞接种于96孔板上并且在第1天以100μg/mL的浓度添加所收集的外来体。通过3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2H-溴化四氮唑(MTT)测定确定细胞活力。关于集落形成实验，将细胞接种于12孔板上并且在培养的第1天和第5天以100μg/mL的浓度添加外来体。8天后，集落被固定并且由MTT试剂染色。
Illumina人类-HT12mRNA表达阵列。RNA在Illumina人类-HT12mRNA表达阵列中杂交。使用由R包“limma”提供的neqc程序(Shi等人,2010)标准化数据。通过每个基因的探针的中位数确定基因丰度。通过基因(行)和样品(列)的欧几里得距离的算术平均值进行聚类。
miRNA表达阵列。定制的miRNA阵列如9中所述加以使用。所述阵列含有1833个人类微RNA探针、1084个小鼠微RNA探针以及另外78个非编码RNA探针。所述探针一式两份进行印刷。包括与各探针相关的GenBank登陆ID。使用R(2.14.2版)(在万维网上r-project.org)和Bioconductor(在万维网上bioconductor.org/)执行生物信息分析。针对各探针的原始强度为具有所减去的中位背景的中位特征像素强度。设定偏置1确保了在对数转换数据后将不存在负值。数据进行分位数标准化，随后进行log2转换。对来自测量相同miRNA的探针的信号求平均值。使用LIMMA库的函数执行所述分析。使用made4库的heatplot函数产生热图。当执行技术重复时，所述热图表示由重复测量获得的平均表达值。
卵巢、子宫内膜以及***肿瘤的原位异种移植物。在4至6周龄之间的雌性无胸腺nu/nu小鼠(Harlan)圈养于在21至23℃和40％至60％湿度下处于12小时光暗循环中的独立通风笼中。使小鼠自由取用被照射的饮食和无菌水。所有动物协议均根据西班牙机构动物护理和使用委员会进行审查和批准。
在HospitalUniversitarideBellvitge(L’HospitaletdeLlobregat,Barcelona,Spain)获得原发肿瘤样本。所述机构审查委员会批准了所述研究。从患者收集书面知情同意书。选择来自五种代表性的被切除的人类上皮卵巢肿瘤(EOC)的非坏死性组织片(约2-3mm3)：浆液性、子宫内膜样、透明细胞肿瘤以及粘液性，并且在室温下将其放置于补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM(BioWhittaker)中。在异氟烷诱导的麻醉中，动物经受侧剖腹手术，其卵巢暴露并且肿瘤片由普理灵(prolene)7.0缝合线锚定于卵巢表面。另外，人类***和子宫内膜肿瘤片分别被植入乳腺脂肪垫和子宫内膜壁中。
使原位移植的肿瘤生长并且在处死时，通过心脏穿刺从麻醉的小鼠获得2ml血液。样品在14,000rpm下离心并且在-80℃下冷冻。
免疫沉淀。细胞和其中所收集的外来体分别在PBS中洗涤并且离心或超速离心，以收集团粒。冰冷RIPA缓冲液或8M尿素/SDS缓冲液分别添加至细胞和外来体中。悬浮液在4℃下轻轻地摇动，关于细胞为15min并且关于外来体为2h。裂解液在14,000g下在预冷却的离心机中离心15分钟并且弃去团粒。蛋白A或G琼脂糖(agarose)/琼脂糖(sepharose)珠粒用PBS洗涤两次并且用具有PBS的50％浆液回收。珠粒/浆液混合物(100μl)添加至1mL细胞裂解液和500μl外来体裂解液中并且在4℃下孵育10min。通过在4℃下在14,000xg下离心10分钟去除珠粒并且弃去团粒。Dicer抗体(关于细胞为5μg并且关于外来体为10μg)添加至500μl细胞裂解液或250μl外来体裂解液(1μg/μl细胞、10μg/μl外来体)中并且在4℃下在定轨振荡器中孵育过夜。添加100μl蛋白A或G琼脂糖(agarose)/琼脂糖(sepharose)珠粒浆液并且留在4℃下过夜。在离心后，弃去上清液并且关于细胞用冰冷RIPA缓冲液或关于外来体用尿素/SDS缓冲液洗涤珠粒3次。所述琼脂糖(agarose)/琼脂糖(sepharose)珠粒煮沸持续5分钟以使免疫复合物从珠粒解离。通过离心收集所述珠粒并且用所述上清液执行蛋白印迹。
在Ca2+离子载体A23187存在下的培养条件。细胞(8×107个细胞)以5×105个细胞/ml接种于DMEM中。为了处理所述细胞，四小时后A23187(200nM最终浓度，Calbiochem,LaJolla,CA)添加至培养物中。收集来自处理过和未处理细胞的培养基并且收集外来体。
裸小鼠中细胞的原位注射。如先前所述(Welch,1997)，通过将MCF10A非致癌***上皮细胞、暴露于MDA-MB231源性外来体的MCF10A非致癌***上皮细胞以及MDA-MB-231乳癌细胞(1×105个细胞于0.2mlPBS中)注射至3周龄雌性无胸腺裸小鼠的乳腺脂肪垫中来测量原位肿瘤生长。如先前所述(Welch,1997)，通过用测径器测量肿瘤长度和宽度每周监测肿瘤生长并且报告为平均肿瘤直径。所有动物均在肿瘤细胞注射后21天安乐死。
统计学。误差棒指示生物重复之间的S.D.。执行各实验的技术以及生物三次重复。通过Studentt测试计算统计学显著性。
实施例2-结果
外来体的分离和鉴定。使用确立的超速离心方法分离来自癌细胞(MDA-MB231三阴性人类转移性乳癌、MCF7人类乳腺癌、67NR小鼠非转移性乳癌以及4T1小鼠转移性乳癌)和对照细胞(MCF10A非致癌人类***上皮细胞和NMuMG非致癌小鼠***上皮细胞)的外来体(图10A)(Luga等人,2012；Thery等人,2006)。通过透射电子显微术(TEM)和原子力显微术(AFM)分析所收集的外来体。鉴定出尺寸在40-140nm之间的粒子(图1A-B)(Thery等人,2002)。此外，通过检测两种外来体标志物TSG101和CD9确认所述外来体的身份(图1C)(Ostrowski等人,2010)。当通过免疫胶体金标记电子显微术分析时，所分离的外来体也对CD9标志物呈阳性(图1A)。还通过流式细胞术分析结合至乳胶珠粒的外来体，显示作为常用的外来体标志物的四跨膜蛋白CD9、CD63、TSG101以及浮舰蛋白1的表面表达(图1D)。另外，使用光散射光谱(LSS)(Fang等人,2007；Itzkan等人,2007；Bang和Setabutr,2010；Benitez-vieyra等人,2009；Khairkar等人,2010；Min等人,2010)示出所分离的样品在104nm直径下显露紧密尺寸分布峰化(图1E，右图)。所述LSS***允许通过使用不同直径的玻璃微球作为内部对照来精确检测外来体萃取物中的所有尺寸的粒子。LSS还排除了这些分离物中潜在的微囊泡和细菌或细胞碎片污染(图1E，参见右侧图形上的插图)。此外并且与LSS数据一致，NanoSight纳米粒子跟踪分析显露在105±1.0nm直径下具有尺寸分布峰化的粒子(图1F)，进一步排除了当未过滤溶液时存在于溶液中的不同尺寸范围的潜在污染物的存在(图1F，右侧图形)。在外来体萃取之前使用外来体的比色细胞活力测定(MTT)、末端脱氧核苷酰转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定、针对AnexinV和碘化丙啶的流式细胞术分析以及细胞色素C免疫印迹(图10C-E)来证明细胞活力以便排除分离物受凋亡小体或随机细胞碎片污染的可能性。从癌细胞分离的外来体统称为如先前所定义(Lee等人,2011)的癌小体。从对照细胞分离的外来体统称为正常发生小体。
与正常发生小体相比较，癌小体特定地富集致癌miRNA。研究癌小体和正常发生小体的整体miRNA含量。与正常发生小体相比较，从外来体分离的RNA的微流体学分析显露癌小体的小RNA含量的增加(图2F)。此外，观察到正常发生小体(MCF10A源性)与癌小体(MDA-MB-231源性)中的miRNA水平之间的低相关，其中R2值为0.35(图2A)。整体miRNA阵列分析显示与正常发生小体相比较，癌小体中miRNA含量的富集。这种分析还显露与正常发生小体相比较在癌小体中的极其不同的miRNA表达谱。miRNA阵列数据显示在癌小体与正常发生小体之间有305种差异表达的miRNA(表5)，其中与正常发生小体相比较在癌小体中的miRNA含量总体富集。癌小体中的miRNA富集并非纯粹反映癌细胞中miRNA的增加，因为所述癌细胞在与非致癌细胞相比较时显示总的小RNA的总量的降低(图11A)。因此，外来体中miRNA的积聚看来为特异性并且靶向性的。
进一步评估癌细胞和源自这些细胞的外来体中被发现在癌小体与正常发生小体之间差异表达的在miRNA阵列中的15种miRNA的表达(表4和5)。来自这一集合的六种miRNA已经牵涉于癌症进展(致癌miRNA：miR-10a、miR-10b、miR-21、miR-27a、miR-155以及miR-373)并且据报告九种miRNA具有肿瘤抑制功能(肿瘤抑制因子miRNA：let7a、miR15b、miR26a、miR31、miR125a、miR125b、miR200a、miR200c、miR335)并且在细胞和源自那些细胞的外来体中表达(图11B-C和表4)。为了确定miRNA在外来体中的半衰期，开发无细胞***以在分离的外来体中研究所述miRNA。不含细胞的纯化的外来体放置于培养基中并且在37℃下孵育24h或72h。在孵育期后，分析所述外来体的miRNA含量并且与其起源细胞相比较。与24h相比较，在72h时，与细胞相比较在癌小体中这些miRNA的相关值降低(R2＝0.60相比R2＝0.43)，而在正常发生小体与MCF10A细胞(用于衍生所述正常发生小体的细胞；R2＝0.98相比R2＝0.98)之间维持高相关(图2B)。与培养24h的癌小体相比较，在培养72h的癌小体中单独地观察到所述六种所分析的致癌miRNA的显著上调，关于MDA-MB231和4T1源性癌小体分别具有17.6和13.2的平均倍数变化，进一步支持癌小体中的miRNA含量随时间特异性增加(图2C中间和下部图形，和图11D右侧、上部以及下部图形)。当癌小体培养24h或72h时，关于肿瘤抑制性miRNA注意到无关重要的差异(图2C和图11D)。正常发生小体并未显露其miRNA含量的任何差异，不受培养时间影响(图2C和图11D)。所有15种miRNA的存在均在72h培养的正常发生小体和其起源细胞中一致，其中相关系数为0.93(图2E，左侧)。MDA-MB231和4T1外来体的相关系数显著较低(分别地，r2＝0.56和0.42)，进一步支持癌小体的miRNA含量随时间特异性改变(图2E，中间和右侧)。另外，当来自MCF7(r2＝0.76)、MDA-MB231(r2＝0.56)、67NR(r2＝0.64)以及4T1(r2＝0.42)的癌小体进行比较时，相关水平随着所述细胞系的增加的恶性肿瘤而降低(图2E和图11E)。因此，正常发生小体的miRNA含量为在所有时间其起源细胞的反映，而癌小体以细胞独立方式随时间改变其miRNA含量。
当MDA-MB231和4T1癌小体的miRNA含量与来自MCF10A和NMuMG细胞的正常发生小体的miRNA含量相比较时，在培养24h的癌小体中观察到致癌miRNA的富集，分别具有2.7和2.0的平均倍数变化(图11B)。在72h时间点，与MCF10A和NMuMG源性正常发生小体相比较，在MDA-MB231和4T1源性癌小体中分别检测到致癌miRNA的平均倍数变化为30和18.2(图11B)。RNA印迹确认致癌miR-10b和miR-21单独地在癌小体中上调，支持miRNA阵列以及qPCR分析(图2D)。
癌小体含有前体miRNA和核心RLC蛋白。新鲜分离的癌小体的无细胞培养导致miRNA含量增加，表明外来体中的活性生物发生。另外，微流体学分析还表明较大RNA分子的存在(图2F)。因此，研究正常发生小体和癌小体制剂中前体miRNA的可能存在。在外来体分离后执行其无细胞培养持续24h或72h并且使其经受RNAse处理以耗尽任何可能的外来体外RNA。此后为外来体中前体miRNA的检测。所分析的前体miRNA为对应于先前所评估的15种成熟miRNA的前体miRNA(表4)。
表4.在癌小体与正常发生小体之间差异表达的15种miRNA。
所分析的所有15种前体miRNA均存在于外来体(正常发生小体和癌小体)中(图3A和图12A)。如由miRNA观察到，癌小体高度富集致癌前体miRNA，而肿瘤抑制性前体miRNA代表性不足(图3A和图12A)。当外来体培养24h或72h时，与培养24h的癌小体相比较，在培养72h的癌小体中观察到致癌前体miRNA的显著下调。所述变化未在正常发生小体中发现(图3B和图12B)。所述肿瘤抑制性前体miRNA并未显示在癌小体或正常发生小体中的任何差异(图3B和图12B)。此外，在96h培养(此时，所述致癌前体miRNA水平达到肿瘤抑制性前体miRNA的水平)后，注意到在癌小体中而非在正常发生小体中致癌前体miRNA的降低的量(图3E和图12E)。癌小体中致癌前体miRNA的下调通过针对前体miR10b和前体miR21的RNA印迹确认(图3C)。接着，执行外来体中前体miRNA和miRNA的时程分析。通过培养分离的癌小体持续6h、12h、24h、36h、48h、72h以及96h，观察到随着增加的培养时间，所述6种所分析的前体miRNA的水平与其相应miRNA成反比(图3D)。在24与72h培养之间，成熟miRNA的量增加，之后其达到平稳状态(图3D)。因此，癌小体随时间耗尽其前体miRNA含量，伴随其相应的成熟miRNA的增加。这种观察结果引起如下假设，即癌小体具有miRNA生物发生的能力。
为了理解培养的外来体中前体miRNA的加工为何在24h后而非立即开始，监测关于输出蛋白-5(XPO5)沉默的MDA-MB-231细胞中的所有六种miRNA(图12C和D)。XPO5负责将前体miRNA从细胞核转运至细胞质(Yi等人,2003)。使XPO5沉默会防止前体miRNA从细胞核流至细胞质并且允许评估细胞质前体miRNA加工而不引入来自细胞核的新的细胞质前体miRNA。在离心之前和之后监测MDA-MB-231siXPO5细胞中的微RNA-21(图12C和D)，所述离心在4℃下进行3小时以模拟外来体分离的条件。在离心细胞对非离心细胞之间的相同时间点未观察到所述miR-21的显著上调，其中前一种细胞经历24h的延迟期(图12C和D)。因此，细胞和外来体均需要一段时间从4℃下的离心应力恢复以启动前体miRNA的加工。预期所述驯化用于组织培养传代后在培养的细胞中的酶促活性。
癌小体含有核心RISC(RLC)蛋白。癌小体随时间耗尽其前体miRNA浓度，伴随其相应的成熟miRNA的增加。这使我们检查外来体中的miRNA生物发生和前体miRNA加工能力。微RNA生物发生需要RLC、Dicer、TRBP以及AGO2的关键蛋白组分(Chendrimada等人,2005)。先前已经示出，Dicer和TRBP形成向Dicer蛋白提供稳定性的复合物，而AGO2在所述生物发生途径中的晚期被募集以帮助链选择和RNA解链过程(Chendrimada等人,2005)。Dicer蛋白在源自MCF7、MDA-MB231、67NR以及4T1癌细胞的癌小体中检测到(图1C和图4A-B)。如先前所述(Montecalvo等人,2012)，通过在外来体蛋白萃取之前用蛋白酶K处理所有外来体制剂来消除检测到污染性外来体外Dicer蛋白的可能性(图1C和图4A-B)。另外，如A549(人类肺癌)、SW480(人类结肠直肠癌)、HeLa(人类子***)以及4T07(鼠类乳癌)的多种癌细胞系也产生含Dicer的外来体(图13H)。Dicer蛋白未在由MCF10A(人类非致癌***上皮细胞)和NMuMG(小鼠非致癌***上皮细胞)细胞系产生的正常发生小体中检测到(图1C和图4A)。使用透射电子显微术进行的外来体的免疫胶体金标记确证了癌小体而非正常发生小体中Dicer蛋白的存在(图4B和图13A)。另外，抗GFP抗体用作免疫胶体金标记实验中的另一种阴性对照，并且完全未在外来体中检测到(图13B)。
Dicer蛋白在MCF10A和MDA-MB231细胞中进一步与N端Flag标签一起过度表达(图13C)。免疫印迹和共焦显微术进一步确认Flag-Dicer蛋白特定地存在于癌小体而非正常发生小体中(图4C)。增加的细胞内Ca2+水平刺激外来体分泌(Savina等人,2003)。Ca2+离子载体A23187添加至MCF10A和MDA-MB231细胞的培养基中并且收集外来体。我们观察到外来体产量的显著增加，如通过CD9表达所判断(图4D)。Dicer蛋白在癌小体中检测到，但未在正常发生小体中检测到(图4D)。这些结果进一步表明，这并非确定含量的外来体的量，而是引起Dicer积聚的特定机制。另外，Dicer表达经由MCF10A和MDA-MB-231细胞中两种短发夹构建体的稳定表达而降低(图13D-E)。通过免疫印迹和免疫胶体金标记所检测，与shScramble或亲本MDA-MB-231细胞相比较，源自MDA-MB-231shDicer细胞的癌小体含有显著较少的Dicer(图4E-F)。Dicer也未在源自MCF10AshDicer细胞的正常发生小体中检测到(图4E)。
另外，RLC蛋白AGO2和TRBP也在癌小体中而非在正常发生小体中检测到(图4G-H)。外来体从用GFP标记的AGO2转染的MCF10A和MDA-MB231细胞萃取(图4I)。使用抗GFP抗体，在从MDA-MB231-GFP-AGO2细胞萃取的外来体中检测到GFP-AGO2的存在(图4J)。在MCF10A和MDA-MB231细胞中AGO2的siRNA沉默后，观察到MDA-MB231源性癌小体中AGO2蛋白的下调(图4K-L)。通过免疫沉淀显示出，AGO2结合癌小体中的Dicer，而两者均无法在正常发生小体中检测到(图4M)。诱导Dicer的稳定性并且有助于其前体miRNA裂解活性的基础搭配物为TRBP(Chendrimada等人,2005；Melo等人,2009)。免疫沉淀显露出癌小体中而非正常发生小体中Dicer/TRBP复合物的存在(图4N)。
使用抗Dicer抗体的免疫沉淀显露出，AGO2结合于癌小体中的Dicer，而两者均无法在正常发生小体中检测到(图13F)。诱导Dicer的稳定性并且有助于其前体miRNA裂解活性的基础搭配物为TRBP(Chendrimada等人,2005；Melo等人,2009)。使用抗Dicer抗体的免疫沉淀显露出癌小体中而非正常发生小体中Dicer/TRBP复合物的存在(图13G)。
癌小体使用RLC来加工前体miRNA以产生成熟miRNA。测试癌小体中RLC蛋白的功能性(所述切割和沉默特性)以从前体miRNA产生成熟miRNA。缺乏Dicer的外来体从MCF10AshDicer、MDA-MB231shDicer以及4T1shDicer细胞萃取(图14A)。前体miRNA和miRNA含量并未在Dicer下调的外来体中随时间显露任何显著变化，指示所述前体miRNA并未被加工成在癌小体中不存在Dicer的情况下产生miRNA(图5A-B和图14B-C)。接着，通过电穿孔将抗Dicer和抗TRBP抗体***至外来体中并且在电穿孔后与用由蛋白酶K处理的抗肌动蛋白对照抗体电穿孔的癌小体和正常发生小体相比较以避免外来体外部抗体的存在(图5C)。用所述对照抗肌动蛋白抗体电穿孔的癌小体显示如先前所提及的前体miRNA和mirNA水平的相同变化(图5D-E和图14D-E)。在具有抗Dicer和抗TRBP抗体的癌小体中，随时间观察到前体miRNA和miRNA水平的无关重要的变化，表明对前体miRNA加工的抑制(图5D-e和图14D-E)。在72h无细胞培养后通过癌小体(MDA-MB-231源性)、抗Dicer抗体电穿孔的癌小体(MDA-MB231源性)以及正常发生小体(MCF10A源性)的miRNA表达阵列分析总的miRNA含量。具有抗Dicer抗体的癌小体的总的miRNA含量更密切地类似MCF10A正常发生小体(R2＝0.79)而非MDA-MB231源性癌小体(R2＝0.48)的总的miRNA含量。当比较癌小体与含有抗Dicer抗体的癌小体时，观察到198种差异表达的miRNA，其中48％显著下调(表6)。其中，基于先前公布的文献，19％为致癌的，而据报告仅1％具有肿瘤抑制特性(图14F，表6)。
已知将前体miRNA转化成成熟miRNA的酶促反应为自发的并且不需要超出所述三种RLC蛋白、所并入的前体miRNA以及存在于外来体中的蛋白Hsp90的任何因素(Maniataki和Mourelatos,2005；McCready等人,2010)。为了进一步确认这一点，用选择性抑制Hsp90活性的药物格尔德霉素对外来体进行电穿孔(Miyata,2005)。与对照相比较，发现在格尔德霉素存在下合成的成熟miRNA的量显著降低(图6A)。Hsp90蛋白对成熟miRNA表达的效应可能经由两种潜在重叠的过程介导：有助于miRNA生物发生中的AGO2活性的积极作用和RISC中结合于AGO2蛋白的成熟miRNA的稳定化。
为了进一步确认癌小体的特异性前体miRNA加工能力，将合成的前体miRNA-10b和-21以及秀丽隐杆线虫(C.elegans)前体前体cel-1前体miRNA电穿孔至外来体中以研究其加工(图15A)。在72h培养后在癌小体中观察到所述前体miRNA的显著下调和其相应miRNA的上调(图6B-C)。具有Dicer抗体的癌小体并未在72h培养后显露前体miRNA含量的差异(图6B-C)。源自shDicer细胞的癌小体并未在72h培养后显露前体miRNA含量的差异(图6B-C)。另外，前体miR-10b、-21以及-cel-1用生物素-脱氧胸苷(dT)内部标记并且将其转染至MCF10A细胞中。所述dT修饰的前体miRNA经过加工并且导致产生成熟miRNA，确认所述标记并不改变其加工潜能(图15B-C)。所述经过修饰的前体miRNA用于‘切割’测定中以显示含Dicer的外来体特定地能够加工前体miRNA并且产生成熟miRNA(图6D-F)。
癌细胞中的细胞质CD43有助于Dicer的动员。多泡体(MVB)为含有内体的细胞器，所述内体在与质膜融合后最终作为外来体释放(Pant等人,2012)。研究允许将RISC蛋白募集至内体中并且使其随后释放至外来体中的可能机制。首先，研究与对照细胞相比较，Dicer是否与癌细胞中的MVB缔合。比较Dicer联合MVB和外来体生物发生途径的标志物的细胞分布。Hrs和BiG2为早期内体标志物并且TSG101为MVB的标志物(Razi和Futter,2006；Shin等人,2004)。Dicer与Hrs、BiG2以及TSG101共定位于MDA-MB231和4T1细胞中(图16A)。外源递送的N-若丹明标记的磷脂酰乙醇胺(NRhPE)由细胞摄取并且保留于MVB内(Sherer等人,2003)。MDA-MB231和4T1细胞中的Dicer染色主要与NRhPE共定位于MVB中，所述MVB最终产生外来体。这些数据与其中Dicer、TRBP以及AGO2出现于晚期内体/MVB部分中的共同分离研究中的先前观察结果(Shen等人,2013)一致。相比之下，在对照细胞(NMuMG和MCF10A)中不存在Dicer与Hrs、BiG2、TSG101或NRhPE的共定位(图16A)。此外，在MDA-MB231和MCF10A细胞中使用两种不同的siRNA使Hrs和TSG101基因沉默，以及使用两种不同的shRNA使BiG2沉默，并且评估Dicer蛋白表达(图16B)。Hrs、BiG2以及TSG101的沉默削弱了MVB形成并且导致外来体产量的下调(图16C-E)。在具有siHrs、shBiG2或siTSG101的MDA-MB231细胞的细胞质和细胞核中观察到增加的Dicer蛋白。当使用4T1细胞来代替MDA-MB231细胞时，获得相似结果。当Hrs、BiG2或TSG101基因在MCF10A细胞中沉默时，未观察到改变的Dicer蛋白表达和定位(细胞质)。有趣的是，DicermRNA表达在siHrs、shBiG2以及siTSG101MDA-MB231和4T1细胞中降低(图16F)。这可能表示在所述细胞中的Dicer蛋白的量与其转录水平之间的负反馈环。这些结果表明，外来体介导的Dicer蛋白输出潜在地为用于癌细胞中的Dicer耗尽的速率限制步骤。削弱的MVB形成导致通过细胞质和细胞核的Dicer蛋白积聚，而不增加Dicer转录水平。
MVB还螯合泛素化蛋白以用于通过溶酶体进行后续降解(Luzio等人,2009)。已经显示，Dicer蛋白未泛素化并且不与广泛使用的溶酶体标志物LAMP-1共定位。这些结果表明，Dicer未在癌细胞中被靶向用于降解，而是经由外来体分泌(图16G)。
使蛋白靶向MVB和外来体的信号大部分尚未可知。近来，推测多种质膜锚定蛋白(如CD43)为蛋白转运至MVB和外来体中的可能介体(Shen等人,2011b)。CD43主要为白血球跨膜唾液酸糖蛋白，其在癌细胞中(呈其截短的细胞质形式)但不在对照细胞中高度表达(Shelley等人,2012)。CD43在包括乳癌在内的多种实体肿瘤中检测到，其中其与癌症进展和转移相关(Shelley等人,2012)。我们研究了CD43是否可能有助于RISC蛋白转运至MVB。显示Dicer与CD43蛋白免疫沉淀于MDA-MB231细胞中(图9A)。当使用siRNA使CD43在MCF10A和MDA-MB231细胞中下调时，Dicer水平在癌小体中显著降低(图9B和16H)，具有Dicer蛋白的细胞核和细胞质积聚。DicermRNA表达的下调在MDA-MB231siCD43癌细胞中但不在MCF10AsiCD43非致癌细胞中观察到，如先前使用siHrs、shBiG2以及siTSG101也观察到(图16I)。
癌小体以Dicer依赖性方式改变靶标细胞的转录组。癌细胞(MDA-MB231细胞)用外来体的标志物CD63-GFP转染(Escola等人,1998)。所述CD63-GFPMDA-MB231细胞用于分离GFP+外来体，所述外来体随后与MCF10A细胞一起孵育。来自MDA-MB231-CD63-GFP的外来体通过使用补充有检测发射绿色荧光的粒子的激光束的NanoSight显示为绿色(图17A)。显示CD63-GFP+癌小体进入MCF10A细胞，其中其出现于细胞质中。使用miRNA表达阵列，示出暴露于MDA-MB231源性癌小体的MCF10A细胞获得不同于亲本MCF10A细胞并且类似MDA-MB231细胞的新的miRNA表达谱。使用miRNA表达阵列，示出暴露于MDA-MB-231源性癌小体的MCF10A细胞获得不同于亲本MCF10A细胞的新的miRNA表达谱。用癌小体处理的MCF10A的整体转录组谱更密切地类似MDA-MB231细胞。当MCF10A细胞暴露于具有Dicer抗体的MDA-MB231癌小体时，mRNA表达谱的所述显著改变发生逆转，并且所述表达模式与亲本MC10A细胞重聚类。
与亲本MCF10A细胞相比较暴露于MDA-MB231癌小体的MCF10A细胞的miRNA和mRNA表达谱的深入分析显露在经过处理的MCF10A细胞中某些miRNA的显著上调和其所述的mRNA靶标的下调。例如，连同其它致癌miRNA，miRNA-21和-10b在经过处理的MCF10A细胞中上调(分别为4.6和2.3倍)。微RNA-21和-10b已经牵涉于乳癌进展、侵袭性以及转移中(Ma等人,2007；Yan等人,2011)。如早先所示，miR-21和-10b在癌小体中由其前体miRNA合成。PTEN和HOXD10被描述为miR-21和miR-10b靶标并且与对照MCF10A细胞相比较，在用癌小体处理的MCF10A细胞的表达阵列分析中受到抑制。蛋白印迹分析显示PTEN和HOXD10水平在暴露于癌小体的MCF10A细胞中受到抑制(图7A-B)。为了检查癌小体中的miR-21和miR-10b是否可使MCF10A受体细胞中的PTEN和HOXD10沉默，用含有能够结合miR-21和miR-10b的PTEN或HOXD10基因的野生型3’UTR的荧光素酶报告基因短暂转染MCF10A细胞。PTEN或HOXD10载体的突变型3’UTR用作对照。在与癌小体一起孵育的MCF10A细胞中可见荧光素酶报告基因活性的降低，确认miRNA从癌小体至受体细胞的功能递送(图7C)。在癌小体孵育的MCF10A细胞中，在不同时间点评估PTEN和HOXD10表达水平。在用72h培养的外来体处理所述细胞之后立即检测到PTEN和HOXD10表达的显著降低(图7A-B)。PTEN和HOXD10表达水平在用新鲜分离的外来体处理的MCF10A细胞中以最小程度变化，表明在这个时刻可能还未存在充足浓度的成熟miRNA(图17B-C)。用72h培养的具有抗Dicer抗体的癌小体处理的MCF10A细胞显露PTEN和HOXD10的无关重要的下调(图7D和图17G)。另外，细胞中的miR-15(在MDA-MB231源性癌小体中未检测到的miRNA)的加工并未由于用含有Dicer抗体的MDA-MB-231外来体处理MCF10A细胞而改变，显示Dicer抗体在经过处理的细胞中的无关重要的效应(图17D)。一些报告显示miRNA靶标在与外来体一起孵育的细胞中下调而无需长培养期(Kosaka等人,2013；Narayanan等人,2013；Pegtel等人,2010)。MiR-182-5p是在癌小体处理后在MCF10A细胞中上调的一种miRNA，并且miR-182-5p靶标Smad4(Hirata等人,2012)是在这些细胞的癌小体处理后下调的一种基因(图7E)。在培养期期间未观察到癌小体中miR-182-5p的上调并且在癌小体中未检测到前体miR182-5p(图17E)。因此，癌小体还包装成熟miRNA而无需用于加工前体miR。如果所述成熟miR呈相关的化学计量的量，那么其能够调节受体细胞的基因表达，如先前所示(Ismail等人,2013；Kogure等人,2011；Kosaka等人,2013；Narayanan等人,2013；Pegtel等人,2010；Valadi等人,2007；Zhang等人,2010)。然而，如果一些成熟miRNA未存在于外来体中但其前体miRNA存在，那么这些前体miRNA仍可对其靶标具有生物效应，因为其将被加工成成熟RLC缔合的miRNA。
用72h培养的癌小体处理的MCF10A细胞的细胞活力和增殖增加，所述增加在使用新鲜分离的癌小体时未观察到(图7F)。当MCF10A细胞用含有抗Dicer抗体的MDA-MB231源性癌小体处理时未观察到差异(图7F)。相同模式适用于用癌小体处理的MCF10A细胞的集落形成能力(图7G和17F)。与未处理细胞相比较，用72h培养的癌小体处理的MCF10A细胞形成集落(图7G)。当使用新鲜分离的癌小体或ABDicer癌小体时未观察到所述集落形成(图7G)。
癌小体诱导非致癌上皮细胞的肿瘤形成并且激活成纤维细胞。最近的研究表明，源自骨髓间充质干细胞的外来体支持多发性骨髓瘤细胞生长(Roccaro等人,2013)。为了解决MCF10A和先前暴露于癌小体的MCF10A细胞(MCF10A细胞-癌小体)的功能性‘致癌潜能’，将这些细胞原位注射至雌性nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中，类似于先前描述的协议(Luga等人,2012)。MCF10A细胞并未在这些小鼠中形成肿瘤，这在早先也有报告(Mavel等人,2002；Thery等人,2002)(图7H)。MCF10A细胞-癌小体在21天后形成肿瘤，所述对照MDA-MB231细胞也一样(图7H)。与含有抗Dicer抗体(而非对照抗肌动蛋白抗体)的癌小体一起孵育的MCF10A细胞显示肿瘤体积的显著降低(图7H)。这些结果支持当暴露于含有Dicer蛋白的癌小体时MCF10A细胞的致癌转化(图7F-H和图17F)。
来自癌症患者的血清外来体含有Dicer并且加工前体miRNA以产生成熟miRNA。检查人类肿瘤的外来体的RISC蛋白。为了实现癌细胞特异性，将新鲜分离的人类原发卵巢、***以及子宫内膜肿瘤片原位移植至雌性无胸腺nu/nu小鼠的适当器官中(图18A-B)。通过电子显微镜评估来自这些小鼠的血清外来体(图18C)。从这些外来体分离的含量的尺寸排阻蛋白印迹证明仅具有人类起源的Dicer蛋白的存在(hsa-Dicer)(图8A和图18D)。来自4T1源性外来体和4T1细胞的蛋白萃取物用作对照以显示小鼠起源的Dicer，其展现不同分子量(mmu-Dicer)(图8A)。
来自MDA-MB231细胞的癌小体与人类真皮成纤维细胞(HDF)一起孵育。与对照细胞相比较，癌小体孵育的成纤维细胞的整体基因表达谱显露对其转录组的显著影响。观察到αSMA(ACTA)(18倍)、COL1A1(12倍)、TGFβ1(15倍)、CTGF(8倍)、Ras(6倍)以及ERK(4倍)的上调。与癌小体一起孵育的成纤维细胞以较高速率增殖(图8I)。这些结果表明，癌小体可激活基质成纤维细胞以类似于肌成纤维细胞表型并且呈现与癌相关成纤维细胞相关的特有特征。
接着，从来自8个健康个体(H)和11个具有乳癌的患者(BC)的100μl新鲜血清样品分离外来体(图8B)。通过对外来体进行电子显微术来区分脂质双层膜(图8C)。与健康供体的血清相比较，乳癌患者的血清含有显著更多的外来体(图8D)。在将相等数目的外来体放置于培养物中持续24和72h时，发现所述6种前体miRNA仅在乳癌患者中下调并且其相应成熟miRNA在72h培养后上调，表明在来自乳癌患者而非健康对照中的新鲜血清的外来体中前体miRNA被加工成成熟形式(图8E-F)。接着，将单独或与MCF10A细胞组合的外来体原位注射于雌性nu/nu小鼠的乳腺脂肪垫中。与MCF10A细胞组合的源自乳癌患者的11种血清外来体中的5种形成肿瘤，而健康供体外来体或单独外来体均未形成肿瘤(图8G)。有趣的是，形成肿瘤的外来体也在72h培养后显示成熟miRNA的量的最高倍数变化增加(图8E-F)。
进一步由从5个健康个体(C46、C45、C44、C43以及C41)和4个具有转移性乳癌的患者(Met219、Met354、Met299以及Met356)获得的新的血清样品集合分离外来体。仅在转移性乳癌样品中并且未在来自健康个体的血清的外来体中观察到外来体中的Dicer表达(图8H)。
表5.在癌小体(MDA-MB231源性)与正常发生小体(MCF10A源性)之间差异表达的miRNA。
表6.在癌小体(MDA-MB231源性)与具有Dicer抗体的癌小体(MDA-MB-231源性)之间差异表达的miRNA。
***
本文所公开并且要求的所有方法均可根据本公开进行并且实施而无需不当实验。虽然本发明的组合物和方法已经就优选的实施方案加以描述，但本领域技术人员应显而易知，变化可应用于所述方法和本文所述方法的步骤中或步骤序列中而不偏离本发明的概念、精神以及范围。更具体说来，应显而易知在化学上并且在生理学上相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时将实现相同或相似结果。本领域技术人员显而易知的所有所述相似的取代物和修饰均被视为在随附权利要求书所界定的本发明的精神、范围以及概念内。
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Claims (54)

1.一种检测受试者中的癌症生物标志物的体外方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)测量以下各物的水平：
(i)在所述样品的外来体部分中的RISC蛋白；
(ii)前体miRNA；
(iii)在所述样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA；和/或
(iv)在所述样品的外来体部分中的初级miRNA或前体miRNA加工活性；以及
(c)基于所述miRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品基本上不含细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述样品为淋巴、唾液、尿液或血浆样品。
4.如权利要求1所述的方法，其进一步包括纯化所述样品的外来体部分或增加所述样品的外来体部分的产量。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述癌症为乳癌、肺癌、头颈癌、***癌、食管癌、气管癌、脑癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫癌、子***、睾丸癌、结肠癌、直肠癌或皮肤癌。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述癌症为乳癌。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量所述miRNA中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10者的水平。
8.如权利要求1所述的方法，其进一步包括测量DICER、AGO2或TRBP的水平。
9.如权利要求1所述的方法，其中测量前体miRNA的水平包括测量表5的所述miRNA中的一者的前体的水平。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者先前已经针对癌症进行治疗。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述受试者先前具有手术去除的肿瘤。
12.如权利要求1所述的方法，其中鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物进一步包括使所述测量的miRNA水平、前体miRNA水平；RISC水平或miRNA加工活性与癌症风险相关联。
13.如权利要求1所述的方法，其中鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物进一步包括使用算法分析所述测量的miRNA水平、前体miRNA水平；RISC水平或miRNA加工活性。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述分析通过计算机执行。
15.如权利要求1所述的方法，其进一步包括：
b)测量以下各物的水平：
(i)在所述样品和参考样品的外来体部分中的RISC蛋白；
(ii)在所述样品和参考样品的外来体部分中的前体miRNA；
(iii)在所述样品和参考样品的外来体部分中的一种或多种选自表5中所提供的miRNA的miRNA；和/或
(iv)在所述样品和参考样品的外来体部分中的miRNA加工活性；以及
(c)通过比较来自所述受试者的所述样品中RISC、前体miRNA、miRNA或miRNA加工活性的所述水平与所述参考样品中miRNA、前体miRNA、RISC或miRNA加工活性的所述水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。
16.如权利要求1所述的方法，其中测量RISC蛋白水平包括执行蛋白印迹、ELISA或结合于抗体阵列。
17.如权利要求1所述的方法，其中测量miRNA水平包括测量加工过的miRNA水平。
18.如权利要求1所述的方法，其中测量miRNA水平包括执行RT-PCR、RNA印迹或阵列杂交。
19.如权利要求1所述的方法，其进一步包括报告所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。
20.如权利要求19所述的方法，其中报告包括制备书面或电子报告。
21.如权利要求19所述的方法，其进一步包括向所述患者、医生、医院或保险公司提供所述报告。
22.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
选择根据权利要求1被鉴定为具有癌症生物标志物的受试者；以及
向所述受试者施用抗癌疗法。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术疗法。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗癌疗法是靶向脑。
25.一种治疗受试者的方法，所述方法包括：
(a)在来自所述受试者的样品的外来体部分中获得以下各物的水平：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA水平；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；
(b)基于所述mRNA、前体miRNA；RISC蛋白或miRNA加工活性的所述水平来选择具有癌症生物标志物的受试者；以及
(c)用抗癌疗法治疗所述选择的受试者。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗癌疗法为化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法、免疫疗法或手术疗法。
27.一种针对诊断程序选择受试者的方法，所述方法包括：
(a)在来自所述受试者的样品的外来体部分中获得以下各物的水平：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；
(b)基于所述mRNA、前体miRNA、RISC蛋白或miRNA加工活性的所述水平来选择具有癌症生物标志物的受试者；以及
(c)对所述选择的受试者执行诊断程序。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述诊断程序包括诊断成像。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述成像为X射线、CT、MRI或PET成像。
30.一种包含计算机可读代码的有形的计算机可读介质，所述代码在由计算机实施时使所述计算机执行操作，所述操作包括：
a)接收对应于在来自所述受试者的样品的外来体部分中以下各物的水平的信息：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性；以及
b)确定所述miRNA或RISC蛋白中的一者或多者与参考水平相比的相对水平，其中与参考水平相比改变的水平指示所述受试者具有癌症生物标志物。
31.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其进一步包括接收对应于在不具有癌症的受试者的外来体部分中以下各物的参考水平的信息：(i)一种或多种选自表5中提供的miRNA的miRNA；(ii)前体miRNA；(iii)RISC蛋白；或(iv)miRNA加工活性。
32.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其中所述参考水平存储于所述有形的计算机可读介质中。
33.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其中所述接收信息包括从有形的数据存储器件接收对应于来自受试者的样品中以下各物的水平的信息：miRNA；前体miRNA；RISC蛋白或miRNA加工活性。
34.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其进一步包含在由计算机实施时使所述计算机执行一种或多种额外操作的计算机可读代码，所述操作包括：向有形的数据存储器件发送对应于miRNA；前体miRNA；RISC蛋白或miRNA加工活性的所述相对水平的信息。
35.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其中所述接收信息进一步包括接收对应于来自受试者的样品中所述miRNA中的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10者的水平的信息。
36.如权利要求30所述的有形的计算机可读介质，其中所述计算机可读代码在由计算机实施时使所述计算机执行操作，所述操作进一步包括：c)计算所述样品的诊断评分，其中所述诊断评分指示所述样品来自具有癌症的受试者的可能性。
37.一种检测受试者中的癌症生物标志物的体外方法，所述方法包括：
(a)从所述受试者获得生物样品；
(b)测量所述样品中选自表5中提供的miRNA的一种或多种miRNA的水平；以及
(c)基于所述miRNA的测量水平来鉴定所述受试者具有或不具有癌症生物标志物。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述样品基本上不含细胞。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述样品为体液的外来体部分。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述样品为淋巴、唾液、尿液或血浆样品。
41.一种用于活性抑制RNA的递送的体外方法，所述方法包括使细胞与联合RISC蛋白复合物提供的抑制RNA接触。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述RISC蛋白复合物包含TRBP、DICER以及AGO2。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述抑制RNA为siRNA或shRNA。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述抑制RNA为人类miRNA。
45.如权利要求41所述的方法，其中所述抑制RNA和RISC蛋白复合物包含于包含脂质双层的脂质体、纳米粒子或微胶囊中。
46.如权利要求46所述的方法，其中所述微胶囊为外来体。
47.如权利要求41所述的方法，其中接触细胞包括用所述抑制RNA和RISC蛋白复合物转染细胞。
48.如权利要求41所述的方法，其进一步包括向受试者施用所述抑制RNA和RISC蛋白复合物。
49.一种包含与RISC蛋白复合物联合的重组或合成抑制RNA的组合物，所述复合物包含于脂质体、纳米粒子或微胶囊中。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述RISC蛋白复合物包含TRBP、DICER以及AGO2。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述抑制RNA为siRNA或shRNA。
52.如权利要求49所述的组合物，其中所述抑制RNA为人类miRNA。
53.如权利要求49所述的组合物，其中所述复合物包含于合成脂质体、纳米粒子或微胶囊中。
54.如权利要求49所述的组合物，其中所述微胶囊为外来体。
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