CN103719018B

CN103719018B - 一种提高胚胎期鸭生长速度的方法

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Publication number: CN103719018B
Application number: CN201410002433.0A
Authority: CN
Inventors: 李慧芳; 胡艳; 刘宏祥; 姬改革; 束婧婷; 朱春红; 朱文奇; 宋迟; 章双杰; 单艳菊; 宋卫涛; 徐文娟; 陶志云
Original assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Current assignee: Jiangsu Institute Poultry Sciences
Priority date: 2014-01-03
Filing date: 2014-01-03
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2034-01-03
Also published as: CN103719018A

Abstract

本发明公开了一种提高胚胎期鸭生长速度的方法，包括如下步骤：（1）制备甲状腺激素溶液：①将生理盐水与氢氧化钠混合，得到PH值为10.7～11.2的混合液，混合液保存4℃待用；②将甲状腺激素溶解于①步的混合液后，采用梯度稀释法进行稀释，得到PH值为6.5～7.0的甲状腺激素溶液；（2）采用微孔滤器对步骤（1）的甲状腺激素溶液过滤后，置入灭菌后的注射剂瓶中，密封，置于碎冰中待用；（3）对鸭种蛋消毒，消毒后向鸭种蛋内注射步骤（2）的甲状腺激素溶液并封孔；（4）将步骤（3）处理后的鸭种蛋置入孵化箱中进行孵化即可。本发明的优点，保证鸭胚生命不受干扰，能够进行后续的孵化，保证了高的出雏率，并且能有效提高鸭胚出雏前体重和胸腿肌重。

Description

一种提高胚胎期鸭生长速度的方法

技术领域

本发明属于通过人工措施调节动物生长的技术领域，具体是一种提高胚胎期鸭生长速度的方法。

背景技术

动物机体是一个高度协调的有机整体，其生长发育的每个阶段均受到遗传与环境的影响。随着研究水平的深入，遗传与环境对机体的影响也不是绝对孤立的。对于细胞来说，遗传因素导致的激素水平的不同也会导致细胞内环境的变化，而神经内分泌***是调节细胞生长内环境激素水平的一个重要的***，与生长相关的下丘脑-垂体生长轴对动物的生长状况起着重要的调节作用。

动物生长可以分为不同的时段，鸟类出雏前和出雏后早期的生长强度要明显高于以后的生长期。鸟类组织器官的发生、发育和形成都是在胚胎期和出雏后早期奠定的，机体通过细胞、分子等对生长环境的应答，形成不同的代谢模式，而这种影响可能会继续存在，即早期的营养条件、激素水平等会程序化影响机体成年后的生长状态和代谢模式。因此，禽类胚胎期和出雏后早期是生长发育的一个关键时期。对于鸟类，胚胎发育所需要的营养条件只能从蛋中获取，而迄今发现的蛋中存在的母源性激素，给胚胎的发育提供了一个必要的、稳定的生长环境。这些母源性激素包括一些特异的肽类激素和脂质激素等，对鸟类胚胎和出雏后的生长、代谢以及繁殖性状会产生程序化的影响。

发明内容

本发明公开了一种提高胚胎期鸭生长速度的方法，本方法在保证鸭胚生命不受干扰的情况下，能够促进鸭胚生长速度，显著增加了鸭胚出雏前体重和胸腿肌重。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为，本发明开发出的一种提高胚胎期鸭生长速度的方法，包括如下步骤：（1）制备甲状腺激素溶液：①将生理盐水与氢氧化钠混合，得到PH值为10.7～11.2的混合液，混合液于4℃待用；②将甲状腺激素溶解于①步的混合液后，采用梯度稀释法进行稀释，得到PH值为6.5～7.0的甲状腺激素溶液；

（2）采用微孔滤器对步骤（1）的甲状腺激素溶液过滤后，置入灭菌后的注射剂瓶中，密封，置于碎冰中待用；

（3）对鸭种蛋消毒，消毒后向鸭种蛋内注射步骤（2）的甲状腺激素溶液并封孔；

（4）将步骤（3）处理后的鸭种蛋置入孵化箱中进行孵化即可。现有的溶解甲状腺激素为PBS缓冲液，但是用这种缓冲液对鸭种蛋胚胎的发育有刺激作用，本发明采用生理盐水溶解甲状腺激素，采用PBS缓冲液与生理盐水相比，PBS缓冲液的胚胎致死率明显高于生理盐水组。

本发明采用氢氧化钠调节生理盐水的PH值，因为甲状腺激素在强碱性溶液中才能溶解，因此我们在生理盐水中加入NaOH溶液，调节其pH值至10.7～11.2用以溶解甲状腺激素，但是鸭胚胎在该PH环境下又是死胚率很高的，所以为了解决这个矛盾，本发明采用的梯度稀释法，最终能将甲状腺激素很好的溶解，又能使甲状腺激素的PH达到6.5～7.0，不会对鸭胚胎造成影响，又能使甲状腺激素很好的溶解于混合液中，用于注射。

步骤（1）第②步的操作方法为，步骤（1）第②步的操作方法为，将甲状腺激素溶解于①步的混合液中，得到浓度为0.25mg/mL的甲状腺激素母液；用生理盐水将甲状腺激素母液浓度稀释至5μg /mL，得到中间液；再用生理盐水将中间液浓度稀释至2.5μg / mL，既得到甲状腺激素溶液，甲状腺激素溶液的PH值为6.5～7.0。注射的甲状腺激素溶液是有浓度要求的，过低起不到促进生长的作用，浓度过高则会影响鸭胚胎的生长，甚至导致死胚，本发明不断的重复该方法，使用各个浓度的甲状腺激素溶液，最终发现250 ng/ 100 μL这个浓度时，PH值为最合适的，而且促进鸭胚胎生长的作用也是最突出的。

步骤（3）向鸭种蛋内注射甲状腺激素溶液的方法为，①在温度为15～25℃条件下，用1 mL注射器从注射剂瓶中吸取甲状腺激素溶液；

②注射器由鸭种蛋锐端垂直地扎入，针尖进入鸭种蛋内0.5 ～ 1 cm即可；

③注射器倾斜30 ～ 45°，针尖继续深入鸭种蛋内1～1.5 cm，然后向鸭种蛋内注射100 μL 甲状腺激素溶液；

④注射后针头先后退0.5 ～1cm，然后将注射器移动至与鸭种蛋锐端垂直方向成10 ～ 30°角时，将针缓慢拔出；

⑤用熔化的石蜡封住针孔。

本发明注射器扎入鸭种蛋内的深度与角度，是由于鸭蛋蛋黄中央厚度高于鸡蛋，且蛋黄的漂浮性也更高于鸡蛋，入针长度过长有可能伤及卵黄膜，所以本发明注射器进入鸭种蛋的长度与角度为最合适的，这样可以防止针头破坏卵黄膜。

由于鸭蛋蛋清的粘稠度较高，在鸭种蛋内注射甲状腺激素溶液后，本发明选择的拔出角度是为了防止注射试剂和/或蛋清随着针头溢出。

步骤（4）孵化的温度、湿度为：第1天温度38.2℃、湿度50%，第2 ～ 3天温度38℃、湿度50%，第4 ～ 20天温度37.8℃、湿度55%，第21 ～25天温度37.5℃、湿度65%，第26天至出雏温度37.2℃、湿度75%。

在鸭种蛋孵化过程中，从第13天到28天，每天对鸭种蛋进行降温处理，第13～ 20天，每天1次降温处理；第21～ 28天，每天2次降温处理。

降温处理的方法为，将鸭种蛋从孵化箱中取出，在温度为20～ 25℃条件下，将27 ～ 35℃纯净水喷洒至鸭种蛋表面，放置5 ～ 10分钟后，再放入孵化器中继续孵化。

经过本发明的改进方法，对鸭种蛋进行降温处理的时间提前至孵化第13天即可，缩短了鸭胚胎生长的时间，对鸭种蛋的降温处理有效缓解鸭胚在狭小空间热量排放过多的问题；同时，本发明在降温过程中“将27～ 35℃纯净水喷洒至鸭种蛋表面，放置5-10分钟后，放入孵化器中继续孵化”，有效地促进了蛋壳中钙质的内流，确保了胚胎发育过程中有效钙质的含量，也有效降低了鸭蛋蛋壳的硬度，从而降低了鸭胚啄壳和出壳的难度，在确保鸭胚正常孵化的同时提高了出雏效率。

综上，本发明的有益效果是，与现有技术相比，本发明的提高鸭子胚胎生长速度的方法具有以下优点：

（1）本发明采用中性生理盐水为佐剂，保证鸭胚生命不受干扰的情况下进行后续试验，确保和提升了蛋内注射方法和相关试验的结果可靠性。打孔对照组在28胚龄死亡率为6.7%，PBS佐剂组在28胚龄死亡率达到61.9%，本发明生理盐水佐剂组在28胚龄死亡率为13.3%。说明PBS作为佐剂对鸭胚的刺激性比较大，而本发明使用生理盐水作为佐剂相对而言更为缓和。

（2）本发明采用强碱性生理盐水配置甲状腺激素T3母液，再用中性生理盐水梯度稀释配置T3工作液，解决了强碱性条件下溶解的T3在弱碱性、中性条件下容易析出的问题。

（3）本发明采用的蛋内注射进针和出针步骤，避免了蛋内注射对卵黄造成的破坏，经本发明的这种方法发现，鸭种蛋内卵黄没有受到损坏，不会出现死胚的情况，经后续经孵化可以保证较高的出雏率。

（4）本发明采用的鸭种蛋降温步骤，有效缓解鸭胚在狭小空间热量排放过多的问题，同时有效地促进了蛋壳中钙质的内流，确保了胚胎发育过程中有效钙质的含量，也有效降低了鸭蛋蛋壳的硬度，从而降低了鸭胚啄壳和出壳的难度，进一步提高了出雏效率。现有授精蛋出雏率为43.91-67.86%，本发明授精蛋出雏率为88.89-92.86%。

（5）本发明虽然在鸭孵化前注射了甲状腺激素促进生长，但是检测其甲状腺素的分泌，发现与正常孵化组个体的甲状腺素处于同一水平，不会造成内分泌的紊乱。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明内容做出进一步的说明。

在对鸭种蛋注射甲状腺激素溶液之前，鸭种蛋的准备：将鸭种蛋进行称重，并用铅笔在种蛋的钝端（大头）和腹部编号使每个鸭种蛋相区别，剔除过重或过轻的蛋，是鸭种蛋的质量大概相同，这样可以排除其它因素的影响。

（1）制备甲状腺激素溶液：①将生理盐水与氢氧化钠混合，得到PH值为10.7～11.2的混合液，混合液于4℃待用；②将甲状腺激素溶解于①步的混合液后，采用梯度稀释法进行稀释，得到PH值为6.5～7.0的甲状腺激素溶液；

（3）对鸭种蛋消毒，消毒后向鸭种蛋内注射步骤（2）的甲状腺激素溶液并封孔；消毒的方法采用现有技术即可，一般都是用新洁尔灭喷洒鸭种蛋锐端（小头），稍微晾干后用碘酊在鸭种蛋小头轻轻擦拭，酒精脱碘；要对鸭种蛋注射，一般都是先用定位锥在小头顶端轻轻打孔，打孔的大小与1 mL医用注射器针头相仿。

（4）将步骤（3）处理后的鸭种蛋置入孵化箱中进行孵化即可。

步骤（1）第②步的操作方法为，将甲状腺激素溶解于①步的混合液中，得到浓度为0.25mg/mL的甲状腺激素母液；用生理盐水将甲状腺激素母液浓度稀释至5μg/mL，得到中间液；再用生理盐水将中间液浓度稀释至2.5μg / mL，既得到甲状腺激素溶液，甲状腺激素溶液的PH值为6.5～7.0。

⑤用熔化的石蜡封住针孔，以防鸭种蛋后期感染。

本发明方法与往鸭种蛋内注射生理盐水的比较：

重复本发明方法，往鸭种蛋内注射的溶液分别是本发明的甲状腺激素溶液、生理盐水，经孵化后，发现甲状腺激素注射组在8胚龄的死亡率为5%，在19胚龄的死亡率为13%；生理盐水对照组在8胚龄的死亡率为6%，在19胚龄的死亡率为12%。两组死亡率差异不明显。说明本发明注射甲状腺激素溶液不会对鸭种蛋造成不良影响，与中性的生理盐水相差不大。

另外，在胚胎发育的过程中，分别于13胚龄、17胚龄、21胚龄、25胚龄和27胚龄，对2个组的雏鸭胚长、体重、心脏、肝脏、胸肌和腿肌进行了称重和比较。统计结果显示，从13胚龄开始一直到21胚龄，T3注射组体重与生理盐水对照组体重没有显著差异，而从25胚龄时甲状腺激素注射组体重显著大于生理盐水对照组，在27胚龄时甲状腺激素注射组体重和胸腿肌重均极显著大于生理盐水对照组。其结果见下表：

注：*表示与对照组比较差异达到极显著水平（P<0.05）；**表示与对照组比较差异达到极显著水平（P<0.01）。

由上表可知，本发明方法可对鸭胚胎生长速度有提高作用，并且不会造成甲状腺素分泌的紊乱。甲状腺素含量见下表：

以下是在选择甲状腺激素溶剂的试验，仅选择代表性的试验说明选择的方法，以PBS与生理盐水作为甲状腺激素佐剂的对比试验：

（1）鸭种蛋的准备：将鸭种蛋进行称重，并用铅笔在种蛋的大头和腹部编号，剔除过重或过轻的蛋。

（2）试剂准备：①配制0.1 M PBS（pH 值为8.5）；②配制0.98%生理盐水；③微孔滤器过滤后，盛入高压灭菌后的钠钙玻璃模制注射剂瓶中，密封，置于碎冰中待用。

（3）鸭种蛋消毒与锥孔：先用新洁尔灭喷洒鸭种蛋小头，稍微晾干后用碘酊在鸭种蛋小头轻轻擦拭，酒精脱碘；用定位锥在小头顶端轻轻打孔，入针位置以刚好突破内壳膜为宜，大小与1 mL医用注射器针头相仿。保持室温15 - 25℃。

（4）蛋内注射并封孔：将种蛋平均分为3组，分别为打孔组、PBS佐剂组和生理盐水佐剂组，用1 mL医用注射器吸取佐剂，给相应组注入PBS佐剂的溶液以及生理盐水佐剂的溶液，打孔组仅在蛋的小头顶端打孔，用熔化的石蜡封住小孔以防种蛋后期感染。保持室温15 - 25℃。

（5）孵化：使用鸭专用孵化箱，根据适当的孵化条件进行全自动孵化。第1天温度38.2℃、湿度50%，第2 - 3天温度38℃、湿度50%，第4 - 20天温度37.8℃、湿度55%，第21 - 25天温度37.5℃、湿度65%，第26天至出雏温度37.2℃、湿度75%。

（6）凉蛋：从13 - 28胚龄必须进行凉蛋程序，室温要求20 - 25℃。每天在固定时间将蛋盘从孵化器中取出，置于桌上，用喷壶承装27-35℃纯净水，将蛋表面喷洒至潮湿状态，放置5 - 10分钟后，放入孵化器中继续孵化。第13-20胚龄，每日1次；第21 - 28胚龄，每日2次。

（7）结果观察

PBS佐剂组在13胚龄的死亡率达到25.0%，在28胚龄死亡率达到61.9%；生理盐水组在13胚龄的死亡率为6.7%，在28胚龄死亡率为13.3%；打孔组在28胚龄死亡率为6.7%。结果说明PBS作为佐剂对鸭胚的刺激性比较大，而生理盐水相对而言更为缓和.以此说明采用生理盐水作为甲状腺激素注射液的佐剂更为合适。

以下是在选择生理盐水与氢氧化钠混合后溶解甲状腺激素（T3）溶剂时，浓度选择的试验，仅选择代表性的试验说明选择的方法：

（2）T3 试剂准备：①称取2.5 mg T3粉状固体并溶于pH值为10.7 - 11.0的10 mL碱性生理盐水中，充分溶解、摇匀静置5 min，配置成的母液T3浓度为25 μg / 100 μL；②吸取400 μL母液加入20 mL生理盐水中配制成T3浓度为500 ng / 100 μL的A液；③吸取一定量的A液加入等量的生理盐水中配制成T3浓度为250 ng / 100 μL的B液；④吸取一定量的B液加入等量的生理盐水配制成T3浓度为125 ng / 100 μL的C液；⑤微孔滤器过滤后，盛入高压灭菌后的钠钙玻璃模制注射剂瓶中，密封，置于碎冰中待用。

（3）鸭种蛋消毒与锥孔：先用新洁尔灭喷洒鸭种蛋小头，稍微晾干后用碘酊在鸭种蛋小头轻轻擦拭，酒精脱碘；再用定位锥在小头顶端轻轻打孔，入针位置以刚好突破内壳膜为宜，大小与1 mL医用注射器针头相仿。

（4）蛋内注射并封孔：将种蛋平均分为四组，分别为高浓度组（500 ng / 100 μL）、中浓度组（250 ng / 100 μL）、低浓度组（125 ng / 100 μL）以及对照组（不含T3的生理盐水注射组），用1 mL医用注射器吸取注射液，给相应组注入T3工作液或生理盐水，针头拔出后用熔化的石蜡封住小孔以防种蛋后期感染。

（6）凉蛋：从13-28胚龄必须进行凉蛋程序，室温要求20 - 25℃。每天在固定时间将蛋盘从孵化器中取出，置于桌上，用喷壶承装27 - 30℃纯净水，将蛋表面喷洒至潮湿状态，放置5-10分钟后，放入孵化器中继续孵化。第13 - 20胚龄，每日1次；第21 - 28胚龄，每日2次。

（7）结果观察

对以上三组重复多次试验，以下得出的数据均为平均数，高浓度组在8胚龄的死亡率达到19%，在19胚龄的死亡率达到80%；中浓度组在8胚龄的死亡率达到7%，在19胚龄的死亡率达到13%；低浓度组在8胚龄的死亡率达到6%，在19胚龄的死亡率达到15%；对照组在8胚龄的死亡率达到5%，在19胚龄的死亡率达到12%。

对于以上三组重复多次试验，最终得到高浓度组活雏数过少，出雏重数据没有统计学意义，剔除。对其他3组27胚龄活胚率、胚重进行对比的结果见下表：

分组	对照组	中浓度组	低浓度组
				平均活胚率（%）	79	83	81
平均胚重（g）	45.20±1.28	48.89±0.67^**	45.86±0.91

由上表可知，中浓度的活胚率为最高，而且27胚龄胚重极显著高于对照组，说明该浓度为最合适的。

上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案，本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理，属于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种提高胚胎期鸭生长速度的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：（1）制备甲状腺激素溶液：①将生理盐水与氢氧化钠混合，得到pH值为10.7～11.2的混合液，混合液保存于4℃待用；②将甲状腺激素溶解于①步的混合液后，采用梯度稀释法进行稀释，得到pH值为6.5～7.0的甲状腺激素溶液；

（3）对鸭种蛋消毒，消毒后向鸭种蛋内注射步骤（2）的甲状腺激素溶液并封孔；向鸭种蛋内注射甲状腺激素溶液的方法为：①在温度为15～25℃条件下，用1 mL注射器从注射剂瓶中吸取甲状腺激素溶液； ②注射器由鸭种蛋锐端垂直地扎入，针尖进入鸭种蛋内0.5 ～ 1 cm即可；③注射器倾斜30 ～ 45°，针尖继续深入鸭种蛋内1～1.5 cm，然后向鸭种蛋内注射100 μL 甲状腺激素溶液；④注射后针头先后退0.5 ～1cm，然后将注射器移动至与鸭种蛋锐端垂直方向成10 ～ 30°角时，将针缓慢拔出；⑤用熔化的石蜡封住针孔；

2.根据权利要求1所述提高胚胎期鸭生长速度的方法，其特征在于，步骤（1）第②步的操作方法为，将甲状腺激素溶解于①步的混合液中，得到浓度为0.25mg/mL的甲状腺激素母液；用生理盐水将甲状腺激素母液浓度稀释至5μg /mL，得到中间液；再用生理盐水将中间液浓度稀释至2.5μg / mL，即得到甲状腺激素溶液，甲状腺激素溶液的pH值为6.5～7.0。

3.根据权利要求1所述提高胚胎期鸭生长速度的方法，其特征在于，步骤（4）孵化的温度、湿度为：第1天温度38.2℃、湿度50%，第2 ～ 3天温度38℃、湿度50%，第4 ～ 20天温度37.8℃、湿度55%，第21 ～25天温度37.5℃、湿度65%，第26天至出雏温度37.2℃、湿度75%。

4.根据权利要求3所述提高胚胎期鸭生长速度的方法，其特征在于，在鸭种蛋孵化过程中，从第13天到28天，每天对鸭种蛋进行降温处理，第13～ 20天，每天1次降温处理；第21～ 28天，每天2次降温处理。

5.根据权利要求4所述提高胚胎期鸭生长速度的方法，其特征在于，降温处理的方法为，将鸭种蛋从孵化箱中取出，在温度为20～ 25℃条件下，将27 ～ 35℃纯净水喷洒至鸭种蛋表面，放置5 ～ 10分钟后，再放入孵化器中继续孵化。