CN105218388B

CN105218388B - β‑羰基烯胺类化合物及作为制备植物病原菌抗菌剂的应用

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Publication number: CN105218388B
Application number: CN201510705388.XA
Authority: CN
Inventors: 耿会玲; 于新池; 逯嫒琳; 曹浩强; 周博航; 赵忠
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2017-07-11
Anticipated expiration: 2035-10-26
Also published as: CN105218388A

Abstract

本发明涉及一种β‑羰基烯胺类化合物及其作为制备植物病原菌抗菌剂的应用。以市售抗菌剂醚菌酯为阳性对照，采用菌丝线性生长速率法测定了23种目标化合物对苹果炭疽病原菌、玉米弯孢病原菌、水稻稻瘟病原菌、小麦赤霉病原菌、西瓜枯萎病原菌等5种常见植物病原真菌的抑制活性，结果表明：目标化合物对供试菌均具有程度不等的抑制作用。化合物8、11、12、14、16的活性较好，它们对多数供试病原菌的EC₅₀值即半数效应浓度均高于阳性对照药物醚菌酯。特别是化合物8对苹果炭疽病原菌的抑制活性(EC₅₀＝2.15μg/mL)以及化合物12对玉米弯孢病原菌的抑制活性(EC₅₀＝9.14μg/mL)均为醚菌酯活性(EC₅₀＝15.45&76.06μg/mL)的8倍多，具有潜在的开发与应用价值。

Description

β-羰基烯胺类化合物及作为制备植物病原菌抗菌剂的应用

一、技术领域：

本发明涉及一类结构新颖的具有抑制植物病原菌生长的化合物，具体涉及一种β-羰基烯胺类化合物及其作为制备植物病原菌抗菌剂的应用。

二、背景技术：

农业是我国国民经济的基础，然而植物病害给我国乃至全世界农业生产带来了难以估计的损失，因此，对其进行有效防控是保证农业高效生产和稳步发展的根本措施之一，目前的主要防治手段是农药的广泛施用。因此，具有我国自主知识产权农药的研究与开发对于我国农业乃至国民经济的发展具有极为重要的战略意义。结构新颖的新型抗菌剂的研究与开发一直是人们攻克的难题。

据文献记载，自然界的真菌大约有十万种，其中有害的病原真菌达8000多种，且真菌引起的病害占植物病害总量的80％，危害极大。有的真菌还会使农产品、木材、食品等发霉变质，有的甚至寄生于人畜体内而引起皮肤病。加之真菌繁殖速度快，传播能力强，很难被除去，从而给农作物和农产品的质量和产量造成了很大的影响。如何采取有效而绿色环保的方法防治病原真菌，是农民增产增收和生态环境保护的关键。近年来，我国在植物病原菌的防治研究方面取得了较大的进展，但同时也存在着一定的问题。传统的农业防治——轮作等简单方法没有得到很好实施，使得这些病害日益严重，化学农药防治仍是目前植物病害防治的主要手段，但化学抗菌剂的大面积频繁使用导致病厡菌对其产生严重的抗药性。因此，有必要开发结构新型而广谱的抗菌剂。为此，我们设计了一系列β-羰基烯胺类化合物，并***考察了其对常见的5种植物病原菌(苹果炭疽病原菌、西瓜枯萎病原菌、玉米弯孢病原菌、水稻稻瘟病原菌和小麦赤霉病原菌)的抑制活性。

三、发明内容

本发明的目的在于提供一种β-羰基烯胺类化合物及作为制备植物病原菌抗菌剂的应用，其采用菌丝线性生长速率法测定了合成的23个目标化合物对苹果炭疽病原菌、玉米弯孢病原菌、水稻稻瘟病原菌、小麦赤霉病原菌、西瓜枯萎病原菌等常见的5种植物病原真菌的体外抑制活性，发现所有化合物对供试菌均具有不同程度的抑制作用。化合物8、11、12、14、16对玉米弯孢病原真菌、苹果炭疽病原真菌、西瓜枯萎病原真菌的抑制活性均明显高于阳性对照药物——醚菌酯，这5个化合物具有进一步研究和开发价值，有望发展成为新型抗菌剂。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种β-羰基烯胺类化合物，其特征在于:具有如下分子结构特征：

其中，R为氢，卤素，甲基，甲氧基，三氟甲基，叔丁基，环己基，杂环取代基。

2、根据权利要求1所述的β-羰基烯胺类化合物，其特征在于：合成路线具体如下：

3、根据权利要求1所述的β-羰基烯胺类化合物作为制备植物病原菌抗菌剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：

(1)该类化合物结构简单，分子量小，药效高；

(2)建立了该类化合物的合成方法并对其结构进行了鉴定，该方法合成步骤短，操作简便，后处理简单；

(3)体外抗菌活性试验证明：该类化合物对所有供试菌均具有不同程度的抑制活性，其中有5个化合物的抑菌活性显著高于阳性药物，特别是化合物8对苹果炭疽病原菌的抑制活性(EC₅₀＝2.15μg/mL)以及化合物12对玉米弯孢病原真菌的抑制活性(EC₅₀＝9.14μg/mL)分别为阳性对照醚菌酯活性(EC₅₀＝15.45,76.06μg/mL)的7.2倍和8.3倍。

据此可知：这是一类在农药方面具有潜在应用价值的药物前体，本发明将为此类化合物的后续设计及其药理活性的研究提供理论依据和技术支撑。

四、附图说明：

图1为化合物8抑制玉米弯孢病原真菌的回归曲线；

图2为化合物8抑制水稻稻瘟病原真菌的回归曲线；

图3为化合物8抑制苹果炭疽病原真菌的回归曲线；

图4为化合物11抑制玉米弯孢病原真菌的回归曲线；

图5为化合物11抑制水稻稻瘟病原真菌的回归曲线；

图6为化合物11抑制苹果炭疽病原真菌的回归曲线；

图7为化合物11抑制西瓜枯萎病原真菌的回归曲线；

图8为化合物12抑制玉米弯孢病原真菌的回归曲线；

图9为化合物12抑制水稻稻瘟病原真菌的回归曲线；

图10为化合物12抑制苹果炭疽病原真菌的回归曲线；

图11为化合物14抑制玉米弯孢病原真菌的回归曲线；

图12为化合物14抑制水稻稻瘟病原真菌的回归曲线；

图13为化合物14抑制苹果炭疽病原真菌的回归曲线；

图14为化合物14抑制西瓜枯萎病原真菌的回归曲线；

图15为化合物16抑制玉米弯孢病原真菌的回归曲线；

图16为化合物16抑制水稻稻瘟病原真菌的回归曲线；

图17为化合物16抑制苹果炭疽病原真菌的回归曲线；

图18为化合物16抑制西瓜枯萎病原真菌的回归曲线；

图19为化合物16抑制小麦赤霉病原真菌的回归曲线。

五、具体实施方式

在本发明中，设计并合成的β-羰基烯胺类化合物结构通式如下：

其中，R为氢，卤素，甲基，甲氧基，三氟甲基，叔丁基，环己基，杂环取代基等。目标化合物的化学结构和物理性质如表1所示。

表1 β-羰基烯胺类化合物的结构和物理性质

本发明建立的制备β-羰基烯胺类化合物的合成路线如下：

(一)β-1,3-二酮的合成

取代苯乙酮和NaNH₂在乙酸乙酯中回流10～15h，即取代苯乙酮在氨基钠的催化下与乙酸乙酯发生克莱森缩合反应，即可制得β-1,3-二酮。

(二)β-羰基烯胺类化合物的合成

β-1,3-二酮与CH₃COONH₄在甲醇溶液中回流1～3h，发生先加成后消除的酮类化合物所特有的典型亲核加成反应，就可合成目标化合物β-羰基烯胺。

合成不同类型β-羰基烯胺类化合物的具体操作步骤如下:

1.化合物1即4-苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

(1)将6.06g(50mmol)苯乙酮加入盛有100mL干燥乙酸乙酯的500mL的梨形瓶中，在冰盐浴中，向其中分批缓慢加入3.91g的NaNH₂(100mmol)，充分搅拌至其完全溶解，溶液由无色透明逐渐变为褐色粘稠液。

(2)95℃油浴加热，回流12h，TLC检测显示原料基本反应完全，停止反应。

(3)向反应瓶中加入适量1mol/L的稀盐酸淬灭反应，待其中固体全部消失后即pH＝7时，将混合液转入分液漏斗，静置分层，水相用乙酸乙酯萃取3次(50mL×3)，合并有机相，用饱和食盐水洗涤有机相，无水NaSO₄干燥后减压蒸馏除去溶剂得到粗产物——β-1,3-二酮的浸膏。

(4)所得浸膏经硅胶柱层析分离，以石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂作为洗脱液，得到中间产物Ⅰ。

(5)依次向250mL圆底烧瓶中加入3.24g(20mmol)中间产物Ⅰ、7.27g(60mmol)的醋酸铵和50mL甲醇，加热回流。

(6)TLC检测证明原料完全反应后，停止反应。

(7)减压蒸馏除去甲醇，得到淡黄色固体；向其中加入100mL蒸馏水以除去多余的醋酸铵。

(8)减压抽滤，布氏漏斗中的粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次，所得粗产品为白色固体。

(9)以石油醚和乙酸乙酯为溶剂重结晶粗产物，得到白色针状晶体，减压抽滤，得2.3172g目标产物。

(10)重结晶母液：减压蒸馏除去溶剂，所得乳白色带黄色固体再次重结晶，得0.53g产品。

计算可知：重结晶总产率为72.60％。

2.化合物8：4-对氟苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

如化合物1所述，加料反应后，减压蒸馏除去甲醇，加100mL水除去多余的醋酸铵；减压抽滤，所得粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次；减压蒸馏除去溶液，对所得粗产品进行重结晶，得到白色片状结晶2.0313g。重结晶产率为75.57％。

3.化合物11：4-间氯苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

如化合物1所述，加料反应后，减压蒸馏除去甲醇，加80mL水除去多余的醋酸铵；减压抽滤，所得粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次；减压蒸馏除去溶液，对所得粗产品进行重结晶，得到白色微小片状结晶0.8346g。重结晶产率为24.34％。

4.化合物12：4-对氯苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

如化合物1所述，加料反应后，减压蒸馏除去甲醇，加100mL水除去多余的醋酸铵；减压抽滤，所得粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次；减压蒸馏除去溶液，对所得粗产品金进行重结晶，得到白色针状结晶1.2841g。重结晶产率为65.21％。

5.化合物14：4-对三氟甲基苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

如化合物1所述，加料反应后，减压蒸馏除去甲醇，加100mL水除去多余的醋酸铵；减压抽滤，所得粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次；减压蒸馏除去溶液，对所得粗产品金进行重结晶，得到淡黄色针状结晶1.5098g。重结晶产率为79.66％。

6.化合物16：4-对溴苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺的合成

如化合物1所述，加料反应后，减压蒸馏除去甲醇，加100mL水除去多余的醋酸铵；减压抽滤，所得粗产物用水洗3次，石油醚洗涤3次；减压蒸馏除去溶液，对所得粗产品金进行重结晶，得到白色针状结晶2.9161g。重结晶产率为73.80％。

(三)部分化合物的波谱数据

申请人采用波谱技术(¹H NMR和¹³C NMR)对所有化合物进行了结构表征，以下为6种代表化合物的核磁共振谱图的数据。

4-苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(1):m.p.109.2～110.2℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.22(br,1H,N-H),7.89～7.87(m,2H,ph-H),7.44～7.41(m,3H,ph-H),5.74(s,1H,-H＝C),5.18(br,1H,N-H),2.06(s,3H,-CH₃)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:189.5,162.7,140.2,130.8,128.2,127.1,92.2,22.8。

4-对氟苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(8):m.p.127.2～128.6℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.18(br,1H,N-H),7.90～7.86(m,2H,ph-H),7.09～7.0(m,2H,ph-H),5.69(s,1H,-CH＝C),5.20(br,1H,N-H),2.06(s,3H,Me-H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:188.0,165.7,163.2,136.4,129.3,115.2,115.0,91.9,22.9。

4-间氯苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(11):m.p.107.8～108.8℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.23(br,1H,N-H),7.85(s,1H,ph-H),7.75～7.73(d,1H,J＝7.8Hz,ph-H),7.41～7.39(d,1H,J＝8.0Hz,ph-H),7.35～7.32(t,1H,J＝7.8Hz,ph-H),5.68(s,1H,-CH＝C),5.26(br,1H,N-H),2.07(s,3H,Me-H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:187.6,163.8,142.0,134.4,130.7,129.5,127.3,125.2,92.1,22.9。

4-对氯苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(12):m.p.120.9～121.9℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.22(br,1H,N-H),7.82～7.80(m,2H,ph-H),7.57～7.55(m,1H,ph-H),7.38～7.36(m,2H,ph-H),5.69(s,1H,-CH＝C),5.23(br,1H,N-H),2.07(s,3H,Me-H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:188.0,163.4,138.5,136.9,128.4,92.0,22.9。

4-对三氟甲基苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(14):m.p.120.9～121.9℃；¹H NMR(500Hz,CDCl₃)δ:10.30(br,1H,N-H),7.97～7.95(d,2H,J＝8.1Hz,ph-H),7.67～7.66(d,2H,J＝8.2Hz,ph-H),5.73(s,1H,-CH＝C),5.33(br,1H,N-H),2.09(s,3H,Me-H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:187.7,164.1,143.3,132.4,132.1,127.4,125.4,125.3,125.2,122.6,92.3,22.9。

4-对溴苯基-4-氧代-2-丁烯-2-胺(16):m.p.120.1～122.6℃；¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:10.22(br,1H,N-H),7.75～7.73(m,2H,ph-H),7.54～7.52(m,2H,ph-H),5.68(s,1H,-CH＝C),5.23(br,1H,N-H),2.07(s,3H,Me-H)；¹³C NMR(125MHz,CDCl₃)δ:188.0,163.4,139.0,131.4,128.7,125.4,92.0,22.9。

(三)β-羰基烯胺类化合物的抗菌活性

1.供试菌

苹果炭疽病原真菌(Colletotrichum gloeosporioides)

西瓜枯萎病原真菌(Fusarium oxysporium)

水稻稻瘟病原真菌(Pyricularia oryza)

玉米弯孢病原真菌(Curvularia lunata)

小麦赤霉病原真菌(Fusarium graminearum)

2.PDA培养基配制

根据所需培养基的总量，按照每1000mL水中添加200g土豆、15g琼脂、20g葡萄糖的量称取原材料并配制培养基。具体步骤如下：在不锈钢锅中加入适量的蒸馏水，加热至沸；将称好的土豆洗干净，去皮，切块，待水沸腾时加入锅中，大火煮沸后调节加热速度，保持微沸30min；用叠成八层的纱布过滤上述混合液至所需体积，调节pH至7，加入预先称量好的琼脂和葡萄糖，充分搅拌至混合均匀，用量筒准确称取所需量后分装在锥形瓶中，用专用封口膜封口，待用。

3.供试样品溶液配制

准确称量待测样品，将其装入20mL的小瓶中，用移液枪加入预先计算好的适量二甲基亚砜(DMSO)，超声波处理使其完全溶解，盖上瓶盖，放入超净工作台中；接着打开紫外灯，照射装有待测样液的小瓶，灭菌30min；按照DMSO与无菌水的体积比为1:19的量，用预先灭菌过的移液管吸取定量的无菌蒸馏水加入样品瓶中，将待测样品配制成5％的供试样液，将其充分混匀后待用。以等体积的5％DMSO水溶液作阴性对照，阳性药物配制方法和待测样品相同。

4.初步筛查目标化合物抗菌活性的实例

实例1 化合物8对水稻稻瘟病原真菌的体外抑菌活性

用20mL小瓶准确称取5mg化合物8，向其中注入0.5mL DMSO和9.5mL无菌水，将待测样品配成5％的DMSO溶液；然后加入灭菌后融化的90mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基。以等量溶剂即5％的DMSO作为空白对照，以市售抗菌药物醚菌酯作为阳性对照。

用直径为5mm的打孔器取出菌落边缘生长旺盛的水稻稻瘟病原菌菌饼，用接种针将其转移至上述平面培养基上，菌丝一面朝下，贴在培养基上，每皿3块，呈三角形放置于中央，加盖后置于恒温培养箱中培养，温度为26℃，湿度为80％，光照设为0％。72h后，采用十字交叉法用直尺测量菌落的垂直交叉直径，取其平均值。每处理设3个重复。

按下式计算抑菌率：

菌丝生长抑制率(％)＝{[空白对照菌落直径–处理菌落直径]}/[空白菌落直径-5]×100

实例2 化合物14对西瓜枯萎病原真菌的体外抑菌活性

用20mL小瓶准确称取5mg化合物14，向其中注入0.5mL DMSO和9.5mL无菌水，将待测样品配成5％的DMSO溶液；然后加入灭菌后融化的90mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基。以等量溶剂即5％的DMSO作为空白对照，以市售抗菌药物醚菌酯作为阳性对照。

用直径为5mm的打孔器取出菌落边缘生长旺盛的西瓜枯萎病原菌菌饼，用接种针将其转移至上述平面培养基上，菌丝一面朝下，贴在培养基上，每皿3块，呈三角形放置于中央，加盖后置于恒温培养箱中培养，温度为26℃，湿度为80％，光照设为0％。72h后，采用十字交叉法用直尺测量菌落的垂直交叉直径，取其平均值。每处理设3个重复。

按下式计算抑菌率：

实例3 化合物14对苹果炭疽病原真菌的体外抑菌活性

用直径为5mm的打孔器取出菌落边缘生长旺盛的苹果炭疽病原菌菌饼，用接种针将其转移至上述平面培养基上，菌丝一面朝下，贴在培养基上，每皿3块，呈三角形放置于中央，加盖后置于恒温培养箱中培养，温度为26℃，湿度为80％，光照设为0％。72h后，采用十字交叉法用直尺测量菌落的垂直交叉直径，取其平均值。每处理设3个重复。

按下式计算抑菌率：

实例4 化合物16对小麦赤霉病原真菌的体外抑菌活性

用20mL小瓶准确称取5mg化合物16，向其中注入0.5mL DMSO和9.5mL无菌水，将待测样品配成5％的DMSO溶液；然后将上述待测液加入灭菌后融化的90mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基。以等量溶剂即5％的DMSO作为空白对照，以市售抗菌药物醚菌酯作为阳性对照。

用直径为5mm的打孔器取出菌落边缘生长旺盛的小麦赤霉病原菌菌饼，用接种针将其转移至上述平面培养基上，菌丝一面朝下，贴在培养基上，每皿3块，呈三角形放置于中央，加盖后置于恒温培养箱中培养，温度为26℃，湿度为80％，光照为0％。72h后，采用十字交叉法用直尺测量菌落的垂直交叉直径，取其平均值。每处理设3个重复。

按下式计算抑菌率：

实例5 化合物16对玉米弯孢病原真菌的体外抑菌活性

用20mL小瓶准确称取5mg化合物16，向其中注入0.5mL DMSO和9.5mL无菌水，将待测样品配成5％的DMSO溶液；然后加入灭菌后融化的90mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基。以等量溶剂即5％的DMSO作为空白对照，以市售抗菌药物醚菌酯作为阳性对照。

用直径为5mm的打孔器取出菌落边缘生长旺盛的玉米弯孢病原菌菌饼，用接种针将其转移至上述平面培养基上，菌丝一面朝下，贴在培养基上，每皿3块，呈三角形放置于中央，加盖后置于恒温培养箱中培养，温度为26℃，湿度为80％，光照设为0％。72h后，采用十字交叉法用直尺测量菌落的垂直交叉直径，取其平均值。每处理设3个重复。

按下式计算抑菌率：

采用上述菌丝生长速率法测定了合成的23种化合物对5种常见植物病原真菌的抑制活性，初步实验结果如表2所示。

表2 β-羰基烯胺类化合物化合物在50μg/mL时的初步抗菌活性

由表2可知：合成的23个β-羰基烯胺类化合物对供试的5种植物病原真菌均具有不同程度的抑菌活性。其中，有16个化合物对玉米弯孢病原菌的抑制活性高于阳性对照醚菌酯，有11个化合物对水稻稻瘟病原菌的抑制活性高于醚菌酯，有7个化合物对苹果炭疽病原菌的抑制率高于醚菌酯，有13个化合物对西瓜枯萎病原菌的抑制率高于醚菌酯，有4个化合物对小麦赤霉病原菌的抑制活性高于醚菌酯。总体而言，化合物8、11、12、14、16对5种供试菌的抑制活性普遍较醚菌酯的高，我们将进一步测量这5个化合物的抗菌毒力。

5.测定部分目标化合物抑制5种植物病原真菌的EC₅₀值的实例

实例1 测定化合物8抑制玉米弯孢病原真菌的EC₅₀值(参见图1)

用20mL的小瓶称取一定量的化合物8，以5％的DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝kx+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

实例2 测定化合物8抑制水稻稻瘟病原真菌的EC₅₀值(参见图2)

实例3 化测定合物8抑制苹果炭疽病原真菌的EC₅₀值(参见图3)

实例4 测定化合物11抑制玉米弯孢病原真菌的EC₅₀值(参见图4)

用20mL的小瓶称取一定量的化合物11，以5％的DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝kx+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

实例5 测定化合物11抑制水稻稻瘟病原真菌的EC₅₀值(参见图5)

将化合物11在样品小瓶中称量不同质量的样品，以5％的DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为80、40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝kx+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

实例6 测定化合物12抑制玉米弯孢病原真菌的EC₅₀值(参见图8)

用20mL的小瓶称取一定量的化合物12，以5％的DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝k x+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

实例7 测定化合物14抑制玉米弯孢病原真菌的EC₅₀值(参见图11)

用20mL的小瓶称取一定量的化合物14，以5％DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝kx+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

实例8 测定化合物16抑制玉米弯孢病原真菌的EC₅₀值(参见图15)

用20mL的小瓶称取一定量的化合物14，以5％的DMSO溶液溶解为5mL药剂，加入灭菌后融化的95mL PDA培养基中，混匀，配成100mL含有待测样品的培养基，最终配制成浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/mL培养基，倒入无菌培养皿中，制成带药平面培养基，采用上述菌丝生长速率法测定供试化合物对待测菌的菌丝生长抑制率。用拟合优度法模拟药物剂量-效应S曲线，通过Scatchard法和Hill法使量-效关系的S型曲线直线化，得出线性毒力回归方程y＝kx+b，应用GraphPad Prism 5.0软件计算EC₅₀值。

结果如表3所示，5种活性较高化合物对部分病原菌的毒力方程及其与醚菌酯抑菌活性的对比。

表3 测定5种活性较高化合物对部分植物病原菌的毒力回归方程

以上5种β-羰基烯胺类化合物的抑菌活性的毒力曲线见图1-19。由表3和图1-19的数据可知：除化合物11外，其余化合物对玉米弯孢病原菌、水稻稻瘟病原菌、苹果炭疽病原菌均有较好的抑制作用，且效果都优于市售商品药醚菌酯。此外，化合物8抑制苹果炭疽病原菌的活性(EC₅₀＝2.15μg/mL)是醚菌酯的(EC₅₀＝15.45μg/mL)7.2倍，化合物12对玉米弯孢病原菌的抑制活性(EC₅₀＝9.14μg/mL)是醚菌酯的(EC₅₀＝76.06μg/mL)8.3倍。化合物14对苹果炭疽病原真菌、西瓜枯萎病原真菌、水稻稻瘟病原真菌、玉米弯孢病原真菌的抑制活性都显著高于阳性对照药醚菌酯，化合物16对5种供试菌的抑制率也显著高于阳性药物醚菌酯。

这些结果充分说明供试样品——β-羰基烯胺类化合物具有进一步开发成抗菌药的潜在价值与用途。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。

Claims

1.一种β-羰基烯胺类化合物作为制备植物病原菌抗菌剂的应用，所述的β-羰基烯胺类化合物，具有如下分子结构特征：

其中，R为氢，卤素，甲基，甲氧基，三氟甲基，叔丁基，环己基。