CN105230607A - 一种蜜蜂人工授精的缓冲液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传育种领域，公开了一种蜜蜂人工授精的缓冲液、其制备方法以及利用所述的缓冲液进行蜜蜂人工授精的方法。本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和水，配方简单、稳定性好，且流动性好不易堵塞吸头，对***活力影响小。本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液取氯化钠、氯化钾、氯化钙和葡萄糖，加水溶解后定容即得，配制方法简单，配置成本低、时间短。采用本发明所述缓冲液进行人工授精可以降低缓冲液对***活力的影响，有效保证雄蜂***在注射期间的活力不下降，提高蜜蜂人工授精的成功率。

Description

一种蜜蜂人工授精的缓冲液及其制备方法

技术领域

本发明属于动物遗传育种领域，具体涉及蜜蜂人工授精的缓冲液，同时还涉及了利用所述蜜蜂人工授精的缓冲液进行蜜蜂人工授精的方法。

背景技术

蜜蜂是社会性昆虫群体，蜜蜂群体中具有同一性别但有不同的形态、身体结构、智能和行为的个体类型，称为级型分化。在蜜蜂生物学上的级型指同属于雌性的蜂王和工蜂两种类型。蜜蜂雌性的不同级型与其主要的职能分工有关，蜂王专司产卵，工蜂负责护理幼虫、供给食物，但是没有生育能力。蜂王是由受精卵发育而成的生殖器官发育完全的雌蜂，具有二倍染色体，在蜂群中专司产卵。但是蜜蜂还具有孤雌生殖的能力，未经交配的蜂王可以产生雄性后代，即雄蜂。处女王是羽化后但未经交配的蜂王，即蜂王未交配前称为处女王。而雄蜂是由未受精卵发育而成的蜜蜂，具有单倍染色体。雄蜂无采集能力，食物都是巢内已有的，它的职能主要是在巢外空中与婚飞的处女王交配。

根据蜜蜂生物遗传育种原理，利用人工的方法诱导蜂群，在蜜粉源丰富、气候温暖的季节，可以有计划、大规模地培育优质雄蜂，采集雄蜂***，进行保存。除蜂王雄蜂自然交配外，可以大量采集雄蜂***进行人工授精，通过雄蜂***的保存，在非蜜粉季进行处女王的人工授精工作，或是在不同的地区采集雄蜂***，返回驻地为特定地区的处女蜂王进行人工授精，达到优良蜜蜂遗传物质的传递及融合。

蜜蜂人工授精技术在1927年取得成功，中国开展该项技术的研究始于1959年，20世纪80年代后，已达到国际先进水平，利用该技术取得了单雄受精、单雄多雌受精和自体受精的新突破。当前，蜜蜂的人工授精技术，在原种保纯、杂交制种乃至工程育种中起到了不可替代的作用。

目前蜜蜂人工授精分为两种：1：直接受精法，即累计采集多只雄蜂***进行人工授精注射；2：漂洗受精法，即将累计采集的雄蜂***置于缓冲液进行稀释、漂洗后进行人工授精注射。目前通常采用第一种方法，即直接受精法。采用该方法无需将雄蜂***置于缓冲液进行稀释、漂洗，注射的***为全部的采集***，缓冲液的作用相对下降，缓冲液对***中***的活力的影响大大减少。但在直接受精法中仍需要缓冲液用于清洗针管、吸头，隔离空气与吸头内的***接触，以免吸头内的***干涸。

目前蜜蜂人工授精的缓冲液配方较多且各有不同，但都容易迅速变干，稳定性差，且较为粘稠，容易发生吸头堵塞，影响***的活力及蜜蜂人工授精的成功率。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷提供一种蜜蜂人工授精的缓冲液及其制备方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种蜜蜂人工授精的缓冲液，包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和水。

本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液，配方简单、稳定性好，且流动性好不易堵塞吸头，对***活力影响小。

在一些实施方案中，本发明所述的缓冲液，每100ml缓冲液中含有：

在一些优选实施方案中，本发明所述的缓冲液，每100ml缓冲液中含有：

本发明还提供了所述蜜蜂人工授精的缓冲液的制备方法，分别称取氯化钠、氯化钾、氯化钙和葡萄糖，加水溶解后定容。

本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液中含有葡萄糖，无需高温消毒，可以显著缩短配置时间。

本领域技术人员可以理解，本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液中的水优选为超纯水。

本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液优选现用现配。

在某一具体实施例中，本发明应用本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液进行蜜蜂人工授精，结果显示本发明所述缓冲液可以降低缓冲液对***活力的影响，有效保证雄蜂***在注射期间的活力不下降，减少对蜂王的伤害，有效提高蜜蜂人工授精的成功率7％-10％。因此，本发明还提供了所述蜜蜂人工授精的缓冲液在提高蜜蜂人工授精成功率中的应用。

本发明还提供了一种蜜蜂人工授精的方法，利用本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液与雄蜂***相接触，形成缓冲液-雄蜂***-缓冲液三相***来采集雄蜂***；然后利用三相***中的雄蜂***对处女王进行人工授精。

所述缓冲液-雄蜂***-缓冲液三相***具体是指雄蜂***在进样器中间，两侧为本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液，雄蜂***通过本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液与空气隔绝，可以防止***干涸或受到污染，保证雄蜂***在注射期间的活力不下降。同时，本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液还可润滑进样器，保证人工受精过程中，***注射过程流畅，缩短注射时间，减少针头在蜂王体内停留时间，降低对蜂王的损伤。

在一些具体实施例中，所述采集雄蜂***的具体操作为先将进样器针头吸入少许本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液和气泡，然后右手操纵进样器，使针头与***接触后稍微拉开点距离，但二者并不断开，借助于***本身的粘滞性把覆盖在白色粘液上的土黄色***较完全地抽吸进针头，然后继续采集其它雄蜂的***，待进样器针头内贮满所需***量后，用本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液封闭针头。

其中，值得注意的是，在本发明所述蜜蜂人工授精的方法中采集雄蜂时***每2只雄蜂的***间应避免出现气泡。

进一步的，在一些实施例中，本发明所述蜜蜂人工授精的方法采集完***的进样器用浸过抗生素的棉签擦进样器针头，可将针头外侧粘附杂物，避免雄蜂***以及处女王受到污染。

本领域技术人员可以理解，本发明所述用于人工授精的雄蜂***采用强迫性成熟的雄蜂***获得。

通常雄蜂出房12天后，即达性成熟，便可捕捉***。性成熟雄蜂的捕捉方法包括：利用颜色标记雄蜂日龄法、巢内直接选择性成熟雄蜂法、巢门捕捉婚飞雄蜂法和捕捉幽闭饲养雄蜂法等。目前用于人工授精的雄蜂的标准要求雄蜂种纯、个大、健壮、活跃和性成熟。

而所述强迫雄蜂***的具体方法为：用左手拇指和食指从腹面捉住胸、腹部两侧，用右手拇指按压雄蜂的腹部背板1节～3节处，然后三指配合，同时向腹部尾端施加压力，强迫“***”外翻并***。在强迫雄蜂***时需要注意用力适度，以保***在“***”顶端形成近球状，以利采集且不易被污染。

本发明所述蜜蜂人工授精的方法中所述人工授精的具体操作为打开处女王的螫针腔，调整处女王和含有雄蜂***进样器的针头的角度，排除进样器针头尖中的缓冲液和气泡后，使进样器针尖接近***口，用探针压住瓣突，将进样器针尖徐徐推入***直至中部输卵管，取出探针，将***慢慢注入。

其中，一次性授精通常注入8μL***。两次性授精，每次各注4μL～5μL***，两次间隔24小时～48小时。授精完毕，10秒～15秒后退出针头，取出蜂王，点上标记，待其复苏后，送回原核心群或框式王笼暂时贮存。

处女王的质量关系到人工授精的效果和新建蜂群的质量。用于人工授精的处女王要求个体大、腹部硕长、无残损、行动稳健、性成熟。

本发明所述蜜蜂人工授精的方法中所述人工授精需要先打开处女王的螫针腔。而打开处女王的螫针腔的具体方法为：处女王麻醉后，调整显微镜，在镜下移动背腹钩操纵杆，使背腹钩在探针配合下，分别钩住背腹板顶端的中央位置，并向外侧拉动背腹板，使其间距为3毫米～4毫米，然后再移动背钩，使其“膨大”部分嵌入到螫针腔基部的三角缝内，再拉动背腹钩，把背腹板间距拉至5毫米～6毫米。

其中，处女王麻醉的方法为将处女王装入麻醉室后，安装到受精仪上，开启二氧化碳钢瓶阀门，调节至每分钟从洗气瓶冒出300个气泡为宜，麻醉30秒左右，处女王进入昏迷状态，直到受精完毕，方可解除麻醉。

在一些优选实施方案中，本发明所述蜜蜂人工授精的方法还包括在人工授精前利用所述蜜蜂人工授精的缓冲液冲洗操作器具的步骤。

利用所述蜜蜂人工授精的缓冲液冲洗操作器具可以降低对受精处女王的伤害。其中所述操作器具包括背腹钩和探针。

本领域技术人员可以理解，无菌操作对于蜜蜂人工授精至关重要。操作消毒不彻底，处女王可能染病死亡或传病给子代。在受精过程中，直接病原就是处女王和雄蜂体表以及人的皮肤。因此，在进行人工授精过程中严格要求无菌操作。具体要求包括：窗明几净，地面清洁无浮尘，***前2小时，用5％来苏儿喷洒地面；台面用75％酒精擦拭；空间用紫外线灯照射；小型器皿、刀、剪、钩、针用煮沸锅消毒至少30分钟；塑料针头和有机制品，用配有抗生素的消毒液、双蒸水、生理液依次冲洗，所有已消毒的器物，均须妥善放置，谨防二次污染；所有用作灭菌的酒精和消毒剂，不得与雄蜂、雄蜂***和处女王接触。

蜜蜂人工授精除了要求无菌操作外，适宜的温度也是十分重要的。温度太低，处女王容易冻僵；而雄蜂活动迟缓而不利***，给***操作带来困难。室温在20℃～30℃，受精效果较为理想。

处女王人工授精后，需要细心管理。首先，蜂王受精后要及时放回原核心群(或大群)，使其能得到工蜂饲喂，不致受饿而影响发育。其次，要保证受精王所在蜂群的蜂数，以便蜜蜂能自行调节巢温。另外，还要预防蜂王出巢进行自然交尾，可以将蜂王剪翅或幽闭巢门，防止蜂王外出；也可利用大型框式王笼封闭观察其产卵情况。

本发明提供了一种蜜蜂人工授精的缓冲液包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和水，配方简单、稳定性好，且流动性好不易堵塞吸头，对***活力影响小。本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液取氯化钠、氯化钾、氯化钙和葡萄糖，加水溶解后定容即得，配制方法简单，配置成本低、时间短。采用本发明所述蜜蜂人工授精的缓冲液进行人工授精可以降低缓冲液对***活力的影响，有效保证雄蜂***在注射期间的活力不下降，提高蜜蜂人工授精的成功率。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。

实施例1、蜜蜂人工授精的缓冲液的制备

电子分析天平准确称取氯化钠(NaCl)0.850g、氯化钾(KCl)0.025g、无水氯化钙(CaCl₂)0.030g、葡萄糖0.500g，将其溶解于50ml超纯水中，磁力搅拌器搅拌均匀后，加入超纯水定容至100mL，置于2-5℃冰箱中备用。

实施例2、蜜蜂人工授精

1、***采集：

捕捉种纯、个大、健壮、活跃和性成熟的雄蜂。用左手拇指和食指从腹面捉住胸、腹部两侧，用右手拇指按压雄蜂的腹部背板1节～3节处，然后三指配合，同时向腹部尾端施加压力，强迫“***”外翻并***(注意用力适度，以保***在“***”顶端形成近球状，以利采集且不易被污染)。在体视显微镜下，直接用进样器逐只采集雄蜂***。

采集雄蜂***的方法具体为：先将进样器针头吸入少许实施例1制备的缓冲液和气泡，然后右手操纵进样器，使针头与***接触后稍微拉开点距离，但二者并不断开，这样就能借助于***本身的粘滞性，把覆盖在白色粘液上的土黄色***较完全地抽吸进针头，然后继续采集其它雄蜂的***，每2只雄蜂的***间，不应出现气泡隔离。待针头内贮满所需***量后，用实施例1制备的缓冲液封闭针头，以防***干涸或污染。最后将针头外侧粘附杂物用浸过抗生素的棉签擦去后，便可提升针头的位置，准备给蜂王受精。

2、处女王的选择与麻醉：选择个体大、腹部硕长、无残损、行动稳健、性成熟的处女王，装入麻醉室后，安装到受精仪上，开启二氧化碳钢瓶阀门，调节至每分钟从洗气瓶冒出300个气泡为宜，麻醉30秒左右，处女王进入昏迷状态后可开始受精，直到受精完毕，方可解除麻醉。

3、受精：

打开螫针腔：蜂王麻醉后，调整显微镜，用实施例1制备的缓冲液冲洗背腹钩及探针，在镜下移动背腹钩操纵杆，使背腹钩在探针配合下，分别钩住背腹板顶端的中央位置，并向外侧拉动背腹板，使其间距为3毫米～4毫米，然后再移动背钩，使其“膨大”部分嵌入到螫针腔基部的三角缝内，再拉动背腹钩，把背腹板间距拉至5毫米～6毫米。

进针注射：螫针腔打开后，调整蜂王和针头的角度，排除针头尖中的实施例1制备的缓冲液和气泡后，使针尖接近***口，用探针压住瓣突，将针尖徐徐推入***直至中部输卵管，取出探针，将***慢慢注入。一次性受精通常注入8μL***；两次性受精，每次各注4μL～5μL***，其间隔24小时～48小时。受精完毕，10秒～15秒后退出针头，取出蜂王，点上标记，待其复苏后，送回原核心群或框式王笼暂时贮存观察其产卵情况。

实施例3、

1、实验器材：微量注射器，人工授精仪及附属配件；生物显微镜；计时器；

2、实验材料：处女蜂王，性成熟雄蜂若干只；

3、实验样品：超纯水和实施例1制备的蜜蜂人工授精的缓冲液；

4、实验准备步骤：

1)、蜂场内抓取性成熟雄蜂备用；

2)、准备实验器材，清洁、消毒人工授精仪部件、微量注射器玻璃针头等；

3)、小型放蜂笼内放入雄蜂试飞，待用；

5、实验方法及结果：

1)、空白对照中，微量注射器玻璃针头内仅吸取雄蜂***进行注射。

在注射过程中，先吸取的上端雄蜂***较为粘稠，有部分粘贴在针头壁内，无法排出，下端雄蜂***排出注射不流畅，无法充分利用所采集的全部雄蜂***，导致针头停留种蜂王体内时间过长，增加了蜂王损伤几率。统计人工授精成功率为40％左右(15只处女蜂王进行授精)。

2)、超纯水对照中，微量注射器玻璃针头先吸取超纯水，再吸取雄蜂***，再吸取超纯水进行封口保护。

在注射过程中，先行排出封口保护的超纯水，中段雄蜂***注射不畅，雄蜂***利用率不高，***注射较慢，耗时较长，增加了蜂王损伤几率。统计人工授精成功率为60％左右(15只处女蜂王进行授精)。

3)、实施例1制备的蜜蜂人工授精的缓冲液应用中，微量注射器玻璃针头先吸取适量实施例1制备的蜜蜂人工授精的缓冲液，再吸取雄蜂***，最后吸取适量缓冲液封口。

进行注射过程中，先排出封口保护的缓冲液，中段雄蜂***注射顺畅，吸取的雄蜂***全部注射完成，管壁未残留雄蜂***，注射过程流畅，有效缩短了注射时间，减少针头在蜂王体内停留时间，降低了蜂王损伤几率。统计人工授精成功率为67％左右(15只处女蜂王进行授精)。

Claims (8)

1.一种蜜蜂人工授精的缓冲液，包括氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡萄糖和水。

2.根据权利要求1所述的缓冲液，每100ml缓冲液中含有：

3.根据权利要求1或2所述的缓冲液，每100ml缓冲液中含有：

4.权利要求1-3任意一项所述蜜蜂人工授精的缓冲液的制备方法，分别称取氯化钠、氯化钾、氯化钙和葡萄糖，加水溶解后定容。

5.权利要求1-3任意一项所述蜜蜂人工授精的缓冲液在提高蜜蜂人工授精成功率中的应用。

6.一种蜜蜂人工授精的方法，利用权利要求1所述蜜蜂人工授精的缓冲液与雄蜂***相接触，形成缓冲液-雄蜂***-缓冲液三相***来采集雄蜂***；然后利用三相***中的雄蜂***对处女王进行人工授精。

7.根据权利要求6所述的方法，还包括在人工授精前利用权利要求1所述蜜蜂人工授精的缓冲液冲洗操作器具的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，所述操作器为背腹钩和探针。