CN105219647A - 一种灵芝孢子的破壁方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子的破壁方法，该方法先以固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎技术、超声波或匀浆法处理得到破壁灵芝孢子粉。本发明提供的灵芝孢子的破壁方法，通过大量实验筛选不同的处理工艺，优选出固定化复合酶法和超微粉碎等技术相结合的处理方法，在短时间内破壁率可达100％，并且总三萜和总多糖等有效成分溶出率更高，临床服用更易吸收，临床效果更佳，整个工艺设计合理，操作方便，可实现工业化生产，具有重要的推广价值和经济效益。

Description

一种灵芝孢子的破壁方法

技术领域

本发明涉及的是一种中药的加工处理方法，具体涉及一种破壁率高，有效成分含量更高的灵芝孢子的破壁方法。

背景技术

灵芝孢子是灵芝子实体发育后期弹射释放出的生殖细胞，呈淡褐色至黄褐色，卵形，双层壁，内孢壁淡褐色至黄褐色，有突起的小刺，外孢壁平滑，无色。灵芝孢子含有比灵芝子实体更加丰富的多糖类、三萜类、脂肪酸类、氨基酸、多肽类、甾醇类、无机离子等活性成分。灵芝孢子富含多糖，蛋白质含量高达18％，其中异亮氨酸、赖氨酸、缬氨酸、蛋氨酸等人体必需氨基酸的含量丰富。三萜类化合物主要包括灵芝酸A、B、C等；脂肪酸主要包括亚油酸、油酸、花生四烯酸、棕搁油酸等，不饱和脂肪酸是主要成分，占脂肪酸总量的61.2％，这些不饱和脂肪酸具有清除DPPH自由基的活性。现代药理与临床研究结果表明，灵芝孢子具有增强免疫、抗肿瘤、抗炎、保肝、降血清胆固醇、降血糖、抗辐射、抗病毒等功能，尤其在增强免疫、抑制肿瘤的药效方面远远超过灵芝子实体。

由于灵芝孢子具有丰富的有效成分和广泛的药理活性，近年来，关于灵芝孢子产品不断地被开发出来，目前灵芝孢子应用主要有破壁和不破壁两种。人体服用未破壁的灵芝孢子后极难被胃酸消化，也很难被肠道中的消化酶分解，导致有效成分很难被人体吸收利用，因此为了充分利用灵芝孢子内的有效物质，对孢子需进行破壁处理。由于灵芝孢子的双层壁结构，且具有同心圆的层网结构，质地坚韧，这些高分子成分不溶于水，且耐酸碱、耐压、耐高温，极难分解，对消化酶也非常稳定，一般方法很难破壁，从而限制了对其化学成分、生物活性成分的提取和研究。近年来，国内外科技工作者曾应用生物法如酶解，物理法如超声波和微波，化学法如溶剂浸提和机械法等方法对灵芝孢子破壁工艺进行了多方面的研究与探索，实际加工中以机械法为主，通过碾压、挤压、喷射粉碎、气流粉碎和撞击等机械作用来破坏灵芝孢子，已有的研究结果表明，灵芝孢子经破壁处理后，有利于其活性成分的提取。破壁灵芝孢子粉的脂肪及水溶性多糖的含量分别比不破壁的提高了38.9％和20.8％，多糖和多肽较不破壁灵芝孢子更易于提取，含量明显提高，三萜类化合物的含量也显著高于不破壁灵芝孢子。且灵芝孢子破壁后，其有效成分更易于在人体消化环境内释放，更易于被人体吸收利用。破壁孢子多糖在人工肠液的溶出率是未破壁孢子的2.5倍，三萜含量约为未破壁孢子的4倍。但是现有的方法，灵芝孢子破壁率不高，有效成分不能充分得到吸收，难以体现灵芝孢子多成分的功效作用。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种破壁率高达100％，总三萜和总多糖溶出率高，工艺设计合理，操作方便的灵芝孢子的破壁方法。

技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

一种灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，该方法先以固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎技术、超声波或匀浆法处理得到破壁灵芝孢子粉。

作为优选方案，所述的灵芝孢子的破壁方法，该方法先以固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎技术处理得到破壁灵芝孢子粉。

作为优选方案，所述所述的灵芝孢子的破壁方法，包括以下步骤：

(1)固定化复合酶的制备

称取植物多糖溶于蒸馏水中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温冷却，加入纤维素酶、几丁质酶和葡聚糖酶，得到植物多糖和酶的混合物，将混合物滴入氯化钙溶液中，搅拌，滴完后静置硬化，倾去氯化钙溶液，再用蒸馏水洗涤，除去漂浮的空化珠状颗粒，制备得到固定化复合酶；

(2)将步骤(1)制备得到的固定化复合酶装入玻璃层析柱中，然后在固定化复合酶上方加入灵芝孢子的悬液，收集玻璃层析柱的流出液，浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物采用超微粉碎技术、超声波或匀浆法进行物理粉碎处理，得到破壁灵芝孢子粉。

作为更加优选的方案，以上所述的灵芝孢子的破壁方法，包括以下步骤：

(1)固定化复合酶的制备

称取海藻酸钠或琼脂溶于蒸馏水中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温冷却，按重量比3:1:1加入纤维素酶、几丁质酶和葡聚糖酶，得到海藻酸钠或琼脂和酶的混合物，将混合物滴入氯化钙溶液中，搅拌，滴完后静置硬化，倾去氯化钙溶液，再用蒸馏水洗涤，除去漂浮的空化珠状颗粒，制备得到固定化复合酶；

(2)将步骤(1)制备得到的固定化复合酶装入玻璃层析柱中，然后在固定化复合酶上方加入灵芝孢子的悬液，控制温度35～40℃，流速1.0～2.0mL/min，收集玻璃层析柱的流出液，减压浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物采用超微粉碎技术进行物理粉碎处理，得到破壁灵芝孢子粉。

作为优选方案，所述所述的灵芝孢子的破壁方法，超微粉碎技术处理的时间为10min。

工艺筛选实验：

本发明以破壁率、有效成分(总三萜、总多糖)等为检测指标，考察超声波、球磨法、挤压法、超微粉碎技术和固定化复合酶与超微粉碎联合技术等多种破壁技术对灵芝孢子破壁率及有效成分溶出的影响，筛选出灵芝孢子的最佳破壁工艺。

一、破壁率的计算：采用血球计数板法，在200倍光学显微镜下计数破碎与未破碎的灵芝孢子。破壁率＝[(A-B)/A]×100％(A为破壁前完整孢子数,B为破壁后完整孢子数。)

二、灵芝多糖含量测定

对照品溶液的制备取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。

标准曲线的制备分别精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，置10ml具塞试管中，加水至2.0ml，精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加80％的硫酸溶液100ml使溶解，摇匀)6ml，摇匀，置水浴中加热15分钟，取出，放入冰浴中冷却15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(附录VA)，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

供试品溶液的制备取本品粉末约2g，精密称定，置索氏提取器中，加水90ml，电加热器加热回流提取至提取液无色(5h)，提取液转移至100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取10ml，加入乙醇150ml，摇匀，4℃放置12小时，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解，转移至50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

测定法精密量取供试品溶液2ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入硫酸蒽酮溶液6ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含葡萄糖的重量(mg)，计算，即得。

三、灵芝孢子三萜含量的测定

1、对照品溶液的制备

取熊果酸对照品5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加入乙酸乙酯溶解、定容，摇匀，即得。

2、对照品溶液的制备与标准曲线的绘制

分别精密吸取熊果酸对照品(0.2mg/mL)0，0.1，0.3，0.5，0.7，0.9mL，100℃水浴蒸干后加入5％香草醛—冰醋酸0.4mL和高氯酸1.0mL摇匀，于60℃水浴加热15min，冰浴3min，加入5mL冰醋酸摇匀，放置15min后于548nm下测定吸光度，以第一份为空白，绘制标准曲线。

3、样品溶液的制备与测定

取孢子粉0.1g置于100mL容量瓶，加入90mL乙酸乙酯超声30min，冷却至室温后定容100mL，过滤，取滤液1mL置于15mL试管，100℃水浴蒸干，后加入5％香草醛—冰醋酸0.4mL和高氯酸1.0mL摇匀，于60℃水浴加热15min，冰浴3min，加入5mL冰醋酸摇匀，放置15min后于548nm下测定吸光度。

4、灵芝孢子三萜含量的计算

三萜含量(mg/g)＝XV/M

X—从对照品曲线查得的对应某一吸光度的样品浓度，mg/mL；V—稀释的体积，mL；M—样品的质量，g。

四、实验结果

以破壁率、有效成分(总三萜、总多糖)等为检测指标，考察超声波、球磨法、挤压法、固定化复合酶法、超微粉碎等多种破壁技术对灵芝孢子破壁率及有效成分溶出的影响，建立破壁灵芝孢子的制备工艺。

灵芝孢子破壁后，颜色加深呈现棕褐色。显微镜下观察未破壁的孢子壁光滑完整、丰满,结构清晰,个体形态一致，呈卵形；破壁后,孢子壁不完整、内容物呈不规则块状(如图1所示)。采用超声波、球磨法、超微粉碎等不同的灵芝孢子破壁方法，随着破壁时间的延长，孢子破壁率呈现上升的趋势，在破壁时间达到45min的时候，破壁率基本上均达到最大值(如图2所示)。由筛选实验结果表明，其中超微粉碎技术的破壁效果最好。随着破壁时间的延长，总三萜和总多糖含量呈现先增加后减少的趋势，30min时总三萜和总多糖的含量达到最高值(如图3和图4所示)，实验结果表明其中超微粉碎破壁法更有利于灵芝孢子有效成分的溶出。综合分析破壁率和有效成分的含量，采用超微粉碎破壁法，破壁时间30min，破壁率可达到96.97％，总三萜和总多糖的溶出量分别为34.16mg/g和33.88mg/g，分别比对照(总三萜13.13±0.72mg/g和总多糖6.91±0.46mg/g)提高了160.2％和390.0％。

另外本发明采用固定化复合酶法和超微粉碎结合的处理技术，结果表明，超微破碎的时间可以大幅度缩短至10min，破碎率就能达100％，且总多糖和总三萜的含量分别为41.72mg/g和38.16mg/g，分别比对照提高了217.7％和252.2％，具有更加优越的破壁处理效果，并且可大幅度缩短超微破碎的时间，可以有效防止灵芝孢子长时间粉碎导致的氧化和不耐热成分破坏的不足。因此，本发明最终优选得到的灵芝孢子破壁方法为先采用固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎处理。

本发明通过采用固定化酶技术，即应用琼脂或海藻酸钠等材料将纤维素酶、几丁质酶、木质素酶等多种复合酶制成固定化酶颗粒后，装入生物反应器，制成酶反应器，将灵芝孢子悬液以一定的流速加入酶反应器后，且以一定的流速排出裂解液，实现酶的高效连续催化裂解，有利于裂解产物与酶分子的有效分离，且固定化酶可反复多次使用，可极大地降低生产成本。然后再将灵芝孢子裂解液应用超微粉碎、超声波、匀浆法等物理技术进行处理，得到高破壁率的灵芝孢粉子。

有益效果：本发明提供的灵芝孢子的破壁方法和现有技术相比具有以下优点：

本发明提供的灵芝孢子的破壁方法，通过大量实验筛选不同的处理工艺，优选出固定化复合酶法和超微粉碎结合的处理方法，在短时间内破壁率可达100％，并且总三萜和总多糖等有效成分溶出率更高，临床服用更易吸收，临床效果更佳，整个工艺设计合理，操作方便，可实现工业化生产，具有重要的推广价值和经济效益。

附图说明

图1为不同时间的超微粉碎灵芝孢子的显微图。

图2不同破碎方法对灵芝孢子破壁影响的柱状图。

图3为不同破碎方法对灵芝孢子总三萜含量影响的柱状图。

图4为不同破碎方法对灵芝孢子总多糖含量影响的柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

实施例1

一种灵芝孢子的破壁方法，其包括以下步骤：

(1)复合酶的固定化及催化反应

称取5.0g海藻酸钠于150mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷至35℃左右，加入预先制备好的纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶(重量比3:1:1)溶液100mL。

(2)用注射器抽取海藻酸钠-酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有500mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤3-4次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的复合酶。

将上述制备的固定化复合酶装入玻璃层析柱式的反应器中，加入灵芝孢子悬液(质量浓度20％)，控制温度35℃，流速1.0mL/min，收集流出液，减压浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物，采用超微粉碎技术进行物理粉碎处理10分钟，超微粉碎的振幅为5.5mm，温度为18℃，得到破壁灵芝孢子粉。

按上述方法检查步骤(3)制备得到的灵芝孢子粉的破壁率为100％，总三萜和总多糖的溶出量分别为34.16mg/g和33.88mg/g。

实施例2一种灵芝孢子的破壁方法，其包括以下步骤：

(1)复合酶的固定化及催化反应

称取5.0g琼脂于150mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷至35℃左右，加入预先制备好的纤维素酶、几丁质酶、葡聚糖酶(重量比3:1:1)溶液100mL。

(2)用注射器抽取海藻酸钠-酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有500mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤3-4次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的复合酶。

将上述制备的固定化复合酶装入玻璃层析柱式的反应器中，加入灵芝孢子悬液(质量浓度20％)，控制温度40℃，流速2.0mL/min，收集流出液，减压浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物，采用超微粉碎技术进行物理粉碎处理10分钟，超微粉碎的振幅为5.5mm；温度为20℃，得到破壁灵芝孢子粉。

按上述方法检查步骤(3)制备得到的灵芝孢子粉的破壁率为100％，总三萜和总多糖的溶出量分别为34.21mg/g和33.92mg/g。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，该方法先以固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎技术、超声波或匀浆法处理得到破壁灵芝孢子粉。

2.根据权利要求1所述的灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，该方法先以固定化复合酶进行前处理，然后再采用超微粉碎技术处理得到破壁灵芝孢子粉。

3.根据权利要求1所述的灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)固定化复合酶的制备

称取植物多糖溶于蒸馏水中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温冷却，加入纤维素酶、几丁质酶和葡聚糖酶，得到植物多糖和酶的混合物，将混合物滴入氯化钙溶液中，搅拌，滴完后静置硬化，倾去氯化钙溶液，再用蒸馏水洗涤，除去漂浮的空化珠状颗粒，制备得到固定化复合酶；

(2)将步骤(1)制备得到的固定化复合酶装入玻璃层析柱中，然后在固定化复合酶上方加入灵芝孢子的悬液，收集玻璃层析柱的流出液，浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物，采用超微粉碎技术、超声波或匀浆法进行物理粉碎处理，得到破壁灵芝孢子粉。

4.根据权利要求3所述的灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)固定化复合酶的制备

称取海藻酸钠或琼脂溶于蒸馏水中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温冷却，按重量比3:1:1加入纤维素酶、几丁质酶和葡聚糖酶，得到海藻酸钠或琼脂和酶的混合物，将混合物滴入氯化钙溶液中，搅拌，滴完后静置硬化，倾去氯化钙溶液，再用蒸馏水洗涤，除去漂浮的空化珠状颗粒，制备得到固定化复合酶；

(2)将步骤(1)制备得到的固定化复合酶装入玻璃层析柱中，然后在固定化复合酶上方加入灵芝孢子的悬液，控制温度35～40℃，流速1.0～2.0mL/min，收集玻璃层析柱的流出液，减压浓缩、干燥，得到灵芝孢子固定化复合酶前处理物；

(3)取步骤(2)制备得到的固定化复合酶前处理物，采用超微粉碎技术进行物理粉碎处理，得到破壁灵芝孢子粉。

5.根据权利要求4所述的灵芝孢子的破壁方法，其特征在于，超微粉碎技术处理的时间为10min。