CN105255854A - 可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

一种可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与应用，其特征在于，该制备方法包含：(a)提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；(b)提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；(c)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体(protoplast)及第二原生质体；(d)使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及(e)培养该融合菌株并进行筛选，以获得一标的菌株。该标的菌株可用于生产有机化合物(例如有机酸与醇)，且一具体态样为酪丁酸梭菌(Clostridium？tyrobutyricum)菌株ITRI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM？32077。

Description

可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与应用

技术领域

本发明是关于一种可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物及其制备方法与应用，尤其关于该微生物在生产例如有机酸与醇的有机化合物的应用。该微生物的一具体态样为酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)菌株ITRI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32077。

背景技术

自20世纪初以来，工业上便广泛使用细菌、酵母菌、霉菌等微生物以进行发酵反应，将生质原料转化为较具经济效益的有机化合物，例如有机酸以及醇类。其中，在生成有机化合物的微生物发酵方法中，以丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)发酵程序最广为使用。于ABE发酵路径中，通过微生物，可以将含有醣类的原料(玉米、薯类、糖蜜等)转化为丙酮酸(pyruvate)，再进一步将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A(acetyl-CoA)，以生成例如丁酸、丁醇或乙醇等较具经济效益的有机化合物。

然而，上述将丙酮酸转化为乙酰-辅酶A的过程会伴随着例如二氧化碳的碳氧化物的释放，造成从原料到产物之间不必要的碳源损失(carbonloss)。已知，若利用自然界的野生型菌株进行ABE发酵程序，将原料转化为产物的碳转化率最高仅约67％，导致有机化合物的产率不佳，造成不必要的成本及资源浪费。因此，如何提高从原料到产物的碳转化率，乃本领域亟待解决的一大课题。一解决此一课题的手段为，进一步选育及改良用于发酵反应的微生物菌种，以突破微生物遗传特性的限制，进一步重建代谢途径、抑制代谢叉路、或增强主要产物合成方向的代谢通量，从而提高从原料到产物之间的碳转化率。

本发明即是针对前述需求所为的研发成果，本案发明人经戮力研究而完成一种可用以制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，由此方法所提供的微生物，除可进行发酵反应以生成有机化合物，更可固定发酵反应中所释放的碳氧化物，将其重新纳入发酵反应的步骤中，从而更有效利用碳源、减少不必要的碳源损失，甚至可达到接近零碳损失的需求。

发明内容

本发明的一目的，在于提供一种制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，其包含：

(a)提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；

(b)提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；

(c)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体(protoplast)及第二原生质体；

(d)使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及

(e)培养该融合菌株并进行筛选，以获得一标的菌株(targetstrain)。

本发明的另一目的，在于提供一种以上述方法所获得的标的菌株。

本发明的又一目的，在于提供一种使用上述标的菌株于生成有机化合物的方法，其包含于一厌氧氛围下，将该标的菌株与一含醣基质混合，以进行发酵反应。较佳地，该方法更包含于发酵反应中使用一共基质(co-substrate)。

本发明的再一目的，在于提供一种酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)菌株ITRI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32077。

本发明的再一目的，在于提供一种制备上述的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的方法，其包含：

(a)提供一第一亲代菌株，其为将达梭菌(Clostridiumljungdahlii)且具有固定碳氧化物的能力；

(b)提供一第二亲代菌株，其为酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)且具有进行发酵反应的能力；

(c)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质体；

(d)使该第一原生质体与第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及

(e)培养该融合菌株并进行筛选，以获得酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32077。

本发明的又再一目的，在于提供一种使用上述的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于生成有机化合物的方法，其包含于一厌氧氛围下，将该酪丁酸梭菌菌株ITRI02001与一含醣基质混合，以进行发酵反应。较佳地，该方法更包含于发酵反应中使用一共基质。

本发明的详细技术内容及部分具体实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明之特征。

附图说明

图1所示为将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535以及一根据本发明的微生物，分别培养于CGM培养基、mPETC培养基、及mRCM培养基三种不同培养基的产气情形；

图2A显示，于一厌氧氛围下，将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，培养于mRCM培养基(含10公克/升之葡萄糖)中，并于不同时间点所测得的OD₆₀₀数值的曲线图；

图2B显示，于一厌氧氛围下，将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，培养于mRCM培养基(含10公克/升之葡萄糖)中以进行发酵反应，并测量不同时间点所生成的丁酸产量的曲线图；以及

图3显示本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于不同的酸性环境(pH5.0、pH5.5、pH6.0)下培养的乙酸代谢率的直条图。

具体实施方式

以下将描述根据本发明的部分具体实施态样；但是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述者。此外，除非文中有另外说明，于本说明书中(尤其是在后述专利申请范围中)所使用的“一”、“该”及类似用语应理解为包含单数及复数形式。另，本文所使用的“约”、“大约”或“近乎”等词，实质上代表与所述的数值相差在20％以内者，较佳在10％以内者，且更佳在5％以内者。此外，于本发明中，所谓的“微生物”是指肉眼无法看见的生物体(例如：细菌、真菌)，其可包括于自然界中自然存在的野生型(wildtype)，以及因任何因素(天然或人为)所产生的突变型(mutant)。所谓“碳氧化物”是指一氧化碳、二氧化碳、或其组合。另，除非明确限定，否则于本说明书中所述的醣类与有机化合物，包含其所有异构物型式，包括，但不限于镜像异构物(enantiomer)、非镜像异构物(diastereomer)及构形异构物(conformationalisomer)。

于本说明书中，所谓“碳转化率”是指在发酵反应中，所生成的有机化合物的总碳数与所消耗碳源的总碳数的比值，以如下式1进行计算。

式1：

本发明是提供一种制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，其包含：

(a)提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；

(b)提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；

(c)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质体；

(d)使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及

(e)培养该融合菌株并进行筛选，以获得一标的菌株。

根据本发明方法，作为步骤(a)的第一亲代菌株可以是任何具有固定碳氧化物能力的微生物。所谓“固定碳氧化物”是指借助生物化学反应将碳氧化物转化为有机化合物的过程，举例言之，已知自然界中有许多微生物可利用Wood-Ljungdahl(WL)路径来固定其生存环境中的碳氧化物，并将碳氧化物转化成乙酰-辅酶A。

可利用WoodLjungdahl(WL)路径以固定碳氧化物的菌株包括，但不限于，将达梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、食氧化碳梭菌(Clostridiumcarboxidivorans)、困难梭菌(Clostridiumdifficile)、醋酸梭菌(Clostridiumaceticum)、热乙酸莫尔氏菌(Moorellathermoacetica，原为热乙酸梭菌(Clostridiumthermoaceticum))、嗜热自营甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、自营脱硫杆菌(Desulfobacteriumautotrophicum)、斯蒂克兰德氏梭菌(Clostridiumsticklandii)、嗜热自营梭菌(Clostridiumthermoautotrophicum)、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、大梭菌(Clostridiummagnum)、甲醇醋酸杆菌(Acetobacteriumcarbinolicum)、凯伍醋酸杆菌(Acetobacteriumkivui)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacteriumwoodii)、瘤胃聚乙酸菌(Acetitomaculumruminis)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobiumnoterae)、以及拜氏醋酸杆菌(Acetobacteriumbakii)。

可于本发明方法的步骤(a)中使用前述可利用WoodLjungdahl(WL)路径以固定碳氧化物的菌株以作为第一亲代菌株。于本发明一具体实施态样中，于步骤(a)中使用将达梭菌(Clostridiumljungdahlii)作为第一亲代菌株。

根据本发明方法，作为步骤(b)的第二亲代菌株可以是任何具有进行发酵反应能力的微生物。所谓“发酵反应”是指微生物代谢一或多种物质以产生有机化合物的过程。举例言之，适用为本发明方法步骤(b)的第二亲代菌株的例子包括，但不限于，梭菌属(Clostridiumsp.)菌株、安爱罗斯代普布替雷熙克菌(Anaerostipesbutyraticus)、粪厌氧棒状菌(Anaerostipescaccae)、安爱罗斯代普菌属(Anaerostipessp.)、穗状丁酸弧菌(Butyrivibriocrossotus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、亨氏丁酸弧菌(Butyrivibriohungatei)、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、梭菌属(Clostridialessp.)、粪球菌ART55/1(CoprococcusART55/1)、灵巧粪球菌(Coprococcuscatus)、陪伴粪球菌(Coprococcuscomes)、一致粪球菌(Coprococcuseutactus)、两形真杆菌(Eubacteriumbiforme)、溶纤维真杆菌(Eubacteriumcellulosolvens)、细长真杆菌(Eubacteriumdolichum)、庞大真杆菌(Eubacteriumhadrum)、霍氏真杆菌(Eubacteriumhallii)、L2-7真杆菌(EubacteriumL2-7)、粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、氧化还原真杆菌(Eubacteriumoxidoreducens)、细枝真杆菌(Eubacteriumramulus)、直肠真杆菌(Eubacteriumrectale)、口臭真杆菌(Eubacteriumsaburreum)、A2-194真杆菌(EubacteriumA2-194)、凸腹真杆菌(Eubacteriumventriosum)、毛螺科菌(Lachnospiraceaebacterium)、毛螺科菌属(Lachnospiraceaesp.)、莫亚拉产吲哚菌(Moryellaindoligenes)、少食八迭球菌(Parasporobacteriumpaucivorans)、瘤胃假丁酸弧菌(Pseudobutyrivibrioruminis)、伪丁酸撒拉尼罗拉菌(Pseudobutyrivibrioxylanivorans)、盲肠罗斯氏菌(Roseburiacecicola)、粪便罗斯拜瑞氏菌(Roseburiafaecis)、罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)、罗斯氏肠菌(Roseburiaintestinalis)、罗斯氏尹琳妮佛伦菌(Roseburiainulinivorans)、孢子细菌树紫苑菌(Sporobacteriumolearium)、安黑罗克斯阿克踏利斯菌(Anerococcusoctavius)、不解糖嗜胨菌(Peptoniphilusasaccharolyticus)、蛋白胨菌(Peptoniphilus)、杜尔丹尼菌(duerdenii)、蛋白胨哈雷菌(Peptoniphilusharei)、蛋白胨泪菌(Peptoniphiluslacrimalis)、吲哚嗜胨菌(Peptoniphilusindolicus)、弗消化链球菌艾弗嗜胨菌(Peptoniphilusivorii)、嗜胨菌属(Peptoniphilussp.)、赛德门特巴克特海卓斯班卓依克菌(Sedimentibacterhydroxybenzoicus)、优杆欧都例牡藤菌(Anaerovoraxodorimutans)、产线龈沟菌(Filifactoralocis)、巴克氏真杆菌(Eubacteriumbarkeri)、骄弱真杆菌(Eubacteriuminfirmum)、细小真杆菌(Eubacteriumminutum)、缠结优杆菌(Eubacteriumnodatum)、沟迹优杆菌(Eubacteriumsulci)、念珠状真杆菌(Eubacteriummoniliforme)、黄单胞菌科(llyobacterdelafieldii)、草酸杆菌属(Oxobacterpfenningii)、最大八叠球菌(Sarcinamaxima)、速生热分枝菌(Thermobrachiumcelere)、布替利西柯普利卡柯伦菌(Butyricicoccuspullicaecorum)、A2-207真杆菌(EubacteriumA2-207)、甲酸芽殖菌(Gemmigerformicilis)、厌氧棒移动菌(Anaerobaculummobile)、巴罗斯波拉咕鲁踏里咖菌(Pelosporaglutarica)、噬热杨斯安斯菌(Thermoanaerobacteryonseiensis)、圆柱状真杆菌(Eubacteriumcylindroides)、隐藏真杆菌(Eubacteriumsaphenum)、多曲真杆菌(Eubacteriumtortuosum)、尤氏真杆菌舒蒂卡亚种(Eubacteriumyuriimargaretiae)、厌氧消化球菌(Peptococcusanaerobius)、黑色消化球菌(Peptococcusniger)、芽孢肠状菌属(Sporotomaculumhydroxybenzoicum)、胺基酸球肠菌(Acidaminococcusintestini)、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcusfermentans)、氨基酸球菌属(Acidaminococcussp.)、埃氏巨球形菌(Megasphaeraelsdenii)、马加斯福利亚基摩斯菌(Megasphaeragenomosp)、巨球形菌(Megasphaeramicronuciformis)、哈拉阿罗比撒喀哩提克菌(Halanaerobiumsaccharolyticum)、巴罗拉哈斯巴拉伊特米迪亚菌(Brachyspiraintermedia)、雏禽短螺旋体(Brachyspiraalvinipulli)、徐特沃斯压斯阿特里额斯菌(Shuttleworthiasatelles)、产氢厌氧球菌(Anaerococcushydrogenalis)、解乳厌氧球菌(Anaerococcuslactolyticus)、普氏厌氧球菌(Anaerococcusprevotii)、四联厌氧球菌(Anaerococcustetradius)、***厌氧球菌(Anaerococcusvaginalis)、嗜碱菌(Alkaliphilusmetalliredigens)、阿克阿里福里额斯菌(Alkaliphilusoremlandii)、黑罗福斯提斯斯特克里猴米尼斯菌(Anaerofustisstercorihominis)、蒲斯瑞德拉米巴克德阿拉克特里克斯菌(Pseudoramibacteralactolyticus)、黑罗特克斯欧里何米尼斯菌(Anaerotruncuscolihominis)、法克里巴克替利亚cf.普阿斯奈特伊菌(Faecalibacteriumcf.prausnitzii)、法克里巴克替利亚普阿斯奈特伊菌(Faecalibacteriumprausnitzii)、鲁米弄克咖西贝克替李亚菌(Ruminococcaceaebacterium)、斯伯特里居里恩法里阿伯菌(Subdoligranulumvariabile)、斯模安罗阿罗贝特替里亚斯模萨哈罗莉替克菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)、卡巴斯基滴不拉清佩西福克菌(Carboxydibrachiumpacificum)、卡巴斯基豆特门斯哈卓基弄福门斯菌(Carboxydothermushydrogenoformans)、腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobactertengcongensis)、利热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterwiegelii)、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceaebacterium)、肉食杆菌属(Carnobacteriumsp.)、迪门斯波拉菌属(Desmosporasp.)、长醋丝菌(Acetonemalongum)、斯模系尼额斯卡巴斯基黛福伦斯菌(Thermosinuscarboxydivorans)、娜卓安罗碧娥斯安罗芙莉娥斯菌(Natranaerobiusthermophiles)、哈仑安罗毕恩普昂福伦(Halanaerobiumpraevalens)、斯拜尔贝特替里亚安罗芙莉伦菌(Symbiobacteriumthermophilum)、斯达克福昂德替里亚那萨尔斯菌(Stackebrandtianassauensis)、英特尔斯波郎吉因克福恩菌(Intrasporangiumcalvum)、两面神菌菌属(Janibactersp.)、橙黄小单孢菌(Micromonosporaaurantiaca)、小单孢菌属(Micromonosporasp.)、海洋放线菌(Salinisporaarenicola)、撒利尼斯波拉特皮卡菌(Salinisporatropica)、福如克西波拉玛莉丝菌(Verrucosisporamaris)、克里贝拉福拉替达菌(Kribbellaflavida)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceaebacterium)、类诺卡氏菌科属(Nocardioidessp.)、弯曲热单孢菌(Thermomonosporacurvata)、会缩嗜盐原体(Haloplasmacontractile)、印度脱硫元螺菌(Desulfurispirillumindicum)、脱铁杆菌属(Deferribacterdesulfuricans)、铁还原红螺菌(Rhodoferaxferrireducens)、及橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)。

较佳地，于步骤(b)中提供一种可利用丙酮-丁醇-乙醇(acetone-butanol-ethanol，ABE)路径进行发酵反应的菌株，以作为第二亲代菌株。该可利用ABE路径以进行发酵反应之菌株的例子包括，但不限于，酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)、酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)、嗜热酪丁酸梭菌(Clostridiumthermobutyricum)、食纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)、解多醣梭菌(Clostridiumpolysaccharolyticum)、普鲁契氏梭菌(Clostridiumpopuleti)、氨基丁酸梭菌(Clostridiumaminobutyricum)、球孢梭菌(Clostridiumsporosphaeroides)、无害梭菌(Clostridiuminnocuum)以及克氏梭菌(Clostridiumkluyveri)。于本发明一具体实施态样中，于步骤(b)中提供酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)作为第二亲代菌株。

其后，于步骤(c)将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质体。其中，将第一亲代菌株与第二亲代菌株分别培养于合适的培养基中，可培养到对数生长期，再将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质体。

可使用任何合宜的培养基以培养第一亲代菌株及第二亲代菌株，只要该培养基与所欲培养的菌株对应即可。视所选用的菌株以调整所采用的培养基组成，一般而言，可于培养基中包含例如，碳源(葡萄糖、琥珀酸等)、氮源(酵母萃取物、蛋白胨等)、盐类(镁盐、氮盐、磷盐、硫盐等)、以及水等成分。举例而言，当用以培养将达梭菌及/或酪丁酸梭菌时，该培养基的例子包括，但不限于，RCM培养基(ReinforcedClostridialMedium)、mRCM培养基(modifiedReinforcedClostridialMedium)、CGM培养基(ClostridialGrowthMedium)、mCGM培养基(modifiedClostridialGrowthMedium)、PETC培养基、以及mPETC培养基。

可分别于第一亲代菌株与第二亲代菌株进入对数生长期之后，对该菌株进行处理，以提供对应的原生质体，但不限于此。所谓菌株进入对数生长期，是指该菌株已适应环境，且培养基中的养分充足，可供该菌株大量繁殖，故菌数呈对数增加。而所谓“原生质体”，是指利用机械法或酵素法去除细胞壁的细胞。可采用任何合宜的方法以提供第一亲代菌株与第二亲代菌株的原生质体(此可参见例如：GenomeShufflingofClostridiumacetobytylicumCICC8012forimprovedproductionofacetone-butanol-ethanol(ABE).CurrMicrobiol.(2012)65:128-132)，该文献全文并于此处以供参考)。举例言之，可用以去除细胞壁的方法包括，但不限于，例如离心、振荡、超音波、电穿孔、及高渗透压的物理方法，以及例如酵素法的化学方法。

于本发明的部分实施态样中，是以酵素法去除第一亲代菌株及第二亲代菌株的细胞壁，以获得第一原生质体及第二原生质体，其中，可使用的酵素包括，但不限于，选自以下群组的至少一种：溶菌酶、蜗牛酶、消解酶、纤维素酶。视所选用的第一亲代菌株及第二亲代菌株的种类，而调整合宜的酵素浓度、作用温度、以及作用时间，以进行该酵素法。一般而言，酵素浓度越高，作用时间越长，则原生质体的制备率就越高，但过长的作用时间可能会影响原生质体的再生率。

于根据本发明的部分具体实施态样中，于步骤(c)使用溶菌酶，以去除第一亲代菌株及第二亲代菌株的细胞壁，提供对应的原生质体。其中，当以将达梭菌为第一亲代菌株，且以酪丁酸梭菌为第二亲代菌株时，可以于37℃，使用约1毫克/毫升的溶菌酶历时15分钟至2小时以去除将达梭菌的细胞壁，获得第一原生质体，且使用约50微克/毫升的溶菌酶历时15分钟至2小时以去除酪丁酸梭菌的细胞壁，获得第二原生质体。

于根据本发明方法的步骤(d)中，使由步骤(c)获得的第一原生质体和第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株。所谓「融合」是指二原生质体突破细胞膜的限制，结合成一个细胞，使二者内容物混合，促使其中的基因体(genome)进行基因体重组(genomeshuffling)的过程。可采用任何合宜的融合方法以进行步骤(d)。举例言之，但不以此为限，该融合方法可为化学方法(例如：聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)法)、物理方法(例如：电融合法、激光诱导融合法)、或生物方法(例如：病毒诱导融合法)。

以使用化学方法进行融合为例，可使用一含有聚乙二醇的诱导溶液，使第一原生质体和第二原生质体进行融合。其中，该聚乙二醇的例子包括，但不限于，PEG200、PEG1000、PEG1450、PEG1500、PEG2000、PEG3000、PEG3350、PEG4000、PEG6000、PEG8000、PEG10000。于本发明一具体实施态样中，是以含有30％PEG6000和0.05摩尔/升CaCl₂的高渗透压SMM溶液使第一原生质体和第二原生质体进行诱导融合，历时大约5至30分钟而完成融合。

于完成第一原生质体和第二原生质体的融合以后，得到经融合的菌体，再进一步培养该融合菌体，以提供融合菌株。之后，于步骤(e)对步骤(d)所得到的融合菌株进行筛选，以得到标的菌株。

根据本发明方法步骤(e)，为提供可固定碳氧化物且可进行发酵反应的标的菌株，于培养基中培养步骤(d)所得到的融合菌株，观察并比较该等融合菌株于生长时的产气情形。此外，针对该等融合菌株进行发酵反应，并分析其发酵产物，以计算并比较各融合菌株进行发酵反应将原料生成为产物时的碳转化率。其后，基于前述比较结果，筛选所欲的标的菌株。

通过本发明上述方法，可以提供可固定碳氧化物且可进行发酵反应的标的菌株。因此，本发明亦提供一种以上述方法所获得的标的菌株，其同时具有第一亲代的固定碳氧化物的能力以及第二亲代的进行发酵反应的能力。举例言之，当步骤(a)的第一亲代菌株为将达梭菌(Clostridiumljungdahlii)，且步骤(b)的第二亲代菌株为酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)，通过本发明上述制备方法，可获得一酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)菌株ITRI02001。因此，本发明亦提供一种酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，其寄存于德国国家菌种保藏中心(DSMZ)，寄存编号为DSM32077。

由于本发明方法所提供的标的菌株同时具有固定碳氧化物的能力以及进行发酵反应的能力，故于进行发酵反应时，可更有效利用发酵反应***中的碳源。因此，本发明亦提供一种使用该标的菌株于生成有机化合物的方法，其中，依所使用第二亲代菌株的发酵能力，所得到的标的菌株可以通过发酵反应将碳源(例如：单醣、双醣、寡醣以及多醣之醣类)转化成不同的有机化合物，例如有机酸及/或醇，但不以此为限。

发酵反应是于一厌氧氛围下，将标的菌株与一含醣基质混合而进行。所谓“厌氧氛围”，系指氧气含量低于5ppm(partpermillion)，较佳低于0.5ppm，更佳低于0.1ppm的氛围。举例言之，但不以此为限，可于发酵反应进行之前，先于发酵反应器中通入惰性的气体(例如：氮气或二氧化碳)且进行曝气，以排出存在于该反应器中的空气，提供所欲的厌氧氛围；或者，于厌氧操作箱中进行发酵反应，厌氧操作箱是采用钯催化剂将密闭箱体内的氧气与厌氧混合气体中的氢气催化生成水，从而提供所欲的厌氧氛围。

一般而言，可于根据本发明的生成有机化合物的方法中使用任何合宜的碳化合物作为基质(substrate)，与培养基混合后进行发酵反应。举例言之，可提供含有醣类的基质(简称“含醣基质”)，该醣类的例子包括，但不限于，单醣(例如：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、***糖(arabinose)、来苏糖(lyxose)、核糖(ribose)、木糖(xylose)、核酮糖(ribulose)、木酮糖(xylulose)、阿洛糖(allose)、阿卓糖(altrose)、古洛糖(gulose)、艾杜糖(idose)、塔罗糖(talose)、阿洛酮糖(psicose)、山梨糖(sorbose)、塔格糖(tagatose))；双醣(例如：蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、乳糖(lactose)、乳酮糖(lactulose)、海藻糖(trehalose)、纤维二糖(cellobiose))；寡糖(例如：水苏糖(stachyose)、麦芽三糖(maltotriose)、麦芽四糖(maltotetrose)、麦芽五糖(maltopentaose))；以及多醣(例如：淀粉、纤维素、肝糖、环糊精(cyclodextrin)、***聚糖(arabinoxylans)、关华豆胶(guargum)、***胶(gumarabic)、几丁质(chitin)、树胶(gum)、海藻酸盐(alginate)、果胶(pectin)、结冷胶(gellan))。或者，可提供含有有机酸、有机酸盐或有机酸酯(例如：苹果酸(malicacid)、柠檬酸(citricacid)、琥珀酸(succinicacid)、乳酸(lacticacid)、乙酸(aceticacid)、甲酸(formicacid)、脂肪酸、不饱和脂肪酸、胺基酸以及谷胺酸(glutamicacid))的基质、含有其他碳化合物(例如：二氧化碳、碳酸盐、低碳醇、烷烃)的基质。较佳地，于本发明的生成有机化合物的方法中所使用的含醣基质是含有单醣。于本发明一具体实施态样中，使用含有葡萄糖的基质，以提供发酵反应所需的碳源。

视需要地，可于基质中掺混一共基质(co-substrate)，以提供标的菌株进行发酵反应时的额外碳源，进一步提高有机化合物的产量。该共基质可为任何合宜的碳化合物，只要对该标的菌株或发酵反应的进行没有不利的影响即可。举例言之，可作为该共基质的碳化合物的例子包括，但不限于，乙酸(aceticacid)、甘油(glycerol)、合成气(syngas)、或其组合。于本发明一具体实施态样中，共基质的用量不超过含醣基质中的醣类含量，举例言之，当采用含醣基质，并以乙酸或甘油作为共基质时，所提供的混合基质中的共基质含量为每份醣类大约0.1至1份共基质。

于本发明一具体实施态样中，是以葡萄糖为含醣基质中的醣类，乙酸为共基质，以提供一混合基质，供应发酵反应所须的碳源，其中葡萄糖与乙酸的含量(重量)比为大约5:2(葡萄糖：乙酸)。

当以本发明所提供的酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)菌株ITRI02001进行发酵反应以产生丁酸时，可于含有葡萄糖的基质中，添加乙酸作为共基质以提供额外的碳源，在厌氧氛围中进行该发酵反应。其中，经发现，于pH值不大于7的环境下进行该发酵反应可达到较佳的乙酸代谢率(metabolicrate)，且较佳是于pH值为约5.0至约7.0、更佳是于pH值为约5.0至约6.5的微酸性环境进行该发酵反应，尤其以pH值为约5.0至5.5为佳。于本发明一具体实施态样中，使用乙酸为共基质，以于葡萄糖之外提供额外的碳源，并于pH值约5.0的酸性环境下进行发酵反应，其乙酸代谢率高达约83％。

于本发明另一具体实施态样中，是以合成气作为共基质以提供标的菌株进行发酵反应的额外碳源。其中，该合成气是一含有氢气与碳氧化物(例如：一氧化碳、二氧化碳)的混合气体。举例言之，可以使用由二氧化碳与氢气以体积比为1：4(二氧化碳：氢气)所提供的合成气作为共基质。

于本发明的生成有机化合物的方法中，基质、共基质与标的菌株的混合顺序并无特殊限制。可于发酵反应开始之前或发酵反应进行过程中，视需要一次性地或多次分批地添加基质及/或共基质，且可视需要补充标的菌株。例如，可于发酵反应进行前，即一次性地将含醣基质与共基质与标的菌株混合；也可将含醣基质及/或共基质分为等量或不等量的二或多批，于发酵反应开始之前或发酵反应进行过程中，分批加入发酵反应器中。

视所使用的第二亲代菌株的发酵能力，本发明可提供具不同发酵能力的标的菌株，其可用以提供不同的有机化合物作为发酵产物。举例言之，该有机化合物的例子包括，但不限于，有机酸及/或醇。较佳地，该有机化合物是C1-C4的有机酸及/或C1-C4的醇；更佳地，该有机化合物是选自以下群组的至少一种：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、乙醇、异丙醇、及丁醇。于本发明一具体实施态样中，该有机化合物是丁酸。如后附实施例所示，当使用本发明的生成有机化合物的方法，可达大于67％的碳转化率。

兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。本发明保护范围系如权利要求的范围所示。

实施例

于以下实施例中，所使用物料的组成或来源分别如下：

(a)mRCM培养基(酵母萃取物：3公克/升，肉萃取物：10公克/升，蛋白胨：5公克/升，氯化钠：5公克/升，乙酸钠：5公克/升，L-半胱胺酸(L-cysteinium)：0.5公克/升)。

(b)SMM溶液(蔗糖：0.5毫摩尔浓度；马来酸：20毫摩尔浓度；氯化镁：20毫摩尔浓度；pH＝6.5)。

(c)SMM诱导融合溶液(SMM溶液再添加30％PEG6000和氯化钙0.05摩尔浓度)。

(d)CGM培养基(酵母萃取物：5公克/升，蛋白胨：5公克/升，硫酸铵((NH₄)₂SO₄)：3公克/升，磷酸氢二钾(K₂HPO₄)：1.5公克/升，含水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)：0.6公克/升，含水硫酸铁(FeSO₄·7H₂O)：0.03公克/升，L-半胱胺酸(L-cysteinium)：0.5公克/升)。

(e)CGM琼脂平板培养基(CGM培养基再添加D(+)葡萄糖：10公克/升，琼脂：15公克/升。)

(f)mPETC培养基(请参照台湾专利公开号201441366)。

(g)再生培养基(mRCM培养基再添加D(+)葡萄糖：10公克/升，蔗糖：0.5摩尔浓度；氯化镁：25毫摩尔浓度；氯化钙：25毫摩尔浓度，L-半胱胺酸(L-cysteinium)：0.5公克/升)。

(h)再生培养基琼脂平板(再生培养基再添加酪蛋白水解物(caseinhydrolysate)：10公克/升，琼脂：15公克/升)。

于以下实施例中，所使用之气密容器(例如气密瓶、离心管)系以如下操作进行准备，提供厌氧氛围。将气密容器与橡胶塞以铝箔包覆，并以高温高压(121℃，1.2大气压)灭菌，确保不会受其他微生物的干扰。于气密容器完成灭菌后，以烘箱去除外部残余水气，防止残余水气于操作时造成微生物污染。经由厌氧操作箱附属的传递箱，将烘干的气密容器送入厌氧操作箱内，稍微松开封口的铝箔后，以厌氧操作设备内附属的钯催化剂(购自Thermoscientific公司，产品编号：BR0042)将气密容器中的氧气去除，以提供上述的厌氧氛围(即，使氧气含量低于0.5ppm)。

实施例1：融合菌株之制备

(1-1)选取亲代菌株

选取可固定二氧化碳的将达梭菌(Clostridiumljungdahlii)菌株BCRC17797以及可进行发酵反应以生成有机酸的酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)菌株BCRC14535作为亲代菌株。

(1-2)制备原生质体

混合葡萄糖与mRCM培养基，以提供葡萄糖浓度为10公克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，其后，于二经除氧的离心管中分别注入40毫升经除氧的混合培养基。接着，将(1-1)所选取的二亲代菌株分别接种于该离心管的混合培养基中，并于37℃的厌氧培养箱中培养，直到将达梭菌生长至OD₆₀₀(波长为600纳米时的吸光度值)为约0.8、酪丁酸梭菌生长至OD₆₀₀约1.5(即，该二亲代菌株皆生长至对数生长中期)。收集该二菌株之菌液，分别以每分钟5000转的速度离心该菌液，获得二不溶物。

分别对该二不溶物进行如下操作：以40毫升的SMM溶液清洗不溶物，重复两次，再将不溶物重新回溶于10毫升的SMM溶液中。

然后，于该含有不溶物的SMM溶液中添加溶菌酶，使溶菌酶于含有将达梭菌以及酪丁酸梭菌的SMM溶液中的最终浓度分别为1毫克/毫升及50微克/毫升，置于37℃的环境下历时约15分钟至约2小时。最后，以显微镜观察确认已生成将达梭菌以及酪丁酸梭菌的原生质体。

(1-3)提供融合菌株

于室温下，将上述(1-2)所得到的二原生质体以等体积混合，于原生质体混合液中加入SMM诱导融合溶液(原生质体混合液体积：SMM诱导融合溶液＝1：10)，以诱导该二原生质体进行融合，历时约5至30分钟，获得一经融合的原生质体。

以SMM溶液清洗该经融合的原生质体，重复两次，其后，将该经融合的原生质体悬浮于含有10公克/升之葡萄糖的再生培养基(此培养基系经除氧，且盛装于一经除氧的离心管中)中，并静置于37℃的厌氧培养箱中培养历时约3至7小时，接着，以每分钟4500转的速度进行离心，获得一不溶物。然后，将此不溶物重新回溶于再生培养基中，并涂于再生培养基琼脂平板上，于37℃的厌氧培养箱中培养历时约48至约72小时，生成不同的菌落(即，获得融合菌株)。

(1-4)培养并筛选出标的菌株

将(1-3)所获得的不同菌落的融合菌株及上述的酪丁酸梭菌菌株BCRC14535分别接种于含10公克/升的葡萄糖的CGM培养基、含10公克/升的葡萄糖的mPETC培养基及含10公克/升的葡萄糖的mRCM培养基三种培养基中(该等培养基皆经除氧，且盛装于经除氧的50毫升离心管中)，置于37℃的厌氧培养箱中培养，待生长至对数生长中期(即，OD₆₀₀为约1.5)时，观察各组菌株的产气情形，并筛选出产气量明显少于酪丁酸梭菌菌株BCRC14535的融合菌株(如图1所示)，以获得一标的菌株。

对该标的菌株进行基因族谱分析(phylogeneticanalysis)，确认该标的菌株具有由SEQIDNO:1所示的部分16S核醣体核醣核酸(16SrRNA)片段。经比对，该SEQIDNO:1是与酪丁酸梭菌菌株BCRC14535的16S核醣体核醣核酸(16SrRNA)片段具有约99％以上的相似度，故确认该标的菌株为酪丁酸梭菌，命名为ITRI02001。其中，该酪丁酸梭菌菌株ITRI02001经培养于CGM琼脂平板培养基后，所形成的菌落外观呈棕黄色，且中心微微凸起，边缘不规则的外形。

实施例2：测试酪丁酸梭菌菌株ITRI02001与酪丁酸梭菌菌株BCRC14535的生理特性

混合葡萄糖与mRCM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10公克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，供后续使用。

于二50毫升离心管中分别注入40毫升的前述经除氧的混合培养基。接着，将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001分别接种于前述混合培养基中，置于37℃的厌氧培养箱中培养。待菌株生长至对数生长期中期时(即，酪丁酸梭菌菌株BCRC14535及酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的OD₆₀₀分别为约1.5时)，将该二菌株的菌液以1：200(菌液：mRCM培养基)的体积比例，分别稀释于装有150毫升经除氧的混合培养基的二气密瓶中，并于37℃的厌氧培养箱中进行培养。培养过程中，于不同的时间点测量OD₆₀₀的数值，以分析酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的生长情形，同时，以Agilent1100系列高效能液相层析仪(highperformanceliquidchromatography，HPLC)与AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述培养基中的有机化合物的成分与葡萄糖的含量。分析结果示于图2A及图2B。

由图2A可知，于相同的培养条件下，酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的生长速率并不相同。此结果显示，经原生质体融合所得的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001是不同于其亲代酪丁酸梭菌菌株BCRC14535。

另一方面，由图2B可知，于相同的培养条件下培养约35小时，相较于酪丁酸梭菌菌株BCRC14535，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001所产生的丁酸产量明显较高。此结果显示，相较于酪丁酸梭菌菌株BCRC14535，于相同的培养条件下，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001具有较佳的丁酸生成效益，此再次说明，该二菌株具有不同的生理特性，为不同的菌株。

实施例3：测试酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于生成有机化合物的效益

(3-1)酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与ITRI02001的碳转化率比较

混合葡萄糖与mRCM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10公克/升且乙酸浓度为4公克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，供后续使用。

于二50毫升离心管中分别注入40毫升的前述经除氧的混合培养基。接着，将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001分别接种于前述的混合培养基中，并培养于37℃的厌氧培养箱中，进行发酵反应，历时48小时。接着，以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述培养基中葡萄糖、乙酸以及丁酸的含量，结果示于表1。另以式2计算其碳转化率，结果亦示于表1。

式2：

表1

由表1可知，于含有葡萄糖与乙酸的mRCM培养基中，酪丁酸梭菌菌株BCRC14535不仅不会消耗乙酸，反而会多生成乙酸，且经式2计算，酪丁酸梭菌菌株BCRC14535所提供的碳转化率仅约67％。另一方面，于相同的培养条件下，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001可利用乙酸，并做为进行发酵反应的额外碳源，生成更大量的丁酸，且经式2计算，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001所提供的碳转化率约85％。前述结果显示，本发明酪丁酸梭菌菌株ITRI02001可利用乙酸做为共基质，进一步生成更大量的丁酸，提供较佳的碳转化率。

(3-2)酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于不同pH值下的乙酸代谢率

重复实施例(3-1)的步骤，但于培养酪丁酸梭菌菌株ITRI02001之前，先通过添加MES缓冲液(购自Sigma-Aldrich)：200毫摩尔浓度与氢氧化钠溶液以调整所使用的混合培养基的pH值至分别为5.0、5.5、以及6.0，以比较酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于不同pH值环境下的乙酸代谢率，结果示于图3。

由图3可知，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于pH值不大于7的环境下进行发酵反应可达到优良的乙酸代谢率，且代谢率随着pH值的下降而提升。其中，于pH值分别为6.0、5.5、以及5.0的培养条件下，乙酸代谢率分别为约55％、约74％以及约83％。

(3-3)酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于不同气体氛围下的碳转化率

混合葡萄糖与mRCM培养基，以提供一葡萄糖浓度为5公克/升且乙酸浓度为4公克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，供后续使用。

于二50毫升离心管中分别注入40毫升之前述经除氧的混合培养基。将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001分别接种于前述经除氧的混合培养基中，同时额外通入每平方英吋20磅(20psi)的合成气(20％二氧化碳，80％氢气)，以进一步提供一气体共基质(称为“通入合成气”实验组)。接着，于37℃的厌氧培养箱中进行发酵反应，历时48小时。以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述培养基中之葡萄糖、乙酸以及丁酸的含量，且以式2计算碳转化率，结果均示于表2。

重复前述实验，但未于经除氧的混合培养基中额外通入任何气体，此为“未额外通气”的控制组。另，同样地重复实验，但改于经除氧的混合培养基中额外通入每平方英吋20磅的氮气(即，以氮气取代合成气)，此为“通入氮气”的对照组。控制组与对照组的结果亦示于表2。

表2

由表2可知，相较于“未额外通气”控制组之酪丁酸梭菌菌株BCRC14535，“通入合成气”实验组之酪丁酸梭菌菌株BCRC14535的丁酸产量及丁酸碳转化率皆未有显著提升。相对地，相较于“未额外通气”控制组的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，“通入合成气”实验组之酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的丁酸产量及丁酸碳转化率皆明显提升。前述结果显示，不同于酪丁酸梭菌菌株BCRC14535的无法于发酵反应中利用合成气生成丁酸，本发明酪丁酸梭菌菌株ITRI02001则可有效利用合成气(二氧化碳与氢气)，生产更多的丁酸，提供较佳的丁酸碳转化率。

另一方面，相较于“未额外通气”控制组的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，“通入氮气”对照组的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的丁酸产量及丁酸碳转化率皆未有显著提升。前述结果确认，“通入合成气”实验组的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于丁酸产量及丁酸碳转化率的提升，并非单纯因为在较高气体压力下进行发酵反应，而是因为存在气体共基质(即，合成气)可提供额外的碳源，且酪丁酸梭菌菌株ITRI02001具有固碳能力，故能将合成气中的二氧化碳纳入发酵反应中(即，固定合成气中的二氧化碳)，以生产更多的丁酸，提供较佳的丁酸碳转化率。

(3-4)酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与ITRI02001的共基质代谢能力比较

混合葡萄糖、甘油、以及mCGM培养基，以提供一葡萄糖浓度为10公克/升、乙酸浓度为4公克/升、且甘油浓度为3公克/升的混合培养基，并对该混合培养基进行除氧，供后续使用。

于二50毫升离心管中分别注入40毫升的前述经除氧的混合培养基。接着，将酪丁酸梭菌菌株BCRC14535与酪丁酸梭菌菌株ITRI02001分别接种于前述之混合培养基中，并置于37℃的厌氧培养箱中，进行发酵反应，历时48小时。接着，以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述培养基中的葡萄糖、乙酸、甘油以及丁酸的含量，结果示于表3。

表3

由表3可知，于相同的培养条件下，酪丁酸梭菌菌株BCRC14535仅可代谢约0.78公克/升的乙酸以及约1.08公克/升的甘油，本发明酪丁酸梭菌菌株ITRI02001则可代谢约3.21公克/升的乙酸以及约3.0公克/升的甘油。前述结果显示，相较于亲代菌株，本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001具有较佳的乙酸及甘油代谢能力。

(3-5)酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的碳源代谢能力

分别以表4所示成分准备不同的混合培养基，并对混合培养基进行除氧，供后续使用。

分别于50毫升离心管中注入40毫升的前述经除氧的混合培养基，接着，分别于其中接种酪丁酸梭菌菌株ITRI02001，并置于37℃的厌氧培养箱中，进行发酵反应历时72小时。接着，以Agilent1100系列高效能液相层析仪搭配AminexHPX-87H(300mmx7.8mm)管柱分析前述各培养基中的葡萄糖、乙酸以及丁酸的含量，结果示于表5。

表4

表5

由表5可知，无论使用mRCM培养基或CGM培养基，在同时含有葡萄糖及乙酸的情况下(即，A组及C组)，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001皆可进行发酵反应，将葡萄糖及乙酸转化为丁酸。然而，在仅含有乙酸共基质的情况下(即，B组及D组)，乙酸消耗量以及丁酸产量皆明显较低。前述结果显示，在没有醣类碳源的情形下，酪丁酸梭菌菌株ITRI02001无法有效利用乙酸共基质，进行发酵反应生成丁酸。

综合以上实验结果，本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001可透过发酵反应而转化醣类碳源，生成大量的丁酸，其丁酸的碳转化率更是超过理论值(即，67％)。在不受理论限制的情形下，咸信是因酪丁酸梭菌菌株ITRI02001可以固定二氧化碳，且进一步将其转化为丁酸，更经济地将原料基质生成为所欲产物。此外，在以醣类作为碳源进行发酵反应时，本发明的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001更可以利用共基质(例如：乙酸、甘油、合成气)，生成更大量的有机化合物，提供更优异的碳转化率。

以上仅为本发明的较佳实施例，不得以此限定本发明实施的保护范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，仍属本发明的保护范围。

菌种保藏信息

保藏的生物材料：ITRI02001

保藏机构：德国国家菌种保藏中心DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH)

保藏编号：DSM32077

保藏日期：2015年6月26日

保藏机构地址：Inhoffenstraβe7B

38124Braunschweig

GERMANY。

Claims (27)

1.一种制备可固定碳氧化物且可进行发酵反应的微生物的方法，其特征在于，其包含：

（a）提供一第一亲代菌株，其具有固定碳氧化物的能力；

（b）提供一第二亲代菌株，其具有进行发酵反应的能力；

（c）将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体（protoplast）及第二原生质体；

（d）使该第一原生质体及第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及

（e）培养该融合菌株并进行筛选，以获得一标的菌株。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第一亲代菌株是利用WoodLjungdahl（WL）路径以固定碳氧化物的菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第一亲代菌株是选自以下的至少一种：将达梭菌（Clostridiumljungdahlii）、自产乙醇梭菌（Clostridiumautoethanogenum）、食氧化碳梭菌（Clostridiumcarboxidivorans）、困难梭菌（Clostridiumdifficile）、醋酸梭菌（Clostridiumaceticum）、热乙酸莫尔氏菌（Moorellathermoacetica，原为热乙酸梭菌（Clostridiumthermoaceticum））、嗜热自营甲烷杆菌（Methanobacteriumthermoautotrophicum）、自营脱硫杆菌（Desulfobacteriumautotrophicum）、斯蒂克兰德氏梭菌（Clostridiumsticklandii）、嗜热自营梭菌（Clostridiumthermoautotrophicum）、蚁酸醋酸梭菌（Clostridiumformicoaceticum）、大梭菌（Clostridiummagnum）、甲醇醋酸杆菌（Acetobacteriumcarbinolicum）、凯伍醋酸杆菌（Acetobacteriumkivui）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacteriumwoodii）、瘤胃聚乙酸菌（Acetitomaculumruminis）、潮湿厌氧醋菌（Acetoanaerobiumnoterae）、及拜氏醋酸杆菌（Acetobacteriumbakii）。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第一亲代菌株是将达梭菌（Clostridiumljungdahlii）。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第二亲代菌株是利用丙酮-丁醇-乙醇（acetone-butanol-ethanol，ABE）路径以进行发酵反应的菌株。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第二亲代菌株是选自以下的至少一种：梭菌属（Clostridiumsp.）菌株、安爱罗斯代普布替雷熙克菌（Anaerostipesbutyraticus）、粪厌氧棒状菌（Anaerostipescaccae）、安爱罗斯代普菌属（Anaerostipessp.）、穗状丁酸弧菌（Butyrivibriocrossotus）、溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibriofibrisolvens）、亨氏丁酸弧菌（Butyrivibriohungatei）、瘤胃溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrioproteoclasticus）、梭菌属（Clostridialessp.）、粪球菌ART55/1（CoprococcusART55/1）、灵巧粪球菌（Coprococcuscatus）、陪伴粪球菌（Coprococcuscomes）、一致粪球菌（Coprococcuseutactus）、两形真杆菌（Eubacteriumbiforme）、溶纤维真杆菌（Eubacteriumcellulosolvens）、细长真杆菌（Eubacteriumdolichum）、庞大真杆菌（Eubacteriumhadrum）、霍氏真杆菌（Eubacteriumhallii）、L2-7真杆菌（EubacteriumL2-7）、粘液真杆菌（Eubacteriumlimosum）、氧化还原真杆菌（Eubacteriumoxidoreducens）、细枝真杆菌（Eubacteriumramulus）、直肠真杆菌（Eubacteriumrectale）、口臭真杆菌（Eubacteriumsaburreum）、A2-194真杆菌（EubacteriumA2-194）、凸腹真杆菌（Eubacteriumventriosum）、毛螺科菌（Lachnospiraceaebacterium）、毛螺科菌属（Lachnospiraceaesp.）、莫亚拉产吲哚菌（Moryellaindoligenes）、少食八迭球菌（Parasporobacteriumpaucivorans）、瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrioruminis）、伪丁酸撒拉尼罗拉菌（Pseudobutyrivibrioxylanivorans）、盲肠罗斯氏菌（Roseburiacecicola）、粪便罗斯拜瑞氏菌（Roseburiafaecis）、罗斯拜瑞氏菌（Roseburiahominis）、罗斯氏肠菌（Roseburiaintestinalis）、罗斯氏尹琳妮佛伦菌（Roseburiainulinivorans）、孢子细菌树紫苑菌（Sporobacteriumolearium）、安黑罗克斯阿克踏利斯菌（Anerococcusoctavius）、不解糖嗜胨菌（Peptoniphilusasaccharolyticus）、蛋白胨菌（Peptoniphilus）杜尔丹尼菌（duerdenii）、蛋白胨哈雷菌（Peptoniphilusharei）、蛋白胨泪菌（Peptoniphiluslacrimalis）、吲哚嗜胨菌（Peptoniphilusindolicus）、弗消化链球菌艾弗嗜胨菌（Peptoniphilusivorii）、嗜胨菌属（Peptoniphilussp.）、赛德门特巴克特海卓斯班卓依克菌（Sedimentibacterhydroxybenzoicus）、优杆欧都例牡藤菌（Anaerovoraxodorimutans）、产线龈沟菌（Filifactoralocis）、巴克氏真杆菌（Eubacteriumbarkeri）、骄弱真杆菌（Eubacteriuminfirmum）、细小真杆菌（Eubacteriumminutum）、缠结优杆菌（Eubacteriumnodatum）、沟迹优杆菌（Eubacteriumsulci）、念珠状真杆菌（Eubacteriummoniliforme）、黄单胞菌科（llyobacterdelafieldii）、草酸杆菌属（Oxobacterpfenningii）、最大八叠球菌（Sarcinamaxima）、速生热分枝菌（Thermobrachiumcelere）、布替利西柯普利卡柯伦菌（Butyricicoccuspullicaecorum）、A2-207真杆菌（EubacteriumA2-207）、甲酸芽殖菌（Gemmigerformicilis）、厌氧棒移动菌（Anaerobaculummobile）、巴罗斯波拉咕鲁踏里咖菌（Pelosporaglutarica）、噬热杨斯安斯菌（Thermoanaerobacteryonseiensis）、圆柱状真杆菌（Eubacteriumcylindroides）、隐藏真杆菌（Eubacteriumsaphenum）、多曲真杆菌（Eubacteriumtortuosum）、尤氏真杆菌舒蒂卡亚种（Eubacteriumyuriimargaretiae）、厌氧消化球菌（Peptococcusanaerobius）、黑色消化球菌（Peptococcusniger）、芽孢肠状菌属（Sporotomaculumhydroxybenzoicum）、胺基酸球肠菌（Acidaminococcusintestini）、发酵氨基酸球菌（Acidaminococcusfermentans）、氨基酸球菌属（Acidaminococcussp.）、埃氏巨球形菌（Megasphaeraelsdenii）、马加斯福利亚基摩斯菌（Megasphaeragenomosp）、巨球形菌（Megasphaeramicronuciformis）、哈拉阿罗比撒喀哩提克菌（Halanaerobiumsaccharolyticum）、巴罗拉哈斯巴拉伊特米迪亚菌（Brachyspiraintermedia）、雏禽短螺旋体（Brachyspiraalvinipulli）、徐特沃斯压斯阿特里额斯菌（Shuttleworthiasatelles）、产氢厌氧球菌（Anaerococcushydrogenalis）、解乳厌氧球菌（Anaerococcuslactolyticus）、普氏厌氧球菌（Anaerococcusprevotii）、四联厌氧球菌（Anaerococcustetradius）、***厌氧球菌（Anaerococcusvaginalis）、嗜碱菌（Alkaliphilusmetalliredigens）、阿克阿里福里额斯菌（Alkaliphilusoremlandii）、黑罗福斯提斯斯特克里猴米尼斯菌（Anaerofustisstercorihominis）、蒲斯瑞德拉米巴克德阿拉克特里克斯菌（Pseudoramibacteralactolyticus）、黑罗特克斯欧里何米尼斯菌（Anaerotruncuscolihominis）、法克里巴克替利亚cf.普阿斯奈特伊菌（Faecalibacteriumcf.prausnitzii）、法克里巴克替利亚普阿斯奈特伊菌（Faecalibacteriumprausnitzii）、鲁米弄克咖西贝克替李亚菌（Ruminococcaceaebacterium）、斯伯特里居里恩法里阿伯菌（Subdoligranulumvariabile）、斯模安罗阿罗贝特替里亚斯模萨哈罗莉替克菌（Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum）、卡巴斯基滴不拉清佩西福克菌（Carboxydibrachiumpacificum）、卡巴斯基豆特门斯哈卓基弄福门斯菌（Carboxydothermushydrogenoformans）、腾冲嗜热厌氧菌（Thermoanaerobactertengcongensis）、利热厌氧杆菌（Thermoanaerobacterwiegelii）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceaebacterium）、肉食杆菌属（Carnobacteriumsp.）、迪门斯波拉菌属（Desmosporasp.）、长醋丝菌（Acetonemalongum）、斯模系尼额斯卡巴斯基黛福伦斯菌（Thermosinuscarboxydivorans）、娜卓安罗碧娥斯安罗芙莉娥斯菌（Natranaerobiusthermophiles）、哈仑安罗毕恩普昂福伦（Halanaerobiumpraevalens）、斯拜尔贝特替里亚安罗芙莉伦菌（Symbiobacteriumthermophilum）、斯达克福昂德替里亚那萨尔斯菌（Stackebrandtianassauensis）、英特尔斯波郎吉因克福恩菌（Intrasporangiumcalvum）、两面神菌菌属（Janibactersp.）、橙黄小单孢菌（Micromonosporaaurantiaca）、小单孢菌属（Micromonosporasp.）、海洋放线菌（Salinisporaarenicola）、撒利尼斯波拉特皮卡菌（Salinisporatropica）、福如克西波拉玛莉丝菌（Verrucosisporamaris）、克里贝拉福拉替达菌（Kribbellaflavida）、类诺卡氏菌科（Nocardioidaceaebacterium）、类诺卡氏菌科属（Nocardioidessp.）、弯曲热单孢菌（Thermomonosporacurvata）、会缩嗜盐原体（Haloplasmacontractile）、印度脱硫元螺菌（Desulfurispirillumindicum）、脱铁杆菌属（Deferribacterdesulfuricans）、铁还原红螺菌（Rhodoferaxferrireducens）、及橙色标桩菌（Stigmatellaaurantiaca）。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第二亲代菌株是选自以下的至少一种：酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）、酪酸梭菌（Clostridiumbutyricum）、嗜热酪丁酸梭菌（Clostridiumthermobutyricum）、食纤维梭菌（Clostridiumcellulovorans）、解多醣梭菌（Clostridiumpolysaccharolyticum）、普鲁契氏梭菌（Clostridiumpopuleti）、氨基丁酸梭菌（Clostridiumaminobutyricum）、球孢梭菌（Clostridiumsporosphaeroides）、无害梭菌（Clostridiuminnocuum）及克氏梭菌（Clostridiumkluyveri）。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该第二亲代菌株是酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）。

9.一种以如权利要求1至8中任一项所述的方法所获得的标的菌株。

10.一种使用如权利要求9所述的标的菌株于生成有机化合物的方法，其特征在于，其包含于一厌氧氛围下，将该标的菌株与一含醣基质混合，以进行发酵反应。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该有机化合物是有机酸及／或醇。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该有机化合物是选自以下群组的至少一种：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、乙醇、异丙醇、及丁醇。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该有机化合物是丁酸。

14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该含醣基质另掺混有一共基质（co-substrate），该共基质包含以下的至少一种：乙酸、甘油、及合成气。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该含醣基质与该共基质的重量比为10：1至1：1。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该共基质包含乙酸，且该发酵反应是于pH值约5.0至约7.0之间进行。

17.如权利要求10至16中任一项所述的方法，其特征在于，该发酵反应中的碳转化率高于67%。

18.一种酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）菌株ITRI02001，其特征在于，其寄存于德国国家菌种保藏中心（DSMZ），寄存编号为DSM32077。

19.一种制备如权利要求18所述的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001的方法，其特征在于，其包含：

（a）提供一第一亲代菌株，其为将达梭菌（Clostridiumljungdahlii）且具有固定碳氧化物的能力；

（b）提供一第二亲代菌株，其为酪丁酸梭菌（Clostridiumtyrobutyricum）且具有进行发酵反应的能力；

（c）将该第一亲代菌株及第二亲代菌株分别制备成第一原生质体及第二原生质体；

（d）使该第一原生质体与第二原生质体进行融合，以提供一融合菌株；以及

（e）培养该融合菌株并进行筛选，以获得酪丁酸梭菌菌株ITRI02001。

20.一种使用如权利要求18所述的酪丁酸梭菌菌株ITRI02001于生成有机化合物的方法，其特征在于，其包含于一厌氧氛围下，将该酪丁酸梭菌菌株ITRI02001与一含醣基质混合，以进行发酵反应。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该有机化合物是有机酸及／或醇。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该有机化合物是选自以下群组的至少一种：乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、乙醇、异丙醇、及丁醇。

23.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该有机化合物是丁酸。

24.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该含醣基质另掺混有一共基质（co-substrate），该共基质包含以下的至少一种：乙酸、甘油、及合成气。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，该含醣基质与该共基质的重量比为10：1至1：1。

26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，该共基质包含乙酸，且该发酵反应于pH值约5.0至约7.0之间进行。

27.如权利要求20至26中的任一项所述的方法，其特征在于，该发酵反应中的碳转化率高于67%。