KR102523522B1

KR102523522B1 - 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 제조 방법

Info

Publication number: KR102523522B1
Application number: KR1020187036636A
Authority: KR
Inventors: 바오 카이; 미첼 마티니; 케이티 토마스; 로스 시마부쿠
Original assignee: 사렙타 쎄러퓨틱스 인코퍼레이티드
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-30
Publication date: 2023-04-20
Also published as: CO2018013831A2; EP3463389A4; CN109152792B; KR20190020674A; EP3463389A2; JP7022079B2; WO2017205879A2; CN109152792A; JP2019518748A; AU2017270598B2; WO2017205879A3; SG11201809502YA; CA3024153A1; AU2017270598A1; MX2018014160A

Abstract

본원에서는 올리고머 (예를 들어, 모르폴리노 올리고머)의 제조 방법이 제공된다. 본원에 기재된 합성 방법은 합성된 올리고머의 전체 수율 및 순도를 유지하면서도 올리고머합성을 확장시키는데 유리할 수 있다.

Description

포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머의 제조 방법

관련 출원

본 특허 출원은 미국 특허 가출원 일련 번호 62/508,256(2017년 5월 18일 출원), 미국 특허 가출원 일련 번호 62/341,049(2016년 5월 24일 출원), 미국 특허 가출원 일련 번호 62/340,953(2016년 5월 24일 출원), 미국 특허 가출원 일련 번호 62/357,134(2016년 6월 30일 출원), 및 미국 특허 가출원 일련 번호 62/357,153(2016년 6월 30일 출원)의 이점을 주장한다. 상기-언급된 특허 가출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.

안티센스 기술은 대안적인 스플라이스 생성물을 포함하는 하나 이상의 특정 유전자 생성물의 발현을 조절하기 위한 수단을 제공하고, 이는 다수의 치료, 진단 및 연구 적용분야에 있어서 특유적으로 유용하다. 안티센스 기술을 뒷받침하는 원리는 안티센스 화합물, 예를 들어, 표적 핵산을 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드가 다수의 안티센스 메커니즘 중 임의의 하나를 통한 유전자 발현 활성 예컨대 전사, 스플라이싱 또는 번역을 조절한다는 것이다. 안티센스 화합물의 서열 특이성은 표적 검증 및 유전자 작용화에 대한 도구뿐만 아니라 질환에 관여된 유전자의 발현을 선택적으로 조절하는 치료제로서 이들을 유용하게 만든다.

뒤센 근육 이상증 (duchenne muscular dystrophy, DMD)은 단백질 디스트로핀의 발현에서의 결함으로 야기된다. 상기 단백질을 인코딩한 유전자는 DNA의 2 백만개 초과의 뉴클레오타이드 상에 퍼져 있는 79 엑손을 포함한다. 엑손의 해독틀을 변화시키거나 또는 정지 코돈을 주입하거나, 또는 전체 아웃오브프레임 엑손 또는 엑손들의 제거, 또는 하나 이상의 엑손들의 복제를 특징으로 하는 임의의 엑손 돌연변이는 기능적 디스트로핀의 생산을 방해하는 능력을 가지고, 이는 DMD를 야기한다.

DMD의 치료를 위한 스플라이스 스위칭 올리고뉴클레오타이드 (SSO)의 안전성 및 효능을 시험하는 최근 임상시험은 스플라이오솜의 입체적 차단에 의해 미성숙-mRNA의 대안적인 스플라이싱을 유도하는 SSO 기술에 기초한다 (문헌 [Cirak et al., 2011; Goemans et al., 2011; Kinali et al., 2009; van Deutekom et al., 2007]). 그러나 이러한 성공에도 불구하고, DMD를 치료하기 위해 이용가능한 약리적 선택사항은 제한된다.

카시머센은 엑손 45을 스킵핑하게 하여 해독틀을 복원하여, 디스트로핀 단백질의 기능성의 짧은 형태를 생성하는 DMD를 가진 환자에서의 인간 디스트로핀 유전자의 스킵 엑손 45에 대해 설계된 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)이다.

안티센스 기술의 기술분야에서 상당한 진전이 이루어졌지만, 개선된 안티센스 또는 안티젠 성능을 갖는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머를 제조하기 위한 방법에 대한 본 기술분야의 필요성이 존재한다.

요약

본원에 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO)의 제조를 위한 방법이 제공된다. 본원에 기재된 합성 방법은 합성된 PMO의 전체 수율 및 순도를 유지하면서 확장된 PMO 합성을 가능하게 한다.

따라서, 일 양태에서, 하기 화학식 (A)의 올리고머성 화합물의 제조 방법이 제공된다:

특정 구현예에서, 화학식 (C)의 올리고머성 화합물의 제조 방법이 제공된다:

또 다른 구현예에서, 예를 들어 화학식 (C)의 올리고머성 화합물의 일부 구현예를 포함하는 본 개시내용의 올리고머성 화합물은 하기 화학식 (XII)의 올리고머성 화합물이다:

명백하게 하기 위해, 예를 들어 화학식 (C)의 올리고머성 화합물 및 화학식 (XII)로 도시되는 카시머센을 포함하는 구조식은 5'으로부터 3'까지의 연속 구조식이고, 상기 구조식의 조밀한 형태로 전체 화학식을 도시하는 것의 편의성을 위해, 본 출원인은 "중단 A", 및 "중단 B"로 표지된 다양한 도식 중단표식을 포함시켰다. 숙련가에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 예를 들어, "중단 A"의 각각의 표시는 이 지점에서의 구조식의 도식의 연속을 나타낸다. 숙련가는 상기의 것이 카시머센을 포함하는 상기 구조식에서의 "중단 B"의 각 경우에 적용됨을 이해할 수 있다. 그러나, 도식 중단표식 중 어느 것도 숙련가가 카시머센을 포함하는 상기 구조식의 실제 중단을 의미하는 것을 이해하도록 의도되는 것은 아니다.

도 1 및 도 2는 합성되고 탈보호된 카시머센 (AVI-4045) 미정제 약물 물질 대표적인 분석적 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 크로마토그램을 보여준다 (실시예 4 참조).
도 3 및 도 4는 정제된 카시머센 약물 물질 용액의 대표적인 분석적 HPLC 크로마토그램을 보여준다 (실시예 5 참조).
도 5 및 도 6은 탈염되고 동결건조된 카시머센 약물 물질의 대표적인 분석적 HPLC 크로마토그램을 보여준다 (실시예 5 참조).

본원에서는 모르폴리노 올리고머의 제조 방법이 제공된다. 본원에 기재된 모르폴리노 올리고머는 원상태 또는 비변형된 올리고뉴클레오타이드에 비하여 서열 특이성을 저하시키기 않고 DNA 및 RNA에 대한 더 강한 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 모르폴리노 올리고머는 RNase H에 의한 절단을 최소화하거나 또는 방지한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 모르폴리노 올리고머는 RNase H를 활성화시키지 않는다.

본원에 기재된 공정은 산업적 규모 공정에서 유리하고, 높은 수율 및 규모 (예를 들어, 약 1 kg, 약 1-10 kg, 약 2-10 kg, 약 5-20 kg, 약 10-20 kg, 또는 약 10-50 kg)로 많은 모르폴리노 올리고머를 제조하기 위해 적용될 수 있다.

정의

본 개시내용을 기술하기 위해 사용되는 다양한 용어의 정의는 하기에 열거되어 있다. 이러한 정의는 특정 경우에서 달리 제한되지 않는 한, 개별적으로 또는 더 큰 그룹의 일부로서 이들이 본 명세서 및 청구항에 걸처 사용되는 용어에 적용된다.

"염기-보호된" 또는 "염기 보호"는 단계적인 올리고머 합성 과정에서의 염기쌍 기의 반응 또는 간섭을 방지하는데 적합한 보호기를 갖는 모르폴리노 서브유닛 상에서의 염기-쌍기, 에그퓨린 또는 피리미딘 염기의 보호를 지칭한다. (염기-보호된 모르폴리노 서브유닛의 일 예는 하기 도시된 시토신 아미노기 상에 CBZ 보호기를 갖는 활성화된 C 서브유닛 화합물 (C)이다).

"활성화된 포스포르아미데이트기"는 전형적으로 올리고머에서의 최종적인 포스포로디아미데이트 연결에서 바람직한 질소에서의 치환을 갖는 클로로포스포르아미데이트기이다. 일 예는 (디메틸아미노)클로로포스포르아미데이트, 즉 -O-P(=O)(NMe2)Cl이다.

용어 "지지체-결합된"은 지지 매체 (support medium)에 공유 결합되는 화학물질 객체를 지칭한다.

용어 "지지 매체"는 예를 들어, 올리고머가 그 위에 부착되거나 또는 합성될 수 있거나, 또는 올리고머의 부착 또는 합성을 위해 개질될 수 있는 임의의 입자, 비드, 또는 표면을 포함하는 임의의 물질을 지칭한다. 대표적인 기재는 비제한적으로 무기 지지체 및 유기 지지체 예컨대 유리 및 개질된 또는 작용화된 유리, 플라스틱 (아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌계 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TEFLON 등), 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 세라믹, 수지, 실리카 또는 실리카계 물질 (실리콘 및 개질된 실리콘 포함), 탄소, 금속, 무기 유리, 플라스틱, 광섬유 다발, 및 다수의 다른 폴리머를 포함한다. 일부 구현예의 경우에서 특히 유용한 지지 매체 및 단단한 표면은 유동 전지 장치 내에 배치된다. 본원에 기재된 방법의 일부 구현예에서, 지지 매체는 1% 가교결합된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌을 포함한다.

일부 구현예에서, 대표적인 지지 매체는 올리고머의 부착 또는 합성을 위한 적어도 하나의 반응성 부위를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 지지 매체는 유입된 서브유닛 및 올리고머를 부착하거나 또는 합성하기 위한 다른 활성화된 기와의 화학 결합을 형성할 수 있는 하나 이상의 말단 아미노 또는 하이드록실기를 포함한다.

본원에 기재된 공정에 적합한 일부 대표적인 지지 매체는 비제한적으로 하기를 포함한다: 조절된 공극 유리; 옥살릴-조절된 기공 유리 (예를 들어 문헌 [Alul, et al., Nucleic Acids Research 1991, 19, 1527] 참조); 예컨대 트리클로로-[3-(4-클로로메틸)페닐]프로필실란과 다공성 유리 비드의 반응에 의해 형성된 다공성 유리 비드 및 실리카겔 (문헌 [Parr and Grohmann,　Angew. Chem. Internatl. Ed. 1972, 11, 314, 미국 메사추세츠주 프레이밍햄 소재의 Waters Associates에 의해 상표명 "PORASILE" 하에 시판됨] 참조); 1,4-디하이드록시메틸벤젠 및 실리카의 모노 에스테르 (문헌 [Bayer and Jung,　Tetrahedron Lett.,　1970, 4503, Waters Associates에 의해 상표명 "BIOPAK" 하에 시판됨] 참조); TENTAGEL (예를 들어, 문헌 [Wright, et al., Tetrahedron Lett. 1993, 34, 3373] 참조); 가교결합된 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머 비딩된 매트릭스, 또는 POROS, 폴리스티렌/디비닐벤젠의 코폴리머 (Perseptive Biosystems로부터 이용가능함); 가용성 지지 매체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 PEG (문헌 [Bonora et al., Organic Process Research & Development, 2000, 4, 225-231] 참조); 펜던트 장쇄 폴리스티렌 (PS) 그라프트를 갖는 폴리에틸렌 (PE) 필름인 PEPS 지지체 (문헌 [Berg, et al.,　J. Am. Chem. Soc.,1989, 111, 8024] 및 국제특허출원 WO 1990/02749 참조); 공지된 양의 N-tert부톡시카보닐-베타-알라닐-N'-아크릴로일헥사메틸렌디아민을 포함하는 N,N'-비스아크릴로일에틸렌디아민과 가교결합된 디메틸아크릴아미드의 코폴리머 (문헌 [Atherton, et al.,　J. Am. Chem. Soc.,　1975, 97, 6584,　Bioorg. Chem.　1979, 8, 351, and J. C. S. Perkin I 538 (1981)] 참조); 소수성 가교결합된 스티렌 폴리머로 코팅된 유리 입자 (문헌 [Scott, et al.,　J. Chrom. Sci.,　1971, 9, 577] 참조); 그 위에 폴리스티렌이 그라프팅된 플루오르화된 에틸렌 폴리머 (문헌 [Kent and Merrifield,　Israel J. Chem.　1978, 17, 243] 및 문헌 [van Rietschoten in　Peptides　1974, Y. Wolman, Ed., Wiley and Sons, New York, 1975, pp. 113-116] 참조); 하이드록시프로필아크릴레이트-코팅된 폴리프로필렌막 (문헌 [Daniels, et al.,　Tetrahedron Lett.1989, 4345] 참조); 아크릴산-그라프팅된 폴리에틸렌-로드 (문헌 [Geysen, et al.,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　1984, 81, 3998]); 종래에-사용된 폴리머 비드를 포함한 "티 백" (문헌 [Houghten,　Proc. Natl. Acad. Sci. USA,　1985, 82, 5131]); 및 이들의 조합을 포함한다.

용어 "유동 셀 장치"는 하나 이상의 유체 시약 (예를 들어, 액체 또는 가스)이 이를 통해 유동할 수 있는 표면 (예를 들어, 단단한 표면)을 포함하는 챔버를 지칭한다.

용어 "탈블로킹제"는 보호기를 제거하기 위한 화학적 산 또는 화학적 산의 조합을 포함하는 조성물 (예를 들어, 용액)을 지칭한다. 탈블로킹제에서 사용되는 예시적인 화학적 산은 할로겐화된 산, 예를 들어, 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 플루오로 아세트산, 디플루오로아세트산, 및 트리플루오로아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 탈블로킹제는 예를 들어, 올리고머, 지지체-결합된 올리고머, 지지체-결합된 서브유닛, 또는 다른 보호된 질소 또는 산소 모이어티로부터 하나 이상의 트리틸기를 제거한다.

용어 "할로겐" 및 "할로"는 불소, 염소, 브롬, 및 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된 원자를 지칭한다.

용어 "캡핑제"는 예를 들어, 유입되는 서브유닛 또는 다른 활성화된 기와의 화학 결합을 형성하는 지지 매체의 반응성 부위를 차단하는데 유용하는 산 무수물 (예를 들어, 벤조산 무수물, 아세트산 무수물, 페녹시아세트산 무수물, 및 기타 동종의 것)을 포함하는 조성물 (예를 들어, 용액)을 지칭한다.

용어 "절단제 (cleavage agent)"는 예를 들어, 지지 매체로부터 지지체-결합된 올리고머를 분리하는데 유용한 화학적 염기 (예를 들어, 암모니아 또는 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔) 또는 화학적 염기의 조합을 포함하는 조성물 (예를 들어, 액체 용액 또는 기체성 혼합물)을 지칭한다.

용어 "탈보호제"는 보호기를 제거하는데 유용한 화학적 염기 (예를 들어, 암모니아, 1,8-디아자바이사이클로운덱-7-엔 또는 탄산칼륨) 또는 화학적 염기의 조합을 포함하는 조성물 (예를 들어, 액체 용액 또는 기체성 혼합물)을 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 탈보호제는 예를 들어, 모르폴리노 서브유닛, 모르폴리노 올리고머의 모르폴리노 서브유닛, 또는 이의 지지체-결합된 형태로부터 염기 보호기를 제거할 수 있다.

용어 "용매"는 용질에 용해된 용액의 용액 또는 혼합물의 일 성분을 지칭한다. 용매는 무기성 또는 유기성 (예를 들어, 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 아세틸 아세톤, 2-아미노에탄올, 아닐린, 아니솔, 벤젠, 벤조니트릴, 벤질 알코올, 1-부탄올, 2-부탄올, i-부탄올, 2-부탄온, t-부틸 알코올, 이황화탄소, 탄소　테트라염화물, 클로로벤젠, 클로로포름, 사이클로헥산, 사이클로헥산올, 사이클로헥산온, 디-n-부틸프탈레이트, 1,1-디클로로에탄, 1,2-디클로로에탄, 디에틸아민, 디에틸렌　글리콜, 디글라임, 디메톡시에탄 (글라임), N,N-디메틸아닐린, 디메틸포름아미드, 디메틸프탈레이트, 디메틸설폭사이드, 디옥산, 에탄올, 에테르, 에틸 아세테이트, 에틸 아세토아세테이트, 에틸 벤조에이트, 에틸렌 글리콜, 글리세린, 헵탄, 1-헵타놀, 헥산, 1-헥산올, 메탄올, 메틸 아세테이트, 메틸　t-부틸　에테르, 메틸렌　염화물, 1-옥탄올, 펜탄, 1-펜타놀, 2-펜타놀, 3-펜타놀, 2-펜탄온, 3-펜탄온, 1-프로판올, 2-프로판올, 피리딘, 테트라하이드로푸란, 톨루엔, 물, p-자일렌)일 수 있다.

용어들 "모폴리노", "모폴리노 올리고머", 또는 "PMO" (포스포르아미데이트- 또는 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머)는 하기 일반적인 구조의 포스포로디아미데이트 모폴리노 올리고머를 지칭한다:

B=뉴클레오베이스

Summerton, J., et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Development, 7: 187-195 (1997)의 도 2에서 기재된 바와 같다. 본 명세서에서 기재된 바와 같은 모폴리노는 전술한 일반적인 구조의 모든 입체이성질체 및 배치형태를 포함하는 것으로 의도된다. 모폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징은 U.S. 특허 번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 5,506,337, 8,076,476, 및 8,299,206에 상술되어 있고, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 편입되어 있다.

특정 구현예에서, 모폴리노는 그것의 안정성 및/또는 용해도를 증가시키기 위해 "테일" 모이어티를 갖는 상기 올리고머의 5’ 또는 3’ 말단에서 접합된다. 예시적인 테일은 하기를 포함한다:

용어 "EG3 테일"은 예를 들어, 그것의 3'- 또는 5'-말단에서 올리고머에 컨쥬게이션된 트리에틸렌 글리콜 모이어티를 지칭한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 올리고머의 3' 말단에 컨쥬게이션되는 "EG3 테일"은 하기 구조의 것일 수 있다:

용어 "약" 또는 "대략"은 일반적으로 관련 해당 분야에서 당업자에게 이해되나, 특정 경우에서 주어진 값 또는 범위의 ±10% 이내, 또는 ±5% 이내일 수 있다.

모르폴리노 올리고머의 제조 방법

합성은 본원에 기재된 바와 같이 지지 매체 상에서 수행된다. 일반적으로 제1 신톤 (예를 들어 모노머, 예컨대 모르폴리노 서브유닛)은 우선 지지 매체에 부착되고, 올리고머는 이후 지지체-결합된 신톤에 서브유닛을 순차적으로 결합시킴으로써 합성된다. 이러한 반복적인 신장은 결국 최종 올리고머성 화합물을 야기한다. 적합한 지지 매체는 가용성 또는 불용성일 수 있거나, 또는 성장하는 지지체-결합된 폴리머가 원하는 대로 용액으로 유입 또는 배출되도록 상이한 용매에서 가변적인 용해도를 가질 수 있다. 종래의 지지 매체는 대개 불용성이고, 일반적으로 반응 용기에 배치되고, 시약 및 용매는 성장하는 사슬과 올리고머가 목표 길이에 도달될 때까지 반응하고 및/또는 이로 세척되고, 이후 지지체로부터 분리되고, 필요에 따라 추가로 처리되어 최종 폴리머성 화합물을 생성한다. 보다 최근 방법은 합성시 원하는 지점에서 반복적으로 합성된 생성물을 침전시키고 용해시킬 수 있는 가용성 폴리머 지지체를 포함하는 가용성 지지체를 도입하고 있다 (문헌 [Gravert et al., Chem. Rev., 1997, 97,489-510]).

모르폴리노 올리고머의 제조 방법이 본원에 제공된다.

따라서, 일 양태에서, 하기 화학식 (II)의 화합물의 제조 방법이 본원에 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이고;

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (A1)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 화학식 (II)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A3)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고;

여기서, 본 방법은 하기 화학식　(II)의 화합물을 하기 화학식 (A2)의 화합물과 접촉시켜 화학식 (A3)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

식 중, R¹은 지지 매체임;

식 중, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨.

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (IV)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이고;

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (A3)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A5)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,

R⁴는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (IV)의 화합물을 하기 화학식 (A4)의 화합물과 접촉시켜 화학식 (A5)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

식 중, R¹은 지지 매체임;

식 중, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A9)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, n은 10 내지 40의 정수이고, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:

여기서, 본 방법은 하기의 순차적인 단계를 포함한다:

(a) 하기 화학식 (IV)의 화합물을 하기 화학식 (A4)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (A5)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임;

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³ is 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,

R⁴는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(b) 하기의 순차적이 단계의 n-1 반복을 수행하여 화학식 (A9)의 화합물을 형성하는 단계:

(b1) 직전 단계에서 형성된 생성물을 탈블로킹제와 접촉시키는 단계; 및

(b2) 직전 단계에서 형성된 화합물을 하기 화학식 (A8)의 화합물과 접촉시키는 단계:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A10)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, n은 10 내지 40의 정수이고, R¹은 지지 매체이고, R⁴는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (A9)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 화학식 (A10)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

식 중, n은 10 내지 40의 정수이고, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A11)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, n은 10 내지 40의 정수이고, R⁴는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (A10)의 화합물을 절단제와 접촉시켜 화학식 (A11)의 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A)의 올리고머성 화합물의 제조 방법이 제공된다:

식 중, n은 10 내지 40의 정수이고, 그리고 각각의 R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

여기서, 본 방법은 하기 화학식 (A11)의 화합물을 탈보호제와 접촉시켜 화학식 (A)의 올리고머성 화합물을 형성하는 것을 포함한다:

또 다른 양태에서, 본원에서는 하기 화학식 (A)의 화합물의 제조 방법이 제공된다:

여기에서, 본 방법은 하기의 순차적인 단계를 포함한다:

(a) 하기 화학식 (A1)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (II)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨;

식 중, R¹은 지지 매체임,

(b) 화학식　(II)의 화합물을 하기 화학식 (A2)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (A3)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨;

(c) 화학식 (A3)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,

(d) 화학식 (IV)의 화합물을 하기 화학식 (A4)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (A5)의 화합물을 형성하는 단계:

R⁴는 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(e) 하기의 순차적인 단계의 n-1 반복을 수행하여 화학식 (A9)의 화합물을 형성하는 단계:

(e1) 직전 단계에 의해 형성된 생성물을 탈블로킹제와 접촉시키는 단계; 및

(e2) 직전 단계에 의해 화합물을 하기 화학식 (A8)의 화합물과 접촉시키는 단계:

식 중, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 화학식 (A8)의 각 화합물에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

(f) 화학식 (A9)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (A10)의 화합물을 형성하는 단계:

(g) 화학식 (A10)의 화합물을 절단제와 접촉시켜 하기 화학식 (A11)의 화합물을 형성하는 단계:

(h) 화학식 (A11)의 화합물을 탈보호제와 접촉시켜 화학식 (A)의 올리고머성 화합물을 형성하는 단계.

일 구현예에서, 단계 (d) 또는 단계 (e2)는 추가로 화학식 (IV)의 화합물 또는 직전 단계에서 형성된 화합물 각각을 캡핑제와 접촉시키는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계는 적어도 하나의 용매의 존재 하에 수행된다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계에서 사용된 탈블로킹제는 할로겐화된 산을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계에서 사용된 탈블로킹제는 시아노아세트산이다.

또 다른 구현예에서, 할로겐화된 산은 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 플루오로 아세트산, 디플루오로아세트산, 및 트리플루오로아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

또 다른 구현예에서, 할로겐화된 산은 트리플루오로아세트산이다.

또 다른 구현예에서, 단계 (a), (c), (e1), 및 (f) 중 적어도 하나는 추가로 각각의 단계의 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계 (a), (c), (e1), 및 (f)는 추가로 각각의 단계의 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 중화제는 디클로로메탄 및 이소프로필 알코올을 포함하는 용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 중화제는 모노알킬, 디알킬, 또는 트리알킬 아민이다.

또 다른 구현예에서, 중화제는 N,N-디이소프로필에틸아민이다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계에서 사용된 탈블로킹제는 4-시아노피리딘, 디클로로메탄, 트리플루오로아세트산, 트리플루오로에탄올, 및 물을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 캡핑제는 에틸모폴린 및 메틸피롤리디논을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 캡핑제는 산 무수물이다.

또 다른 구현예에서, 산 무수물은 벤조산 무수물이다.

또 다른 구현예에서, 화학식 (A4) 및 화학식 (A8)의 화합물 각각은 독립적으로 에틸모폴린 및 디메틸이미다졸리디논을 포함하는 용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 절단제는 디티오트레이톨 및 1,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운덱-7-엔을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 절단제는 N-메틸-2-피롤리돈을 포함하는 용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 탈보호제는 NH₃를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 탈보호제는 수용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 지지 매체는 1% 가교결합된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 화학식 (A4)의 화합물은 하기 화학식 (A4a)의 것이다:

식 중:

R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,

R⁴는 하기로부터 선택됨:

또 다른 구현예에서, 화학식 (A5)의 화합물은 하기 화학식 (A5a)의 것이다:

식 중:

R¹은 지지 매체이고,

R⁴는 하기로부터 선택됨:

또 다른 구현예에서, 화학식 (A8)의 화합물은 하기 화학식 (A8a)의 것이다:

식 중:

R⁴는 화학식 (A8a)의 화합물의 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

또 다른 구현예에서, 화학식 (A9)의 화합물은 하기 화학식 (A9a)의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고,

R¹은 지지 매체이고,

R⁴는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

또 다른 구현예에서, 화학식 (A10)의 화합물은 하기 화학식 (A10a)의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고,

R¹은 지지 매체이고,

또 다른 구현예에서, 화학식 (A11)의 화합물은 하기 화학식 (A11a)의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고,

화학식 (A)의 올리고머성 화합물의 일 구현예에서, n은 30이고, R²는 1 내지 25의 각각의 위치 및 5' 내지 3'에 있다:

여기서, 화학식 (A)의 올리고머성 화합물은 하기 화학식 (C)의 화합물 또는이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

그것의 코드 명칭 "SPR-4045"에 의해 예전에 공지되는 "카시머센"은 염기 서열 5'-CAATGCCATCCTGGAGTTCCTG-3' (서열번호:1)를 갖는 PMO이다. 카시머센은 CAS 등록번호 1422958-19-7 하에 등록되어 있다. 화학명은 하기를 포함한다:

all-P-ambo-[P,2',3'-트리데옥시-P-(디메틸아미노)-2',3'-이미노-2',3'-seco](2'a5')(C-A-A-T-G-C-C-A-T-C-C-T-G-G-A-G-T-T-C-C-T-G) 5'-[4-({2-[2-(2-하이드록시에톡시)에톡시]에톡시}카보닐)-N,N-디메틸피페라진-1-포스폰아미데이트].

카시머센은 하기 화학 구조를 가지며:

그리고 또한 하기 화학 구조로 표시된다:

5'에서 3' 말단으로의 염기 서열은 다음과 같다:

카시머센은 또한 식 (XII)의 구조로 묘사될 수 있다:

따라서, 상기에 기재된 방법의 일 구현예에서, 식 (A)의 올리고머성 화합물은 식 (C)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

또 다른 구현예에서, 식 (C)의 올리고머성 화합물은 식 (XII)의 올리고머성 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

카시머센을 제조하는 방법

카시머센을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다.

또 다른 양태에서, 식 (C)의 올리고머성 화합물을 제조하는 방법이 본 명세서에 제공된다:

상기 방법은 하기의 순차적인 단계들을 포함한다:

(a) 식 (I)의 화합물:

(I);

(식 중, R¹은 지지 매체임),

을 탈블록킹제와 접촉시켜 하기 식 (II)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(b) 상기 식 (II)의 화합물을 화합물 (B):

과 접촉시켜 식 (III)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(c) 상기 식 (III)의 화합물을 탈블록킹제와 접촉시켜 식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(d) 상기 식 (IV)의 화합물을 식 (D)의 화합물:

과 접촉시켜 하기 식 (V)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(e) 상기 식 (V)의 화합물을 탈블록킹제와 접촉시켜 식 (VI)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(g1) 상기 식 (VI)의 화합물을 식 (g1)의 화합물:

과 접촉시켜 식 (VII)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임);

(g) 하기의 순차적인 단계의 20회 반복을 수행하여:

(g1) 직전 단계에 의해 형성된 생성물을 탈블록킹제와 접촉시키는 단계; 및

(g2) 직전 단계에 의해 형성된 생성물을 식 (VIII)의 화합물과 접촉시키는 단계:

(식 중, R²는, 식 (VIII)의 각각의 화합물에 대해 독립적으로, 하기로 구성된 군으로부터 선택됨):

, 및

(여기서, 1 내지 20의 각각의 반복에 대해, R²는 하기임):

식 (IX)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임),

(식 중, R²는, 독립적으로 각 경우에 대해, 하기로 구성된 군으로부터 선택됨):

, 및

(식 중, R²는 각각의 위치 1 내지 22 및 5’에서 3’에서 하기임):

(h) 상기 식 (IX)의 화합물을 탈블록킹제와 접촉시켜 하기 식 (X)의 화합물을 형성하는 단계:

(식 중, R¹은 지지 매체임),

, 및

및

(i) 상기 식 (X)의 화합물을 절단제와 접촉시켜 하기 식 (XI)의 화합물을 형성하는 단계:

, 및

및 및

및

(j) 상기 식 (XI)의 화합물을 탈보호제와 접촉시켜 식 (C)의 올리고머성 화합물을 형성하는 단계.

일 구현예에서, 단계 (d), 단계 (g1), 단계 (g2), 또는 이들의 조합은 추가로 화학식 (IV), 화학식 (VI)의 화합물, 또는 직전 단계에 의해 형성된 화합물 각각을 캡핑제와 접촉시키는 것을 포함한다.

특정 구현예에서, 각각의 단계 (d), 단계 (g1) 및 단계 (g2)는 추가로 화학식 (IV), 화학식 (VI)의 화합물, 또는 직전 단계에 의해 형성된 화합물 각각을 캡핑제와 접촉시키는 것을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계에서 사용되는 탈블로킹제는 할로겐화된 산을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계에서 사용되는 탈블로킹제는 시아노아세트산이다.

또 다른 구현예에서, 단계 (c), (e), 및 (g1) 중 적어도 하나는 추가로 각각의 단계의 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 각각의 단계 (c), (e), 및 (g1)는 추가로 각각의 단계의 탈블로킹된 화합물을 중화제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 중화제는 디클로로메탄 및 이소프로필 알코올을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 캡핑제는 산 무수물이다.

또 다른 구현예에서, 산 무수물은 벤조산 무수물이다.

또 다른 구현예에서, 화학식 (VIII)의 화합물, 화합물 (D), 및 화합물 각각은 독립적으로 에틸모폴린 및 디메틸이미다졸리디논을 포함하는 용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 절단제는 N-메틸-2-피롤리돈을 포함하는 용액이다.

또 다른 구현예에서, 탈보호제는 NH₃를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 탈보호제는 수용액 중에 있다.

또 다른 구현예에서, 상기 식 (D)의 화합물은 식 (D1)의 것이다:

또 다른 구현예에서, 상기 식 (V)의 화합물은 식 (Va)의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 구현예에서, 상기 식 (F)의 화합물은 식 (F1)의 것이다:

또 다른 구현예에서, 상기 식 (VII)의 화합물은 식 (VIIa)의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 구현예에서, 상기 식 (VIII)의 화합물은 식 (VIIIa)의 것이다:

식 중, R²는, 식 (VIIIa)의 각각의 화합물에 대해 독립적으로, 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:

및

및

또 다른 구현예에서, 상기 식 (IX)의 화합물은 식 (IXa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중,

R¹은 지지 매체이고, 그리고

R²는, 독립적으로 각 경우에, 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및

및

식 중, R²는 각각의 위치 1 내지 22 및 5’에서 3’에서 하기이다:

또 다른 구현예에서, 식 (X)의 화합물은 식 (Xa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

(Xa),

식 중,

R¹은 지지 매체이고, 그리고

및

및

또 다른 구현예에서, 상기 식 (XI)의 화합물은 식 (XIa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중:

및

및

또 다른 구현예에서, 상기 식 (VI)의 화합물은 식 (VIa)의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 구현예에서, 식 (C)의 올리고머성 화합물은 식 (XII)의 올리고머성 화합물이다:

또 다른 양태에서, 식 (V)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체다.

일 구현예에서, 상기 식 (V)의 화합물은 식 (Va) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 양태에서, 식 (A5)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 구성된 군으로부터 선택되고, 그리고 R⁴는 하기로부터 선택된다:

일 구현예에서, 상기 식 (A5)의 화합물은 식 (A5a) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

또 다른 양태에서, 식 (VI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

일 구현예에서, 상기 식 (VI)의 화합물은 식 (VIa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 양태에서, 식 (VII)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

일 구현예에서, 상기 식 (VII)의 화합물은 식 (VIIa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중, R¹은 지지 매체이다.

또 다른 양태에서, 식 (IX)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중:

R¹은 지지 매체임), 및

및

및

일 구현예에서, 상기 식 (IX)의 화합물은 식 (IXa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

(IXa),

식 중,

R¹은 지지 매체이고, 그리고

및

및

또 다른 양태에서, 식 (A9)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고;

R¹은 지지 매체이고;

R³는 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 구성된 군으로부터 선택되고; 그리고

R⁴는, 독립적으로 각 경우에, 하기로 구성된 군으로부터 선택된다:

일 구현예에서, 상기 식 (A9)의 화합물은 식 (A9a) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고;

R¹은 지지 매체이고;

R⁴는, 독립적으로 각 경우에, 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

또 다른 양태에서, 식 (X)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

(X);

식 중,

R¹은 지지 매체이고,그리고

및

및

일 구현예에서, 식 (X)의 화합물은 식 (Xa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중,

R¹은 지지 매체이고, 그리고

및

및

또 다른 양태에서, 식 (A10)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고;

R¹은 지지 매체이고;

일 구현예에서, 식 (A10)의 화합물은 식 (A10a) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고;

R¹은 지지 매체이고; 그리고

이들 화합물의 또 다른 구현예에서, 상기 지지 매체는 1% 가교결합된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌을 포함한다.

또 다른 양태에서, 식 (XI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중:

및

및

일 구현예에서, 상기 식 (XI)의 화합물은 식 (XIa) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중,

및

및

또 다른 양태에서, 식 (A11)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 본 명세서에 제공된다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고; 그리고

일 구현예에서, 상기 식 (A11)의 화합물은 식 (A11a)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 것이다:

식 중:

n은 10 내지 40의 정수이고; 그리고

올리고머

모르폴리노-기반 서브유닛의 중요한 특징은 하기를 포함한다: 1) 안정한 미하전된 또는 양전하로 하전된 주쇄 연결에 의한 올리고머성 형태로 연결되는 능력; 2) 형성된 폴리머가 표적 RNA를 포함하는 상보적-염기 표적 핵산으로 가수분해될 수 있도록 뉴클레오타이드 염기 (예를 들어 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘, 우라실, 5-메틸-시토신 및 하이포잔틴)를 지지하는 능력; 3) 포유동물 세포로 활성적으로 또는 능동적으로 이송되는 올리고머의 능력; 및 4) 각각 RNAse 및 RNase H 열화에 저항하는 올리고머 및 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스의 능력.

일부 구현예에서, 안티센스 올리고머는 염기 변형 또는 치환을 함유한다. 예를 들어, 특정 핵-염기는 본원에 기재된 안티센스 올리고머의 결합 친화도를 증가시키도록 선택될 수 있다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃까지 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것을 나타내었고, 본원에 기재된 안티센스 올리고머로 혼입될 수 있다. 일 구현예에서, 올리고머의 적어도 하나의 피리미딘 염기는 5-치환된 피리미딘 염기를 포함하고, 여기서 피리미딘 염기는 시토신, 티민 및 우라실로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 5-치환된 피리미딘 염기는 5-메틸시토신이다. 또 다른 구현예에서, 올리고머의 적어도 하나의 퓨린 염기는 하이포잔틴을 포함한다.

모르폴리노-기반 올리고머 (안티센스 올리고머 포함)은 예를 들어, 미국특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,185,444, 5,521,063, 5,506,337, 8,299,206, 및 8,076,476, 국제특허출원 공개번호 WO/2009/064471 및 WO/2012/043730, 및 문헌 [Summerton et al. (1997, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-195)]에 상술되어 있고, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.

본 개시내용의 올리고머성 화합물은 비대칭 중심, 키랄 축, 및 키랄 면 (예를 들어, 문헌 [E. L. Eliel and S. H. Wilen, Stereo-chemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, pages 1119-1190] 및 문헌 [March, J. , Advanced Organic Chemistry, 3d. Ed., Chap. 4, John Wiley & Sons, New York (1985)]에 기재됨)을 가질 수 있고, 광학 이성질체를 포함하는 모든 가능한 이성질체 및 이들의 혼합물과 함께 라세미체, 라세미 혼합물, 및 별개의 부분입체이성질체로서 생성될 수 있다. 이의 입체 화학의 임의의 표시 없는 본원에 구체적으로 언급된 본 개시내용의 올리고머성 화합물은 모든 가능한 이성질체 및 이들의 혼합물을 나타내는 것으로 의도된다.

구체적으로, 임의의 특정 이론에 의해 결합됨을 의도함 없이, 본 개시내용의 올리고머성 화합물은 본 명세서에서 논의된 바와 같이 하기 화학식 (VIII)의 화합물과 같은 비제한적인 예를 포함하는 활성화된 모르폴리노 서브유닛으로부터 제조된다:

식 중, R²는 독립적으로 화학식 (VIII)의 각각의 화합물에 대해 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

화학식 (VIII)의 상기-언급된 화합물 각각은 예를 들어 하기 도시된 바와 같이 상응하는 베타-D-리보푸라노실로부터 제조될 수 있다:

문헌 [Summerton et al., Antisense & Nucleic Acid Drug Dev. 7:187-195 (1997)]을 참조한다. 임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 2개의 키랄 탄소의 입체 화학은 각각의 모르폴리노 서브유닛의 다수의 가능한 입체 이성질체가 예를 들어 알파-L- 리보푸라노실, 알파-D- 리보푸라노실, 베타-L-리보푸라노실, 또는 베타-D-리보푸라노실 개시 물질의 선택에 기초하여 생성될 수 있는 합성 조건 하에 유지된다.

예를 들어, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 화학식 (VIII)의 화합물은 하기 화학식 (VIIIa)의 것일 수 있다:

식 중, R²는 화학식 (VIIIa)의 각각의 화합물에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 예를 들어 본 개시내용의 올리고머성 화합물로의 화학식 (VIII)의 10 내지 40개의 화합물의 혼입은 다수의 가능한 입체 이성질체를 야기할 수 있다.

임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도함 없이, 본 개시내용의 올리고머성 화합물은 하나 이상의 인-함유 인터서브유닛을 포함하고, 이는 각각의 인에서 키랄 중심을 생성하고, 이의 각각은 본 기술분야에 이해되는 바와 같이 "Sp" 또는 "Rp" 구조로서 표시된다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도함 없이, 이러한 키랄성은 입체이성질체를 생성하고, 이는 동일한 화학조성을 가지지만 그 원자의 상이한 3차원 배열을 가진다.

임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도함 없이, 각각의 인 인터서브유닛 연결의 구조는 예를 들어 본 개시내용의 올리고머성 화합물의 합성 과정에서 무작위로 발생된다. 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도함 없이, 합성 공정은 기하급수적으로 많은 수의 본 개시내용의 올리고머성 화합물의 입체이성질체를 생성하고, 이는 본 개시내용의 올리고머성 화합물이 다수의 인 인터서브유닛 연결기를 포함하고 - 각 인 인터서브유닛 연결기는 랜덤 키랄 구조를 갖는다. 구체적으로, 임의의 특정 이론에 구속되는 것을 의도함 없이, 추가의 모르폴리노 서브유닛의 각각의 인터서브유닛 연결기는 생성물의 입체이성질체의 수를 2배가 되게 하고, 이로써 본 개시내용의 올리고머성 화합물의 종래의 제조는 사실상 2^N 입체이성질체의 고도의 불균질 혼합물이고, 여기서 N은 인 인터서브유닛 연결기의 수를 나타낸다.

따라서, 달리 나타내지 않는 한, 예컨대 하나 이상의 입체 중심으로부터의 하나 이상의 결합이 "-" 또는 "~~" 또는 당해분야에서 이해되는 바와 같은 균등기호로 나타내는 경우에 부분입체이성질체 및 거울상이성질체 혼합물, 및 순수한 거울상이성질체 및 부분입체이성질체를 포함하는 모든 이러한 이성질체가 포함된다.

표 1은 본원에 기재된 공정에 제공되는 모르폴리노 서브유닛의 다양한 구현예를 도시하고 있다.

[표 1] 모르폴리노 서브유닛의 다양한 구현예

실시예

실시예는 예시의 목적을 위해 그리고 본 개시내용의 임의의 특정 구현예를 기술하기 위해 하기에 제시되어 있다. 그러나, 특허청구범위는 본원에 제시된 실시예에 의해 임의의 방식으로 제한되지 않는다. 개시된 구현예에 대한 다양한 변화 및 변형은 당해 분야의 숙련가에게 자명할 것이고, 비제한적으로, 화학 구조, 치환체, 유도체, 본 개시내용의 제형 또는 방법과 관련한 것을 포함하는 이러한 변화 및 변형은 첨부된 청구항의 범위 및 개시내용의 사상을 벗어남 없이 이루어질 수 있다. 본원의 반응식에서의 구조의 변수의 정의는 본원에 나타낸 식에서의 상응하는 위치의 것에 상응한다.

실시예 1: NCP2 앵커 합성

1. 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (1)의 제조

100L 플라스크에 12.7kg의 4-플루오로-3-니트로벤조산을 충전시키고, 40kg의 메탄올 및 2.82kg의 농축된 황산을 첨가하였다. 혼합물을 36 시간 동안 환류에서 (65℃) 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시켰다. 결정은 38℃에서 형성되었다. 혼합물을 4시간 동안 0℃로 유지시키고, 이후 질소 하에 여과시켰다. 100L 플라스크를 세정하고, 필터 케이크를 0℃로 냉각시킨 10kg의 메탄올로 세정하였다. 고체 필터 케이크를 1시간 동안 깔때기 상에서 건조시키고, 트레이로 이송시키고, 실온에서 진공 오븐 내에서 일정 중량의 13.695kg 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트로 건조시켰다 (100% 수율; HPLC 99%).

2. 3-니트로-4-(2-옥소프로필)벤조산의 제조

A. (Z)-메틸 4-(3-하이드록시-1-메톡시-1-옥소부트-2-엔-2-일)-3-니트로벤조에이트 (2)

100L 플라스크에 이전 단계로부터의 3.98kg의 메틸 4-플루오로-3-니트로벤조에이트 (1), 9.8kg의 DMF, 2.81kg의 메틸 아세토아세테이트를 충전하였다. 혼합물을 교반하고 0℃로 냉각시켰다. 이에 4시간에 걸쳐 3.66kg의 DBU를 첨가하였고, 한편 온도를 5℃ 이하에서 유지시켰다. 혼합물을 추가의 1시간 동안 교반하였다. 반응 온도를 15℃ 이하에서 유지하면서 반응 플라스크에 37.5kg의 정제수 중의 8.15kg의 시트르산의 용액을 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 추가의 30분 동안 교반하였고, 이후 질소 하에 여과시켰다. 습윤 필터 케이크를 14.8kg의 정제수와 함께 100L 플라스크로 복귀시켰다. 슬러리를 10분 동안 교반하였고, 이후 여과시켰다. 습윤 케이크를 다시 100L 플라스크로 복귀시켰고, 10분 동안 14.8kg의 정제수로 슬러리화시키고, 조물질 (Z)-메틸 4-(3-하이드록시-1-메톡시-1-옥소부트-2-엔-2-일)-3-니트로벤조에이트로 여과시켰다.

B. 3-니트로-4-(2-옥소프로필)벤조산

조물질 (Z)-메틸 4-(3-하이드록시-1-메톡시-1-옥소부트-2-엔-2-일)-3-니트로벤조에이트를 질소 하에 100L 반응 플라스크에 충전하였다. 이에 14.2kg의 1,4-디옥산을 첨가하고 교반하였다. 반응 온도의 온도를 15℃로 유지하면서 상기 혼합물에 16.655kg 농축된 HCl 및 13.33kg 정제수 (6M HCl)의 용액을 2시간에 걸쳐 첨가하였다. 첨가가 완료되는 경우, 반응 혼합물을 24시간 동안 환류 (80℃)하며 가열하였고, 실온으로 냉각시키고, 질소 하에 여과시켰다. 고체 필터 케이크를 14.8kg의 정제수로 분쇄하고, 여과시키고, 14.8kg의 정제수로 다시 분쇄시키고, 여과시켰다. 고형물을 39.9kg의 DCM를 가진 100L 플라스크로 복귀시키고, 1시간 동안 교반하면서 환류시켰다. 1.5kg의 정제수를 첨가하여 잔류 고형물을 용해시켰다. 하부 유기층을 예비-가온된 72L 플라스크로 분리시켰고, 이후 투명한 건조 100L 플라스크로 복귀시켰다. 용액을 0℃로 냉각시키고, 1시간 동안 유지시키고, 이후 여과시켰다. 고체 필터 케이크를 9.8kg DCM 및 5kg 헵탄의 용액으로 각각 2회 세척하고, 이후 깔때기 상에서 건조시켰다. 고형물을 트레이로 이송시키고, 일정 중량의 1.855kg 3-니트로-4-(2-옥소프로필)벤조산으로 건조시켰다. 화합물 1로부터의 전체 수율 42%. HPLC 99.45%.

3. N-트리틸피페라진 석시네이트 (NTP)의 제조

72L 재킷형 플라스크에 질소 하에서 1.805kg 트리페닐메틸 염화물 및 8.3kg의 톨루엔 (TPC 용액)을 충전하였다. 혼합물을 고형물이 용해될 때까지 교반하였다. 100L 재킷형 반응 플라스크에 질소 하에서 5.61kg 피페라진, 19.9kg 톨루엔, 및 3.72kg 메탄올을 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 0℃로 냉각시켰다. 반응 온도를 10℃ 이하로 유지시키면서 이에 4 시간에 걸쳐 TPC 용액 나누어서 서서히 첨가하였다. 혼합물을 10℃에서 1.5 시간 동안 교반하였고, 이후 14℃로 가온시켰다. 32.6kg의 정제수를 72L 플라스크에 충전하였고, 이후 내부 배치 온도를 20+/-5℃로 유지시키면서 100L 플라스크에 이송시켰다. 층을 나누어 하부 수성층을 분리하여 저장하였다. 유기층을 32kg의 정제수로 각각 3회 추출하였고, 수성층을 분리하여 저장된 수용액과 조합하였다.

잔류 유기층을 18℃로 냉각시키고, 10.87kg의 정제수 중의 석신산 847g의 용액을 유기층에 나누어 서서히 첨가하였다. 혼합물을 20+/-5℃에서 1.75 시간 동안 교반하였다. 혼합물을 여과시키고, 고형물을 2kg TBME 및 2kg의 아세톤으로 세정하고, 이후 깔때기 상에서 건조시켰다. 필터 케이크를 5.7kg 각각의 아세톤으로 2회 분쇄시키고, 분쇄들 간에 1kg의 아세톤으로 세정시켰다. 고형물을 깔때기 상에서 건조시키고, 이후 트레이로 이송시키고, 진공 오븐에서 실온으로 일정한 중량의 2.32kg의 NTP으로 건조시켰다. 수율 80%.

4. (4-(2-하이드록시프로필)-3-니트로페닐)(4-트리틸피페라진-1-일)메탄온의 제조

A. 1-(2-니트로-4(4-트리틸피페라진-1-카보닐)페닐)프로판-2-온의 제조

100L 재킷형 플라스크에 질소 하에서 2kg의 3-니트로-4-(2-옥소프로필)벤조산 (3), 18.3 kg DCM, 1.845kg N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC.HCl)을 충전하였다. 용액을 균질한 혼합물이 형성될 때까지 교반하였다. 3.048kg의 NTP를 30 분에 걸쳐 실온에서 첨가하였고, 8시간 동안 교반하였다. 5.44kg의 정제수를 반응 혼합물에 첨가하고, 30분에 걸쳐 교반하였다. 층을 분리하고, 생성물을 포함하는 하부 유기층을 배출시켜 저장하였다. 수성층을 5.65kg의 DCM으로 2회 추출하였다. 조합된 유기층을 4.08kg 정제수 중의 1.08kg 염화나트륨의 용액으로 세정하였다. 유기층을 1.068kg의 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과시켰다. 황산나트륨을 1.3kg의 DCM으로 세정하였다. 조합된 유기층을 252g의 실리카겔로 슬러리화시켰고, 252g의 실리카겔의 층을 포함하는 필터 깔때기를 통해 여과시켰다. 실리카겔층은 2kg의 DCM로 세정하였다. 조합된 유기층을 회전증발기로 증발시켰다. 4.8kg의 THF를 잔류물에 첨가하고, 이후 THF 중의 미정제 1-(2-니트로-4(4-트리틸피페라진-1-카보닐)페닐)프로판-2-온의 2.5 볼륨이 도달될 때까지 회전증발기 상에서 증발시켰다.

B. (4-(2-하이드록시프로필)-3-니트로페닐)(4-트리틸피페라진-1-일)메탄온 (5)의 제조

100L 재킷형 플라스크에 질소 하에서 이전의 단계로부터의 3600 g의 4 및 9800g THF를 충전하였다. 교반된 용액을 ≤5℃로 냉각시켰다. 용액을 11525g 에탄올로 희석시키고, 194g의 나트륨 보로하이드라이드를 약 2시간에 걸쳐 ≤5℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 추가의 2 시간 동안 ≤5℃에서 교반하였다. 반응물을 약 3kg의 물 중의 약 1.1kg 암모늄 염화물의 용액을 서서히 첨가하여 켄칭시켜 ≤10℃로 온도를 유지시켰다. 반응 혼합물을 추가의 30 분 동안 교반하였고, 여과시켜 무기물을 제거하였고, 100L 재킷형 플라스크에 재충전하고, 23kg의 DCM으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 각각 4.7kg의 DCM으로 2회 이상 추출하였다. 조합된 유기층을 약 3kg의 물 중의 약 800 g의 염화나트륨의 용액으로 세정하고, 이후 2.7kg의 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 현탁액을 여과시키고, 필터 케이크를 2kg의 DCM으로 세정하였다. 조합된 여과물을 2.0 볼륨으로 농축시키고, 약 360 g의 에틸 아세테이트로 희석시키고, 증발시켰다. 조 생성물을 DCM과 함께 패킹된 4kg의 실리카의 실리카겔 칼럼에 질소 하에 장입하였고, 7.2kg의 DCM 중의 2.3kg 에틸 아세테이트로 용출시켰다. 조합된 분획을 증발시켰고, 잔류물을 11.7kg의 톨루엔에 용해시켰다. 톨루엔 용액을 여과시키고, 필터 케이크를 일정한 중량의 2.275kg의 화합물 5로 건조시켰다 (화합물 3으로부터의 46% 수율) HPLC 96.99%.

5. 2,5-디옥소피롤리딘-1-일(1-(2-니트로-4-(4-트리페닐메틸피페라진-1 카보닐)페닐)프로판-2-일) 카보네이트 (NCP2 앵커)의 제조

100L 재킷형 플라스크에 질소 하에서 4.3kg의 화합물 5 (¹H NMR에 의한 잔류 톨루엔에 기초하여 조정된 중량; 이하의 모든 시약을 이에 따라 조정함) 및 12.7kg 피리딘을 충전하였다. 내부 온도를 ≤35℃로 유지시키면서 이에 3.160 kg의 DSC (¹H NMR에 의한 78.91 중량%)를 충전하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 약 22 시간 동안 에이징시키고, 이후 여과시켰다. 필터 케이크를 200 g의 피리딘으로 세정하였다. 각각 ½ 여과물 용적을 갖는 2개의 배치에서, 여과 세정물을 약 50 kg의 물 중의 약 11kg의 시트르산의 용액을 포함하는 100L 재킷형 플라스크에 서서히 충전하였고, 30 분 동안 교반시켜 고형물 침전이 이루어지게 하였다. 고형물을 필터 깔때기로 수집하였고, 세정당 4.3kg의 물로 1회 세정하였고, 진공 하에서 필터 깔때기 상에서 건조시켰다.

조합된 고형물을 100L 재킷형 플라스크에 충전시켰고, 28kg의 DCM에 용해시키고, 4.3kg의 물 중의 900 g의 탄산칼륨의 용액으로 세정하였다. 1시간 이후, 층을 분리시키고, 수성층을 제거하였다. 유기층을 10kg의 물로 세정하였고, 분리하였고, 3.5kg의 황산나트륨 상에서 건조시켰다. DCM을 여과시키고, 증발시키고, 진공 하에서 6.16kg의 NCP2 앵커로 건조시켰다 (114% 수율).

실시예 2: 앵커 장입된 수지 합성

75L 고상 합성 반응기에 약 52L의 NMP 및 2600 g의 아미노메틸 폴리스티렌 수지를 충전하였다. 수지를 NMP 중에서 교반하여 약 2시간 동안 팽윤시키고, 이후 배출시켰다. 수지를 세정당 약 39L DCM으로 2회 세정하였고, 이후 세정당 39L 중화 용액으로 2회 세정하였고, 이후 세정당 39L의 DCM으로 2회 세정하였다. NCP2 앵커 용액을 교반 수지 용액에 서서히 첨가하였고, 24시간 동안 실온에서 교반하였고, 배출시켰다. 수지를 세정당 39L의 NMP로 4회 세정하였고, 세정당 39L의 DCM로 6회 세정하였다. 수지를 처리하고, 30분 동안 ½ DEDC 캡핑 용액과 함께 교반하였고, 배출시키고, 처리하고, 30 분 동안 2회차 ½의 DEDC 캡핑 용액과 함께 교반하고 배출시켰다. 수지를 세정당 39L의 DCM으로 6회 세정하였고, 이후 오분에서 일정한 중량의 3573.71g의 앵커 장입된 수지로 건조시켰다.

실시예 3: 활성화된 EG3 테일의 제조

1. 트리틸 피페라진 페닐 카바메이트 (35)의 제조

디클로로메탄 (6 mL/g NTP) 중의 NTP의 냉각된 현탁액에 물 중의 탄산칼륨 (3.2 eq)의 용액 (4 mL/g 탄산칼륨)을 첨가하였다. 이러한 2상 혼합물에 디클로로메탄 중의 페닐 클로로포르메이트 (1.03 eq)의 용액 (2 g/g 페닐 클로로포르메이트)을 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 20℃로 가온시켰다. 반응 완료시 (1-2 hr), 층을 분리하였다. 유기층을 물로 세정하고, 무수탄산칼륨 상에서 건조시켰다. 생성물 35를 아세토니트릴로부터의 결정화에 의해 분리하였다. 수율=80%.

2. 카바메이트 알코올 (36)의 제조

수소화나트륨 (1.2 eq)을 1-메틸-2-피롤리디논 (32 mL/g 수소화나트륨)에 현탁시켰다. 이러한 현탁액에 트리에틸렌 글리콜 (10.0 eq) 및 화합물 35 (1.0 eq)을 첨가하였다. 수득한 슬러리를 95℃로 가열하였다. 반응 완료시 (1-2 hr), 혼합물을 20℃로 냉각시켰다. 이러한 혼합물에 30% 디클로로메탄/메틸 tert-부틸 에테르 (v:v) 및 물을 첨가하였다. 생성물-함유 유기층을 연속적으로 수성 NaOH, 수성 석신산, 및 포화된 수성 염화나트륨으로 세정하였다. 디클로로메탄/메틸 tert-부틸 에테르/헵탄으로부터의 결정화에 의해 생성물 36을 분리하였다. 수율=90%.

3. EG3 테일 산 (37)의 제조

테트라하이드로푸란 (7 mL/g 36) 중의 화합물 36의 용액에 석신산 무수물 (2.0 eq) 및 DMAP (0.5 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하였다. 반응 완료시 (5 hr), 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 수성 NaHCO3로 pH 8.5로 조정하였다. 메틸 tert-부틸 에테르를 첨가하였고, 생성물을 수성층에서 추출하였다. 디클로로메탄을 첨가하고, 혼합물을 수성 시트르산으로 pH 3으로 조정하였다. 생성물-함유 유기층을 pH=3 시트레이트 완충액 및 포화된 수성 염화나트륨의 혼합물로 세정하였다. 37의 이러한 디클로로메탄 용액을 화합물 38의 제조시 분리 없이 사용하였다.

4. 활성화된 EG3 테일 (38)의 제조

화합물 37의 용액에 N-하이드록시-5-노르보르넨-2,3-디카복실산 이미드 (HONB) (1.02 eq), 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP) (0.34 eq), 그 다음 1-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC) (1.1 eq)를 첨가하였다. 혼합물을 55℃로 가열하였다. 반응 완료시 (4-5 hr), 혼합물을 20℃로 냉각시키고, 연속적으로 1:1 0.2 M 시트르산/염수 및 염수로 세정하였다. 디클로로메탄 용액을 아세톤, 그 다음 N,N-디메틸포름아미드으로 용매 교환시키고, 생성물을 포화된 수성 염화나트륨으로의 아세톤/N,N-디메틸포름아미드으로부터의 침전에 의해 분리하였다. 조 생성물을 수중에서 수회 재슬러리화시켜 잔류 N,N-디메틸포름아미드 및 염을 제거하였다. 화합물 36으로부터의 활성화된 EG3 테일 38의 수율=70%.

실시예 4: 카시머센 [올리고머성 화합물 (XII)] 미정제 약물 물질의 50L 고체상 합성

1. 물질

[표 2] 개시 물질

개시 물질의 화학 구조:

A. 활성화된 EG3 테일

B. 활성화된 C 서브유닛 (제조용, 미국 특허 번호 8,067,571 참조)

화합물 (D1)

C. 활성화된 A 서브유닛 (제조용, 미국 특허 번호 8,067,571 참조)

화합물 (F1)

D. 활성화된 DPG 서브유닛 (제조용, WO 2009/064471 참조)

화합물 (E1)

E. 활성화된 T 서브유닛 (제조용, WO 2013/082551 참조)

화합물 (G1)

F. 앵커 장입된 수지

화학식 (I)

식 중, R¹은 지지 매체이다.

[표 3] 카시머센 미정제 약물 물질의 고상 올리고머합성용 용액의 설명

약물 물질

2. 카시머센 미정제 약물 물질의 합성

A. 수지 팽윤

750 g의 앵커 장입된 수지 및 10.5 L의 NMP를 50L 실란화 반응기에 충전하였고, 3시간 동안 교반하였다. NMP를 배출시키고, 앵커 장입된 수지를 각각 5.5L DCM로 2회 세정하고, 각각 5.5L 30% TFE/DCM로 2회 세정하였다.

B. 사이클 0: EG3 테일 커플링

앵커 장입된 수지를 각각 5.5L 30% TFE/DCM으로 3회 세정하였고, 배출시키고, 15분 동안 5.5L의 CYFTA 용액으로 세정하였고, 다시 배출하지 않고 15 분 동안 5.5L의 CYTFA 용액으로 세정하고, 이에 122 mL의 1:1 NEM/DCM를 충전하였고, 현탁액을 2분 동안 교반하고, 배출시켰다. 수지를 5.5L 중화 용액으로 10분 동안 1회 세정하고 5.5 L의 중화 용액으로 5분 동안 2회 배출하고 그 다음 5.5 L 각각의 DCM으로 2회 배출하고 배출했다. 3 L의 DMI 중 706.2 g의 활성화된 EG3 테일 (MW 765.85) 및 234 mL의 NEM의 용액을 수지에 충전하고 3시간 동안 rt에서 교반하고 배출했다. 수지를 5.5 L의 중화 용액으로 10분 동안 1회 세정하고 5.5 L의 중화 용액으로 5분 동안 1회 배출하고 5.5 L의 DCM으로 1회 배출하고 배출했다. 2680 mL NMP 중 374.8 g의 벤조산 무수물 및 195 mL NEM의 용액을 충전하고 15분 동안 교반하고 배출했다. 수지를 5.5 L의 중화 용액으로 10분 동안 1회 세정하고 5.5 L의 중화 용액으로 5분 동안 1회 배출하고 5.5 L의 DCM으로 1회 배출하고 5.5 L 각각의 30% TFE/DCM으로 2회 배출했다. 수지를 5.5 L의 30% TFE/DCM 에 현탁시키고 14시간 동안 유지했다.

C. 서브유닛 커플링 사이클 1-22

i. 예비-커플링 처리

표 4에 기재된 바와 같은 각각의 커플링 사이클 이전에 수지를 1) 30% TFE/DCM으로 세정하고; 2) a) 15분 동안 CYTFA 용액으로 처리하고 배출시키고, b) 15분 동안 CYTFA 용액으로 처리하고, 이에 1:1 NEM/DCM을 첨가하고, 교반하고, 배출시키고; 3) 중화 용액으로 3회 교반하였고; 4) DCM으로 2회 세정하였다. 표 4 참조.

ii. 커플링후 처리

표 4에 기재된 바와 같이 각각의 서브유닛 용액을 배출시킨 이후, 수지를 1) DCM으로 세정하고; 2) 30% TFE/DCM으로 3회 세정하였다. 수지를 다음 커플링 사이클 이전에 일정 기간 동안 유지시켰고, 제3 TFE/DCM 세정물을 배출시키지 않고, 수지를 상기 TFE/DCM 세정액에서 유지시켰다. 표 4 참조.

iii. 활성화된 서브유닛 커플링 사이클

커플링 사이클을 표 4에 기재된 바와 같이 수행하였다.

iv. 최종 IPA 세정

표 4에 기재된 바와 같이 최종 커플링 단계를 수행한 이후, 수지를 각각 19.5L IPA로 8회 세정하였고, 진공 하에 약 63.5 시간 동안 실온에서 4523 g의 건조 중량으로 건조시켰다.

D. 절단

상기 수지 결합된 카시머센 미정제 약물 물질을 2개의 로트(lot)로 분리하였고, 각 로트를 하기와 같이 처리하였다. 2개의 2261.5g 로트의 수지를 1) 2시간 동안 10L의 NMP와 함께 교반시키고, 이후 NMP를 배출시키고; 2) 각각 10L의 30% TFE/DCM으로 3회 세정하였고; 3) 15분 동안 10L CYTFA 용액으로 처리하였고; 4) 15 분 동안 10L의 CYTFA 용액으로 처리하였고, 이에 130ml 1:1 NEM/DCM을 첨가하였고, 2분 동안 교반하고, 배출시켰다. 수지를 각각 10L 중화 용액으로 3회 처리하고, 10L의 DCM으로 6회 세정하였고, 각각 10L NMP로 8회 세정하였다. 수지를 2시간 동안 6.96L NMP 중의 1530.4g DTT 및 2980 DBU의 절단 용액으로 처리하여 카시머센 미정제 약물 물질을 수지로부터 탈착시켰다. 절단 용액을 배출시키고, 별개의 용기에서 유지시켰다. 반응기 및 수지를 4.97L의 NMP로 세정하고, 이를 절단 용액과 함께 조합시켰다.

E. 탈보호

조합된 절단 용액 및 NMP 세정물을 압력 용기로 이송시켰고, 이에 냉동고에서 -10℃ 내지 -25℃의 온도로 냉각된 39.8L의 NH₄OH (NH₃·H₂O)를 첨가하였다. 압력 용기를 밀봉하고, 16시간 동안 45℃로 가열시키고, 이후 25℃로 냉각시켰다. 카시머센 미정제 약물 서브스턴스를 함유하는 상기 탈호보 용액을 용매 제거 전에 정제수로 3:1로 희석했다. 용매 제거 동안에, 탈보호 용액의 pH를 2M 인산으로 3.0 으로, 그 다음 NH₄OH로 pH 8.03로 조정했다. HPLC: C18 80.93% (도 1) 및 SCX-10 84.4% (도 2).

실시예 5: 카시머센 미정제 약물 물질의 정제

카시머센 미정제 약물 물질을 포함하는 실시예 4, E 부분으로부터의 탈보호 용액을 ToyoPearl Super-Q 650S 음이온교환수지 (Tosoh Bioscience)의 칼럼 상에 장입하였고, 17 칼럼 볼륨 (완충액 A: 10 mM 수산화나트륨; 완충액 B: 10 mM 수산화나트륨 중의 1M 염화나트륨)에 걸쳐 0-35% B의 구배로 용출시켰고, 허용가능한 순도 (C18 및 SCX HPLC)의 분획을 정제된 약물 생성물 용액으로 모집하였다. HPLC: 97.74% (C18; 도 3) 94.58% (SCX; 도 4).

정제된 약물 서브스턴스 용액을 탈염하고 1477.82 g 정제된 카시머센 약물 서브스턴스로 동결건조시켰다. 수율 63.37%; HPLC: 96.045% (도 5; C18) 96.346% (도 6; SCX).

[표 5] 두문자어

참조로의 편입

본 출원 전반에 인용된 모든 참조문헌 (문헌 참조, 공표된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시계류 중인 특허 출원 포함)은 그 전문이 본원에 명백하게 편입되어 있다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 당해 분야의 숙련가에게 일반적으로 알려진 의미를 따른다.

균등물

당해 분야의 숙련가는 단지 일상적인 실험과정을 사용하여 본원에 기재된 개시내용의 특정 구현예의 다수의 균등물을 인지하거나 또는 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 청구항에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims

하기 화학식 (C)의 올리고머성 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 제조 방법으로서,

여기서 상기 방법은 하기의 순차적인 단계를 포함하는 제조 방법:
(a) 하기 화학식 (A1)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (II)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체(support medium)이고, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨;

식 중, R¹은 지지 매체임,
(b) 화학식 (II)의 화합물을 하기 화학식 (A2)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (A3)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨;

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택됨,
(c) 화학식 (A3)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(d) 화학식 (IV)의 화합물을 하기 화학식 (A4)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (A5)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는
임;

식 중, R¹은 지지 매체이고, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R⁴는
임,
(e) 하기의 순차적인 단계의 21회 반복을 수행하여 화학식 (A9)의 화합물을 형성하는 단계:
(e1) 직전 단계에 의해 형성된 생성물을 탈블로킹제와 접촉시키는 단계; 및
(e2) 직전 단계에 의해 형성된 화합물을 하기 화학식 (A8)의 화합물과 접촉시키는 단계:

식 중, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

;

식 중, n은 22이고, R¹은 지지 매체이고, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고, R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

,
(f) 화학식 (A9)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (A10)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, n은 22이고, R¹은 지지 매체이고, R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

,
(g) 화학식 (A10)의 화합물을 절단제와 접촉시켜 하기 화학식 (A11)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, n은 22이고, R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

, 및
(h) 화학식 (A11)의 화합물을 탈보호제와 접촉시켜 화학식 (C)의 올리고머성 화합물을 형성하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A4)의 화합물은 하기 화학식 (A4a)의 화합물인 방법:

식 중, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R⁴는
임.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A5)의 화합물이 하기 화학식 (A5a)의 화합물인 방법:

식 중, R¹은 지지 매체이고,
R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R⁴는
임.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A8)의 화합물이 하기 화학식 (A8a)의 화합물인 방법:

식 중, R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A9)의 화합물은 하기 화학식 (A9a)의 화합물인 방법:

식 중, n은 22이고,
R¹은 지지 매체이고,
R³은 트리틸, 모노메톡시트리틸, 디메톡시트리틸 및 트리메톡시트리틸로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A10)의 화합물은 하기 화학식 (A10a)의 화합물인 방법:

식 중, n은 22이고,
R¹은 지지 매체이고,
R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

.
제1항에 있어서, 상기 화학식 (A11)의 화합물은 하기 화학식 (A11a)의 화합물인 방법:

식 중, n은 22이고,
R⁴는 화학식 (C)의 올리고머성 화합물에 따라, 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

.
삭제
제1항에 있어서, 상기 화학식 (C)의 올리고머성 화합물이 하기 화학식 (XII)의 올리고머성 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인 방법:
제1항에 있어서, R³은, 각 경우에, 트리틸인 방법.
제1항에 있어서, 하기 화학식 (C)의 올리고머성 화합물의 제조를 위해,

하기의 순차적인 단계를 포함하는 방법:
(a) 하기 화학식 (I)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (II)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임;

식 중, R¹은 지지 매체임,
(b) 상기 화학식 (II)의 화합물을 하기 화합물 (B)와 접촉시켜 하기 화학식 (III)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(c) 상기 화학식 (III)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (IV)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(d) 상기 화학식 (IV)의 화합물을 하기 화학식 (D)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (V)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(e) 상기 화학식 (V)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (VI)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(f) 상기 화학식 (VI)의 화합물을 하기 화학식 (F)의 화합물과 접촉시켜 하기 화학식 (VII)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체임,
(g) 하기의 순차적인 단계의 20회 반복을 수행하여 하기 화학식 (IX)의 화합물을 형성하는 단계:
(g1) 직전 단계에 의해 형성된 생성물을 탈블로킹제와 접촉시키는 단계; 및
(g2) 직전 단계에 의해 형성된 화합물을 하기 화학식 (VIII)의 화합물과 접촉시키는 단계:

식 중, R²는 화학식 (VIII)의 화합물 각각에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택됨:

여기서, 1 내지 20의 각각의 반복의 경우, R²는 하기의 것임:

;

식 중, R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:

R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

,
(h) 상기 화학식 (IX)의 화합물을 탈블로킹제와 접촉시켜 하기 화학식 (X)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:

R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

,
(i) 상기 화학식 (X)의 화합물을 절단제와 접촉시켜 하기 화학식 (XI)의 화합물을 형성하는 단계:

식 중, R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 이루어진 군으로부터 선택되고:

R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

, 및
(j) 상기 화학식 (XI)의 화합물을 탈보호제와 접촉시켜 화학식 (C)의 올리고머성 화합물을 형성하는 단계.
제1항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d), 단계 (f) 또는 단계 (g2)는, 추가로 화학식 (IV)의 화합물, 화학식 (VI)의 화합물 또는 직전 단계에 의해 형성된 화합물 각각을 캡핑제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
제1항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각각의 단계에서 사용되는 탈블로킹제는 할로겐화된 산 또는 시아노아세트산인 방법.
제13항에 있어서, 상기 할로겐화된 산은 클로로아세트산, 디클로로아세트산, 트리클로로아세트산, 플루오로아세트산, 디플루오로아세트산, 및 트리플루오로아세트산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제1항 내지 제7항, 및 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 매체는 유리, 개질된 또는 작용화된 유리, 플라스틱, 아크릴, 폴리스티렌, 1% 가교결합된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌, 스티렌계 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, TEFLON, 다당류, 나일론 또는 니트로셀룰로스, 세라믹, 수지, 실리카 또는 실리카계 물질, 실리콘, 개질된 실리콘, 탄소, 금속, 및 광섬유 다발로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질을 포함하는 방법.
화학식 (IX)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

(IX)
식 중,
R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.
제16항에 있어서, 상기 화학식 (IX)의 화합물은 하기 화학식 (IXa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물:

식 중,
R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.
화학식 (X)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

(X)
식 중,
R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.
제18항에 있어서, 상기 화학식 (X)의 화합물은 하기 화학식 (Xa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물:

식 중,
R¹은 지지 매체이고,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.
제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지지 매체는 1% 가교결합된 디비닐벤젠을 갖는 폴리스티렌을 포함하는, 화합물.
화학식 (XI)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염:

식 중,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.
제21항에 있어서, 상기 화학식 (XI)의 화합물은 하기 화학식 (XIa)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염인, 화합물:

식 중,
R²는 각 경우에 대해 독립적으로 하기로 구성된 군으로부터 선택되고:

및
및
R²는 5'에서 3'으로 각각의 위치 1 내지 22에서 하기의 것임:

.