CN105219878A - 一种新孢子虫病检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学检测技术领域，是涉及一种基于3D数字PCR标量阳性对照建立的新孢子虫病（Real-Time？PCR）检测试剂盒，用于动物感染新孢子虫病的临床诊断和日常监测。本发明试剂盒包括用于检测的新孢子虫特异性引物、探针其核苷酸如SEQ？ID？NO.1-3，检测的新孢子虫NcSRS2基因为SEQ？ID？NO.4所示。本试剂盒具有检测准确，灵敏度高，特异性强，简便快速的特点，用于检测早期感染和隐性“带虫”阶段的虫体DNA，为新孢子虫病的临床诊断和日常监测提供科学的技术支撑。

Description

一种新孢子虫病检测试剂盒
发明领域
本发明属于分子生物学检测技术领域，是涉及一种基于3D数字PCR标量阳性对照建立的新孢子虫病(Real-TimePCR)检测试剂盒，用于不同动物感染新孢子虫病的临床诊断和日常监测。
背景技术
新孢子虫病(Neosporiasis)是1998年新发现的一种原虫病。病原为犬新孢子虫(Neosporacaninum)，寄生于多种哺乳动物有核细胞内，可导致妊娠母畜发生流产、弱产、死胎等，新生仔畜发生运动障碍和神经***疾病等，牛对该病尤为灵敏。犬是新孢子虫的终末宿主兼中间宿主，牛、马、羊、鹿等家畜及多种野生动物均可以作为其中间宿主，健康动物通过吞食被新孢子虫孢子化卵囊或速殖子污染的水或饲草而发生水平感染，胎儿及仔畜主要通过胎盘而发生垂直感染，垂直感染是该病的主要传播方式。新孢子虫感染后主要寄生于宿主动物的脑、脊髓、神经和内脏等组织中。据报道，该病在世界范围内牛类动物中的感染率为10％～40％，最高达82％；我国新疆、青海、北京、吉林等地也有该病的报道，其感染率为11.8％～25.4％不等。每年由该病导致的繁殖障碍性疾病给畜牧业生产造成了巨大的经济损失。目前，还没有可用于防治该病的有效疫苗和特效药物，准确的检测、监控技术结合患畜淘汰等措施是综合防治该病的关键。
传统的免疫组织化学技术、超微结构检测技术、病原分离技术等方法过程冗长、操作繁琐，不适用于该病的检测。目前，用于检测该病的方法主要有血清学方法检测抗体和分子生物学方法检测病原DNA。血清学方法在虫体感染早期的检测效果欠佳，本研究运用分子生物学方法着力于研制新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒，用于早期感染和隐性“带虫”阶段的虫体DNA检测，与新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒形成优势互补，为新孢子虫感染全程的临床诊断和日常监测提供科学的技术支撑。
近年研究发现，由NcSRS2基因编码的P43蛋白是最有希望成为新孢子虫病的诊断抗原和免疫疫苗之一。实时荧光定量PCR技术(Real-TimePCR)具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、方便快捷等特点，已被广泛运用于各种病原的定性和定量检测。其中，TaqmanMGB探针3’端能准确结合到DNA双链小沟部，相对于其他探针具有更好的特异性、灵敏性和稳定性。3D数字PCR技术(3DDigitalPCR)是美国ABI公司于2008年新研发的基于单拷贝模板扩增而设计的一项新型绝对定量分析技术，它是通过PCR扩增和收集发生的荧光信号读取阳性反应数，再根据泊松分布计算出阳性模板DNA分子数。结合3D数字PCR技术建立实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)检测方法，无需依赖阳性核酸标准品和Real-TimePCR扩增曲线的循环阈值(CT)即可实现对扩增模板进行绝对定量分析。
发明内容
本发明的目的：为与新孢子虫病rELISA抗体检测试剂盒的检测效果形成优势互补，本发明通过设计检测引物和荧光探针，结合3D数字PCR***绝对定量分析，通过优化反应体系和循环条件，建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法。并建立一种基于3D数字PCR标量的新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒，用于新孢子虫病的临床诊断和流行病学监测。
本发明的技术方案如下：为实现上述目的，发明人下载GenBank数据库中已报道的不同国家和地区的新孢子虫NcSRS2基因序列，通过DNAMAN软件分析下载序列的同源性，找出特异性的保守靶序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，将该靶序列作为检测新孢子虫病的遗传标记物。此外，本领域技术人员应当理解，该序列的特异性片段只可作为检测新孢子虫病的遗传标记物。
设计检测引物、荧光探针和获得地方阳性目的基因片段
①根据上述新孢子虫NcSRS2基因(登录号：U93870.1)保守序列设计检测引物和MGB荧光探针。上游引物NcSRS2F：5’-TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3’，下游引物NcSRS2R：5’-CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3’；探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’标记MGB荧光淬灭基团，荧光探针NcSRS2P为：5’-FAM-TTATTCCGCCGTGTTTC-MGB-3’。②运用PCR技术从地方阳性样品基因组DNA中扩增目的基因片段。NcSRS2F/R常规PCR反应体系为25μL：10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.15μL，上、下游引物(10pM)各1μL，模板DNA1.5μL，ddH2O补足25μL。扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸5min，扩增146bp的目的基因片段。
目的基因的克隆、测序
①回收、纯化扩增的目的基因片段连入pEASY-BluntZeroClongVector，再转入大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，经Amp+/LB培养基扩大培养后，运用PlasmidPurificationKit提取菌体质粒，并对质粒进行PCR鉴定。②将PCR鉴定为阳性的重组质粒和克隆菌送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序，测序结果与NcSRS2基因(登录号：U93870.1)序列进行相似性比对。
建立新孢子虫病实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)检测方法
①3D数字PCR***对提取的某一阳性质粒(32.5ng/μL)稀释的10-6、10-7、10-8滴度进行绝对定量分析，以筛选引物、探针的最佳退火-延伸温度和确定该质粒中实际参与Real-TimePCR反应的模板浓度。3D数字PCR反应体系为15μL：2×3DMasterMix7.5μL，引物、探针(10pM)各1μL，模板DNA2μL，ddH2O补足15μL。循环条件为：96℃预变性10min；58℃退火-延伸2min，98℃变性30s，40次循环；60℃延伸2min。②均匀设计法优化Real-TimePCR反应中模板浓度、引物浓度、退火-延伸温度和延伸时间及扩增循环数等参数。优化的Real-TimePCR反应体系为25μL：2×Real-TimePCRMix12.5μL，引物、探针(10pM)各1μL，荧光校正液0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O补足25μL。循环条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火-延伸45s，45次循环。根据该反应条件建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法标准曲线回归方程。③运用优化的反应条件分别扩增新孢子虫、弓形虫、牛环形泰勒虫、牛巴贝斯虫和牛双芽巴贝斯虫等虫种阳性DNA，以评价其特异性。④对该质粒的100至10-9的每一稀释滴度进行Real-TimePCR扩增，并比较常规PCR和Real-TimePCR的检测灵敏性。⑤重复3次对该质粒的103copies/μL、104copies/μL和105copies/μL的稀释滴度进行Real-TimePCR扩增，每个稀释浓度均设计3个平行，计算其组间、组内变异系数，以评价Real-TimePCR检测方法的稳定性。
新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒的制备及使用
①试剂盒用途：本试剂盒用于检测家畜是否罹患新孢子虫病，可准确检测出家畜体内新孢子虫虫体DNA，在初期感染和“带虫”阶段的检测效果特别准确，为新孢子虫病的临床检测和流行病学监测提供科学的技术支持。②试剂盒的原理：本检测试剂盒采用实时荧光定量PCR检测技术(Real-TimePCR)，根据GenBank中已发表的新孢子虫NcSRS2基因保守序列设计检测引物和MGB探针，建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法。结合3D数字PCR检测技术(3DDigitalPCR)筛选该检测方法的最佳退火-延伸温度和对最低有效检测量进行绝对定量分析。通过探讨Real-TimePCR检测方法特异性、灵敏性、稳定性和重复性等特性，组装新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒用于检测新孢子虫病，该试剂盒适用于Real-TimePCR***扩增。③自备材料：实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)***；微量振荡离心机；96孔反应板或Real-TimePCR8联管；移液器及吸头等。
样本要求：样本采集后应及时提取DNA，样本DNA可参照DNA提取试剂盒或CTAB法提取。若不能及时提取样品可暂时储存于-20℃冰箱中，2周内提取；提取的DNA储存于-20℃待检。
新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒操作及注意事项
①提前准备彼此独立的制样、加样的操作室和移液器。②在制样室中配置反应体系，从-20℃冰箱取出试剂盒中的适量试剂放置于室温自然融化，低速离心后根据预设的反应体系进行配制。③反应体系配制好后置于微量振荡离心机上充分振荡混匀，在冰盒上分装至96孔反应板或8联反应管中。④将分装的反应体系转至加样室加样。⑤加样时遵循先加待检样品，再加阴、阳性对照(阴性对照先于阳性对照)。其中，每加完一排样品更换加样手套，盖好管盖，避免彼此污染，最后加入阴、阳性对照。⑥加样完毕后置于微量震荡离心机中充分振荡混匀，置于Real-TimePCR仪中进行扩增。
有益效果：运用该检测试剂盒监测我区(新疆地区)牛(牦牛)、马、羊、鹿等家畜新孢子虫病，结合淘汰患畜的措施从而达到净化畜群的目的，为保障我区畜牧业的健康发展奠定了良好的基础。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步的说明。
图1所示为新孢子虫阳性DNA常规PCR扩增结果。其中M为DL2000DNAMarker，P为新孢子虫阳性DNA检测，N为阴性对照。图2所示为3D数字PCR***对NcSRS2F/R和NcSRS2P最佳退火-延伸温度的筛选，筛选出最佳退火-延伸温度为58℃。图3所示为3D数字PCR***对阳性质粒(32.5ng/μL)稀释的10-6、10-7、10-8滴度的绝对定量分析结果。图4所示为建立的新孢子虫病Real-TimePCR检测方法标准曲线。图5所示为NcSRS2F/R引物常规PCR扩增阳性DNA产物在146bp处的特异性条带。图6所示为新孢子虫病Real-TimePCR检测方法的特异性实验结果。出现的扩增曲线为新孢子虫阳性DNA检测。图7所示为NcSRS2F/R引物常规PCR检测的灵敏性实验结果。其中，M为DL2000DNAMarker，1～8为6.41×109～6.41×102copies/μL的稀释质粒。图8所示为新孢子虫病Real-TimePCR检测方法的灵敏性实验结果。其中，1～10为6.41×109～6.41×100copies/μL的稀释质粒，N为阴性对照。
具体实施方式
下列实施例旨在进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明中使用的主要试剂有：PremixExTaqTM(ProbeqPCR)、TaKaRaTaqTM、DL2000DNAMarker、PlasmidPurificationKit等均购自宝生物工程(大连)有限公司；QuantStudioTM3DMasterMix购自美国ABI公司；pEASY-BluntZeroCloningKit购自北京Trans公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明中使用的主要仪器有：7500Real-TimePCRSystem、QuantStudioTM3DDigitalPCRSystem、ProFlexTMBasePCR仪等均购自美国ABI公司；Qsep100全自动单通道毛细管电泳分析仪购自中国台湾BiopticInc公司；NanoDrop2000cSoftwareInstallationGuide购自美国Thermo公司；G:BOXEF全自动凝胶成像分析仪购自英国SYNGENE公司。
本发明中参照GenBank中上传的新孢子虫NcSRS2基因(登录号：U93870.1)设计检测引物和荧光探针，相关领域技术人员可通过NCBI搜寻询获得。
实例一、设计新孢子虫病检测引物和荧光探针
①参考文献，了解新孢子虫NcSRS2基因相关特性，下载GenBank中上传的不同国家和地区的新孢子虫NcSRS2基因序列，运用DNAMAN软件对所有序列进行对比分析，找出NcSRS2基因的保守序列，在保守序列内设计检测引物和荧光探针，设计原则遵循Real-TimePCR引物扩增产物长度为80～150bp。②运用PrimerExpress3.0和Oligo6.24软件根据新孢子虫NcSRS2基因(登录号：U93870.1)保守区序列设计检测引物NcSRS2F/R和MGB荧光探针NcSRS2P，探针5’端标记FAM荧光报告基团，3’标记MGB荧光淬灭基团，扩增146bp的目的片段。上游引物NcSRS2F为：5’-TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3’，下游引物NcSRS2R为：5’-CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3’；荧光探针NcSRS2P为：5’-FAM-TTATTCCGCCGTGTTTC-MGB-3’。
实例二、制备目的基因片段阳性质粒
①先将设计的检测引物委交于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，运用合成的引物对新孢子虫阳性DNA进行常规PCR扩增，常规PCR反应体系为25μL：10×PCRBuffer(Mg2+plus)2.5μL，dNTP(2.5mM)2μL，上、下游引物(10pM)各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.15μL，模板DNA1.5μL，ddH2O补足25μL。循环条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，35次循环；72℃延伸5min。②取1μL的6×DNALoadingBuffer加入到5μLPCR产物中充分混匀，经1.5％的琼脂糖凝胶、100V电泳40min分析扩增条带大小。若条带大小为146bp则可继续进行后续实验(详见附图1)。③SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收、纯化凝胶中阳性产物连入pEASY-BluntZero克隆载体，再将克隆质粒导入Trans1-T1感受态细胞中。运用Amp+/LB固体培养基对Trans1-T1感受态细胞进行阳性筛选，成功导入克隆质粒的感受态细胞会在固体培养基上生长成独立的单个菌落，未出现单个菌落则表示导入不成功，须重新连接。④操净台中挑取Amp+/LB固体培养基平板上生长的单个菌落接入Amp+/LB液体培养基进行37℃、180rpm过夜培养(12～16h为宜)，吸出4mL菌液运用PlasmidPurificationKit提取菌体质粒。⑤运用引物NcSRS2F/R对提取的菌体质粒进行PCR扩增鉴定。将经PCR鉴定为阳性的重组质粒和克隆菌送至北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司测序，将返回的测序结果与NcSRS2基因(登录号：U93870.1)序列进行相似性比对。⑥当测序结果确定为新孢子虫NcSRS2基因序列后即成功制备了目的基因阳性质粒，此时再将探针NcSRS2P交由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
实例三、3D数字PCR筛选最佳退火-延伸温度和对扩增模板进行绝对定量分析
①运用NcSRS2F/R和NcSRS2P对提取的某一阳性质粒(32.5ng/μL)的10-6、10-7、10-8稀释滴度进行3D数字PCR扩增，以筛选引物、探针的最佳退火-延伸温度和确定参与反应的模板浓度。②3D数字PCR反应体系为15μL：2×3DMasterMix7.5μL，引物、探针(10pM)各1μL，质粒模板2μL，ddH2O补足15μL。筛选的最佳循环条件为：96℃预变性10min；58℃退火-延伸2min，98℃变性30s，40次循环；60℃延伸2min。因此以58℃作为Real-TimePCR扩增的最佳退火-延伸温度(详见附图2)；得出10-6稀释的质粒模板中，参与反应的模板浓度为6.41×103copies/μL，以此计算出该阳性质粒实际参与扩增的模板浓度为6.41×109copies/μL(详见附图3)。
实例四、建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法
①运用NcSRS2F/R和NcSRS2P对阳性质粒(32.5ng/μL)的100～10-9稀释滴度进行Real-TimePCR扩增。通过均匀设计法优化反应中模板浓度、引物浓度、延伸时间及循环数等参数，建立新孢子虫病Real-TimePCR检测方法。②优化Real-TimePCR反应体系为25μL：2×Real-TimePCRMix12.5μL，引物、探针(10pM)各1μL，荧光校正液0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O补足25μL。优化的扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火-延伸45s，45次循环。③取出各组分试剂融化、离心后于体系配制区配制反应体系，预设计反应总数为N(N＝n+1)，其中n为实际检测样品数和阴、阳性对照之和。④反应体系配制后置于微量振荡离心机上充分振荡混匀，吸取24μL混匀的反应体系分装至各反应小管(小管须置于冰盒上)，再转移至加样区加样。⑤加样前须对待检模板进行微离心，参照预设计的加样顺序吸取1μL样本DNA依次加入，最后加入阴、阳性对照。⑥加样完毕后对反应板或8联管进行离心混匀，置于Real-TimePCR扩增***中反应。⑦设置扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火-延伸45s，45次循环，反应结束后从仪器中读取结果。⑧实验得出参与反应的模板浓度与Ct值呈现出良好的线性关系。其中，回归方程斜率为-3.022，截距为42.43，得出的标准曲线回归方程为：Ct＝–3.022×log拷贝数+42.43，相关系数R2＝0.998(详见附图4)。将仪器读取的Ct值带入该回归方程即可计算出扩增模板的拷贝数。
实例五、检测方法特异性探讨
运用优化的Real-TimePCR反应条件同时扩增新孢子虫、弓形虫、牛环形泰勒虫、牛巴贝斯虫和牛双芽巴贝斯虫等虫种阳性DNA，以判定该方法的特异性。得出仅有新孢子虫阳性DNA出现了扩增曲线，其余虫种阳性DNA均未出现扩增曲线，可见建立的新孢子虫病Real-TimePCR检测方法特异性良好(详见附图5、附图6)。
实例六、检测方法灵敏性探讨
运用本方法中的引物共同对稀释度为6.41×109～6.41×100copies/μL的质粒模板进行常规PCR和Real-TimePCR扩增。得出常规PCR方法最低有效检出量为6.41×103copies/μL；Real-TimePCR方法最低有效检出量为6.41×100copies/μL，检测灵敏性是常规PCR检测的1000倍，说明Real-TimePCR检测方法的灵敏性较好(详见附图7、附图8)。
实例七、检测方法稳定性探讨
运用该方法重复3次对6.41×103～6.41×105copies/μL稀释的质粒模板进行组内、组间重复性试验。得出组内重复性试验平均变异系数为1.108％，组间重复性试验平均变异系数为2.732％，各试验组变异系数均小于5％，证明建立的新孢子虫病Real-TimePCR检测方法具有良好的稳定性，详见下表一。
表一Real-TimePCR检测方法稳定性实验结果
实例八、新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒的临床使用：对我区近三年发生流产的1046头份牛(牦牛)全血样品和采集的255份流产胎儿脑组织样品进行新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒检测，得出血液样品新孢子虫阳性率为10.19％，流产胎儿脑组织样品阳性率为18.04％，详见下表二。
表二新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒检测临床样品检测结果
实例九、检测效果与行业标准相比较
运用《新孢子虫病检疫技术规范》(SN/T3499-2013)作为新孢子虫病Real-TimePCR检测方法的参照标准共同对保存的46份新孢子虫阳性DNA进行Real-TimePCR扩增，结果得出两检测方法的检出复合率为100％(46/46)，检测效果与出入境检验检疫行业标准相一致。
实例十、组装新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒
新孢子虫病Real-TimePCR检测试剂盒配制了300份检测样品所需的试剂，可检测3个96孔反应板的样品，即可检测288份样品。试剂组成及配制见下表三。
表三新孢子虫病Real-TimePCR检测方法样品检测配制体系
实例十一、检测试剂盒的保存及使用
①本试剂盒保存温度为-20℃。②使用前根据待检样品数取出相应的组分试剂平衡至室温(20～25℃自然融化)，避免在冷气、阳光直射或热源区域融化试剂。若室温较低，可置于25℃恒温箱中孵育融化，待所有试剂完全融化后低速离心使用(5000rpm离心45s)。③反应体系参考下表配制，自上而下加入相应的各组分试剂，用完标记后及时放回原试剂盒保存。配制检测体系详见下表四。
表四新孢子虫病Real-TimePCR检测方法样品检测配制体系
实例十二、检测质控标准及阴阳性判定
①仪器直接读取扩增结果，阴性对照呈一条水平直线，无Ct值；阳性对照Ct值应小于或等于40，并呈典型的“S”型扩增曲线，实验方可成立，反之视为无效扩增。②阳性判定：样品扩增Ct值小于或等于40，并呈现典型的“S”型扩增曲线，表示新孢子虫阳性。③阴性判定：样品扩增无扩增曲线且为一水平直线，表示检测样品为阴性。④其他：样品扩增曲线Ct值介于40～45之间者判定为疑似阳性，需重新对这些样品进行Real-TimePCR扩增。重复样品Ct值依然介于40～45者，可人为判定为阳性，必要时可对该部分样品Real-TimePCR扩增产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳分析，出现146bp的条带则判定为阳性。此外，还可对扩增产物进行测序确定。

Claims (12)

1.一种用于检测新孢子虫病（Neosporiasis）的遗传标记物，其具有SEQIDNO.4所示的序列或其特异性片段。
2.用于扩增权利要求1所述遗传标记物的特异性引物对。
3.根据权利要求2所述的特异性引物对，其核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示：
上游引物：5’-TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3’
下游引物：5’-CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3’。
4.与权利要求2或3所述的引物配合使用的荧光探针。
5.根据权利要求4所述的荧光探针，其核苷酸序列为SEQIDNO.3所示：
5’-TTATTCCGCCGTGTTTC-3’。
6.一种检测新孢子虫病的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2或3所述的特异性引物对和权利要求4或5所述的荧光探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，还包括实时荧光定量PCR反应试剂，阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为新孢子虫病的标准阳性模板，阴性对照品为灭菌去离子水。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，采用3D数字PCR方法进行检测，制定标准阳性模板，其15μL反应体系为：
样品DNA2.0μL
2×3DMasterMix7.5μL
10pM上游引物1.0μL
10pM下游引物1.0μL
10pM荧光探针1.0μL
ddH2O补至15μL。
9.根据权利要求6-8任一所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的引物、探针3D数字PCR工作程序为：96℃预变性10min；58℃退火-延伸2min，98℃变性30s，40次循环；60℃延伸2min。
10.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，其采用实时荧光定量PCR方法进行检测，优化后的实时荧光定量PCR反应体系为25μL：
样品DNA1.0μL
2×Real-TimePCRMix12.5μL
10pM上游引物1.0μL
10pM下游引物1.0μL
10pM荧光探针1.0μL
荧光校正液0.5μL
ddH2O补至25μL。
11.根据权利要求6、7及10任一所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒的工作程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火-延伸45s，45次循环。
12.根据权利要求2或3所述的特异性引物对和权利要求4或5所述的荧光探针在制备检测新孢子虫病试剂盒中的应用。
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