KR102212699B1 - 유방암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 miR-3188을 유효성분으로 함유하는 유방암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 miR-3188은 유방암, 특히 저항성(내성) 유방암에 대하여 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 라파티닙 등의 알려진 항암제 또는 방사선 처리와 함께 시너지 효과를 가져 저항성 유방암의 예방 또는 치료에 효과적이다.

Description

유방암 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for the prevention or treatment of breast cancer}

본 기술은 유방암, 특히 내성 유방암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

유방암은 여성에게 가장 흔한 암사망 원인이다. 선행화학요법(neoadjuvant chemotherapy, NACT)은 IIb-III 단계의 국소 진행 유방암 환자의 치료에 많이 시도되고 있다. 선행화학요법은 원발성 종양의 크기를 감소시키기 위해서 또한 수술 전에 특이하고 조직적인 미소-전이를 방지하기 위하여 일반적으로 사용되고 있다. 또한 선행화학요법을 평가한 많은 임상 논문들에서, 대다수는 선행화학요법이 유방 존치율을 높이고, 환자의 생존과 상관관계를 있는 것으로 나타나고 있다. 그러나 불행히도 사용된 화학요법의 처방에 따라 40% 정도까지 상당 수의 환자들에게 임상적으로 또는 병인학적으로 선행화학요법의 이점이 나타나지 않고 있다. 그러한 유방암 환자들은 사용된 화학요법제에 대하여 저항성 혹은 내성을 보유하고 있거나 저항성이나 내성이 생성되는 것일 수 있다.

저항성이 높은 유방암종의 하나로는 삼중-네가티브 유방암을 들 수 있다. 삼중-네가티브 유방암(Triple negative breast cancer; TNBC)은 에스트로겐(ERα), 프로제스테론(PR) 및 인간 상피세포 성장인자 (HER-2) 수용체들이 없고, 허가된 표적 치료제의 선택이 없는 악성이고 치명적인 형태의 암이다. 수 많은 진전이 있었음에도 불구하고, 치료 내성 및 전이는 TNBC 환자들의 사망의 주 원인이다. 전통적인 치료에의 내성 및 전이의 개시는 종양-시작 능력이 있는 부차집단의 세포들로부터 일어날 수도 있다. 화학요법 치료 후에 남은 종양들은 CD44+/CD24-/low가 풍부해진 세포로 자체-재생능력과 간엽성(mesenchymal) 성질들을 보여준다. 이 암줄기세포(스템셀,CSCs)들은 종양 성장을 다시-시작할 수 있고 전이의 기원이 될 수 있다. 그러므로 전통적인 화학요법치료와 항-CSC 화합물들과의 조합된 치료는 종양의 부담을 감소시키고, 재발은 물론 다른 기관으로의 전이도 감소시키는데 요구될 것이다. 불행하게도 현재는 일상적인 임상에서의 사용이 가능한 그러한 조합은 없다.

또한, 방사선 치료는 유방 보존수술뿐만 아니라 재발 위험이 높은 유방 절제술을 받은 환자들의 효과적인 국소 부위 관리를 위해 추천되는 치료방법이나, 일부 환자들에게는 방사선 치료 저항성과 국소 부위 관리 실패에 따른 생존율 감소가 나타난다.

위와 같은 방사선 치료의 문제점이나 내성 유방암에 관한 문제점 등을 해결하기 위해, 많은 연구 개발들이 있었으나 충분한 효과를 나타내지 못하여 유방암 치료에 제한점이 많다. 즉, 내성을 갖는 유방암 및/또는 이의 세포에 민감성을 증가시키기 위한 분자 신호에 대한 연구가 필요한 실정이다.

이러한 배경 하에 유방암, 특히 내성 유방암의 치료를 위한 새로운 치료 방법들에 대한 연구개발이 활발히 진행되고 있으며, 특히 약물과의 병용 치료 요법, 방사능과의 병용 처리 등과 관련된 연구 개발의 필요성이 절실히 대두되고 있다.

KR10-1956861, 2019.03.05. KR10-2016-0143775, 2016.12.14.

본 발명은 miR-3188을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 miR-3188을 포함하는 항암 치료 보조용 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 miR-3188이 유방암 세포 사멸에 우수한 효과를 나타낼 뿐만 아니라 라파티닙에 내성을 가지는 유방암종들에 대하여 민감성을 증가시켜 암의 사멸 효과를 크게 증가시키고 방사선 등과 병용하였을 때도 시너지 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본원 발명은 miR-3188을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본원 발명의 조성물은 유방암, 특히 내성 유방암에 대하여 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 라파티닙 등의 알려진 항암제 또는 방사선 처리와 함께 시너지 효과를 가져 내성 유방암의 예방 또는 치료에 효과적이다.

miRNA(마이크로RNA, microRNA, miRNA, miR)는 다양한 유전자 발현을 조절하는 non-coding RNA을 말하며, mRNA의 번역을 억제하거나, mRNA의 분해를 유도함으로써 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 억제하거나 타겟 RNA의 분해를 유도한다. 전사 후 조절은 세포 내 신호전달과 같이 정확하고 정밀한 유전자 발현이 요구되는 과정에서 강력한 조절 방법으로 이용되고 있으며, 외부자극에 의한 유전자의 발현변화 중 절반 정도가 전사 후 단계에서 조절되므로, 전사 후 조절이 전체 유전자의 발현조절에서 매우 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 몇몇 연구에서는 miRNA는 세포 분화, 증식, 세포사멸, 발생, 면역, 물질대사 및 줄기세포 유지 등과 같은 많은 생물학적 과정을 통제하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. miRNA는 펩타이드나 항체 치료제와 달리 개발 기간이 짧고, 확실한 질환 표적 유전자만 밝혀진다면 이론적으로 모두 치료제를 개발할 수 있다는 장점이 있다. 또한, miRNA는 일반적으로 1개가 아닌 복수의 표적 유전자의 발현을 동시에 조절함으로 매우 높은 특이성과 효능을 가지고 있다.

본원 발명에 있어서, miR-3188는 인간을 포함한 동물, 예를 들어 원숭이, 침팬지, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등으로부터 유래할 수 있으며, 인간 유래의 것이 바람직하다. 본 발명에서 miR-3188을 구성하는 핵산 분자는 각각 18 내지 100 nt(nucleotide) 길이를 가질 수 있다. 바람직한 일예로, 상기 핵산 분자는 19 내지 25nt 길이의 성숙 miRNA 형태일 수 있고, 바람직한 다른 일예로 50 내지 100nt, 더욱 바람직하게는 65-95nt 길이의 전구체 miRNA 형태일 수도 있다.

상기 성숙 miRNA 또는 전구체 miRNA 형태의 miR-3188 핵산 분자의 염기서열 정보는 미국국립보건원 유전자은행(NIH GenBank) 및 miRBASE(http://www.mirbase.org/) 등의 공지된 유전자데이터베이스에서 확인할 수 있다. 보다 상세하게, miR-3188의 성숙 형태의 염기서열은 유전자 등록번호 MIMAT0015070 (서열번호 1), 전구체 형태는 MI0014232 (서열번호 2)로 등록되어 있다.

[표 1]

발명에서 사용되는 miRNA 들은 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, miRNA 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실, 치환 또는 삽입에 의해 변형되더라도 상기 miRNA 핵산 분자와 기능적으로 동등한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함하는 개념이다. 예를 들어, 본 발명의 miRNA는 각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상의 상동성을 나타낼 수 있으며, 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 나타내는 것을 포함할 수 있다. 이러한 상동성은 당 분야에 널리 공지된 컴퓨터 알고리즘, 예를 들어 Align 또는 BLAST 알고리즘을 이용하여 뉴클레오티드의 서열을 표적 유전자의 상응하는 부분과 비교하여 용이하게 결정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 miRNA 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다. 성숙 miRNA 분자는 주로 단일 가닥으로 존재하지만, 전구체 miRNA 분자는 이중가닥을 형성할 수 있는 부분적인 자가-상보적인 구조(예를 들어 스템-루프 구조)를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산 분자는 RNA, PNA(peptide nucleic acids) 또는 LNA(locked nucleic acid) 같은 형태로 구성될 수 있다.

본 발명의 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 상기 miR-3188의 발현을 증가시키기 위하여, miR-3188의 핵산 서열을 포함하는 조성물을 제공할 수 있다. 또한, 상기 miRNA 자체를 포함할 수도 있으나 이와 기능적으로 동등한 단편을 포함할 수도 있으며, 상기 miRNA의 단편은 상기 miRNA 의 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 종자 서열(seed sequence)은 miRNA가 타겟을 인식할 때 완전한 상보성을 가지고 결합하는 miRNA 내 일부 영역의 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 miRNA가 타겟에 결합하기 위해 필수적으로 요구되는 부분이다. 예컨대 miR-3188의 종자 서열은 5'-GAGGCUU -3'(서열번호 3)일 수 있다.

또한, 상기 miRNA는 성숙 형태의 miRNA, 전구체 형태의 miRNA일 수 있다.

miR-3188이 생체에 투여될 경우 세포 내에서 miRNA가 활성화되어 기능하는 경로에 관여하여 miRNA의 발현 수준을 증가 시키거나, 활성을 증대시킬 수 있다. 또한, miRNA에 직접적으로 작용하거나 또는 miRNA의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 miRNA의 발현을 전사 수준에서 증대시키거나, 발현된 miRNA의 분해를 감소시키거나, 그 활성을 증대함으로써, miRNA의 발현 수준 또는 그 활성을 증대시킬 수 있다.

본 발명에서, miRNA 핵산 분자는 발현 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.

일 구현예로, 상기 miRNA 핵산 분자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 본 발명에서 miRNA 핵산 분자는, 핵산 및 DEAE-덱스트란의 복합체, 핵산 및 핵 단백질의 복합체, 핵산 및 지질의 복합체 등의 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있는데, 이를 위해 상기 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 전달체는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 발현 벡터는, 형질전환된 세포의 선별을 용이하게 하기 위하여 선별마커를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들, 예를 들어 녹색 형광 단백질, 퓨로마이신, 네오마이신, 하이그로마이신, 히스티디놀디하이드로게나제(hisD) 및 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(Gpt) 등을 예시할 수 있다.

다른 일구현예로, 본 발명에서 miRNA 핵산 분자는, 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다. 세포 내로 도입하는 방법으로는, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있다.

본원 발명의 약제학적 조성물은 survivin 단백질을 억제하고 관련 pathway를 조절하며, 특히 라파티닙 등의 화합물과 조합하였을 때 관련 pathway를 더 잘 조절하여, 유방암, 특히 라파티닙 등의 항암제 내성 유방암에 대해 우수한 항암 효과를 나타낸다.

본 발명에 따른 조성물은 유방암의 예방 및 치료에 효과적이다. 특히, 상기 유방암은 방사선 내성 유방암, 항암제 내성 유방암의 치료에 효과적일 수 있다. 구체적으로, 방사선 내성 유방암은 방사선 치료 내성을 나타내는 유방암을 언급한다. 특히, 유방암 치료의 경우 거의 대부분 방사선 치료를 병행하기 때문에, 방사선 치료 저항성 내지 내성은 유방암 치료를 위해 반드시 극복되어야 할 사항이며, 이러한 점에서 본 발명에 따른 조성물은 유방암 치료에 더욱 효과적일 수 있다.

구체적으로, 상기 항암제는 트라스투주맙 엠탄신, 퍼투주맙, 라파티닙, 이리노테칸, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 겜시타빈, 카페시타빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 마이토마이신 C, 테가푸르·기메라실·오테라실 배합제, 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 레고라페닙, 트리플루리딘·티피라실 배합제, 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 메토트랙사이트, 및 페메트렉세드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 항암제일 수 있고, 상기 언급된 항암제에 대해 내성을 가지는 유방암일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 survivin 과발현 유방암에 효과적일 수 있으며, 삼중음성유방암에 효과적일 수 있다.

본 발명에 따른 miR-3188을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 유효성분으로 트라스투주맙 엠탄신, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 라파티닙, 이리노테칸, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 겜시타빈, 카페시타빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 마이토마이신 C, 테가푸르·기메라실·오테라실 배합제, 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 레고라페닙, 트리플루리딘·티피라실 배합제, 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 메토트랙사이트, 및 페메트렉세드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 항암제를 더 포함할 수 있다. 바람직하게 본 발명에 따른 추가의 항암제는 라파티닙일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 추가의 항암제와 함께 시너지 효과를 나타내어, 유방암 특히 항암제 내성 유방암의 치료에 효과적일 수 있다.

상기 조성물은 비경구, 경구, 경피, 피내, 근육내, 정맥, 피하, 복강내, 지속성 방출, 제어된 방출, 지연된 방출, 좌약, 흡입, 카테터 (catheter), 또는 설하 투여 또는 간 조직으로의 직접 주사를 위해 제제화되는 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 miRNA-3188 및/또는 추가의 항암제는 식품의약안정청 (KFDA)의 통상적인 약학 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.

그 자체를 사용하거나 약학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있다. 그리고 miRNA-3188의 모방체 및 이들의 염 형태, 기타의 항암제를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구 투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리 (pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다.

이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 0.0001 내지 100㎎을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

본 발명의 miR-3188를 포함하는 벡터의 경우 구체적으로 0.01 내지 500 mg을 함유하고, 좀 더 구체적으로 0.1 내지 300 mg을 함유하며, miR-3188를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 구체적으로 10³~10¹² IU(10 내지 10¹⁰ PFU)를 함유하고, 좀 더 구체적으로는 10⁵ 내지 10¹⁰ IU를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 miR-3188를 포함하는 세포의 경우, 구체적으로 10³ 내지 10⁸개를 함유하고, 좀 더 구체적으로 10⁴ 내지 10⁷개를 함유하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명의 miR-3188를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁷ 내지 10¹¹ 바이러스 입자(10⁵ 내지 10⁹ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10³ 내지 10⁶ 세포/㎏이고, 구체적으로 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 10⁸ 내지 10¹⁰ 입자(10⁶ 내지 10⁸ IU)/㎏, 세포의 경우에는 10² 내지 10⁵ 세포/㎏이며, 일일 2 내지 3회 투여할 수 있다. 상기 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명은 miR-3188을 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명에 따른 miR-3188을 포함하는 항암 보조제는 방사선에 민감한 암세포뿐만 아니라, 방사선에 내성이 있는 암세포에서도 방사선 민감도를 증가시킴으로써 방사선 치료의 효율을 증진시킬 수 있고 방사선의 필요량을 감소시킴으로써 방사선 치료로부터 나올 수 있는 부작용 등을 감소시킬 수도 있다. 본 발명에 따른 miR-3188는 방사선 치료전, 치료와 함께 또는 치료 후에 투여될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 항암 보조제는 방사선 치료에 대한 항암 보조제일 수 있다.

또한, 항암제를 이용한 항암 치료법에 있어서 상승 효과를 나타낼 수 있는 보조적인 역할을 수행할 수도 있다.

예컨대, 상기 항암 보조제는 트라스투주맙 엠탄신, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 라파티닙, 이리노테칸, 시스플라틴, 카르보플라틴, 옥살리플라틴, 플루오로우라실, 겜시타빈, 카페시타빈, 파클리탁셀, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 시클로포스파미드, 마이토마이신 C, 테가푸르·기메라실·오테라실 배합제, 세툭시맙, 파니투무맙, 베바시주맙, 라무시루맙, 레고라페닙, 트리플루리딘·티피라실 배합제, 제피티닙, 엘로티닙, 아파티닙, 메토트랙사이트, 및 페메트렉세드로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 항암제에 대한 항암 보조제일 수 있다. 본 발명의 일구현예로, 상기 항암보조제는 다른 항암제 또는 다른 항암보조제를 포함하는 복합제 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 항암 보조제는 대상체에서 방사선 또는 항암제에 대한 민감성을 회복하게 하여 방사선 내성 유방암 또는 항암제 내성 유방암에 대한 치료 효과를 가지게 할 수 있다. 이에 따라 유방암에서 원할한 종양 치료를 도울 수 있게 한다.

조성물의 투여, 투여 경로, 제형화, 투여량 등에 대해서는 앞서는 약제학적 조성물의 내용이 항암 보조제에도 적용될 수 있다.

본 발명은 miR-3188을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 유방암의 치료방법을 제공한다.

본 발명에 "miR-3188", "유방암", "투여" 등의 용어는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 miR-3188을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유동물일 수 있다. 이러한 대상체의 바람직한 예로 인간과 같은 영장류가 포함될 수 있다. 또한 이와 같은 대상체들에는 유방암의 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 유방암의 치료를 위한 약제의 제조에서 miR-3188의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 유방암의 치료에 사용하기 위한 miR-3188를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유방암의 치료를 위한 miR-3188의 용도를 제공한다.

본 발명에 따른 miR-3188은 유방암, 특히 내성 유방암에 대하여 우수한 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 라파티닙 등의 알려진 항암제 또는 방사선 처리와 함께 시너지 효과를 가져 내성 유방암의 예방 또는 치료에 효과적이다.

도 1은 HCC1954 및 HCC1419 유방암 세포주에서 라파티닙에 대한 민감성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 miR-3188 처리에 따른 HCC1954 유방암 세포주의 사멸 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 HCC1954 세포주에 microRNA3188을 인위적으로 발현하여 라파티닙에 대한 민감성의 증가를 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 microRNA3188를 라파티닙과 처리한 HCC1954 세포주에서 Survivin의 발현 감소를 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 miR-3188 처리와 함께 방사선을 조사하여 세포 사멸 증진을 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

<실시예 1> 라파티닙 저항성 세포주의 확인

라파티닙에 저항성을 거의 보이지 않는 유방암 세포주 HCC1419 (ATCC로부터 구매) 및 라파티닙에 저항성을 가지는 HCC1954 (ATCC로부터 구매)를 5% CO₂가 공급되는 37℃ 항온항습기에서 10% 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 을 포함하는 RPMI1640에 배양하였다.

그리고 나서, 라파티닙을 0, 0.5, 1, 2 μM 농도로 처리하고, 48시간 배양 후 세포 사멸 효과를 확인하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, HCC1954 세포주에서는 라파티닙의 민감도가 매우 낮게 나와서 세포 사멸 효과가 낮은 반면, HCC1419 세포주의 경우 라파티닙에 대한 민감도가 높아 우수한 세포 사멸 효과를 나타내었다.

<실시예 2> microRNA3188 발굴과 라파티닙에 대한 민감성 분석

HCC1954세포에 miRNA3188을 과발현시키기 위하여 reagent로 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen, USA)을 사용하였으며, 제조사의 설명서에 따라 miRNA3188 mimic (Dharmacon)을 0, 50, 100, 200 pM 의 농도로 형질감염시켰다. 48시간 뒤 miRNA mimic 처리군과 비 처리군을 trypan blue로 염색하여 전체 세포 중 죽은 세포의 수를 측정하여 miRNA3188으로 인한 세포 사멸 효과를 확인하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, HCC1954 세포주에서의 miR-3188의 처리는 농도 의존적으로 세포 사멸 효과를 크게 증가시켰다.

또한, miR-3188과 함께 라파티닙을 HCC1954 세포주에 처리하여 세포 사멸 효과를 확인하였다.

구체적으로, HCC1954세포에 miRNA3188 mimic(200pM) 또는 대조군으로서 타켓이 없는 miRNA mimic(200pM)을 형질감염 시킨 뒤, 라파티닙을 0, 1uM로 처리하여 48시간 뒤 결과를 확인하였다. Trypan blue로 염색하여 전체 세포 중 죽은 세포의 수를 측정하여 세포 사멸효과를 확인하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, miR-3188과 함께 라파티닙을 처리하는 경우 세포 사멸 효과가 크게 증가하는 것을 확인하였다.

<실시예 3> MicroRNA1388에 의한 세포사멸 기전 확인

MicroRNA3188과 라파티닙에 의한 세포사멸 기전을 확인하기 위하여 세포 사멸 저해 인자 중 하나인 Survivin 발현양을 측정하였다.

survivin은 caspase를 억제하는 기작을 통해 자살 세포사 증진을 유도할 가능성이 있다.

위 실시예２에서와 같이 실험을 수행한 후, 세포 추출물을 얻어 SDS가 함유된 polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 실시하였다. 전기영동 후 니트로셀룰로스 필터 (nitrocellulose membrane filter)에 80V에서 2시간 동안 transfer하고, 1차 항체와 2차 항체를 각각 반응시키고, 0.05% tween-20이 함유된 TBS로 세척한 뒤 ECL 검출키트를 이용하여 검출하였다. 이때 사용한 1차 항체는 1:1000, 2차 항체는 1:3000으로 희석해서 사용하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, miR-3188의 처리는 Survivin의 발현량을 크게 감소시켰고, 특히 라파티닙과 함께 처리되었을 때 그 효과가 보다 현저하였다.

<실시예 4> 방사선과 microRNA3188 의 병용 처리에 따른 시너지 효과 확인

microRNA3188을 발현한 후 방사선을 조사하여 세포사멸을 확인하였다.

이온화 방사선 조사(ionizing radiation; IR)을 위해, Gammacell 3000 Elan 방사선 조사장치(irradiator)를 이용하여 감마 이온화 방사선을 조사하였다.

HCC1954 세포는 miRNA3188 mimic(200pM) 또는 대조군으로서 타켓이 없는 miRNA mimic(200pM)을 형질감염 시킨 뒤 0, 7Gy의 방사선을 조사하였다. miRNA3188이 방사선 민감도에 미치는 영향은 Trypan blue로 염색하여 전체 세포 중 죽은 세포의 수를 측정하여 세포 사멸효과로 확인하였다.

상기 실험을 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, microRNA3188과 방사선의 병용 처리는 HCC1954 유방암 세포주에 대해 우수한 시너지 효과를 나타내어 세포 사멸을 크게 증가시켰다.

<110> KOREA INSTITUTE OF RADIOLOGICAL & MEDICAL SCIENCES <120> Composition for the prevention or treatment of breast cancer <130> WON1.4P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mature MiR-3188 <400> 1 agaggcuuug ugcggauacg ggg 23 <210> 2 <211> 85 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Precursor MiR-3188 <400> 2 ggcgccuccu gcucugcugu gccgccaggg ccuccccuag cgcgccuucu ggagaggcuu 60 ugugcggaua cggggcugga ggccu 85 <210> 3 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Seed sequence of MiR-3188 <400> 3 gaggcuu 7

Claims (14)

1. miR-3188을 유효성분으로 포함하는 라파티닙 내성 유방암 또는 방사선 내성 유방암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 miR-3188은 성숙 형태의 miRNA, 전구체 형태의 miRNA, 또는 상기 miRNA 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 단편인 약제학적 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 miR-3188은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 약제학적 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 miR-3188은 발현 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공되는 것인 약제학적 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. miR-3188을 포함하는 항암 보조제로서,
   상기 항암 보조제는 방사선 치료에 대한 항암 보조제 또는 라파티닙 항암제에 대한 항암 보조제이며, 암은 라파티닙 내성 유방암 또는 방사선 내성 유방암인, 항암 보조제.
10. 제9항에 있어서,
    상기 miR-3188은 성숙 형태의 miRNA, 전구체 형태의 miRNA, 또는 상기 miRNA 종자 서열(seed sequence)을 포함하는 단편인 항암보조제.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 제9항에 있어서, 상기 miR-3188은 서열번호 1의 서열로 이루어진 것인 항암보조제.

Images