CN105238869A - 基于竞争性等位基因特异性pcr技术的flc1特异snp分子标记及应用 - Google Patents

基于竞争性等位基因特异性pcr技术的flc1特异snp分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于竞争性等位基因特异性PCR技术的FLC1特异SNP分子标记及应用，本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态中的应用。本发明的实验证明了，开发的SNP标记特异引物可以对抽薹性状良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗抽薹遗传材料的预先选择和辅助育种。

Description

基于竞争性等位基因特异性PCR技术的FLC1特异SNP分子标记及应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，涉及基于竞争性等位基因特异性PCR技术的FLC1特异SNP分子标记及应用。
背景技术
白菜类作物是我国栽培面积最大的蔬菜作物，在我国菜篮子工程中的作用举足轻重。近年，随着人们生活水平的提高，白菜生产已由保证数量供给为主转向以提高品质、满足周年生产供应和高端需求为主。食用品质优良、能满足多元化需求的特色大白菜品种如春播白菜、娃娃菜和快菜等在市场中越来越走俏，使得春白菜及高寒地区的春夏白菜栽培面积逐年扩大。先期抽薹是制约我国春大白菜及高海拔地区春夏白菜生产的主要限制因素，其对白菜生产最重要的影响是抑制叶片中营养物质积累，导致产量和品质下降。筛选抗抽薹遗传资源，培育抗抽薹新品种是解决白菜先期抽薹开花的根本途径，也是目前白菜最重要的育种目标之一。
抽薹开花是受复杂基因网络调控的数量性状，并且该网络中的很多基因都受表观遗传水平上的调控。FLC是控制植物开花的关键调控因子。白菜BrFLC家族共有BrFLC1-3和BrFLC5四个基因，在拟南芥和大白菜中过量表达这些BrFLC均可导致开花延迟，这说明BrFLC的功能与拟南芥FLC类似(Schranzetal.,2002；Kimetal.,2007；黄细松等,2007)。最近研究显示位于A02染色体的BrFLC2是调控白菜开花的重要基因(Zhaoetal.,2010；Xiaoetal.,2013)；也有研究显示，BrFLC1的可变剪切与开花时间密切相关(原玉香等,2008；Yuanetal.,2009)。
在育种实践及相关生物学研究的过程中，分子标记起着极其重要的作用。其在目标资源筛选，定位调控特定农艺性状的基因，基因聚合，品种鉴定等方面的应用越来越广泛。SNP属于新一代分子标记，具有丰度高、检测易实现自动化等特点。不同物种全基因组的序列测定及比较表明，SNP在基因组上的分布极其丰富，相比于目前育种中常用的SSR标记要广泛得多。SNP突变率低，尤其处于编码区的SNP是高度稳定的，其遗传稳定性要比SSR等遗传标记高得多，遗传分析或基因诊断时的重现性、准确性都优于SSR。
基于KASP(竞争性等位基因特异性PCR)的SNPline基因分型检测是英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist)有限公司开发的高通量SNP分型技术，其具有准确、灵活、低成本、高通量的特点，目前已经成为国际上SNP分析的主流方法之一。该方案的核心是KASP技术，即CompetitiveAllele-SpecificPCR。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(InsertionsandDeletions，***和缺失)。
分子标记在基于分子标记辅助选择(MAS)技术的抗性育种工作中起着越来越重要的作用。然而与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制，在不同的群体中需对亲本的多态性进行检测；此外，在减数***过程中，该类型的分子标记仍然存在着因染色体发生交换而失去了与目的基因紧密连锁关系的可能性，这使得在目的基因鉴定过程中会出现错选或漏选的情况(Hayashietal.,2006；Ingvardsenetal.,2008)。因此开发功能基因的分子标记显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态中的应用；
或本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质的用途。
本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜中的应用；
或本发明提供了检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜产品中的应用。
上述应用中，所述检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质包括由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物组。
上述物质可以是引物组或含有引物组的试剂或试剂盒等。
本发明第三个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA、GG或GA，若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则所述待测白菜为或候选为早抽薹白菜；若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或GA，则所述待测白菜为或候选为晚抽薹白菜。
抽薹指数0-33.3为晚抽薹材料，77.7-100为早抽薹材料。
上述方法中，所述检测待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型的方法为如下：
1)直接测序；
2)用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
上述方法中，所述FLC1-13859895G/ASNP位点为序列表中序列4中第182位核苷酸。
本发明第四个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的引物。
本发明提供的引物，由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
本发明第五个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，为含有上述的引物的PCR试剂；所述引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM；
本发明第六个目的是提供鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的试剂盒。
本发明提供的试剂盒，为含有上述的引物或上述的试剂盒。
本发明第七个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：用上述的引物对待测引物进行等位基因特异性PCR，若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则待测白菜为或候选为早抽薹白菜；若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或G/A，则待测白菜为或候选为晚抽薹白菜。
上述方法中，所述等位基因特异性PCR的模板为待测白菜的基因组DNA。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.本发明提供的分子标记是功能型基因分子标记。在实践育种工作中，与目的基因紧密连锁的分子标记在应用过程中有可能受到遗传背景的限制。本发明所涉及的SNP分子标记是基于功能基因FLC的序列变异引起的。研究表明FLC是控制白菜抽薹开花的关键因子，因此该标记可在很大程度上避免遗传背景的不同对检测结果的影响。
2.本发明提供的分子标记能对该SNP位点的G或A碱基进行特异的区分和检测。
3.本发明提供的分子标记在实际应用中，低成本、高通量。目前，检测SNP的方法有测序法、荧光检测法、DNA芯片、质谱检测法等，而这些方法大部分成本高，速度慢。本发明提供的分子标记只需PCR和荧光检测两个步骤，成本低、通量高、加上特异性高(即准确度高)，特别适用于育种实践中。
4.本发明提供的分子标记准确度高。利用105份不同遗传材料组成的自然群体试验表明，开发的SNP标记特异引物可以对抽薹性状良好分型，具有良好的应用价值，可实现对抗抽薹遗传材料的的预先选择和辅助育种。
附图说明
图1为是FLC1-13859895G/A位点特异性分子标记(FLC1SNP)在105份高代自交型材料中的基因分型鉴定图。
图2为是FLC1-13859895G/A位点对照引物在105份高代自交型材料中的鉴定图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、分子标记的获得
为了更好更快地筛选获得抗抽薹资源，促进分子标记辅助选择育种实践的进行,通过对5个抗抽薹白菜材料和5个易抽薹白菜材料的重测序数据分析发现，在FLC1基因内部第3763位的碱基有一个G/A突变的SNP位点，该位点的物理位置位于A10染色体第13859895位碱基，该SNP位点命名为FLC1-13859895G/A位点。
根据FLC1-13859895G/A位点，设计如下可用于KASP技术的FLC1特异的引物作为分子标记：上游引物FLC1-FF、上游引物FLC1-FV和下游引物FLC1-R。
上述FLC1-FF、FLC1-FV和FLC1-R引物委托英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室)有限公司获得。
FLC1-FF、FLC1-FV和FLC1-R引物序列特征如下：
上游引物FLC1-FF：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAACCATGTTTTGGCTAGCCAGa(序列1)；
上游引物FLC1-FV：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAACCATGTTTTGGCTAGCCAGg(序列2)；
下游引物FLC1-R：AATCGGATCGAAACTTAAACCGTAAC(序列3)。
上述上游引物最后一位碱基g/a对应A10染色体上FLC1基因的第3763位的SNP位点。
实施例2、FLC1-13859895G/A位点的分子标记在鉴定的早抽薹和晚抽薹材料中的应用
1、分子标记在鉴定的早抽薹和晚抽薹材料
1)DNA提取
常规CTAB法分别提取表1中105种待测白菜材料的基因组DNA。
用琼脂糖电泳和Nanodrop2100分别检测所提取DNA的质量，发现提取的基因组DNA均达到了相关的质量要求，即琼脂糖电泳显示DNA条带单一，没有明显弥散；Nanodrop2100检测A260/280介于1.8-2.0之间(DNA样品没有蛋白污染)；A260/230介于1.8-2.0之间(DNA样品盐离子浓度低)；270nm没有明显的光吸收(DNA样品没有酚污染)；用于竞争性等位基因特异性PCR技术检测的DNA用量为4～10ng/每样品。稀释DNA浓度成为10ng/μl备用，得到待测DNA。
2)基于竞争性等位基因特异性PCR
按照英国LGC(LaboratoryoftheGovernmentChemist政府化学家实验室)有限公司提供的标准实验流程，即基于竞争性等位基因特异性PCR技术的实验流程进行实验，以下试剂除特殊说明为均为LGC公司提供的配套试剂，试剂用量、用法、以及整个实验步骤按照LGC公司的操作指南GenetypingAssay，ManualPart#15004070Rev.B进行。KASPar反应在384微孔板或1536微孔板(Cat.No.04729749001,Roche)中进行，反应体系为3ul或1ul。
具体步骤为：首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待测DNA模板(4ng/μl)1.5ul，60℃烘干。然后在Kraken操作***下利用Meridian加样工作站向每个反应孔中加入1×Mastermix(KBS-1016-002或Cat.No.KBS-1016-011，LaboratoryoftheGovernmentChemist)与引物预混液(实施例1的两条上游引物和下游引物按照摩尔浓度比6:6:15混合，各引物终浓度为10μM)，Mix分装完毕立即将微孔板依次放在Kube热封仪和Fusion激光封膜仪上封膜。PCR反应在高通量水浴***Hydrocycler中进行，具体程序为94℃预变性，15分钟；94℃，20秒(变性)—61℃-55℃，1分钟(复性&延伸：以touchdown程序扩增10个循环，每循环降低0.6℃)；94℃，20秒(变性)—55℃，60秒继续扩增26个循环。扩增结束后，利用BMGPHERAstar仪器检测荧光信号并查看分型情况。若分型不充分，则继续扩增，每3个循环查看分型情况，直至分型完全。
结果如图1所示，结果显示分型效果良好，该标记能特异区分该位点为纯合GG、或纯合AA或杂合G/A的材料；
若待测白菜FLC1-13859895G/A位点的核苷酸为AA纯合，则待测白菜为早抽薹；
若待测白菜FLC1-13859895G/A位点的核苷酸为GG纯合或G/A杂合，则待测白菜为晚抽薹。
2、抽薹检测
将表1中的105份白菜遗传种质播种，检测抽薹指数，检测方法可参照如下文献中记载：余阳俊等，大白菜室内苗期耐抽薹鉴定方法，中国蔬菜，2002。
抽薹调查分级标准:0级,无蕾,短缩茎未见伸长；1级,有蕾,短缩茎长＜1cm；3级,有蕾,短缩茎明显伸长,短缩茎长1-2cm；5级,抽薹,薹长2-5cm；7级,抽薹,薹长＞5cm；9级,开花,薹长＞5cm。
具体计算公式如下：
抽薹指数0-33.3为晚抽薹材料，77.7-100为早抽薹材料。
结果如表1所示，在47份抽薹检测为晚抽薹材料中，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为GG纯合的材料有35份，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为AA纯合的材料12份，经过抽薹常规验证，47种为晚抽薹，本发明方法的鉴定准确度为74.5％；
在58份抽薹检测为早抽薹材料中，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为AA纯合的材料有4份，分子标记鉴定FLC1-13859895G/A位点为GG纯合的材料3份，杂合G/A位点的有1份，经过抽薹常规验证，58种为早抽薹，本发明方法的鉴定准确度为93.2％。
表1为105份材料在FLC1-13859895G/A位点的基因分型及抽薹指数统计表
表注：所有材料为自交六代以上纯合自交系。
因此，可以看出，本发明的方法和分子标记可以用来检测待测白菜的抽薹状态。
对比例1、
一、引物的设计合成
根据FLC1-13859895G/A位点设计了其它两组检测引物。
引物组1：
上游引物FLC1-FF1：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATGTTTTGGCTAGCCAGa；
上游引物FLC1-FV1：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATGTTTTGGCTAGCCAGg；
下游引物FLC1-R1：AATCGGATCGAAACTTAAACCGTA(序列3)。
引物组2：
上游引物FLC1-FF2：GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACCATGTTTTGGCTAGCCAGa；
上游引物FLC1-FV2：GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACCATGTTTTGGCTAGCCAGg；
下游引物FLC1-R2：CGGATCGAAACTTAAACCGTAAC(序列3)。
二、应用
采用实施例2的1的方法，不同的是将引物分别替换为对比例中的引物组1和引物组2。
对比例中的引物组1的检测结果如下表2和图2左图。
对比例中的引物组2的检测结果如下表2和图2右图。
表2为利用引物组1和引物组2对105份材料的基因分型及抽薹指数统计表
表注：“—”，未能分型。
可以看出，这两组引物不能进行基因分型。

Claims (10)

1.检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态中的应用；
或检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定白菜的抽薹状态产品中的应用。
2.检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜中的应用；
或检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜产品中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述检测白菜基因组中FLC1-13859895G/ASNP位点的多态性或基因型的物质包括由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成的引物组。
4.一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法，包括如下步骤：检测待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA、GG或GA，若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则所述待测白菜为或候选为早抽薹白菜；若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或GA，则所述待测白菜为或候选为晚抽薹白菜。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述检测待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型的方法为如下：
1)直接测序；
2)用引物对待测白菜进行等位基因特异性PCR；
所述引物由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于：所述FLC1-13859895G/ASNP位点为序列表中序列4中第182位核苷酸。
7.鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的引物，由序列1所示的单链DNA分子、序列2所示的单链DNA分子和序列3所示的单链DNA分子组成。
8.鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的PCR试剂，为含有权利要求7所述的引物的PCR试剂；所述引物中的每条引物在所述PCR试剂中的终浓度均为10μM。
9.鉴定或辅助鉴定待测白菜抽薹的试剂盒，为含有权利要求7所述的引物或权利要求8所述的试剂盒。
10.一种鉴定或辅助鉴定待测白菜为早抽薹白菜或晚抽薹白菜品种的方法，包括如下步骤：用权利要求7所述的引物对待测引物进行等位基因特异性PCR，若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为AA，则待测白菜为或候选为早抽薹白菜；若所述待测白菜基因组FLC1-13859895G/ASNP位点基因型为GG或G/A，则待测白菜为或候选为晚抽薹白菜；
所述等位基因特异性PCR的模板具体为待测白菜的基因组DNA。
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