CN105228999A - 吗啉代寡核苷酸的制备方法 - Google Patents

吗啉代寡核苷酸的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过使用5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的吗啉代核苷酸作为原料，可提供能够在液相合成法中有效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸的方法。

Description

吗啉代寡核苷酸的制备方法
技术领域
本发明涉及吗啉代寡核苷酸的制备方法、以及用作该制备方法的原料的吗啉代核苷酸。
背景技术
吗啉代寡核苷酸对DNA、RNA的亲和性高，具有对各种核酸酶的抗性，在机体内稳定，毒性也低，因此是作为反义寡核苷酸的使用备受注目的化合物(参照非专利文献1)。
作为吗啉代寡核苷酸的制备方法，报道了固相合成法和液相合成法(参照非专利文献2、专利文献1～5)。
固相合成法能够自动合成化，在速度方面有利，但设备上的限制使其规模扩大受限，另外由于反应性低，因此用于核苷酸延伸反应中的试剂单体需要过量使用，不适合工业化大量合成。另外，还存在难以确认中间步骤中的反应进行状况、难以解析中间体结构等缺点。
另一方面，液相合成法需要柱纯化等繁杂的处理，难以大量且迅速地合成可用作反义药物的20mer(单体单元)左右链长的吗啉代寡核苷酸。
近年来，作为想要消除液相法和固相法各自缺点的尝试，报道了使用疏水性基团键合核苷、准固相保护核苷等的寡核苷酸的合成方法(参照专利文献6、7)。但是，对于反应路径、反应本身与寡核苷酸合成不同的吗啉代寡核苷酸的合成，既无记载也无启示。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO91/09033号
专利文献2：国际公开WO2008/008113号
专利文献3：美国专利申请公开第2009/0131632号说明书
专利文献4：国际公开WO2009/064471号
专利文献5：国际公开WO2012/043730号
专利文献6：日本特开2010-275254号公报
专利文献7：国际公开WO2012/157723号
非专利文献
非专利文献1：Summerton，J.等，AntisenseandNucleicAcidDrugDevelopment，1997年，Vol.7，p.187.
非专利文献2：Harakawa等，Bioorganic&MedicinalChemistryLetters，2012年，Vol.22，p.1445-1447
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供利用液相法有效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸的方法、以及作为该方法的原料的新型吗啉代核苷酸。
用于解决问题的方案
本发明人等发现，通过在吗啉代寡核苷酸的液相合成中，用特定保护基对5’位羟基侧进行保护，能够解决上述课题。
即，通过使用5’位羟基侧被该保护基保护的吗啉代核苷酸作为吗啉代寡核苷酸液相合成的原料，缩合反应本身能够在液相中进行，故反应性与固相法相比显著提高，可显著降低使用的单体当量，进而能够在反应后利用结晶或萃取操作简便地对吗啉代寡核苷酸进行分离、纯化，因此能够有效且高收率地用液相法合成可用于药物的链长20mer左右的吗啉代寡核苷酸。
另一方面，本发明人等在研究吗啉代寡核苷酸的液相合成的过程中，发现缩合反应中使用的活化吗啉代核苷单体在下一循环的缩合反应中微量残留时引起双重加成，所得吗啉代寡核苷酸的品质下降的问题。对此，本发明人发现通过用猝灭剂处理缩合反应后残留的活化吗啉代核苷单体，能够解决问题。
即，本发明包括以下内容。
[1]吗啉代核苷酸，其由通式(I)表示：
[式中，
m表示0以上的任意整数；
m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
P1表示氢原子、或者在酸性条件下可除去的临时保护基；
m个X各自独立地表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基(ピペラジノ基)；
m个W各自独立地表示氧原子或硫原子；
S1表示单键、或*O-S2**(式中，*表示与L的键合位置，**表示与5’位羟基的键合位置，S2表示主链原子数1至20的间隔基。)所示的基团；
L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
**表示与S1的键合位置，
L1表示任选取代的二价C1-22烃基，并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)所示的基团。]；
Y表示单键、氧原子、或NR(R表示氢原子、烷基或芳烷基。)；以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基，
k个Q各自独立地表示单键，或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
k表示1～4的整数，
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，
Ra表示氢原子，
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置，
j表示0～4的整数，
j个Q表示与上述相同的含义，
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基，并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。)，或者
Ra和Rb一起形成氧原子。]。]。
[2]上述[1]记载的吗啉代核苷酸，其中，m为0。
[3]上述[1]或[2]记载的吗啉代核苷酸，其中，
通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
R5和/或R7为碳原子数10～40的烷基。
[4]上述[1]或[2]记载的吗啉代核苷酸，其中，
通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
Ra和Rb均为氢原子，并且R5为碳原子数10～40的烷基。
[5]上述[1]或[2]记载的吗啉代核苷酸，其中，
通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
R5和/或R7为碳原子数12～30的烷基。
[6]上述[1]或[2]记载的吗啉代核苷酸，其中，
通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
Z-Y-为选自下组的基团：
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氧基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氧基、
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氨基、
2，4-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
二(4-二十二烷基氧基苯基)甲氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)环己基甲氧基]苄氨基、
2，4-二(十二烷基氧基)苄氨基、
苯基(2，3，4-三(十八烷基氧基)苯基)甲氨基、
二[4-(12-二十二烷基氧基十二烷基氧基)苯基]甲氨基、
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、以及
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基。
[7]上述[1]或[2]记载的吗啉代核苷酸，其中，
Z-Y-L-选自下列基团：
2-{2，4-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{1-[(2-氯-5-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基)]苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{2-[3’，4’，5’-三(2”，3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基琥珀酰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄基琥珀酰基、
2-{4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[2，3，4-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[4-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]-4’-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄基琥珀酰基、以及
2-{3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄氨基羰基}乙基羰基。
[8]上述[1]至[7]中任一项记载的吗啉代核苷酸，其中，
P1为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、或者二甲氧基三苯甲基。
[9]n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，该方法包括：
(2)使p聚体吗啉代寡核苷酸与n聚体吗啉代寡核苷酸经由其吗啉环氮原子通过(硫代)磷酰胺键((チオ)ホスホルアミダ一ト結合)或(硫代)磷酰二胺键((チオ)ホスホロジアミダ一ト結合)而缩合的步骤，所述p表示1以上的任意整数，所述n表示1以上的任意整数，
所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化((チオ)ホスホルアミダ一ト化)，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基、或者在5’位羟基具有含羟基的取代基时存在于该取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
[10]上述[9]记载的制备方法，其中，p为1。
[11]上述[9]或[10]记载的制备方法，其中，
反应结束后，用猝灭剂处理反应混合物。
[12]上述[9]至[11]中任一项记载的制备方法，其进一步包括下述步骤(1)：
(1)在缩合步骤(2)之前，在非极性溶剂中，使n聚体吗啉代寡核苷酸与酸反应来除去吗啉环氮原子的临时保护基的步骤，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基、或者在5’位羟基具有取代基时存在于该取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护。
[13]上述[12]记载的制备方法，其中，
在阳离子清除剂的存在下进行临时保护基的除去。
[14]上述[12]或[13]记载的制备方法，其中，
在步骤(1)中，在除去吗啉环氮原子的临时保护基后，进一步包括用有机碱进行中和的步骤。
[15]上述[9]至[14]中任一项记载的制备方法，其中，
具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
Z-Y-L-(II)
[L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
**表示与S1的键合位置，
L1表示任选取代的二价C1-22烃基，并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)所示的基团。]；
Y表示单键、氧原子、或NR(R表示氢原子、烷基或芳烷基。)；以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基，
k个Q各自独立地表示单键，或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
k表示1～4的整数，
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，
Ra表示氢原子，
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置，
j表示0～4的整数，
j个Q表示与上述相同的含义，
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基，并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。)；或者
Ra和Rb一起形成氧原子。]。
[16]上述[15]记载的制备方法，其进一步包括下述步骤(3)：
(3)向步骤(1)和/或(2)所得的反应液中添加极性溶剂，使吗啉代寡核苷酸沉淀，通过固液分离得到吗啉代寡核苷酸的步骤。
[17]上述[12]至[16]中任一项记载的制备方法，其中，
非极性溶剂为选自卤化溶剂、芳族溶剂、酯溶剂、脂族溶剂、非极性醚溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
[18]上述[16]或[17]记载的制备方法，其中，
极性溶剂为醇溶剂或腈溶剂。
[19]上述[9]至[18]中任一项记载的制备方法，其进一步包括下述步骤(4)：
(4)将所得的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的保护基全部除去的步骤。
[20]上述[9]至[19]中任一项记载的制备方法，其中，
在酸性条件下可除去的临时保护基为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、或者单甲氧基三苯甲基。
发明的效果
根据本发明，可以兼具液相法的优点和固相法的优点，该液相法的优点是能够通过用特定保护基对吗啉代核苷酸的5’位羟基侧进行保护来提高反应性从而降低缩合反应中的原料单体当量，该固相法的优点是能够在延伸反应每个阶段中通过结晶、洗涤或萃取操作简便地对吗啉代寡核苷酸进行分离、纯化，因此能够有效且高收率地进行作为药物有用的20mer左右链长的吗啉代寡核苷酸的工业化大量生产。
另外，同时还发现通过用猝灭剂处理缩合反应后残留的活化吗啉代核苷单体，能够防止目标吗啉代寡核苷酸的品质下降，通过与上述方法组合，能够提供大量且有效地制备高品质吗啉代寡核苷酸的方法。
具体实施方式
本发明涉及5’位羟基侧被特定保护基保护、且吗啉环氮原子任选被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的新型吗啉代核苷酸。
另外，本发明的另一实施方式是n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，该方法包括使p聚体吗啉代寡核苷酸与n聚体吗啉代寡核苷酸经由其吗啉环氮原子通过(硫代)磷酰胺键或(硫代)磷酰二胺键而缩合的步骤，所述p表示1以上的任意整数，所述n表示1以上的任意整数，所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
以下进行说明。
[术语的说明]
除非文中另有说明，本说明书中使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。与本说明书中记载的方法和材料相同或等同的任意方法和材料均可用于本发明的实施或试验中，但优选的方法和材料记载如下。为了记载和公开例如能够与所记载的发明关联使用的出版物中记载的构筑物和方法论，本说明书中提及的所有出版物和专利作为参照并入本说明书中。
本说明书中，作为吗啉代寡核苷酸的构成单元的“吗啉代核苷”是指下列式(1)代表的化合物。
(式中，碱基表示任选被保护的核酸碱基)
吗啉代核苷(1)可以按照本身公知的方法(例如WO91/09033A1中记载的方法)、或者以其为基准的方法进行制备。具体而言，如下列流程图所示，可以通过利用高碘酸钠等使相应核糖核苷(2)氧化开环形成相应2’，3’-二醛(3)，利用氨使二醛(3)闭环形成2’，3’-二羟基吗啉代核苷(4)，利用还原剂(例如氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠等)将二羟基吗啉代核苷(4)还原，得到吗啉代核苷(1)。
应予说明，本说明书中吗啉代核苷的位置编号(1’、2’等)采用与原料核糖核苷(2)的核糖的碳原子的位置编号相对应的位置编号。
本说明书中，吗啉代寡核苷酸是指，2个以上的吗啉代核苷经由5’位羟基和吗啉环的氮原子通过(硫代)磷酰胺键或(硫代)磷酰二胺键聚合而成的化合物，例如，作为m’+1聚体的吗啉代寡核苷酸可列举出下列式(5)代表的化合物。
(式中，
m’表示1以上的任意整数，
m’+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基，
m’个X各自独立地表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基等，
m’个W各自独立地表示氧原子或硫原子。)
本说明书中，“4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基”是指，哌嗪基的4位氮原子被保护基保护，优选为被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的哌嗪基。作为所述“哌嗪基4位氮原子的保护基”，优选为酰基，更优选为例如单氟乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、2-氟丙酰基、2，2-二氟丙酰基、3，3，3-三氟丙酰基、2，3，3，3-四氟丙酰基、五氟丙酰基等碳链上具有氟基的酰基(参照国际公开WO2008/008113号小册子)。对于哌嗪基而言，哌嗪基的碳原子上键合的氢原子可被取代，作为取代基可列举出甲基等烷基(优选碳原子数1～3)等。
本说明书中，按照核酸化学的惯例，将吗啉代寡核苷酸的5’位具有游离羟基一侧的末端(上述式(5)的左上侧)的吗啉代核苷称为“5’-末端”，相反侧的末端(上述式(5)的右下侧)的吗啉代核苷称为“3’-末端”。
本说明书中，“核酸碱基”只要是可用于合成核酸的核酸碱基则没有特别限制，例如可列举出胞嘧啶基(cytosylgroup)、尿嘧啶基(uracilgroup)、胸腺嘧啶基(thyminylgroup)等嘧啶碱基；腺嘌呤基、鸟嘌呤基等嘌呤碱基。另外，“任选被保护的核酸碱基”是指，例如在具有氨基的核酸碱基即腺嘌呤基、鸟嘌呤基、或胞嘧啶基中，氨基任选被保护，优选为核酸碱基的氨基被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。作为所述“氨基的保护基”没有特别限制，例如可列举出Greene’sPROTECTIVEGROUPSinORGANICSYNTHESIS(第4版，Wiley-Interscience出版，2006年)等记载的保护基。作为所述“氨基的保护基”的具体例，例如可列举出新戊酰基、新戊酰氧甲基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、二甲基甲脒基、9-芴基甲氧羰基等。其中，优选苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、以及二甲基甲脒基。另外，核酸碱基的羰基可以被保护，例如可以使苯酚、2，5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等进行反应，来保护羰基。此处，对于羰基的保护基，有时无需特别导入。另外，该“核酸碱基”除了上述基团以外还包括：核酸碱基在任意位置被1～3个任意取代基(例如卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烷氧基烷基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基等)取代而成的修饰核酸碱基(例如8-溴腺嘌呤基、8-溴鸟嘌呤基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鸟嘌呤基、次黄嘌呤基(hypoxanthinyl)等)。
本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子、或者碘原子。
本说明书中，作为“烷基”可列举出碳数1以上的直链或支链烷基，在不特别限制碳数范围的情况下，优选为C1-10烷基，更优选为C1-6烷基。作为不限定碳数范围的情况的适当具体例，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，特别优选为甲基、乙基。
本说明书中，作为“芳烷基”可列举出C7-20芳烷基，优选为C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。作为适当具体例，可列举出苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-苯丙基、萘甲基、1-萘乙基、1-萘丙基等，特别优选为苄基。
本说明书中，作为“烷氧基”可列举出碳数1以上的烷氧基，在不特别限制碳数范围的情况下，优选为C1-10烷氧基，更优选为C1-6烷氧基。作为不限定碳数范围的情况的适当具体例，可列举出甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等，特别优选为甲氧基、乙氧基。
本说明书中，作为“酰基”，例如可列举出直链或支链C1-6烷酰基、C7-13芳酰基等。具体而言，例如可列举出甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、乙酰丙酰基(levulinoyl)等，这些基团可分别被取代。
本说明书中，作为“烯基”，优选为直链或支链C2-6烯基等，例如可列举出乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。其中，优选为C2-4烯基。
本说明书中，作为“炔基”，优选为C2-6炔基等，例如可列举出乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基等。其中，优选为C2-4炔基。
本说明书中，“环烷基”是指环状烷基，例如可列举出环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。其中，优选为环丙基、环丁基、环戊基、环己基等C3-6环烷基，特别优选为环己基。
本说明书中，“芳基”是指显示出芳香族性质的单环或多环(稠合)烃基，具体而言，例如可列举出苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等C6-14芳基等。其中更优选为C6-10芳基，特别优选为苯基。
本说明书中，作为“烃基”，例如可列举出脂肪族烃基、芳香脂肪族烃基、单环饱和烃基、以及芳香族烃基等，具体而言，例如，烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等一价基团以及由它们衍生出的二价基团。
本说明书中，“具有烃基的有机基团”是指具有上述“烃基”的基团，“具有烃基的有机基团”中的“烃基”以外的部分可任意设定。例如，可以具有-O-、-S-、-COO-、-OCONH-、以及-CONH-等部分作为连接基。
本说明书中，“任选取代”的“取代基”除了上述卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基以外，还包括羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、烷氧基羰基(烷氧基部分与上述烷氧基相同)、磺基(スルホ基)、二氧磷基(ホスホ基)、烷基硫基(烷基部分与上述烷基相同)、烷基亚硫酰基(烷基部分与上述烷基相同)、烷基磺酰基(烷基部分与上述烷基相同)、氨基、单烷基氨基(烷基部分与上述烷基相同)、二烷基氨基(烷基部分与上述烷基相同)、氧代基等。
[5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被特定保护基保护、且 吗啉环氮原子任选被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的吗啉代核苷 酸]
通过使用本发明所用的5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被特定保护基保护的吗啉代核苷酸，可以提供适合于液相合成的吗啉代寡核苷酸的制备方法。
其中，从可在目标吗啉代寡核苷酸的制备方法中实现高效率和高收率的观点出发，优选5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护的吗啉代核苷酸。
5’位羟基具有取代基的情况是指，5’位羟基的氢原子被具有羟基的取代基取代。作为“具有羟基的取代基”的“取代基”，只要是主链由1至20个原子组成的取代基则没有特别限制。此处，“主链”是指将5’位羟基的氧原子与存在于取代基上的羟基的氧原子连接的最短原子链，该原子链可进一步被取代。组成主链的原子选自碳原子、氧原子、氮原子、硫原子、磷原子等。作为“具有羟基的取代基”，具体而言可列举出在烷基、芳烷基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基、烷氧基羰基等具有烃基的有机基团中，烃基上的氢原子被羟基取代的基团等。另外，还可列举出例如国际公开WO2008/008113号小册子中公开的下列5’位羟基的取代基等。
作为“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”，可列举出一价基团和由其衍生出的二价基团，其中优选为碳数10～40的烷基，特别优选为碳数10～30的烷基。“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的烷基、烯基包括直链或支链烷基、直链或支链烯基。本发明的制备方法中，优选直链烷基、直链烯基，特别优选直链烷基。作为“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的优选具体例，例如可列举出癸基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、油基、亚油基、二十烷基、二十二烷基、异十八烷基等一价脂肪族烃基、以及由它们衍生出的二价基团。
作为5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子任选被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的吗啉代核苷酸，优选5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被式(II)：Z-Y-L-代表的保护基保护的吗啉代核苷酸，具体而言可列举出下列通式(I)代表的新型化合物(以下有时也称为本发明化合物)。
通式(I)：
[式中，
m表示0以上的任意整数；
m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
P1表示氢原子、或者在酸性条件下可除去的临时保护基；
m个X各自独立地表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基；
m个W各自独立地表示氧原子或硫原子；
S1表示单键、或*O-S2**(式中，*表示与L的键合位置，**表示与5’位羟基的键合位置，S2表示主链原子数1至20的间隔基。)所示的基团，；
L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
**表示与S1的键合位置，
L1表示任选取代的二价C1-22烃基，并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)所示的基团。]；
Y表示单键、氧原子、或NR(R表示氢原子、烷基或芳烷基。)；以及
Z表示式(a2)所示的基团：
[式中，*表示与Y的键合位置，
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基，
k个Q各自独立地表示单键，或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
k表示1～4的整数，
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，
Ra表示氢原子，
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
(式中，*表示键合位置，
j表示0～4的整数，
j个Q表示与上述相同的含义，
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基，并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。)；或者
Ra和Rb一起形成氧原子。]。]。
在后述本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法中，本发明化合物能够与5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)键合，形成m+1+p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)。
m为0时，本发明化合物理解为“吗啉代核苷”，是本发明的吗啉代寡核苷酸合成中的5’位末端的起始化合物。另外，本发明化合物广义上还包括3’末端侧的吗啉环氮原子未保护(P1为氢原子)的化合物。
上述式(I)中的m表示0以上的任意整数，优选为0。m的上限没有特别限制，优选为49以下，更优选为29以下，进一步优选为19以下。
上述式(I)中的m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基。“任选被保护的核酸碱基”是指，例如在具有氨基的核酸碱基即腺嘌呤基、鸟嘌呤基或胞嘧啶基中，氨基可被保护，或者在具有环状酰亚胺基的胸腺嘧啶基、尿嘧啶基中，酰亚胺基可被保护，优选核酸碱基的氨基被可耐受吗啉代核苷酸的吗啉环氮原子的脱保护条件的保护基保护的核酸碱基。作为所述“氨基的保护基”和“酰亚胺基的保护基”没有特别限制，例如可列举出Greene’sPROTECTIVEGROUPSinORGANICSYNTHESIS(第4版，Wiley-Interscience出版，2006年)等记载的保护基。作为所述“氨基的保护基”和“酰亚胺基的保护基”的具体例，例如可列举出新戊酰基、新戊酰氧甲基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、二甲基甲脒基、9-芴基甲氧羰基等。其中，优选苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、以及二甲基甲脒基。另外，核酸碱基的羰基可以被保护，例如可以使苯酚、2，5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲基甲硅烷基)乙醇、二甲基氨基甲酰氯、二乙基氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等进行反应，来保护羰基。此处，对于羰基的保护基，有时无需特别导入。
作为可用作本发明化合物3’末端吗啉环氮原子的保护基的临时保护基P1，只要是可在酸性条件下脱保护、作为羟基的保护基使用的临时保护基则没有特别限制，可列举出：三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、1，1-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等二(C1-6烷氧基)三苯甲基；1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中，从脱保护容易性、获取容易性的观点出发，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，更优选为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。
上述式(I)中的m个X各自独立地表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基，优选二C1-6烷基氨基。
作为C1-6烷氧基，优选甲氧基、乙氧基，更优选甲氧基。
作为二C1-6烷基氨基，优选二甲氨基、二乙氨基、N-乙基-N-甲氨基等，更优选二甲氨基。
作为哌嗪基的4位氮原子的保护基，优选酰基，更优选例如单氟乙酰基、二氟乙酰基、三氟乙酰基、2-氟丙酰基、2，2-二氟丙酰基、3，3，3-三氟丙酰基、2，3，3，3-四氟丙酰基、五氟丙酰基等碳链上具有氟基的酰基。该保护基通常在延伸反应结束后脱保护，按照国际公开WO2008/008113号小册子记载的方法，脱保护后可以进一步用修饰基修饰哌嗪基的氨基。作为修饰基，可列举出卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基、羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、烷氧基羰基、磺基、二氧磷基、烷基硫基、烷基亚硫酰基、烷基磺酰基等。作为哌嗪基中的修饰基，优选任选取代的酰基，更优选任选被胍基取代的酰基(例如6-胍基己酰基)。对于该哌嗪基而言，哌嗪基的碳原子上键合的氢原子可被取代，作为取代基可列举出甲基等烷基(优选碳原子数1～3)等。
m个W各自独立地表示氧原子或硫原子，优选为氧原子。
上述式(I)中的S1表示单键、或*O-S2**(式中，*表示与L的键合位置，**表示与5’位羟基的键合位置，S2表示主链原子数1至20的间隔基。)所示的基团，优选为单键。
作为S2代表的“主链原子数1至20的间隔基”，可列举出从5’位羟基具有取代基时的上述“具有羟基的取代基”中除去羟基而形成的二价基团。
上述式(a1)代表的连接基L的优选实施方式为以下基团：式(a1)中，
L1表示亚乙基、或者CH2-O-1，4-亚苯基-O-CH2；并且
L2表示C(＝O)，或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示C1-6亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-6烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-6亚烷基键。)所示的基团。
上述式(a1)代表的连接基L的另一优选实施方式为以下基团：式(a1)中，
L1表示亚乙基；并且
L2表示C(＝O)。
上述式(a1)代表的连接基L的另一优选实施方式为以下基团：式(a1)中，
L1表示亚乙基；并且
L2中的N(R3)-R1-N(R2)部分表示亚哌嗪基(piperazinylenegroup，ピペラジ二レン基)。
上述式(a1)代表的连接基L的又一优选实施方式为以下基团：式(a1)中，
L1表示亚乙基；并且
L2表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示亚戊基或亚己基，R2和R3各自独立地表示氢原子或甲基。)所示的基团。
上述连接基L的特别优选例为单键、或者容易获得且低价的琥珀酰基。
上述式(I)中的Y表示单键、氧原子、或者NR(R表示氢原子、烷基或芳烷基。)。
本说明书中，作为R代表的“烷基”，可列举出C1-30烷基，优选为C1-10烷基，更优选为C1-6烷基。作为适当具体例，可列举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等，特别优选甲基、乙基。
本说明书中，作为R代表的“芳烷基”，可列举出C7-30芳烷基，优选为C7-20芳烷基，更优选为C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。作为适当具体例，可列举出苄基、1-苯乙基、2-苯乙基、1-苯丙基、α-萘甲基、1-(α-萘基)乙基、2-(α-萘基)乙基、1-(α-萘基)丙基、β-萘甲基、1-(β-萘基)乙基、2-(β-萘基)乙基、1-(β-萘基)丙基等，特别优选苄基。
R优选为氢原子、C1-6烷基或C7-16芳烷基，更优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，特别优选为氢原子。
Y优选为单键、氧原子或NH。
Z的优选实施方式为式(a2)所示的基团。
上述式(I)中Z的优选实施方式，即上述式(I)中Z的式(a2)所示的基团包括：特定的苄基(式(a2)中，Ra和Rb均为氢原子，且R4为氢原子)；特定的苯甲酰基(式(a2)中，Ra和Rb一起形成氧原子，且R4为氢原子)；特定的二苯基甲基(式(a2)中，Ra为氢原子，R4为氢原子，k为1～3，且Rb为式(a3)(式中，R6为氢原子，j为0或1)所示的基团)；特定的芴基(式(a2)中，Ra为氢原子，k为1，Rb为式(a3)(式中，j为0)所示的基团，且R6与R4一起表示单键，与环A共同形成芴环)；特定的呫吨基(式(a2)中，Ra为氢原子，k为1，Rb为式(a3)(式中，j为0)所示的基团，且R6与R4一起表示-O-，与环A共同形成黄嘌呤环)。
在上述式(a2)的k个QR5基、以及式(a3)的j个QR7基中，Q为单键、或者-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，优选为-O-。k个QR5基、以及j个QR7基可以各自相同也可以不同。
上述式(a2)中，“Ra和Rb一起形成氧原子”是指，Ra和Rb一起形成羰基(C(＝O))。
以R5或R7表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”是指，其分子结构中具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的一价有机基团。
作为“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的碳数，优选碳数14～40，更优选碳数14～30。
“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的部位没有特别限制，可以存在于末端(一价基团)，也可以存在于除末端以外的部位(例如二价基团)。
作为“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”，可列举出一价基团和由其衍生出的二价基团，其中优选碳数14～40的烷基，特别优选碳数14～30的烷基。作为“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的具体例，例如可列举出癸基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、油基、亚油基、二十烷基、二十二烷基等一价直链脂肪族烃基；3，7，11，15-四甲基十六烷基、3，7，11-三甲基十二烷基、2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基等一价支链脂肪族烃基、以及由它们衍生出的二价基团。
“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”以外的部分可以任意设定。例如，可以具有作为连接基的-O-、-S-、-COO-、-OCONH-和-CONH-、以及烃基(一价基团或二价基团)等部分。作为所述“烃基”，例如可列举出脂肪族烃基、芳香脂肪族烃基、单环饱和烃基和芳香族烃基等，具体而言，例如可以使用烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等一价基团以及由它们衍生出的二价基团。作为“脂肪族烃基”以外的部分的“烷基”、“烯基”、“炔基”、“环烷基”、“芳基”、或“芳烷基”，例如可列举出与上述相同的基团。该“烃基”可被选自卤素原子(氯原子、溴原子、氟原子、碘原子)、任选被1个以上卤素原子取代的C1-6烷基、氧代基等中的取代基取代。
以组成上述通式(I)中的Z的“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”可通过支链等存在多个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”。在“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中存在多个“碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基”的情况下，它们各自可以相同也可以不同。
以组成上述通式(I)中的Z的“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的碳数总和的下限优选为10以上，更优选为12以上，进一步优选为14以上，更进一步优选为18以上，特别优选为30以上。另一方面，以“R5(基团)”和/或“R7(基团)”表示的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团”中的碳数总和的上限优选为200以下，更优选为150以下，进一步优选为120以下，进一步更优选为100以下，特别优选为80以下，特别更优选为60以下。即使在随着该碳数增大而吗啉代寡核苷酸成为长链的情况下，本发明化合物在极性溶剂中的结晶性或溶解性也良好。
上述式(a2)代表的Z的优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
Ra和Rb均表示氢原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1～3的整数。
上述式(a2)代表的Z的另一优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
k表示1～3的整数；
Ra和Rb均表示氢原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有1～3个碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的苄基、或者具有1～3个碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的环己基；并且
环A除了具有k个QR5以外，进一步任选具有选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
上述式(a2)代表的Z的另一优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
Ra表示氢原子；
Rb为上述式(a3)(式中，*表示键合位置；j表示0～3的整数；j个Q表示-O-；j个R7各自独立地表示C10-40烷基；R4和R6均表示氢原子。)所示的基团。
上述式(a2)代表的Z的又一优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
Ra表示氢原子；
Rb表示上述式(a3)(式中，*表示键合位置；j表示0～3的整数；j个Q表示-O-；j个R7各自独立地表示C10-40烷基；R6与环A的R4一起形成单键或-O-，由此环A与环B一起表示芴基或呫吨基。)所示的基团。
上述式(a2)代表的Z的另一优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1～3的整数。
上述式(a2)代表的Z的另一优选实施方式为以下基团：式(a2)中，
k表示1～3的整数；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有1～3个碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的苄基、或者具有1～3个碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的环己基；并且
环A除了具有k个QR5以外，进一步任选具有选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基中的取代基。
作为式(II)：Z-Y-L-代表的保护基，优选在可将3’末端的吗啉环氮原子的保护基P1除去的酸性条件下难以切断而在碱性条件下被切断的基团。
作为所述保护基的代表例，例如可列举出L为上述式(a1)所示的基团(优选为琥珀酰基等)，并且Z-Y-为以下基团的保护基：
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氧基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氧基、
3，5-二[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氨基、
2，4-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
二(4-二十二烷基氧基苯基)甲氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)环己基甲氧基]苄氨基、
2，4-二(十二烷基氧基)苄氨基、
苯基(2，3，4-三(十八烷基氧基)苯基)甲氨基、
二[4-(12-二十二烷基氧基十二烷基氧基)苯基]甲氨基、
3，5-二[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、或
3，4，5-三[3’，4′，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基。
另外，作为保护基Z-Y-L-的另一实施方式，可列举出以下的苄基琥珀酰基或二苯基甲基琥珀酰基：
2-{2，4-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{1-[(2-氯-5-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基)]苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{2-[3’，4’，5’-三(2”，3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基琥珀酰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄基琥珀酰基、
2-{4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[2，3，4-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[4-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]-4’-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄基琥珀酰基、以及
2-{3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄氨基羰基}乙基羰基。
作为式(II)：Z-Y-L-代表的保护基的另一优选实施方式为以下基团：
L和Y为单键；
Z表示式(a2)；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1～3的整数。
作为式(II)：Z-Y-L-代表的保护基的另一优选实施方式为以下基团：
L表示式(a1)；
L2表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**(式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键。)；
Y表示单键；
Z表示式(a2)；
Ra和Rb一起形成氧原子；
R4表示氢原子；
k个Q为-O-；
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团(例如C10-40烷基)；并且
k表示1～3的整数。
作为通式(I)代表的本发明化合物的优选实施方式为以下化合物：通式(I)中，
m为0；
碱基为各自任选被保护的胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、腺嘌呤基、或者鸟嘌呤基；
P1为三苯甲基、二(C1-6烷氧基)三苯甲基、或者单(C1-6烷氧基)三苯甲基；
S1为单键；并且
Z-Y-L-与上述通式(I)中以优选实施方式表示的各基团的组合相同。
作为上述通式(I)代表的本发明化合物的另一优选实施方式为以下化合物：通式(I)中，
m为0；
碱基为各自任选被保护的胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、腺嘌呤基、或鸟嘌呤基；
P1为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、或单甲氧基三苯甲基；
S1为单键；并且
Z-Y-L-与上述通式(I)中以优选实施方式表示的各基团的组合相同。
作为上述通式(I)代表的本发明化合物的又一优选实施方式为以下化合物：通式(I)中，
m为0；
碱基为各自任选被保护的胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基、腺嘌呤基、或鸟嘌呤基；
P1为三苯甲基；
S1为单键；并且
Z-Y-L-与上述通式(I)中以优选实施方式表示的各基团的组合相同。
[本发明化合物的制备方法]
作为m为0、S1为单键的通式(I)(以下称为“通式(Ia)”)代表的本发明化合物的制备方法没有特别限制，可以按照本身公知的方法或者以其为基准的方法(RichardT.Ponetal.，NucleicAcidsResearch2004，32，623-631.)，由上述保护基的前体进行制备。
上述通式(Ia)中L为琥珀酰基的化合物的常规制备方法如下所示。
(式中各符号与上述含义相同。)
通过在碱的存在下使3’末端吗啉环氮原子被保护基P1保护的吗啉代核苷(a)与琥珀酸酐反应，得到向5’位羟基引入了琥珀酸的化合物(b)。通过在缩合剂存在下使化合物(b)与保护基的前体(Z-Y-H)(醇或胺)脱水缩合，可以得到通式(Ia)代表的化合物。
从上述吗啉代核苷(a)向化合物(b)的转化步骤在对反应惰性的溶剂中进行是有利的。作为这样的溶剂，只要反应能进行则没有特别限制，优选为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化烃溶剂；苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃系溶剂；或者戊烷、己烷、庚烷、辛烷等脂肪族烃系溶剂；或者二***、四氢呋喃、环戊基甲基醚等醚系溶剂；或者它们的混合溶剂。其中特别优选二氯甲烷或氯仿。
作为碱没有特别限制，例如可列举出如后述的有机碱，优选为N，N-二甲氨基吡啶、三乙胺等。
上述脱水缩合步骤在对反应惰性的溶剂中进行是有利的。作为这样的溶剂，只要反应能进行则没有特别限制，优选为二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等卤化烃溶剂；苯、甲苯、二甲苯等芳香族烃系溶剂；或者戊烷、己烷、庚烷、辛烷等脂肪族烃系溶剂；或者它们的混合溶剂。其中特别优选二氯甲烷、氯仿。
作为化合物(b)与Z-Y-H的缩合反应中使用的缩合剂，可列举出二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺及其盐酸盐(EDC-HCl)、六氟磷酸(苯并***-1-基氧基)三吡咯烷基磷(PyBop)、O-(苯并***-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、1-[双(二甲氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并***鎓-3-氧化物六氟磷酸酯(HCTU)、O-苯并***-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)等。其中优选HBTU、HCTU、N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺及其盐酸盐(EDC-HCl)。
缩合剂的使用量相对于1摩尔化合物(b)，可以使用1～10摩尔，优选为1～5摩尔。另外，Z-Y-H的使用量相对于1摩尔化合物(b)，可以使用1～10摩尔，优选为1～5摩尔。反应温度只要反应能进行则没有特别限制，优选为-10℃～50℃，更优选为0℃～30℃。反应时间为30分钟～70小时。
对于上述通式(Ia)中L为琥珀酰基以外的化合物，也可以使用相应酸酐、相应二羧基卤化物(dicarboxylichalide)、相应二羧酸的活性酯等来代替上述制备方法中的琥珀酸酐，通过进行同样的反应而制备。
对于S1为*O-S2**(式中各符号表示与上述相同的含义)时的化合物，可以根据公知方法(例如WO2008/008113记载的方法)，向吗啉代核苷(a)的5’位羟基引入上述“具有羟基的取代基”后，按照上述方法进行制备。
另外，对于Y为单键时的化合物，可以按照本身公知的方法通过使Z-Y-H的活化衍生物(卤化物、酰基卤化物、活化羧基等)与吗啉代核苷(a)反应，或者在缩合剂的存在下使Z-Y-H与吗啉代核苷(a)反应来进行制备。Z-Y-H和吗啉代核苷(a)的缩合反应可以与Z-Y-H和化合物(b)的缩合反应同样进行。
m为1以上的通式(I)代表的化合物可以按照下列本发明的制备方法，通过使用通式(Ia)代表的化合物作为起始原料，重复5’末端延伸过程来进行制备。
作为上述保护基的前体(Z-Y-H)(醇、胺或羧酸)的制备方法没有特别限制，可以按照本身公知的方法(例如参照Bull.Chem.Soc.Jpn.2001，74，733-738；日本特开2000-44493号公报、国际公开WO2006/104166号小册子、国际公开WO2007/034812号小册子、国际公开WO2007/122847号小册子、国际公开WO2010/113939号小册子、日本特开2010-275254号公报、国际公开WO2012/157723号小册子等)或者以它们为基准的方法由原料化合物进行制备。
应予说明，用作原料化合物的化合物，例如组成通式(I)中的Z的R5、R7所对应的卤化物等可以作为市售品获得，或者按照本身公知的方法或者以它们为基准的方法进行制备。
另外，如上所述，该保护基的前体(Z-Y-H)可以按照本身公知的方法或者以它们为基准的方法进行制备，但在原料化合物具有对反应造成影响的取代基(例如，羟基、氨基、羧基)的情况下，通常按照公知方法预先用适当的保护基保护原料化合物后再进行反应。所述保护基在反应后可以通过酸处理、碱处理、催化还原等公知方法除去。
作为3’末端吗啉环氮原子被保护基P1保护的吗啉代核苷(a)的制备方法没有特别限制，可以按照本身公知的方法(例如参照WO91/09033A1)或者以它们为基准的方法由吗啉代核苷(1)进行制备。
例如，在P1为三苯甲基的情况下，可以通过使吗啉代核苷(1)在三乙胺等碱的存在下与氯化三苯甲基反应而得到化合物(a)。
另外，P1为氢原子的化合物(a)可以通过使P1为临时保护基的化合物(a)进行后述脱保护步骤(1)而得到。
[本发明的制备方法]
接着，对本发明所述的吗啉代寡核苷酸的制备方法(以下也称为“本发明的制备方法”)进行说明。具体而言，对由被适当保护的n聚体吗啉代寡核苷酸制备被适当保护的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法进行说明，例如，在n＝1的情况下n聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代核苷”，在p＝1的情况下p聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代核苷”，n+p聚体吗啉代寡核苷酸应理解为“吗啉代二核苷酸”。
本发明的制备方法优选包括以下步骤(2)。
(2)使p聚体吗啉代寡核苷酸(以下有时也简称为“活化吗啉代核苷酸”)与n聚体吗啉代寡核苷酸经由其吗啉环氮原子通过(硫代)磷酰胺键或(硫代)磷酰二胺键而缩合，得到n+p聚体吗啉代寡核苷酸的步骤，所述p表示1以上的任意整数，所述n表示1以上的任意整数。所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护；所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基、或者在5’位羟基具有含羟基的取代基时存在于该取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
n的上限没有特别限制，优选为50以下，更优选为30以下，进一步优选为20以下。
p的上限没有特别限制，优选为50以下，更优选为30以下，进一步优选为20以下，进一步更优选为5以下，特别优选为3以下。
本发明的制备方法优选还包括下列步骤(1)，制备步骤(2)中使用的、5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸。
(1)在缩合步骤(2)之前，在非极性溶剂中，使n聚体吗啉代寡核苷酸与酸反应来除去吗啉环氮原子的临时保护基的步骤，所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护。
步骤(1)优选在除去吗啉环氮原子的临时保护基后，还包括用有机碱进行中和的步骤。由此，能够在液体中连续进行步骤(1)和步骤(2)，并且可以连续进行吗啉代核苷酸延伸形成吗啉代寡核苷酸。
通过用具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护n聚体吗啉代寡核苷酸的5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基，所得n+p聚体吗啉代寡核苷酸的脂溶性提高，例如，通过包括下列步骤(3)，能够简便且有效地除去过量原料、副产物，将n+p聚体吗啉代寡核苷酸纯化。
(3)向步骤(1)和/或(2)所得的反应液中添加极性溶剂，使n+p聚体吗啉代寡核苷酸沉淀，通过固液分离得到目标物的步骤。
如下列(A)～(C)所示，可以对步骤(1)和(2)的反应液两者均进行步骤(3)，也可以仅对步骤(1)和(2)的反应液的任一者进行步骤(3)。
(A)步骤(1)→步骤(3)→步骤(2)→步骤(3)
(B)步骤(1)→步骤(2)→步骤(3)
(C)步骤(1)→步骤(3)→步骤(2)
具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基优选为式(II)Z-Y-L-(式中各符号含义与上述相同)，在此情况下，可以进一步有效进行上述步骤(3)。
只要在通过对原料进行当量管理和反应控制能够控制副产物生成量的状况下，则优选重复作为步骤(1)和(2)的基本单位，包含步骤(3)。
另外，从能够严格管理、控制副产物生成，从而获得高纯度吗啉代寡核苷酸的观点考虑，优选以包括步骤(1)～步骤(3)的上述(A)～(C)中的任一者为基本单位重复进行。
本发明的制备方法通过进一步包含步骤(4)，能够对吗啉代寡核苷酸进行分离、制备。
(4)将所得的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的保护基全部除去的步骤。
以下对各步骤进行详细说明。
1.“n聚体吗啉代寡核苷酸”的说明
首先，对用于步骤(1)和(2)的原料的n聚体吗啉代寡核苷酸进行说明。
步骤(1)中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸是，例如下列通式(i)所示的5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的n聚体吗啉代寡核苷酸，步骤(2)中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸是，例如下列通式(ii)所示的5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸。
(式中，
m表示相当于n-1的0以上的任意整数，
P1’表示在酸性条件下可除去的临时保护基，
P2表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，
其他符号含义与式(I)中各定义相同。)
对于通式(i)和(ii)中的各符号，说明如下。
m的上限没有特别限制，通常为99以下，优选为74以下，更优选为49以下，进一步优选为29以下。
作为通式(i)中的P1’代表的在酸性条件下可除去的临时保护基，只要是可在酸性条件下脱保护、用作羟基的保护基的基团，则没有特别限制，可列举出三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、1，1-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等二(C1-6烷氧基)三苯甲基；1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中，从脱保护容易性、获取容易性的观点出发，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，更优选为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。
通式(i)和(ii)中的P2代表的“具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基”是指在可将3’末端吗啉环氮原子的保护基除去的酸性条件下稳定的基团，只要是在步骤(1)和(2)中能够使n聚体吗啉代寡核苷酸溶解于作为反应溶剂的非极性溶剂让反应进行的基团，则没有特别限制，优选为下列通式(II)所示的基团。
Z-Y-L-(II)
[式中，各符号含义与上述相同。]
作为5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基的保护基，只要使用具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基、更优选为式(II)所示的基团，则能够使n聚体吗啉代寡核苷酸和n+p聚体吗啉代寡核苷酸的脂溶性、在溶剂(尤其是非极性溶剂)中的溶解性提高，从而能够顺畅地进行步骤(1)和(2)，另外，如后述步骤(3)所示，能够简便地对n聚体吗啉代寡核苷酸、或n+p聚体吗啉代寡核苷酸进行分离、纯化。
式(II)中的L、Y和Z的优选实施方式与式(I)中的L、Y和Z相同。
2.“p聚体吗啉代寡核苷酸”的说明
首先，对用于步骤(2)的原料的p聚体吗啉代寡核苷酸进行说明。
作为步骤(2)中使用的“5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(p表示1以上的任意整数)”，只要满足该结构要求，则没有特别限制。
“5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化”是指，吗啉代寡核苷酸5’位羟基被例如下列式(c)所示的基团修饰。
(式中，
＊表示键合在吗啉代寡核苷酸5’末端羟基上的位置，
L1表示离去基团，
X表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基，
W表示氧原子或硫原子。)
“活化磷酸酯化”是指，上述式中，X为C1-6烷氧基、且W为氧原子的情况。
“活化硫代磷酸酯化”是指，上述式中，X为C1-6烷氧基、且W为硫原子的情况。
“活化磷酰胺化”是指，上述式中，X为二C1-6烷基氨基或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基、且W为氧原子的情况。
“活化硫代磷酰胺化”是指，上述式中，X为二C1-6烷基氨基或4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基、且W为硫原子的情况。
作为L1代表的离去基团，例如可列举出卤素原子、甲磺酰氧基、对甲苯磺酰氧基等，优选为氯原子。
X和W的含义、示例、优选实施方式如上述式(I)的说明所示。
“在酸性条件下可除去的临时保护基”的含义、示例、优选实施方式如上述式(I)的说明所示。
作为步骤(2)中使用的优选p聚体吗啉代寡核苷酸，可列举出通式(iii)代表的化合物。
(式中，
q表示相当于p-1的0以上的任意整数，
P1”表示在酸性条件下可除去的临时保护基，
其他符号含义与式(I)和式(c)中各定义相同。)
通式(iii)中的q优选为0。q的上限没有特别限制，通常为99以下，优选为74以下，更优选为49以下，进一步优选为29以下。
作为通式(iii)中的P1”代表的在酸性条件下可除去的临时保护基，只要是可在酸性条件下脱保护、用作羟基的保护基的基团，则没有特别限制，可列举出三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基硫代呫吨基、1，1-二(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、二甲氧基三苯甲基等二(C1-6烷氧基)三苯甲基、1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基、单甲氧基三苯甲基等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中，从脱保护容易性、获取容易性的观点出发，优选为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基，更优选为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基。
通式(iii)中的其他符号的优选实施方式如上述式(I)和(c)的说明所示。
本发明的p聚体吗啉代寡核苷酸可以按照本身公知的方法(例如WO91/09033A1记载的方法)、或者以其为基准的方法进行制备。例如，L1为氯原子的化合物可以通过使通式(iii)中5’位羟基未被活化的下列式(iii’)的化合物，与例如通式(d)：Cl2P(＝W)(X)(式中，W和X含义与上述相同)代表的二氯(硫代)磷酸酯或二氯(硫代)氨基磷酸酯反应来进行制备。
通式(d)代表的二氯(硫代)磷酸酯或二氯(硫代)氨基磷酸酯可以使用市售品，或者按照公知方法(例如WO91/09033、WO2008/008113等)记载的方法或以其为基准的方法进行制备。
通式(iii’)的化合物可以采用例如国际公开WO91/09033号小册子等的公知方法进行制备。
3.步骤(1)～(4)的说明
以下，为方便起见，参照式(i)、(ii)、(iii)等对步骤(1)～(4)进行说明，但步骤(1)～(4)并不限于此。
步骤(1)(脱保护步骤)
本步骤是：在缩合步骤(2)之前，在非极性溶剂中使5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的n聚体吗啉代寡核苷酸(i)与酸反应，除去吗啉环氮原子的临时保护基，得到5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的步骤(脱保护步骤)。
(式中，各符号含义与上述相同。)
本步骤在不影响反应的溶剂中进行。该溶剂中的溶解度越高，就越能期待优异的反应性，因此优选对本发明的n聚体吗啉代寡核苷酸(i)的溶解度高的非极性溶剂。具体而言，可列举出氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等卤化溶剂；苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等芳族溶剂；乙酸乙酯、乙酸异丙酯等酯溶剂；己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等脂族溶剂；二***、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等非极性醚溶剂。其中，优选二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚等。这些溶剂可以将两种以上以适当比例混合使用。
本步骤中的n聚体吗啉代寡核苷酸(i)在溶剂中的浓度只要能够溶解则没有特别限制，优选为1～30质量％。
作为本步骤中使用的酸，只要能够实现良好的脱保护则没有特别限制，优选使用三氟乙酸、氰基吡啶三氟乙酸盐和三氟乙醇、三乙胺三氟乙酸盐、氰基乙酸、乙酸、二氯乙酸、磷酸、甲磺酸、甲苯磺酸、盐酸等。
从能够实现良好的反应的观点考虑，更优选三氟乙酸、氰基吡啶三氟乙酸盐、三乙胺三氟乙酸盐、氰基乙酸，进一步优选氰基吡啶三氟乙酸盐、三乙胺三氟乙酸盐，特别优选三乙胺三氟乙酸盐。这些酸可以用上述非极性溶剂稀释。另外，使用上述酸时，可以与特定碱(例如三乙胺等)组合，适当调节酸度再使用。
本步骤中酸的使用量相对于1摩尔n聚体吗啉代寡核苷酸(i)，可以使用1～100摩尔，优选为1～40摩尔。
在本步骤中，为了防止由脱保护反应生成的三苯甲基阳离子等保护基P1的阳离子化物等引起的副反应，可以添加阳离子清除剂。作为优选的阳离子清除剂，可列举出吡咯、吲哚、乙醇、2，2，2-三氟乙醇、甲醇、苯甲醚、对甲酚、三异丙基硅烷、巯基乙醇、硫代苯甲醚等。其中更优选吡咯、吲哚、乙醇、2，2，2-三氟乙醇，特别优选乙醇、2，2，2-三氟乙醇。
阳离子清除剂的使用量，可以根据p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)相对于n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的过剩量(p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的摩尔数-n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的摩尔数)适当决定，相对于该过剩量(摩尔)优选为1～20当量，更优选为1～10当量。
本步骤的反应温度只要反应能进行则没有特别限制，优选为-10℃～50℃，更优选为0℃～40℃。反应时间根据使用的n聚体吗啉代寡核苷酸的种类、酸的种类、溶剂的种类、反应温度等而不同，为5分钟～5小时。
如果作为脱保护剂使用的酸存在于下一步骤的缩合步骤中，则会诱发p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的保护基P1”的脱保护，因此需要除去或中和处理。为了在液体中连续进行本脱保护步骤、其后的缩合步骤，优选在本步骤中除去3’末端吗啉环氮原子的临时保护基后，利用有机碱进行中和。
作为用于中和的有机碱，只要能够中和上述酸、所得的盐可以起到缩合剂的作用则没有特别限制，从反应良好地进行的观点考虑，优选N，N-二异丙基乙胺、吡啶、4-氰基吡啶、三乙胺，更优选N，N-二异丙基乙胺、三乙胺，特别优选N，N-二异丙基乙胺。
本步骤中的有机碱的使用量相对于1摩尔酸，可以使用1～10摩尔，优选为1～3摩尔。
本步骤中，特别优选的酸和有机碱的组合为氰基吡啶三氟乙酸盐和N，N-二异丙基乙胺、或者氰基乙酸和N，N-二异丙基乙胺。
步骤(2)(缩合步骤)
本步骤是：将5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)，与5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护、且吗啉环氮原子未被保护的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)，经由其吗啉环氮原子通过(硫代)磷酰胺键或(硫代)磷酰二胺键缩合，得到n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)的步骤。
(式中，各符号含义与上述相同。)
作为5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化、且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)，优选p为1的情况(即，5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化、且吗啉环氮原子被临时保护基P1”保护的吗啉代核苷)。
本步骤中使用的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)没有特别限制，优选可以使用上述步骤(1)中所得的n聚体吗啉代寡核苷酸。在此情况下，可以不分离n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)，向步骤(1)后的反应液中直接添加p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)。
或者，可以在步骤(1)之后，对反应液进行后述步骤(3)，将n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)暂时分离，溶解于规定溶剂后，再添加p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)。
本步骤在不影响反应的溶剂中进行。优选对本发明的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的溶解度高的非极性溶剂。具体而言，可列举出氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等卤化溶剂；苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等芳族溶剂；乙酸乙酯、乙酸异丙酯等酯溶剂；己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等脂族溶剂；二***、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等非极性醚溶剂。其中，优选二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚等。这些溶剂可以将两种以上以适当比例混合使用。另外，只要n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)能够溶解，则可以将极性溶剂以适当比例混合使用。具体而言，可列举出乙腈、丙腈等腈溶剂；丙酮、2-丁酮等酮溶剂；1，4-二噁烷、四氢呋喃等极性醚溶剂；N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮、1，3-二甲基-2-咪唑啉酮等酰胺系溶剂；二甲亚砜等亚砜系溶剂等极性溶剂。
p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的使用量相对于1摩尔n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)，可以使用1～10摩尔，优选为1～5摩尔，进一步优选为1～2摩尔。
反应温度只要反应能进行则没有特别限制，优选为0℃～100℃，更优选为20℃～50℃。反应时间根据缩合的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)、p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的种类、反应温度等而不同，为30分钟～24小时。
优选在本缩合反应结束后，用猝灭剂处理反应混合物。通过使用猝灭剂，可以将缩合反应中残留的p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)完全猝灭，能够避免下一循环的缩合反应中残留的活化吗啉代核苷酸引起双重加成，从而能够防止目标吗啉代寡核苷酸的品质下降。
应予说明，双重加成是指，上一循环的缩合反应中使用并残留的活化吗啉代核苷酸在下一循环的缩合反应中发生反应，对同一残基进行双重加成。
作为猝灭剂，只要是与p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)反应的亲核性试剂则可以没有限制地使用，作为优选例可列举出有机胺、硫醇，其中优选仲胺，特别优选吗啉。
猝灭剂的使用量，可以根据p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)相对于n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的过剩量(p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)的摩尔数-n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)的摩尔数)适当决定，相对于该过剩量(摩尔)优选为0.1～10当量，更优选为0.3～3当量。
向反应混合物中添加猝灭剂后，通过在0℃～100℃、优选为20℃～50℃下，反应30分钟～24小时、优选为30分钟～5小时，能够将p聚体吗啉代寡核苷酸(iii)完全猝灭。
步骤(3)(吗啉代寡核苷酸的分离、纯化步骤)
上述步骤(1)和/或(2)的步骤中所得的n聚体吗啉代寡核苷酸(ii)或n+p聚体吗啉代寡核苷酸(iv)，5’末端的羟基被保护基保护，该保护基是具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基，优选为式(II)：Z-Y-L-(式中，各符号含义与上述相同。)代表的保护基，因此对吗啉代寡核苷酸赋予了非常高的脂溶性，无需柱纯化等繁杂的操作，仅利用结晶或萃取操作即可简便地对吗啉代寡核苷酸进行分离、纯化。
以下，对利用结晶进行的吗啉代寡核苷酸的分离、纯化法进行说明，但本发明并不限于此。
利用结晶进行的吗啉代寡核苷酸的分离、纯化步骤是向步骤(1)和/或(2)所得的反应液中添加极性溶剂，使吗啉代寡核苷酸沉淀，通过固液分离得到目标物的步骤。
可以向步骤(1)和/或(2)所得的反应液中直接添加极性溶剂，也可以将步骤(1)和/或(2)所得的反应液浓缩后添加极性溶剂。
作为用于使本步骤中的目标物吗啉代寡核苷酸沉淀的极性溶剂，例如可列举出甲醇、乙醇、异丙醇等醇溶剂；乙腈、丙腈等腈溶剂；丙酮、2-丁酮等酮溶剂；二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮等酰胺溶剂；二甲亚砜等亚砜溶剂；水等；以及这些溶剂中两种以上的混合溶剂。应予说明，为了提高沉淀效率，极性溶剂可以使用有机溶剂和水的混合溶剂。在此情况下，极性溶剂中水的含量根据所用的有机溶剂设定适当的优选值即可，可以在通常为1～50％(V/V)、优选为10～30％(V/V)的范围内进行设定。作为极性溶剂，优选为醇溶剂、腈溶剂、或者这些溶剂各自与水的混合溶剂，更优选为甲醇、乙腈、或者这些溶剂各自与水的混合溶剂，特别优选乙腈或乙腈与水的混合溶剂。
本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法通过将上述步骤(1)-(3)-(2)-(3)的顺序、步骤(1)-(3)-(2)的顺序、或者步骤(1)-(2)-(3)的顺序重复所需次数，能够以高纯度且高收率得到目标吗啉代寡核苷酸。
步骤(4)(脱保护、吗啉代寡核苷酸分离步骤)
本发明的吗啉代寡核苷酸的制备方法中，在步骤(3)之后，可以根据保护基的种类、性质进行脱保护，对吗啉代寡核苷酸进行分离。作为脱保护的方法，例如可以按照Greene’sPROTECTIVEGROUPSinORGANICSYNTHESIS(第4版，Wiley-Interscience出版，2006年)等记载的脱保护方法，进行将吗啉代寡核苷酸的所有保护基除去的步骤。具体而言，本发明中具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基、以及作为核酸碱基的保护基的苯氧基乙酰基、乙酰基等，可以通过用氨水、氨水/乙醇溶液、或氨水与甲基胺水溶液的混合液进行处理而全部除去。另外，吗啉代寡核苷酸3’末端吗啉环氮原子的保护基可以通过用步骤(1)中所用的酸或者将它们适当稀释后的溶液进行处理而除去。
上述各步骤中反应进行情况的确认均可适用与常规液相有机合成反应相同的方法。即，可以采用薄层硅胶色谱、高效液相色谱等对反应进行追踪。
步骤(3)或步骤(4)所得的吗啉代寡核苷酸通过进一步进行有机合成反应，还可以获得所需的吗啉代寡核苷酸衍生物。
由本发明制备的吗啉代寡核苷酸可以用于各种人体用或动物用的药物(RNA、DNA、寡核酸(oligonucleicacid)药物、肽修饰吗啉代寡核苷酸等)、功能性食品、特定保健食品、食品、化工产品、机体用或工业用高分子材料等各种用途。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。另外，除非另有说明，本发明中使用的试剂、装置、材料均可商业获取。另外，本说明书中，用缩写表示时，除非另有说明，各缩写表示均基于IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUBCommissiononBiochemicalNomenclature)的缩写或本领域的惯用缩写。
参考例、实施例中使用的缩写如下所示。
mo：吗啉代核苷
moA：吗啉代腺苷
moG：吗啉代鸟苷
moC：吗啉代胞苷
moT：吗啉代胸苷
moU：吗啉代尿苷
PMO：磷酰二胺吗啉代寡核苷酸(phosphorodiamidatemorpholinooligonucleotide)
例如，表示为PMO[A-G-C]时，是指左侧为5’末端，右侧为3’末端，从5’末端起依次为吗啉代腺苷、吗啉代鸟苷、吗啉代胞苷的磷酰二胺吗啉代寡核苷酸。
bz：苯甲酰基
pac：苯氧基乙酰基
ce：2-氰乙基
吗啉代核苷的核酸碱基被保护时，保护基在核酸碱基的缩写(A、G、C、T和U)的右侧以上标表示。
例如，Cbz是指胞嘧啶的氨基被苄基保护，Gce/pac是指鸟嘌呤的氨基被苯氧基乙酰基保护、羰基被2-氰乙基保护。
TOB：3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氧基
suc：琥珀酰基
Tr、Trt：三苯甲基
CYTFA：氰基吡啶三氟乙酸盐
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
TFE：2，2，2-三氟乙醇
TFA：三氟乙酸
DMAP：4-二甲氨基吡啶
MeCN：乙腈
HOBt：1-羟基苯并***
UHPLC：超高效液相色谱
EDC-HCl：N-乙基-N’-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐
MMTr：单甲氧基三苯甲基
teg：三甘醇
参考例1TOB-suc-moC bz -Tr的合成(向TOB锚定物(anchor)引入 suc-moC bz -Tr中间体)
将3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲醇(4500mg，4.92mmol)溶解于氯仿(45ml)中，冰浴下将suc-moCbz-Tr(3640mg，5.41mmol)、EDC-HCl(1141mg，5.95mmol)、DMAP(33mg，0.055mmol)分别分成三份间隔1小时添加。室温下搅拌一夜，中途追加投入suc-moCbz-Tr(503mg，0.74mmol)、EDC-HCl(157mg，0.82mmol)，利用HPLC确认反应结束。减压蒸馏除去溶剂，加入MeCN(10ml)再次进行减压蒸馏。向残渣中加入MeCN(50ml)，将沉淀物滤出，完全溶解于氯仿(30ml)后，用MeCN(90ml)重结晶。减压干燥得到TOB-suc-moCbz-Tr(7337mg，收率95％)。
TOF-MS+(m/z)1566.8
参考例2TOB-suc-moC bz -Tr的脱Tr反应
将TOB-suc-moCbz-Tr(500mg，0.32mmol)溶解于氯仿(5ml)中，冰浴下用30分钟缓慢滴加16mlA液*，室温下搅拌1.5小时。反应结束后，冰浴下缓慢加入DIEA(137μl)/氯仿(1ml)的稀释溶液，然后加入MeCN(50ml)，将沉淀物过滤。所得结晶用MeCN(10ml)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-moCbz(395mg，收率94％)。
*A液的组成如下所示：
EtOH/TFE/TFA/TEA/氯仿＝250μl/2.5ml/173μl/161μl/22.25ml。
TOF-MS+(m/z)1324.9
实施例1和2的流程图如下所示。
实施例1化合物2的合成：琥珀酰基连接基键合于化合物1[mo(Tr)C bz ]
氩气氛下，将化合物1[mo(Tr)Cbz](573mg，1.0mmol)和N，N-二甲氨基吡啶(183mg，1.5mmol)溶解于干燥二氯甲烷(7.0ml)中，加入琥珀酸酐(150mg，1.5mmol)，室温下搅拌3小时。利用薄层色谱确认反应结束后，加入甲醇(1.0ml)，将反应液减压浓缩。向所得浓缩残渣中加入乙酸乙酯(8.0ml)和0.5mol/l的KH2PO4水溶液(8.0ml)并进行萃取分层，进而向水层中加入乙酸乙酯(8.0ml)进行萃取。将所得乙酸乙酯层合并，用0.5mol/l的KH2PO4水溶液(13.0ml)、水(13.0ml)、饱和盐水(13.0ml)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤。将滤液浓缩干固得到化合物2[suc-mo(Tr)Cbz](680mg，定量(quant))。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ1.20(1H，t，J＝10.4Hz)，1.49(1H，t，J＝11.2Hz)，2.52-2.75(4H，m)，3.14(1H，d，J＝11.5Hz)，3.80(1H，d，J＝10.4Hz)，3.92(1H，d，J＝11.7Hz)，4.37-4.59(2H，m)，6.19(1H，d，J＝7.2Hz)，7.15-7.88(22H，m)
实施例2化合物3的合成：化合物2[suc-mo(Tr)C bz ]负载于TOB锚定物 [3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲醇]上
氩气氛下，将3，4，5-三(十八烷基氧基)苯甲醇(133mg，0.15mmol)、N，N-二甲氨基吡啶(21mg，0.18mmol)、化合物2[suc-mo(Tr)Cbz](123mg，0.18mmol)溶解于干燥二氯甲烷(2.4ml)中，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(101mg，0.53mmol)，室温下搅拌一整夜。利用薄层色谱确认反应结束后，加入甲醇(6.0ml)，将所得混合液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(6.0ml)，将所得浆液搅拌15分钟，过滤。对所得固体进行减压加热干燥，得到化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](218mg，95％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.88(9H，t，J＝6.8Hz)，1.22-1.85(98H，m)，2.54-2.68(4H，m)，3.12-3.18(1H，m)，3.58-3.65(1H，m)，3.88-3.98(6H，m)，4.07-4.15(2H，m)，4.35-4.43(1H，m)，5.00(2H，s)，6.25-6.29(1H，m)，6.53(2H，s)，7.15-7.88(22H，m)，8.50-8.56(1H，m)
m/z1569.14[M+H]+
实施例3～12的反应流程图如下所示。
实施例3化合物4[TOB-suc-moC bz ]的合成(使用CYTFA(氰基吡啶和三 氟乙酸的盐)作为脱Tr化剂的方法)
氩气氛下，向化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](62.7mg，0.04mmol)中加入含有2％CYTFA、1％乙醇、10％CF3CH2OH的二氯甲烷溶液(1.5ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(2.3ml)，室温下搅拌30分钟。然后，加入甲醇(1.5ml)，将溶液减压浓缩。向浓缩残渣中再次加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到脱Tr化的化合物4[TOB-suc-moCbz](52.0mg，98.0％)。
1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ0.88(9H，t，J＝6.9Hz)，1.22-1.85(96H，m)，2.45-2.53(1H，m)，2.62-2.74(5H，m)，2.94-3.00(1H，m)，3.38-3.46(1H，m)，3.89-4.00(7H，m)，4.13-4.24(2H，m)，4.98-5.07(2H，m)，5.75-5.82(1H，m)，6.54(2H，s)，7.45-7.65(4H，m)，7.83-8.00(3H，m)，8.62(1H，brs)
实施例4化合物4[TOB-suc-moC bz ]的合成(使用氰基乙酸作为脱Tr化剂 的方法)
氩气氛下，向化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](62.7mg，0.04mmol)中加入含有10％氰基乙酸、20％乙腈的二氯甲烷溶液(0.75ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(4.5ml)，室温下搅拌30分钟。然后，加入甲醇(1.5ml)，将溶液减压浓缩。向浓缩残渣中再次加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，将固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到脱Tr化的化合物4[TOB-suc-moCbz](50.0mg，94.3％)。
实施例5化合物5[TOB-suc-PMO[C bz -T]-Tr]的合成(使用3当量T单体 的方法)
氩气氛下，向化合物4[TOB-suc-moCbz](48.8mg，0.036mmol)中加入ClPONMe2-mo(Tr)T(61mg，0.11mmol)的四氢呋喃溶液(0.4ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.4ml)，室温下搅拌1.5小时。利用薄层色谱确认反应结束后，向反应液中加入甲醇(1.5ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](66.0mg，98.0％)。
实施例6化合物5[TOB-suc-PMO[C bz -T]-Tr]的合成(T单体减为1.1当量 的方法)
氩气氛下，向化合物4[TOB-suc-moCbz](54.2mg，0.04mmol)中加入ClPONMe2-mo(Tr)T(27mg，0.044mmol)的四氢呋喃溶液(0.4ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.4ml)，室温下搅拌1.5小时。利用薄层色谱确认反应结束后，向反应液中加入甲醇(1.5ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](70.8mg，93.2％)。
实施例7化合物5[TOB-suc-PMO[C bz -T]-Tr]的合成(从化合物3起始的 一锅法)
氩气氛下，向化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](62.7mg，0.04mmol)中加入含有2％CYTFA、1％乙醇、10％CF3CH2OH的二氯甲烷溶液(1.8ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(2.7ml)，室温下搅拌30分钟。然后，向该反应液中加入ClPONMe2-mo(Tr)T(73.1mg，0.12mmol)的四氢呋喃溶液(0.4ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.5ml)，室温下搅拌30分钟，进而在38℃下搅拌1小时。向反应液中加入甲醇(1.5ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](75.0mg，98.8％)。
实施例8化合物6[TOB-suc-PMO[C bz -T]]的合成(使用CYTFA作为脱Tr 化剂的方法)
氩气氛下，向化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](37.4mg，0.02mmol)中加入含有2％CYTFA、1％乙醇、10％CF3CH2OH的二氯甲烷溶液(0.75ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(1.0ml)，室温下搅拌30分钟。然后，加入甲醇(1.5ml)，将溶液减压浓缩。向浓缩残渣中再次加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到脱Tr化的化合物6[TOB-suc-PMO[Cbz-T]](30.0mg，92.1％)。
实施例9化合物6[TOB-suc-PMO[C bz -T]]的合成(使用氰基乙酸作为脱 Tr化剂的方法)
氩气氛下，向化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](37.4mg，0.02mmol)中加入含有10％氰基乙酸、20％乙腈的二氯甲烷溶液(0.38ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(2.3ml)，室温下搅拌30分钟。然后，加入甲醇(1.5ml)，将溶液减压浓缩。向浓缩残渣中再次加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到脱Tr化的化合物6[TOB-suc-PMO[Cbz-T]](31.0mg，95.2％)。
实施例10化合物7[TOB-suc-PMO[C bz -T-C bz ]-Tr]的合成(使用3当量C 单体的方法)
氩气氛下，向化合物6[TOB-suc-PMO[Cbz-T]](25.8mg，0.016mmol)中加入ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(32.7mg，0.05mmol)的四氢呋喃溶液(0.2ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.2ml)，室温下搅拌1.5小时。利用薄层色谱确认反应结束后，向反应液中加入甲醇(1.5ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物7[TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]-Tr](32.9mg，90.9％)。
实施例11化合物7[TOB-suc-PMO[C bz -T-C bz ]-Tr]的合成(C单体减为1.5 当量的方法)
氩气氛下，向化合物6[TOB-suc-PMO[Cbz-T]](99.4mg，0.06mmol)中加入ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(62.8mg，0.09mmol)的四氢呋喃溶液(0.6ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.75ml)，室温下搅拌5小时。利用薄层色谱确认反应结束后，向反应液中加入甲醇(2.7ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(2.7ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(2.7ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物7[TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]-Tr](131mg，94.4％)。
实施例12化合物7[TOB-suc-PMO[C bz -T-C bz ]-Tr]的合成(从化合物5起 始的一锅法)
氩气氛下，向化合物5[TOB-suc-PMO[Cbz-T]-Tr](75.9mg，0.04mmol)中加入含有2％CYTFA、1％乙醇、10％CF3CH2OH的二氯甲烷溶液(1.5ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(2.3ml)，室温下搅拌30分钟。然后，向该反应液中加入ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(83.8mg，0.12mmol)的四氢呋喃溶液(0.4ml)、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(0.5ml)，室温下搅拌30分钟，进而在38℃下搅拌45分钟。向反应液中加入甲醇(1.5ml)，将该溶液减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.5ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用甲醇(1.5ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到化合物7[TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]-Tr](90.8mg，97.9％)。
实施例13的反应流程图如下所示。
实施例13化合物8[PMO[CTC]]的合成
向化合物7[TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]-Tr](162mg，0.07mmol)中加入28％氨水(3.5ml)和乙醇(14.0ml)的混合液，置于高压釜中在55℃下加热搅拌一整夜。冷却至室温，利用薄层色谱确认反应结束，将内容物边用甲醇和二氯甲烷洗涤边转移至甲醇中。将该混合液减压浓缩，向所得浓缩残渣中加入甲醇(14.0ml)，浆液洗涤30分钟。滤出固体，将滤液浓缩，将所得固体溶解于0.2mol/l的KH2PO4水溶液(pH2.0)中，搅拌15分钟。利用薄层色谱确认原料消失后，用2.0mol/l氢氧化钠水溶液调整至pH13～pH14，用膜滤器过滤，滤液进行HPLC分析后，结果与目标物分析标准品一致。
反相HPLC分析(柱＝InertSustainC18，5μm，4.6x150mm；溶剂A＝50mMTEAA(pH7.0)，溶剂B＝CH3CN；梯度＝0％-40％B(20min)；流量＝0.75ml/min；温度＝60℃)：RT11.6min，11.7min，11.8min，12.0min(4种异构体混合物)
实施例14～16的反应流程图如下所示。
实施例14化合物9[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G pac -G pac -T-T -C bz -T-G pac ]-Tr]的合成(1次分离/1循环的方法)
由化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](78.4mg，0.05mmol)按照实施例7和12记载的方法，以一锅依次进行三苯甲基的脱保护和对应单体的偶联。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表1]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
2mer 96mg 97％ 8mer 139mg 89％
3mer 104mg 95％ 9mer 110mg 84％
4mer 120mg 100％ 10mer 101mg 97％
5mer 134mg 104％ 11mer 70mg 67％
6mer 138mg 92％ 12mer 74mg 94％
7mer 151mg 104％
实施例15化合物9[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G pac -G pac -T-T- C bz -T-G pac ]-Tr]的合成(2次分离/1循环、使用氰基乙酸作为脱Tr化剂的方法)
由化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](94.1mg，0.06mmol)按照实施例4和9记载的方法进行三苯甲基的脱保护，按照实施例5和10记载的方法依次进行对应单体的偶联。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表2]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
2mer 112mg 94％ 8mer 236mg 96％
3mer 169mg 94％ 9mer 245mg 97％
4mer 183mg 94％ 10mer 232mg 88％
5mer 206mg 98％ 11mer 222mg 93％
6mer 216mg 93％ 12mer 218mg 90％
7mer 231mg 95％
实施例16化合物10[PMO[CCTCCGGTTCTG]-Tr]的合成
向实施例15合成的化合物9[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gpac-Gpac-T-T-Cbz-T-Gpac]-Tr](6.0mg，1.0μmol)中加入28％氨水/乙醇＝1/3(v/v)(0.2ml)，封入高压釜中，55℃下加热搅拌一整夜。返回至室温，边用甲醇洗涤边过滤除去固形物。将滤液浓缩，得到化合物10[PMO[CCTCCGGTTCTG]-Tr]的粗产物(3.3mg，80％)。
反相HPLC分析(柱＝InertSustainC18，5μm，4.6x150mm；溶剂A＝50mMTEAA(pH7.0)，溶剂B＝CH3CN；梯度＝10％-70％B(20min)；流量＝0.75ml/min；温度＝60℃)：RT13.1min
实施例17和18的反应流程图如下所示。
实施例17化合物11[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G pac -G pac -T-T- C bz -T-G pac -A bz -A bz -G pac -G pac -T-G pac -T-T-C bz ]-Tr]的合成
由化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](78.4mg，0.05mmol)按照实施例3和8记载的方法进行三苯甲基的脱保护，按照实施例5和10记载的方法依次进行对应单体的偶联。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表3]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
2mer 92mg 92％ 12mer 92mg 92％
3mer 89mg 86％ 13mer 87mg 90％
4mer 98mg 95％ 14mer 84mg 90％
5mer 103mg 91％ 15mer 82mg 92％
6mer 111mg 95％ 16mer 79mg 91％
7mer 123mg 98％ 17mer 71mg 86％
8mer 112mg 85％ 18mer 65mg 86％
9mer 103mg 87％ 19mer 49mg 74％
10mer 95mg 86％ 20mer 37mg 75％
11mer 93mg 94％ 21mer 25mg 66％
实施例18化合物12[PMO[CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC]-Tr]的合成
将化合物11[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gpac-Gpac-T-T-Cbz-T-Gpac-Abz-Abz-Gpac-Gpac-T-Gpac-T-T-Cbz]-Tr](6mg，0.61mmol)溶解于28％氨水/乙醇＝1/3(v/v)(200μl)中，封入高压釜中，55℃下搅拌一整夜。返回至室温，边用甲醇洗涤边过滤除去固形物。将滤液浓缩，得到化合物12[PMO[CCTCCGGTTCTGAAGGTGTTC]-Tr]的粗产物(3.1mg，71％)。
反相HPLC分析(柱＝InertSustainC18，5μm，4.6x150mm；溶剂A＝50mMTEAA(pH7.0)，溶剂B＝CH3CN；梯度＝10％-70％B(20min)；流量＝0.75ml/min；温度＝60℃)：RT12.4min
阴离子交换HPLC分析(柱＝DNAPacPA-100，4.0x250mm；溶剂A＝10mMNaOH水溶液，B＝1MNaCl，10mMNaOH水溶液；梯度＝20％-100％B(30min)；流量＝1.0ml/min；温度＝35℃)：RT10.8min
m/z7167.50[M+H]+
实施例19和20的反应流程图如下所示。
实施例19化合物13[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T] -Tr]的合成
由化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](502mg，0.32mmol)按照实施例3和8记载的方法进行三苯甲基的脱保护，按照实施例5和10记载的方法依次进行对应单体的偶联。对应于鸟苷的单体使用O6位具有氰乙基作为保护基的ClPONMe2-mo(Tr)Gce/pac。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表4]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
2mer 536mg 87％ 6mer 732mg 92％
3mer 576mg 94％ 7mer 682mg 92％
4mer 632mg 96％ 8mer 572mg 89％
5mer 694mg 97％
实施例20化合物14[PMO[CCTCCGGT]-Tr]的合成
将实施例19合成的化合物13[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-Tr](19.3mg，4.2μmol)悬浮于28％氨水/乙醇＝1/3(v/v)(2.0ml)中，封入高压釜中55℃下加热搅拌一夜。冷却至室温后，用二氯甲烷(1.5ml)和甲醇(1.5ml)转移至茄形瓶中，减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(2.0ml)，析出的固体用膜滤器滤出，将滤液浓缩干固，定量地得到化合物14[PMO[CCTCCGGT]-Tr]。
m/z929.2[M+3H]3+，1393.3[M+2H]2+
实施例21和22的反应流程图如下所示。
实施例21化合物15[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T-T- C bz -T-G ce/pac -A bz ]-Tr]的合成
使用实施例19合成的化合物13[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T]-Tr](487mg，0.11mmol)，按照实施例12记载的方法进行三苯甲基的脱保护和对应单体的偶联。对应于鸟苷的单体使用O6位具有氰乙基作为保护基的ClPONMe2-mo(Tr)Gce/pac。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表5]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
9mer 429mg 86％ 12mer 267mg 86％
10mer 400mg 93％ 13mer 208mg 92％
11mer 308mg 86％
实施例22化合物16[PMO[CCTCCGGTTCTGA]-Tr]的合成
将实施例21合成的化合物15[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T-Cbz-T-Gce/pac-Abz]-Tr](8.6mg，1.3μmol)悬浮于28％氨水/乙醇＝1/3(v/v)(1.0ml)中，封入高压釜中，55℃下加热搅拌一夜。冷却至室温后，用二氯甲烷(1.0ml)和甲醇(1.0ml)转移至茄形瓶中，减压浓缩。向浓缩残渣中加入甲醇(1.0ml)，析出的固体用膜滤器滤出，将滤液浓缩干固，定量地得到化合物16[PMO[CCTCCGG]-Tr]。
m/z1114.8[M+4H]4+，1486.0[M+3H]3+
实施例23和24的反应流程图如下所示。
实施例23化合物17[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac ]-Tr] 的合成
氩气氛下，向化合物3[TOB-suc-mo(Tr)Cbz](300mg，0.19mmol)中加入含有2％CYTFA、1％乙醇、10％CF3CH2OH的二氯甲烷溶液(8.0ml)，室温下搅拌90分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入含有5％N，N-二异丙基乙胺、25％2-丙醇的二氯甲烷溶液(12.0ml)，室温下搅拌30分钟。将该溶液减压浓缩，向所得浓缩残渣中加入乙腈(8.0ml)，室温下搅拌15分钟。将所得浆液过滤，固体用乙腈(8.0ml)洗涤。对该固体进行真空加热干燥，得到脱Tr化的化合物4[TOB-suc-moCbz](254mg，100％)。
氩气氛下，向化合物4[TOB-suc-moCbz](242mg，0.18mmol)中加入ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(382mg，0.55mmol)的四氢呋喃(1.8ml)溶液、以及含有25％N，N-二异丙基乙胺的1，3-二甲基-2-咪唑啉酮溶液(2.0ml)，室温下搅拌30分钟。利用薄层色谱确认反应结束后，加入吗啉(48μl，0.55mmol)搅拌10分钟。然后，向该溶液中加入乙腈(7.3ml)进行减压浓缩，向所得浓缩残渣中再次加入乙腈(7.3ml)，将所得浆液搅拌15分钟。将该浆液过滤，所得固体用乙腈(7.3ml)洗涤，减压加热干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr(355mg，98％)。
以下同样依次进行脱三苯甲基化和与对应单体的偶联，得到标题化合物17[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac]-Tr]。各阶段中分离出的产物重量和重量收率示于下表。
[表6]
链长 获得量 重量收率 链长 获得量 重量收率
2mer 355mg 98％ 5mer 372mg 100％
3mer 399mg 110％ 6mer 386mg 98％
4mer 358mg 87％ 7mer 306mg 77％
实施例24化合物18[PMO[CCTCCGG]-Tr]的合成
由实施例23合成的化合物17[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac]-Tr](4mg，0.94μmol)按照实施例22记载的方法进行脱保护并从载体切出，得到化合物18[PMO[CCTCCGG]-Tr]。
m/z819.3[M+3H]3+，1228.4[M+2H]2+
实施例25[TOB-suc-PMO[C bz -C bz ]](一锅延伸)
将TOB-suc-moCbz(395mg，0.30mmol)溶解于二氯甲烷(4ml)中，冰浴下将DIEA(1.8eq，0.54mmol，50μl)、ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(1.5eq，0.45mmol，312mg)分成三份间隔30分钟添加，室温下搅拌一夜。然后，将DIEA(0.1eq，0.03mmol，5μl)、ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(0.1eq，0.03mmol，21mg)分别三次追加投入，进而搅拌一整夜。反应结束后，加入吗啉(1.28eq，0.37mmol，34μl)，搅拌1.5小时，确认残留的ClPONMe2-mo(Tr)Cbz消失后，用10分钟缓慢滴加参考例2的A液(16.8ml)，室温下搅拌2小时。脱Tr化反应结束后，冰浴下缓慢添加DIEA(142μl，1.0eqvsTFA)/二氯甲烷(1ml)的稀释溶液，加入MeCN(50ml)生成沉淀。将悬浮液中的沉淀物过滤，滤出物用MeCN洗涤，得到[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz]](wet.526mg)。
TOF-MS+(m/z)1743.8
实施例26[TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T]]的合成(缩合3和一锅延伸)
将[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz]]直接以湿结晶形态(wet.526mg)溶解于二氯甲烷(10ml)中，冰浴下将DIEA(0.54mmol，50μl)、ClPONMe2-mo(Tr)T(0.45mmol，272mg)分成三份间隔30分钟添加。室温下搅拌一夜。然后，将DIEA(0.03mmol，3μl)、ClPONMe2-mo(Tr)T(0.03mmol，17mg)两次追加投入，室温下搅拌4小时。反应结束后，常温下加入吗啉(0.5eq，0.14mmol，21μl)，搅拌3小时。冰浴下用15分钟缓慢滴加参考例2的A液(30ml)，滴下结束后，室温下搅拌4小时。反应结束后，冰浴下缓慢添加DIEA(77μl)/二氯甲烷(1ml)的稀释溶液，然后加入MeCN(50ml)，制成白色浆液。该液体减压蒸馏除去25ml，加入MeCN(20ml)，将浆液搅拌15分钟后进行过滤。所得结晶用MeCN(30ml)再次洗涤，减压干燥，以收率95％得到[TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T]](vsTOB-suc-moCbz)。
TOF-MS+(m/z)2073.4
比较例1评价吗啉对过量单体的猝灭的品质产生的影响
按照实施例14记载的方法，对实施例14中记载的合成过程中所得的2mer至5mer的中间体进行脱保护并从载体切出，利用质量分析(LC-MS)进行杂质解析。同样，对实施例23记载的合成过程中所得的2mer至7mer的中间体也同样进行脱保护并从载体切出，利用质量分析(LC-MS)进行杂质解析。对各分析结果进行比较，可知使用吗啉对过量单体进行猝灭的实施例23记载的方法中，未生成n+1mer等的过量延伸的杂质作为副产物。
[表7]
*末端三苯甲基的标记省略
实施例27DPM-suc-mo(Tr)C bz 的合成
将α，α-二-4，4’-二十二烷基氧基苯基甲基胺(1.0g，1.20mmol)溶解于氯仿(20mL)中，加入HOBt(162.3mg，1.20mmol)、suc-mo(Tr)Cbz(969.8mg，1.44mmol)和EDC-HCl(152.0mg，0.79mmol)，室温下搅拌20分钟。然后，向该反应液中再次加入EDC-HCl(152.0mg，0.79mmol)，室温下搅拌24小时。利用UHPLC确认反应结束后，将溶剂减压蒸馏除去，向所得残渣中加入乙腈(10mL)，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(10mL)再次洗涤，减压干燥得到DPM-suc-mo(Tr)Cbz(1.70g，收率96％)。
TOF-MS+(m/z)1486.9
实施例28和29的反应流程图如下所示。
实施例28DPM-suc-moC bz 的合成
将DPM-suc-mo(Tr)Cbz(1.69g，1.13mmol)溶解于氯仿(16.9mL)中进行冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(4.3mL)和乙醇(0.52g，11.3mmol)后，滴加三氟乙酸(1.03g，9.07mmol)和三乙胺(0.57g，5.67mmol)的氯仿(7.0mL)溶液，15℃下搅拌1小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.59g，4.54mmol)的氯仿(6mL)溶液。向反应液中加入乙腈(16.9mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(16.9mL)，0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(16.9mL)再次洗涤，得到DPM-suc-moCbz。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
TOF-MS+(m/z)1244.9
实施例29DPM-suc-PMO[C bz -C bz ]-Tr的合成
将DPM-suc-moCbz湿结晶(3.33g，1.13mmol相当)溶解于氯仿(9.8mL)中，加入环己烷(4.2mL)。加入N，N-二异丙基乙胺(0.26g，2.03mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(1.18g，1.69mmol)，40℃下加热搅拌21小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.20g，2.25mmol)室温下搅拌1小时。向反应液中加入乙腈(14mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(14mL)再次洗涤，减压干燥得到DPM-suc-PMO[Cbz-Cbz]-Tr(1.96g，收率91％)。
TOF-MS+(m/z)1906.3
实施例30TOB-suc-PMO[C bz -C bz ]-MMTr的合成
将TOB-suc-mo(Tr)Cbz(1.0g，0.64mmol)溶解于氯仿(10mL)中进行冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(2.8mL)和乙醇(0.29g，6.4mmol)后，滴加三氟乙酸(0.29g，2.55mmol)和三乙胺(0.14g，1.27mmol)的氯仿(4.5mL)溶液，室温下搅拌2小时。利用UHPLC确认反应结束后，将该反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(0.33g，2.55mmol)的氯仿(3mL)溶液。向反应液中加入乙腈(30mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(20mL)，0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(20mL)再次洗涤，得到TOB-suc-moCbz。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
将TOB-suc-moCbz湿结晶(1.39g，0.64mmol相当)溶解于氯仿(10mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.15g，1.15mmol)和ClPONMe2-mo(MMTr)Cbz(695mg，0.96mmol)，室温下搅拌17小时。利用UHPLC确认反应结束后，向所得溶液中加入乙腈(20mL)，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(20mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz]-MMTr(1.19g，收率92％)。
TOF-MS+(m/z)2017.3
实施例31TOB-suc-PMO[C bz -T]的合成(延伸-2)
将TOB-suc-moCbz(4.3g，3.23mmol)溶解于氯仿(33mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.73g，5.81mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)T(2.95g，4.85mmol)，室温下搅拌19小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.28g，3.23mmol)室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(13.1mL)和乙醇(1.49g，32.3mmol)后，滴加三氟乙酸(2.95g，25.8mmol)和三乙胺(1.21g，12.0mmol)的氯仿(9.9mL)溶液，15℃下搅拌1.5小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.26g，25.8mmol)的氯仿(4.5mL)溶液。向反应液中加入乙腈(86mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(43mL)再次洗涤，得到TOB-suc-PMO[Cbz-T]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例32TOB-suc-PMO[C bz -T-C bz ]的合成(延伸-3)
将TOB-suc-PMO[Cbz-T]湿结晶(5.7g，3.20mmol相当)溶解于氯仿(43mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.73g，25.6mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(3.35g，4.8mmol)，室温下搅拌16小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.28g，3.20mmol)室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(13.0mL)和乙醇(1.48g，32.0mmol)后，滴加三氟乙酸(2.92g，25.6mmol)和三乙胺(1.20g，11.8mmol)的氯仿(9.8mL)溶液，15℃下搅拌1.5小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.23g，25.6mmol)的氯仿(4.5mL)溶液。向反应液中加入乙腈(106mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌15分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(53mL)再次洗涤，得到TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例33TOB-suc-PMO[C bz -T]的合成(氯化锂添加系，延伸-2)
将TOB-suc-moCbz湿结晶(4.9g，3.08mmol相当)溶解于氯仿(34.9mL)中，加入氯化锂(143mg，3.38mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.72g，5.54mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)T(2.81g，4.61mmol)，40℃下搅拌16小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.32g，3.69mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(12.5mL)和乙醇(1.41g，30.8mmol)后，滴加三氟乙酸(1.75g，15.4mmol)和三乙胺(0.49g，4.86mmol)的氯仿(5.9mL)溶液，室温下搅拌1小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(2.0g，15.4mmol)的氯仿(2.7mL)溶液。向反应液中加入乙腈(82mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(41mL)再次洗涤，得到TOB-suc-PMO[Cbz-T]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例34TOB-suc-PMO[C bz -T-C bz ]的合成(氯化锂添加系、延伸-3)
将TOB-suc-PMO[Cbz-T]湿结晶(5.5g，3.05mmol相当)溶解于氯仿(44.6mL)中，加入氯化锂(142mg，3.36mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.71g，5.49mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(3.19g，4.58mmol)，40℃下搅拌16小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.26g，3.05mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(12.4mL)和乙醇(1.41g，30.5mmol)后，滴加三氟乙酸(1.74g，15.3mmol)和三乙胺(0.52g，5.19mmol)的氯仿(5.8mL)溶液，室温下搅拌1小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(1.97g，15.3mmol)的氯仿(2.7mL)溶液。向反应液中加入乙腈(100mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌15分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(50mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz](6.74g，收率106％)。
实施例35TOB-suc-PMO[C bz -T]的合成(氯化锂和乙酸酐添加系、延伸-2)
将TOB-suc-moCbz(4.3g，3.23mmol)溶解于氯仿(42.8mL)中，加入氯化锂(150mg，3.55mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.73g，5.81mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)T(2.95g，4.85mmol)，室温下搅拌15小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入乙酸酐(0.03mL，0.32mmol)和2，6-二甲基吡啶(0.19mL，1.62mmol)，室温下搅拌1小时。向反应液中加入吗啉(0.28g，3.23mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入吲哚(3.78g，32.3mmol)后，滴加三氟乙酸(2.86g，25.8mmol)的氯仿(19.2mL)溶液，室温下搅拌1.5小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.25g，25.8mmol)的氯仿(4.5mL)溶液。向反应液中加入乙腈(86mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌15分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(43mL)再次洗涤，得到TOB-suc-PMO[Cbz-T]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例36TOB-suc-PMO[C bz -T-c bz ]的合成(氯化锂和乙酸酐添加系、延 伸-3)
将TOB-suc-PMO[Cbz-T]湿结晶(6.5g，3.23mmol相当)溶解于氯仿(53.4mL)中，加入氯化锂(150mg，3.36mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.73g，5.81mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(3.38g，4.85mmol)，室温下搅拌40小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入乙酸酐(0.03mL，0.32mmol)和2，6-二甲基吡啶(0.15mL，1.29mmol)，室温下搅拌1小时。向反应液中加入吗啉(0.28g，3.23mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入吲哚(3.78g，32.3mmol)后，滴加三氟乙酸(2.86g，25.8mmo1)的氯仿(19.2mL)溶液，室温下搅拌1.5小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.25g，25.8mmol)的氯仿(4.5mL)溶液。向反应液中加入乙腈(107mL)，将溶剂减压蒸馏除去。将所得浆液在0℃下搅拌15分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(53mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-T-Cbz]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例37TOB-suc-PMO[C bz -C bz ]的合成(延伸-2)
将TOB-suc-moCbz湿结晶(16.1g，3.2mmol相当)溶解于氯仿(42mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.74g，5.76mmol)和ClPONMe2mo(Tr)Cbz(3.35g，4.80mmol)，室温下搅拌15小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.28g，3.2mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(14.1mL)和乙醇(1.5g，32.0mmol)后，滴加三氟乙酸(2.92g，25.6mmol)和三乙胺(1.13g，11.2mmol)的氯仿(40mL)溶液，15℃下搅拌30分钟。向反应液中追加2，2，2-三氟乙醇(3.5mL)，进而在15℃下搅拌1小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.31g，25.6mmol)的氯仿(30mL)溶液。向反应液中加入乙腈(75mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(25mL)，将溶剂减压蒸馏除去后，加入乙腈(100mL)。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(100mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz](5.4g，收率96.6％vsTOB-suc-moCbz)。
实施例38TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T]的合成(延伸-3)
将TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz](5.4g，3.09mmol)溶解于氯仿(54mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(0.72g，5.56mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)T(2.82g，4.64mmol)，室温下搅拌23小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.27g，3.09mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(17mL)和乙醇(1.42g，30.9mmol)后，滴加三氟乙酸(2.82g，24.7mmol)和三乙胺(1.16g，11.4mmol)的氯仿(39mL)溶液，15℃下搅拌1.5小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(3.19g，24.7mmol)的氯仿(30mL)溶液。向反应液中加入乙腈(160mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(80mL)，将溶剂减压蒸馏除去后，加入乙腈(100mL)。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(100mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例39TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T-T-C bz -T- G ce/pac -A bz -A bz -G ce/pac -G ce/pac -T-G ce/pac -T-T-C bz ]-Tr的合成(结果一览)
由TOB-suc-mo(Tr)Cbz(5.0g，3.2mmol)按照实施例37和38记载的方法，以一锅依次进行对应单体的偶联和三苯甲基的脱保护。各阶段的步骤收率示于下表。应予说明，无数值的链长的产物不干燥直接用于下一步骤。
[表8]
实施例40TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T-T-C bz ]的合成 (氯化锂添加系、延伸-10)
将TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T]湿结晶(12.9g，2.37mmol相当)溶解于氯仿(100mL)中，加入氯化锂(150mg，3.56mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.53g，4.27mmol)和ClPONMe2mo(Tr)Cbz(2.48g，3.56mmol)，室温下搅拌33小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.78g，9.0mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(10.2mL)和乙醇(1.1g，23.7mmol)后，滴加三氟乙酸(1.89g，16.6mmol)的氯仿(10mL)溶液，室温下搅拌2小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(2.07g，16.0mmol)的氯仿(10mL)溶液。向反应液中加入乙腈(200mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(100mL)。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(100mL)再次洗涤，得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T-Cbz]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例41TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T-T-C bz -T]的合 成(氯化锂添加系、延伸-11)
将TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T-Cbz]湿结晶(12.6g，2.37mmol)溶解于氯仿(110mL)中，加入氯化锂(150mg，3.56mmol)、N，N-二异丙基乙胺(0.53g，4.27mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)T(2.17g，3.56mmol)，室温下搅拌19小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(0.78g，9.01mmol)，室温下搅拌1小时。将反应液冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(10.2mL)和乙醇(1.09g，23.7mmol)后，滴加三氟乙酸(1.89g，16.6mmol)的氯仿(10mL)溶液，室温下搅拌2小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(2.07g，16.0mmol)的氯仿(10mL)溶液。向反应液中加入乙腈(150mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(200mL)，将溶剂减压蒸馏除去后，加入乙腈(50mL)。将所得浆液在0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物。所得结晶用乙腈(100mL)再次洗涤，减压干燥得到TOB-suc-PMO[Cbz-Cbz-T-Cbz-Cbz-Gce/pac-Gce/pac-T-T-Cbz-T]。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
实施例42TOB-suc-PMO[C bz -C bz -T-C bz -C bz -G ce/pac -G ce/pac -T-T-C bz -T -G ce/pac -A bz -A bz -G ce/pac -G ce/pac -T-G ce/pac -T-T-C bz ]-Tr的合成(结果一览)
由TOB-suc-mo(Tr)Cbz(5.0g，3.2mmol)按照实施例37、38、40和41记载的方法，以一锅依次进行对应单体的偶联和三苯甲基的脱保护。各阶段的步骤收率示于下表。应予说明，无数值的链长的产物不干燥直接用于下一步骤。
[表9]
实施例43、44和45的反应流程图如下所示。
实施例43TOB-suc-teg-Tr的合成
将3，4，5-三(十八烷基)苯甲醇(91.4mg，0.1mmol)溶解于氯仿(1.0mL)中，加入suc-teg-Tr(72.6mg，0.12mmol)、EDC-HCl(23.0mg，0.12mmol)和4-二甲氨基吡啶(1.2mg，0.01mmol)，室温下搅拌65小时。利用UHPLC确认反应结束后，加入乙腈(2mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(4mL)，滤出沉淀物，减压干燥得到TOB-suc-teg-Tr(140mg，收率93％)。
TOF-MS+(m/z)1501.0
实施例44TOB-suc-teg-H的合成
将TOB-suc-teg-Tr(139mg，0.09mmol)溶解于氯仿(1.4mL)中进行冰冷却，加入2，2，2-三氟乙醇(0.4mL)和乙醇(42.8g，0.93mmol)后，滴加三氟乙酸(82.7mg，0.75mmol)和三乙胺(47.4mg，0.47mmol)的氯仿(0.5mL)溶液，室温下搅拌2小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冰冷却，滴加N，N-二异丙基乙胺(97mg，0.75mmol)的氯仿(0.5mL)溶液。向反应液中加入乙腈(5mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(4mL)，0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物，得到TOB-suc-teg-H。该结晶不进行干燥，直接用作下一反应的原料。
TOF-MS+(m/z)1257.9
实施例45TOB-suc-teg-mo(Tr)C bz 的合成
将TOB-suc-teg-H湿结晶(168mg，0.09mmol相当)溶解于氯仿(1.2mL)中，加入N，N-二异丙基乙胺(20.7mg，0.16mmol)和ClPONMe2-mo(Tr)Cbz(92.8mg，0.13mmol)，室温下加热搅拌13小时。利用UHPLC确认反应结束后，将反应液冷却至室温，加入吗啉(11.3mg，0.09mmol)，室温下搅拌1小时。向反应液中加入乙腈(2.4mL)，将溶剂减压蒸馏除去。向所得残渣中加入乙腈(3mL)，0℃下搅拌30分钟后，滤出沉淀物，减压干燥得到TOB-suc-teg-mo(Tr)Cbz(148mg，收率86％、vsTOB-suc-teg-Tr)。
TOF-MS+(m/z)1919.0
产业适用性
根据本发明的5’位羟基或者存在于5’位羟基的取代基上的羟基被特定保护基保护的吗啉代核苷酸，可以提供液相合成法中能够有效且高收率地制备吗啉代寡核苷酸的方法。
本申请以在日本申请的特愿2013-110358作为基础，其内容全部包含于本说明书中。

Claims (20)

1.吗啉代核苷酸，其由通式(I)表示：
式中，
m表示0以上的任意整数；
m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
P1表示氢原子、或者在酸性条件下可除去的临时保护基；
m个X各自独立地表示C1-6烷氧基、二C1-6烷基氨基、或者4位氮原子被保护基保护进而任选取代的哌嗪基；
m个W各自独立地表示氧原子或硫原子；
S1表示单键、或*O-S2**所示的基团，式中，*表示与L的键合位置，**表示与5’位羟基的键合位置，S2表示主链原子数1至20的间隔基；
L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置，
**表示与S1的键合位置，
L1表示任选取代的二价C1-22烃基，并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团，式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键；
Y表示单键、氧原子、或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示式(a2)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置，
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基，
k个Q各自独立地表示单键，或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
k表示1～4的整数，
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，
Ra表示氢原子，
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
式中，*表示键合位置，
j表示0～4的整数，
j个Q表示与上述相同的含义，
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基，并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成氧原子。
2.根据权利要求1所述的吗啉代核苷酸，其中，m为0。
3.根据权利要求1或2所述的吗啉代核苷酸，其中，通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
R5和/或R7为碳原子数10～40的烷基。
4.根据权利要求1或2所述的吗啉代核苷酸，其中，通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
Ra和Rb均为氢原子，而且R5为碳原子数10～40的烷基。
5.根据权利要求1或2所述的吗啉代核苷酸，其中，通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
R5和/或R7为碳原子数12～30的烷基。
6.根据权利要求1或2所述的吗啉代核苷酸，其中，通式(I)中的L为琥珀酰基，并且
Z-Y-为选自下组的基团：
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氧基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氧基、
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氧基、
3，4，5-三(十八烷基氧基)苄氨基、
2，4-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
3，5-二(二十二烷基氧基)苄氨基、
二(4-二十二烷基氧基苯基)甲氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、
4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)环己基甲氧基]苄氨基、
2，4-二(十二烷基氧基)苄氨基、
苯基(2，3，4-三(十八烷基氧基)苯基)甲氨基、
二[4-(12-二十二烷基氧基十二烷基氧基)苯基]甲氨基、
3，5-二[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基、以及
3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷基氧基)苄氧基]苄氨基。
7.根据权利要求1或2所述的吗啉代核苷酸，其中，Z-Y-L-选自下列基团：
2-{2，4-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{1-[(2-氯-5-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基)]苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{2-[3’，4’，5’-三(2”，3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基琥珀酰基、
2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氨基羰基}乙基羰基、
4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄基琥珀酰基、
2-{4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰氨基]苄氨基羰基}乙基羰基、
4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄基琥珀酰基、
2-{4-(3，7，11-三甲基十二烷基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[2，3，4-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]苄氨基羰基}乙基羰基、
2-{1-[4-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]-4’-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氨基羰基}乙基羰基、
3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄基琥珀酰基、以及
2-{3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄氨基羰基}乙基羰基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的吗啉代核苷酸，其中，P1为三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、或者二甲氧基三苯甲基。
9.n+p聚体吗啉代寡核苷酸的制备方法，该方法包括：
(2)使p聚体吗啉代寡核苷酸与n聚体吗啉代寡核苷酸经由其吗啉环氮原子通过(硫代)磷酰胺键或(硫代)磷酰二胺键而缩合的步骤，所述p表示1以上的任意整数，所述n表示1以上的任意整数，
所述p聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基被活化(硫代)磷酸酯化或活化(硫代)磷酰胺化，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基、或者在5’位羟基具有含羟基的取代基时存在于该取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子未被保护。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其中，p为1。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其中，反应结束后，用猝灭剂处理反应混合物。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的制备方法，其进一步包括下述步骤(1)：
(1)在缩合步骤(2)之前，在非极性溶剂中，使n聚体吗啉代寡核苷酸与酸反应来除去吗啉环氮原子的临时保护基的步骤，
所述n聚体吗啉代寡核苷酸中，5’位羟基、或者在5’位羟基具有取代基时存在于该取代基上的羟基，被具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基保护，而且吗啉环氮原子被在酸性条件下可除去的临时保护基保护。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，在阳离子清除剂的存在下进行临时保护基的除去。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其中，在步骤(1)中，在除去吗啉环氮原子的临时保护基后，进一步包括用有机碱进行中和的步骤。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的制备方法，其中，
具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的保护基是下述式(II)所示的基团：
Z······Y······L······(II)
L表示单键、或者式(a1)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置，
**表示与S1的键合位置，
L1表示任选取代的二价C1-22烃基，并且
L2表示C(＝O)、或者表示***N(R3)-R1-N(R2)C(＝O)**所示的基团，式中，**表示与L1的键合位置，***表示与Y的键合位置，R1表示任选取代的C1-22亚烷基，R2和R3各自独立地表示氢原子或任选取代的C1-22烷基、或者R2和R3任选地一起形成任选取代的C1-22亚烷基键；
Y表示单键、氧原子、或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示式(a2)所示的基团：
式中，*表示与Y的键合位置，
R4表示氢原子，或者当Rb为下述式(a3)所示的基团时，R4任选地与R6一起表示单键或-O-、并与环B一起形成芴基或呫吨基，
k个Q各自独立地表示单键，或者表示-O-、-S-、-OC(＝O)-、-NHC(＝O)-或-NH-，
k个R5各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
k表示1～4的整数，
环A除了具有k个QR5之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，
Ra表示氢原子，
Rb表示氢原子、或式(a3)所示的基团：
式中，*表示键合位置，
j表示0～4的整数，
j个Q表示与上述相同的含义，
j个R7各自独立地表示具有碳数10以上且300以下的烷基和/或碳数10以上且300以下的烯基的有机基团，
R6表示氢原子，或者任选地与R4一起表示单键或-O-、并与环A一起形成芴基或呫吨基，并且
环B除了具有j个QR7之外，进一步任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、以及任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra和Rb一起形成氧原子。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其进一步包括下述步骤(3)：
(3)向步骤(1)和/或(2)所得的反应液中添加极性溶剂，使吗啉代寡核苷酸沉淀，通过固液分离得到吗啉代寡核苷酸的步骤。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的制备方法，其中，非极性溶剂为选自卤化溶剂、芳族溶剂、酯溶剂、脂族溶剂、非极性醚溶剂、以及它们的组合中的溶剂。
18.根据权利要求16或17所述的制备方法，其中，极性溶剂为醇溶剂或腈溶剂。
19.根据权利要求9至18中任一项所述的制备方法，其进一步包括下述步骤(4)：
(4)将所得的n+p聚体吗啉代寡核苷酸的保护基全部除去的步骤。
20.根据权利要求9至19中任一项所述的制备方法，其中，在酸性条件下可除去的临时保护基为三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、或者单甲氧基三苯甲基。
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