CN105209600A - 通过代谢工程化的酵母菌株调节由玉米生产乙醇期间的氮代谢的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种减少重组微生物甘油产生并提高氮利用和乙醇产生的机制。本发明的一个方面涉及具有降低的甘油生产率的酿酒酵母菌株，其由更高的氮浓度获得动力益处而不会牺牲乙醇产率。本发明的第二个方面涉及导致玉米醪液中存在的氮源转运和/或胞内代谢发生改变的代谢性修饰。

Description

通过代谢工程化的酵母菌株调节由玉米生产乙醇期间的氮代谢的方法

背景技术

能量转化、利用和获取成为我们时代的许多重大挑战的根本原因，包括与可持续性、环境质量、安全和贫困相关的那些。需要新兴技术的新应用以对这些挑战作出响应。生物技术，一种最有力的新兴技术，可产生重要的新能量转化工艺。植物生物质和其衍生物是将能量生物转化成对人类有用的形式的资源。

在植物生物质的形式中，基于粮食(grain)的生物质和木质纤维素生物质(统称为“生物质”)非常适于能源应用。每种原料具有优势和劣势。例如，因为其大规模可用性、低成本，和环境友好的生产，木质纤维素生物质作为用于生物燃料生产的可行的进料(feed)来源受到关注。特别地，基于纤维素生物质的许多能源生产和利用循环在生命周期的基础上具有接近零的温室气体排放。

然而，基于粮食的原料更容易通过现有的微生物转化成燃料，但是基于粮食的原料比木质纤维素原料更昂贵并且转化成燃料与用于粮食的供选择的用途竞争。

涉及酶或微生物水解的生物质加工方案通常涉及四种生物介导的转化：(1)产生糖解酶(纤维素酶和半纤维素酶)；(2)将预处理的生物质中存在的碳水化合物组分水解成糖；(3)己糖(例如葡萄糖、甘露糖和半乳糖)发酵；和(4)戊糖(例如，木糖和***糖)发酵。这四种转化可发生在被称为联合生物加工(“CBP”)的工艺配置的单个步骤中，所述工艺配置与其他较不高度整合的配置的区别在于其不涉及用于纤维素酶和/或半纤维素酶生产的专用处理步骤。

CBP提供比特征为专用的纤维素酶生产的方法成本更低和效率更高的潜力。这些益处部分源自避免了与纤维素酶生产相关的资本成本、底物和其他原料和设备。另外，数个因素支持使用CBP实现更高的水解速率，并且因此实现减小的反应器体积和资本投资，所述因素包括酶-微生物协同作用和使用嗜热生物体和/或复杂的纤维素酶体系。而且，纤维素粘附性分解纤维素的微生物可能与非粘附性微生物成功地竞争纤维素水解的产物，例如污染物。期望的微生物的成功竞争增加基于微生物纤维素利用的工业过程的稳定性。开发实现CBP的微生物的进展通过下述两个策略来进行：工程化天然存在的分解纤维素的微生物，以改善产物相关的特性，如产率和效价；和工程化显示高产物产率和效价的非分解纤维素的生物体，以表达能够利用纤维素和半纤维素的异源纤维素酶和半纤维素酶体系。

符合乙醇生产需求的一种方式是转化生物质中存在的糖以产生乙醇，所述生物质即比如农业废物、玉米外壳、玉米芯、纤维素材料等的材料。大规模工业应用中有效的生物质转化需要能够耐受高浓度糖和乙醇的微生物，并且其能够同时发酵多于一种糖。

烘焙酵母(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))是用于生产乙醇的优选微生物(B.等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.73：53–84(2001))。有利于该微生物的属性是(i)接近理论产率的高产率(0.51g产生的乙醇/g使用的葡萄糖)，(ii)高渗透和乙醇耐受，(iii)工业过程中的天然稳健性，还有(iv)由于其与葡萄酒和面包制作以及啤酒酿造的长期关联而通常被视为安全的(GRAS)。此外，酿酒酵母显示对源自生物质预处理的水解产物中常见的抑制剂的耐受。产生乙醇的示例性代谢途径描绘在图1中。然而，酿酒酵母既不自发地分解纤维素的成分，也不有效地利用戊糖。

甘油是天然酵母乙醇发酵的代谢终产物(图1)。在碳水化合物上的厌氧生长期间，乙醇和二氧化碳的产生是氧化还原中性的，而产生细胞生物质和相关的二氧化碳的反应相对于碳水化合物更多是氧化的。相对于碳水化合物，甘油的产生更多是还原的，其用作电子冷阱，以抵消细胞生物质形成，以使总体氧化还原中性是守恒的。基于物质守恒的理论考虑这是必要的，并且在实践中不能产生甘油的菌株不能(或仅仅非常差地能够)在厌氧条件下生长。

有强的商业动机不产生作为副产物的甘油，因为其代表乙醇产率的损失。在工业玉米乙醇发酵中，对于～140亿加仑/年的市场，该产率损失可高达理论值的6％。以$2.50/加仑的销售价格，总市值为$2B/年。

解决该问题的来自文献的策略包括通过上调编码谷氨酰胺合酶的GLN1或编码谷氨酸合酶的GLT1，同时删除编码NADPH-依赖性谷氨酸脱氢酶的GDH1，通过工程化固定氨以与NADH而不是NADPH作用来减少甘油形成。(Nissen，T.L.等，MetabolicEngineering2：69-77(2000))。工程化细胞以在糖酵解期间通过表达NADPH产生过量NADPH的另一策略与甘油醛-3-磷酸脱氢酶相关。(Bro，C.等MetabolicEngineering8：102-111(2006))。另一策略包含GDH1的删除、以及谷氨酸合酶(GLT1)和谷氨酰胺合酶(GLN1)的过表达，这也导致甘油形成减少。然而，生长速率和生物质形成是远低于对照菌株的，而对初始性能的改进并未得到证实。此外，工业相关的产率、效价和发酵速率从未得到证实(第7,018,829号美国专利)。另一种策略描述了仅删除GDH1而未过表达GDH2或GLT1/GLN1。但是，该策略依赖于能够耐受高乙醇浓度的工业多倍体酵母菌株的使用。注意，在该专利中，仅删除GDH1，并且基因组中没有异源DNA序列。另外，在甘油生产中可见的最大减少量是12.04％，并且在工业上相关的底物中未得到证实(第7,935,514号美国专利)。大部分甘油减少策略或者仅仅部分减少对甘油形成的需要，或产生除乙醇之外的副产物。本发明克服了这些其他策略的缺陷。

玉米醪液含有游离的氨基氮。然而，量太低而无法实现足以满足工艺需求的酵母生物质形成。氮被加到工业玉米乙醇发酵中以促进酵母的生长，最常见的是以尿素和氨的形式。过量的氮可改善传统酵母的发酵动力学，然而，由于过量的生物质和甘油形成，乙醇产率通常较低。典型地，尿素以500ppm–1000ppm的浓度被加到工业玉米发酵中。

酵母摄取并同化铵作为其优选的氮源，接着是氨基酸、最后是尿素(图2)(Lungdhal等,Genetics190:885-929(2012)广泛地综述)。氮分解代谢物阻遏(NCR)控制的机理是由控制铵、氨基酸和尿素转运蛋白的转录因子来确立的。这些转录因子还控制负责含氮分子的降解和同化的蛋白质的表达。已表明，非优选氮源同化的途径去阻遏可以改善发酵动力学(Salmon,J.M.和Barre,P.,Appl.Environ.Microbiol.64:3831–3837(1998))；然而，未衡量对乙醇产率的影响。

酿酒酵母含有三种已知的铵转运蛋白：MEP1、MEP2和MEP3。MEP1和MEP2是高亲和力转运蛋白，而MEP3是低亲和力转运蛋白。酿酒酵母通过尿素-酰胺裂解酶(EC6.3.4.6)的酶促作用分解尿素。这一活性由酿酒酵母内的酶DUR1/2编码(图2-4)。DUR1/2在葡萄酒酵母菌中的过表达已显示提高在葡萄汁发酵期间尿素的降解速率(Coulon,J.等,Am.J.Enol.Vitic,57:2(2006))。有两种已知的酿酒酵母中的尿素转运蛋白：DUR3和DUR4(图2-图4)。已经表明，DUR3的过表达导致葡萄酒发酵期间尿素降解速率改善(Dahabieh,M.S.等,Am.J.Enol.Vitic.60:4(2009))。第2011/0129566号美国专利公开申请描述了DUR1/2和DUR3在葡萄酒酵母中的表达。

工业玉米醪液底物含有多达3％的蛋白质(w/v)；然而，在这些蛋白质中包含的许多氨基酸成分对酿酒酵母并不可用。一种或多种蛋白酶的表达将会释放出充当酵母的氮源的氨基酸。此外，将氨基酸用作玉米乙醇发酵中的酿酒酵母的氮源将会通过由厌氧生长期间体内氨基酸合成产生的剩余NADH的还原来改善产率。

Guo等人工程化了酿酒酵母以出于改善乙醇产率的目的表达异源蛋白酶(Guo,Z-p等,EnzymeandMicrobialTechnology48:148-154(2011))。然而，该工作是在此前尚未针对减少的甘油形成工程化的野生型酵母背景下进行的，表达出的内切蛋白酶的活性主要将蛋白质分解成不被酿酒酵母转运的短的多肽。

本发明的一个方面涉及通过外切蛋白酶的共表达来释放单独的氨基酸，从而改善发酵性能。此外，玉米粒蛋白主要是一类被称为玉米醇溶蛋白的贮存蛋白。玉米醇溶蛋白已被表明通过许多蛋白酶来抵抗水解，而且可能的是，玉米醇溶蛋白特异性蛋白酶的表达将导致改善的蛋白质水解。因此，本发明的另一个方面涉及表达玉米醇溶蛋白特异性蛋白酶以通过酵母改善玉米蛋白质的水解和氨基酸利用。

氨基酸由一个大家族的氨基酸通透酶转运。本发明的一个方面涉及特异性或普通的氨基酸通透酶的去调节或过表达，以通过改善蛋白质水解期间释放的游离氨基酸的摄取速率来补充蛋白酶表达或代谢工程化。例如，普通的氨基酸通透酶GAP1的表达受到AUA1的负调节。本发明的一个方面涉及可导致氨基酸摄取速率改善的AUA1缺失或GAP1过表达。

PCT/US2012/032443，其通过引用并入本文，教导了一种通过产生甲酸来消除甘油形成的方法。甲酸生产途径也可以与为了天然甘油生产途径的降低活性而工程化的菌株组合。这些组合可以设计成使菌株构建成具有如图5所示的不同甘油减少程度。本发明的几个实施方案涉及PCT/US2012/032443中描述的那些或相关的基因修饰的组合，附带额外的设计用于改变氮转运和同化的基因修饰。

本发明的一个方面涉及甘油产生减少的酿酒酵母菌株，这些菌株从较高的氮浓度获得了动力学益处，而不会牺牲乙醇的产率。本发明涉及的第二方面涉及代谢修饰，所述代谢修饰导致存在于玉米醪液中的氮源的转运和/或胞内代谢改变。

发明概述

一些实施方案涉及重组微生物，其包括：至少一种导致在一个或多个乙醇生产途径中发挥功能的一种或多种天然和/或异源酶上调或下调的工程化基因修饰；至少一种导致甘油生产途径中的酶下调的工程化基因修饰；以及至少一种导致氮同化途径中的酶上调或下调的工程化基因修饰。

在本发明的一些实施方案中，氮同化途径中下调的酶是谷氨酸脱氢酶(Gdh)(EC1.4.14)。

在本发明的一些实施方案中，所述微生物进一步包括至少一种导致氮同化途径中的酶上调的基因修饰。

在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是至少一种选自谷氨酸脱氢酶(Gdh)(EC1.4.1.1.2)、谷氨酸合酶(Glt)(EC1.4.1.14)、以及谷氨酰胺合酶(Gln)(EC6.3.1.2)的酶。在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是天然铵转运蛋白。在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是来自酿酒酵母属的MEP蛋白。在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是尿素-酰胺裂解酶(EC6.3.4.6)。在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是尿素转运蛋白。在本发明的一些实施方案中，在氮同化途径中上调的酶是Gln3。

在本发明的一些实施方案中，在甘油生产途径中的酶由至少一种选自以下的酶编码：甘油-3-磷酸脱氢酶1多核苷酸(GPD1)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶1多肽(Gpd1)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶2多核苷酸(GPD2)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶2多肽(Gpd2)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸磷酸酶1多核苷酸(GPP1)(EC3.1.3.21)、甘油-3-磷酸磷酸酶多肽1(Gpp1)(EC3.1.3.21)、甘油-3-磷酸磷酸酶2多核苷酸(GPP2)(EC3.1.3.21)和甘油-3-磷酸磷酸酶多肽2(Gpp2)(EC3.1.3.21)。

在本发明的一些实施方案中，在乙醇生产途径中起作用的上调的酶是丙酮酸甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)。在本发明的一些实施方案中，在乙醇生产途径中起作用的上调的酶是丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(EC1.91.1.4)。

在本发明的一些实施方案中，在乙醇生产途径中起作用的上调的酶是选自同时具有酶学委员会编号EC1.2.1.10和1.1.1.1的一组酶的双功能乙醛-醇脱氢酶。

在本发明的一些实施方案中，在乙醇生产途径中起作用的上调的酶是选自同时具有酶学委员会编号EC1.2.1.10和EC1.1.1.2的一组酶的NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶。

在一些实施方案中，所述微生物进一步包括由选自EC1.2.1.43和EC1.2.1.2的甲酸脱氢酶编码的一种或多种天然酶中的下调。

在本发明的一些实施方案中，所述重组微生物进一步包括可操作地连接到天然GPD2启动子的异源GPD1多核苷酸。在本发明的一些实施方案中，所述重组微生物进一步包括可操作地连接到天然GPD1启动子的异源GPD2多核苷酸。

在本发明的一些实施方案中，所述微生物进一步包括调节元件的上调或下调。在一些实施方案中，所述调节元件选自Ure2和Anal。

在本发明的一些实施方案中，所述微生物进一步包括至少一种另外的上调的酶。在本发明的一些实施方案中，所述另外的上调的酶是具有EC编号3.2.1.3的葡糖淀粉酶。在本发明的一些实施方案中，所述另外的上调的酶的是通透酶。在本发明的一些实施方案中，所述另外的上调的酶是具有EC编号3.4.23.41的蛋白酶。

在本发明的一些实施方案中，上调的或下调的酶受异源启动子的控制。在本发明的一些实施方案中，所述异源启动子选自TEF2(SEQIDNO：58)、HXT7(SEQIDNO：59)、ADH1(SEQIDNO：60)和TPI(SEQIDNO：61)。

在一些实施方案中，所述微生物是酵母。在一些实施方案中，所述酵母来自酿酒酵母属(Saccharomyces)。在一些实施方案中，所述酵母是酿酒酵母。在一些实施方案中，所述微生物产生乙醇的产率高于缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物。在一些实施方案中，所述微生物产生的乙醇效价比缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物高约1％至约10％。在一些实施方案中，所述微生物产生的乙醇效价为至少约125g/L。

在一些实施方案中，所述微生物产生甘油的产率低于缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物。在一些实施方案中，所述微生物产生的甘油效价比缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物低约10％至约100％。

在一些实施方案中，本发明涉及包括本文的任意重组微生物和含碳原料的组合物。

本发明的一些实施方案涉及采用本文的任意组合物生产发酵产品的方法，其中重组微生物能够使含碳原料发酵以产生发酵产品。

本发明的一些实施方案涉及生产发酵产品的方法，其包括：提供本文的任意组合物；使所述组合物与含碳原料接触，其中，所述重组微生物能够使含碳原料发酵以产生发酵产品；和任选地回收发酵产品。

本发明的一些实施方案涉及生产乙醇的方法，其包括：提供本文的任意重组微生物；在存在含碳原料的条件下培养重组微生物足够的时间以生产乙醇；以及，任选地提取乙醇。

本发明的一些实施方案涉及包括至少两种宿主细胞的共培养物，其中一种宿主细胞包括本文的任意重组微生物；而另一种宿主细胞在基因上不同于所述重组微生物。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2和上调的Gdh2。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2、上调的Glt1和上调的Gln1。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2、上调的Glt1和上调的Gln1。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶和上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶和受控于GPD1启动子的GPD2。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶和上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、上调的DUR1/2和受控于GPD1启动子的GPD2。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶和上调的DUR1/2。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Ure2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1和受控于GPD1启动子的GPD2。

本发明的一些实施方案涉及重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、上调的GDH2、受控于GPD2启动子的GPD1和受控于GPD1启动子的GPD2。

附图说明

图1描绘在厌氧生长期间被野生型酿酒酵母利用的简化的碳和氧化还原途径。乙醇形成是氧化还原中性的，而细胞生物质的形成产生净NADH，这通过甘油形成平衡。

图2描绘尿素转运和胞内分解代谢。酶Dur3和Dur4是已知的尿素转运蛋白。一旦进入细胞内，尿素即在由Dur1、2催化的反应中被分解成两个氨分子和两个二氧化碳分子。

图3描绘未经修饰的酿酒酵母同化尿素的过程。

图4描绘含有Gdh1缺失的基因修饰的甘油减少菌株同化尿素的过程。

图5描绘含有甲酸途径的野生型和甘油减少菌株(M2390(野生型)、M3465、M3467、M3469和M3624被描绘)的甘油效价。这些数据显示了玉米醪液中存在的总甘油，玉米醪液在发酵前含有7g/l甘油。

图6描绘MA0631***盒的示意图。

图7描绘MA0425***盒的示意图。

图8描绘MA0426***盒的示意图。

图9描绘MA0888***盒的示意图。

图10描绘MA0837***盒的示意图。

图11描绘MA0616***盒的示意图。

图12描绘MA0616.1***盒的示意图。

图13描绘MA0615***盒的示意图。

图14描绘MA0615.1***盒的示意图。

图15描绘MA0622***盒的示意图。

图16描绘MA0622.1***盒的示意图。

图17描绘MA0580***盒的示意图。

图18描绘MA0581***盒的示意图。

图19描绘MA0582***盒的示意图。

图20描绘MA0583***盒的示意图。

图21描绘MA0584***盒的示意图。

图22描绘MA0585***盒的示意图。

图23描绘MA0617***盒的示意图。

图24描绘MA0617.1***盒的示意图。

图25描绘MA0434***盒的示意图。

图26描绘MA0434.2***盒的示意图。

图27描绘MA0434.3***盒的示意图。

图28描绘MA0434.4***盒的示意图。

图29描绘MA0434.5***盒的示意图。

图30描绘MA0454.14***盒的示意图。

图31描绘MA0464***盒的示意图。

图32描绘MA0464.1***盒的示意图。

图33描绘MA0464.2***盒的示意图。

图34描绘MA0464.3***盒的示意图。

图35描绘MA0464.4***盒的示意图。

图36描绘MA0464.5***盒的示意图。

图37描绘MA0465.1***盒的示意图。

图38描绘MA0467***盒的示意图。

图39描绘MA0467.1***盒的示意图。

图40描绘MA0467.2***盒的示意图。

图41描绘MA0467.3***盒的示意图。

图42描绘MA0467.4***盒的示意图。

图43描绘MA0881***盒的示意图。

图44描绘MA0881.1***盒的示意图。

图45描绘pMU2873的质粒图谱。

图46描绘pMU2879的质粒图谱。

图47描绘pMU2908的质粒图谱。

图48描绘pMU2909的质粒图谱。

图49描绘pMU2911的质粒图谱。

图50描绘pMU2913的质粒图谱。

图51描绘pMU3409的质粒图谱。

图52描绘pMU3410的质粒图谱。

图53描绘pMU3411的质粒图谱。

图54描绘pMU3459的质粒图谱。

图55描绘pMU3460的质粒图谱。

图56描绘pMU3461的质粒图谱。

图57描绘pMU3463的质粒图谱。

图58描绘pMU3464的质粒图谱。

图59描绘pMU3465的质粒图谱。

图60描绘pMU3466的质粒图谱。

图61描绘pMU3468的质粒图谱。

图62描绘pMU3471的质粒图谱。

图63描绘pMU3472的质粒图谱。

图64描绘pMU3473的质粒图谱。

图65描绘pMU3475的质粒图谱。

图66描绘pMU3605的质粒图谱。

图67描绘pMU3606的质粒图谱。

图68描绘pMU3607的质粒图谱。

图69描述在以下菌株中对31％固体的玉米醪液进行发酵后测量的最终乙醇效价：野生型细胞(M2390)；包含甲酸途径的甘油减少菌株(M3624)；以及两株具有铵同化途径修饰的菌株(M4117，包含gdh1缺失和Gdh2过表达，和M4118，包含gdh1缺失和Glt1和Gln1过表达)。

图70描绘包含甲酸途径的甘油减少菌株(M3465、M3467、M3469)在对31％固体玉米醪液发酵后测量的乙醇效价，该甘油减少菌株另外具有gdh1缺失(M4400、M4401、M4402)。M2390是亲代对照。

图71描绘以下菌株在对31％固体的玉米醪液发酵后测量的乙醇效价：M2390、M3467、M3469、M4427(M3467亲代菌株：由TEF2启动子驱动的DUR1/2表达)、M4428(M3467亲代菌株：由HXT7启动子驱动的DUR1/2表达)、M4429(M3467亲代菌株：由ADH1启动子驱动的DUR1/2表达)、M4430(M3467亲代菌株：由HXT7/TEF2启动子驱动的DUR1/2表达)、M4431(M3469亲代菌株：由TEF2启动子驱动的DUR1/2表达)、M4432(M3469亲代菌株：由HXT7启动子驱动的DUR1/2表达)、M4433(M3469亲代菌株：由ADH1启动子驱动的DUR1/2表达)、M4434(M3469亲代菌株：由HXT7/TEF2启动子驱动的DUR1/2表达)。

图72描绘M2390、M3624、M4406和M4407在对31％固体的玉米醪液发酵后测量的乙醇效价。

图73描绘在菌株M2390、M3624、M4117、M5841、M5842、M5843和M5844在微型瓶中发酵68小时后产生的乙醇效价。

图74描述在菌株M2390、M3624、M4117、M5841、M5842、M5843和M5844在微型瓶中发酵68小时后产生的甘油效价。

发明详述

定义

除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如微生物代谢工程领域的普通技术人员一般理解的相同含义。尽管与本文所述的那些类似或相同的方法和材料可用于公开的方法和组合物的实施，但是本文描述了示例性方法、设备和材料。

描述的实施方案和在说明书中提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“示例性实施方案”等，表明描述的实施方案可包括具体的特征、结构或特性，但是未必每个实施方案都包括具体的特征、结构或特性。而且，这样的短语未必指相同的实施方案。此外，当结合实施方案描述具体的特征、结构或特性时，应理解，结合其他实施方案实现这样的特征、结构或特性在本领域技术人员的知识范围内，无论是否明确描述。

本文中的描述“一个(a)”或“一个(an)”物品可指单个物品或多个物品。应理解，在本文各处用语言“包括”描述实施方案时，也另外提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的类似实施方案。因此，例如，提及的“多核苷酸”包括多个这样的多核苷酸和提及的“微生物”包括提及的一种或多种微生物等等。

术语“异源的”用于指通常不出现在宿主生物体中的多核苷酸或基因。“异源的”包括上调的或下调的内源基因。“异源”也包括天然编码区域或其部分，其以不同于相应的天然基因的形式，例如，不在其生物体基因组的天然位置中被重新引入来源生物体中。“异源的”也包括已经被修饰并且放入生物体中的任何基因。异源基因可包括作为嵌合基因的一部分的天然编码区域，所述嵌合基因包括重新引入天然宿主中的非天然调节区域或对影响基因表达水平的天然调节序列的修饰。外源基因可包括***非天然生物体中的天然基因，或嵌合基因。异源多核苷酸、基因、多肽或酶可源自或分离自任何来源，例如，真核生物、原核生物、病毒或合成的多核苷酸片段，并且包括上调的内源基因。

术语“基因(或多个基因)”或“多核苷酸”或“核酸”或“多核苷酸序列(或多个多核苷酸序列)”旨在包括核酸分子，例如，包括编码多肽的可读框的多核苷酸，并且可进一步包括非编码调节序列和内含子。另外，该术语旨在包括定位至功能基因座的一个或多个基因。而且，该术语旨在包括用于选择目的的特定基因。基因可以对宿主细胞是内源性的或可被重组地引入宿主细胞中，例如，作为附加型保持的质粒或稳定整合至基因组中的质粒(或其片段)。除了质粒形式外，基因可以例如为线性DNA或RNA的形式。术语“基因”也旨在包括多拷贝的具体基因，例如，细胞中编码特定基因产物的所有DNA序列。“基因”是指编码多肽的核苷酸的装配体并且包括cDNA和基因组DNA核酸。“基因”也指表达特定蛋白质的核酸片段，包括单一编码段(外显子)之间的间插序列(内含子)，以及在编码序列之前(5'非编码序列)和编码序列之后(3'非编码序列)的调节序列。“天然”或“内源的”是指在自然界发现的具有其自身调节序列的基因。

“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”是由称为核苷酸的共价连接的亚单位组成的聚合化合物。核酸包括聚核糖核酸(RNA)和聚脱氧核糖核酸(DNA)，它们两者均可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和半合成DNA。

“分离的核酸分子”或“分离的核酸片段”指磷酸酯聚合形式的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；RNA分子)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；DNA分子)，或其任意磷酸酯类似物，例如硫代磷酸酯和硫酯，或单链形式或双链螺旋。可能是双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，而不将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括特别在线状或环状DNA分子(例如限制片段)、质粒和染色体中发现的双链DNA。在对特定双链DNA分子结构的讨论中，本文可以根据仅给出沿DNA非转录链(即具有与mRNA同源的序列的链)的5'到3'方向的序列的通常惯例对序列进行描述。

术语“表达”旨在包括至少在一般随后翻译成蛋白质产物的mRNA产生水平的基因表达。术语“表达”是指源自本发明的核酸片段的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达也可以指mRNA翻译成多肽。

如本文所使用的，“表达载体”是能够引导与其可操作地连接的基因的表达的载体。

“载体”，例如“质粒”或YAC(酵母人工染色体)，是指染色体外的元件，其通常携带不作为细胞中心代谢的一部分的一个或多个基因，并且通常为环形双链DNA分子的形式。这种元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，它们是源自任何来源的线性、环状或超螺旋的单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经结合或重组成独特的构造，该独特的构造能够将用于选择的基因产物的启动子片段和DNA序列和适当的3'非翻译序列一起引入细胞内。优选地，本发明的质粒或载体是稳定的和自复制的。

本文使用的术语“整合的”是指通过分子生物学技术放入宿主细胞染色体内的遗传元件。例如，遗传元件可以放入宿主细胞而不是载体，诸如宿主细胞携带的质粒的染色体内。用于将遗传元件整合进宿主细胞的基因组的方法是本领域熟知的并且包括同源重组。

本文使用的术语“域”指具有相同物理或化学特性，例如疏水、极性、球状、螺旋域或性质的一部分分子或结构，例如DNA结合域或ATP结合域。域可以通过它们与保守的结构性或功能性基序的同源性进行鉴别。纤维二糖水解酶(CBH)域的实例包括催化域(CD)和纤维素结合域(CBD)。

当单链形式的核酸分子在适当温度和溶液离子强度的条件下可以退火成其它核酸分子时，核酸分子与另一个核酸分子，例如cDNA、基因组DNA或RNA是“可杂交的”。杂交和清洗条件是熟知的并举例在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor(1989)，特别是其中的第11章和表11.1(下文称“Maniatis”，其通过引用全部并入本文中)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。严格度条件可以被调整以筛选出中度相似的片段，例如来自远缘相关的生物体的同源序列，到高度相似的片段，例如由近缘相关生物体复制功能酶的基因。杂交后洗涤决定严格度条件。一组条件采用一系列洗涤，始于6XSSC、0.5％SDS，室温下持续15分钟，然后重复2XSSC、0.5％SDS在45℃下持续30min，然后重复两次0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下持续30min。对于更严格的条件，洗涤在更高的温度下进行，其中洗涤与上述条件相同，除了在0.2XSSC、0.5％SDS中的最后两次30min洗涤的温度升高至60℃。另一组高度严格的条件是采用两次在0.1XSSC、0.1％SDS在65℃下进行的最终洗涤。一组附加的高度严格的条件确定为：在0.1XSSC、0.1％SDS、65℃下杂交，然后采用2XSSC、0.1％SDS，接着0.1XSSC、0.1％SDS洗涤。

杂交要求两个核酸含有互补序列，虽然依赖于杂交的严格度，但是碱基间的错配是可能的。用于杂交核酸的合适的严格度取决于核酸的长度和互补程度，其为在本领域内众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似度或同源性越高，具有这些序列的核酸杂交的Tm值越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于更高的Tm)按如下顺序递减：RNA:RNA，DNA:RNA，DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂交，已经推导出计算Tm的公式(参见例如Maniatis，9.50-9.51)。对于较短核酸即寡核苷酸的杂交，错配位置变得更加重要，并且寡核苷酸的长度决定其特异性(参见例如Maniatis，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度是至少约15个核苷酸；更优选地至少约20个核苷酸；最优选地至少约30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，温度和洗涤液盐浓度可以根据各因素例如探针的长度在必要时进行调整。

如本领域已知的，术语“同一性百分比”是两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定的。在现有技术中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这根据具体情况而定，如通过这样的序列的链之间的匹配而确定。

如本领域已知的，两条多肽之间的“相似度”是通过比较多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替换与第二多肽的序列而确定的。

“同一性”和“相似度”可容易通过已知的方法计算，包括但不限于以下描述的那些：计算分子生物学(ComputationalMolecularbiology)(Lesk,A.M.,ed.)OxfordUniversityPress,NY(1988)；生物计算：信息学和基因组工程(Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects)(Smith,D.W.，ed.)AcademicPress，NY(1993)；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysisofSequenceData)，I部分(Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.，eds.)HumanaPress，NJ(1994)；分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysisinMolecularBiology)(vonHeinje，G.，ed.)AcademicPress(1987)；和序列分析引物(SequenceAnslysisPrimer)(Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.)StocktonPress，NY(1991)。确定同一性的优选方法被设计为给出测试序列之间的最佳匹配。确定同一性和相似度的方法在公众可用的计算机程序中编码。可使用LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序进行序列比对和同一性百分比计算(DNASTARInc.，Madison，Wis.)。使用比对的Clustal方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)，使用默认参数(空隙罚分＝10、空隙长度罚分＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLE1、空隙罚分＝3、窗口＝5和保存的对角线＝5。

适当的核酸序列或其片段(本发明的分离的多核苷酸)编码的多肽与本文报导的氨基酸序列具有至少约70％至约75％的同一性，与本文报导的氨基酸序列具有至少约80％、约85％或约90％的同一性，或与本文报导的氨基酸序列具有约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。适合的核酸片段与本文报导的核酸序列具有至少约70％、约75％或约80％的同一性，与本文报导的核酸序列具有至少约80％、约85％或约90％的同一性，或与本文报导的核酸序列具有至少约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的同一性。适合的核酸片段不仅具有上述同一性/相似度，而且通常编码具有至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸或至少250个氨基酸的多肽。

DNA或RNA“编码区域”是这样的DNA或RNA分子，当置于适宜的调节序列的控制之下时，该分子在细胞内被体外或体内转录或翻译为多肽。“合适的调节区域”是指位于编码区域的上游(5'非编码序列)、其中或者下游(3'非编码序列)且影响与编码区域相关的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核酸区域。调节区域可以包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。编码区域的边界由5'(氨基)端处的起始密码子和3'(羧基)端处的翻译终止密码子决定。编码区域可包括但不限于原核区域、来自mRNA的cDNA、基因组DNA分子、合成DNA分子或RNA分子。如果该编码区域意在用于真核细胞内的表达，则通常将聚腺苷酸化信号和转录终止序列定位在编码区域的3'端。

“同工型”是功能与另一种蛋白质相同但由不同的基因编码且序列可以具有微小差异的蛋白质。

“旁系同源”是由基因组内与复制相关的基因编码的蛋白质。

“直系同源”是来自通过物种形成由共同祖先基因进化的不同物种的基因。通常地，直系同源在进化过程保留了与祖先基因相同的功能。

“开放阅读框架”缩写为“ORF”，意指包括翻译起始信号或起始密码子例如ATG或AUG以及终止密码子，并可能被翻译成多肽序列的一段核酸，DNA、cDNA或RNA。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA片段。一般地，编码区域位于启动子的3'端。启动子可以整体地源自天然基因或由源自自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包括合成DNA片段。本领域技术人员理解的是，不同的启动子可以在不同组织或细胞类型中、或在细胞发育的不同阶段，或为响应不同环境或生理条件引导基因的表达。导致基因在大部分细胞类型、在大部分时间内表达的启动子通常称为“组成型启动子”。进一步认识的是，由于在大多数情形下调节序列的准确边界尚未完全确定，不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。启动子通常通过转录起始位点被界定在其3'端并向上游延伸(5'方向)以包括在背景以上的可检测水平启动转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子内，可以发现转录起始位点(例如通过绘制核酶S1的图谱而方便确定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。

当RNA聚合酶将编码区域转录成mRNA时，编码区域“受控于”细胞内的转录和翻译控制元件，所述mRNA然后经由反RNA剪接(如果编码区域含有内含子)并被翻译成由编码区域编码的蛋白质。

“转录和翻译控制区域”是为宿主细胞内编码区域的表达作准备的DNA调节区域，例如启动子、增强子、终止子，诸如此类。在真核细胞内，聚腺苷酸化信号是控制区域。

术语“可操作地关联”指核酸序列关联到单一的核酸片段上，使得其中一个功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码区域的表达(即编码区域受到启动子的转录控制)时，启动子可操作地与编码区域关联。编码区域可以在有义或反义方向上可操作地关联至调节区域。

如本文所使用的，术语“厌氧的”指在没有气态O₂的条件下是活性的或存在的生物体、生物化学反应或过程。

“厌氧条件”被定义为其中发酵培养基中氧浓度对于微生物过低而不能用作最终电子受体的条件。厌氧条件可通过用惰性气体，如氮吹扫发酵培养基直到氧不再作为最终电子受体为微生物所用来实现。供选择地，厌氧条件可通过微生物消耗发酵可用的氧直到氧不能作为最终电子受体为微生物所用来实现。

“需氧代谢”指生物化学过程，其中氧用作最终电子受体，以从碳水化合物转化能量，通常为ATP的形式。例如，需氧代谢通常经真核生物的线粒体中的电子传递链发生，其中单个葡萄糖分子在存在氧的情况下完全代谢成二氧化碳。

相反地，“厌氧代谢”指其中氧不是产生的电子的最终受体的生物化学过程。厌氧代谢可分成：厌氧呼吸，其中氧之外的化合物用作最终电子受体；和底物水平磷酸化，其中不使用外源性电子受体并且经“发酵途径”产生中间氧化态的产物。

在“发酵途径”中，通过糖酵解产生的NAD(P)H的量通过在随后步骤中消耗相同量的NAD(P)H平衡。例如，在某些酵母菌株的一个发酵途径中，通过糖酵解产生的NAD(P)H提供其电子至乙醛，产生乙醇。发酵途径通常在厌氧条件下是活跃的，但是也可在需氧条件下，在其中NADH经呼吸链未充分氧化的条件下发生。

如本文所使用的，术语“终产物”指不被细胞或不能被细胞使用的化学化合物，因此其被***或允许扩散至细胞外环境。来自厌氧发酵的终产物的常见实例包括但不限于乙醇、乙酸、甲酸、乳酸、氢和二氧化碳。

如本文所使用的，“辅助因子”是参与生物化学反应的化合物，其在细胞中循环并且保持在大概稳态水平。参与厌氧发酵的辅助因子的常见实例包括但不限于NAD⁺和NADP⁺。在代谢中，辅助因子可在氧化-还原反应中起作用，以接受或提供电子。当有机化合物在代谢中通过氧化降解时，它们的能量可通过其还原成NADH而转移至NAD⁺，通过其还原成NADPH而转移至NADP⁺，或通过其还原成FADH₂转移至另一辅助因子FAD⁺。还原的辅助因子随后可以用作还原酶底物。

如本文所使用的，“途径”是一组生物化学反应，其在按步骤的过程中，可一起将一种化合物转化成另一化合物。途径中第一步的产物可以是第二步的底物，和第二步的产物可以是第三步的底物等等。本发明的途径包括但不限于丙酮酸代谢途径、乳酸生产途径、乙醇生产途径、甘油生产途径、氮同化途径和铵同化途径。

术语“重组”或“重组体”指两个相同的(同源的)，或几乎相同的DNA分子之间的DNA的物理交换。重组可用于靶向的基因删除或修饰基因的序列。术语“重组微生物”和“重组宿主细胞”在本文中互换使用并且指已经被基因修饰以表达或过表达内源多核苷酸，或表达异源多核苷酸，如载体中包括的那些的微生物，或在内源基因的表达中有修饰的微生物。

“表达修饰”意思是基因的表达，或编码一个或多个多肽或多肽亚单位的RNA分子或等同的RNA分子的水平，或一个或多个多肽或多肽亚单元的活性上调或下调，使得表达、水平或活性大于或小于在缺少该修饰下观察到的。

在本发明的一个方面，基因或具体的多核苷酸序列是部分、基本上或完全删除、沉默、失活或下调的，以使它们编码的酶活性失活。完全的缺失提供最大稳定性，因为没有回复突变以恢复功能的机会。供选择地，可通过***、删除、去除或替换破坏基因功能和/或表达的核酸序列而部分、基本上或完全删除、沉默、失活或下调基因。

如本文所使用的，术语“下调”包括遗传序列的删除或突变，或***编码或非编码的扰乱遗传元件，使得基因产物的产生通过删除、突变或***而减弱。其包括mRNA或蛋白质的表达水平(即，分子数量)的降低。如本文所使用的，“删除(delete)”或“删除(deletion)”指去除遗传元件使得相应的基因完全不被表达。在一些实施方案中，删除指完全的基因删除。也可通过化学或其他环境手段，例如通过工程化化学应答启动子元件(或其他类型的条件启动子)以控制期望的基因产物的表达来工程化遗传元件的抑制，从而产生下调。可也通过使用弱启动子来发生下调。

如本文所使用的，术语“上调”包括***、再引入、突变或增加遗传序列的表达，使得基因产物的产生通过***、再引入或突变而增加。其包括mRNA或蛋白质表达水平(即分子数量)的提高。如本文所使用的，“***(insert)”或“***(insertion)”指引入遗传元件，使得表达相应的基因。可也通过改变相关的调节序列来使遗传元件表达的增加，从而发生上调。也可以通过化学或其他环境手段来工程化遗传元件的表达，例如通过工程化化学应答启动子元件(或其他类型的条件启动子)以控制期望的基因产物的表达，从而产生上调。还可以通过使用强启动子来发生上调。

如本文所使用的，术语“甘油生产途径”指由DHAP产生甘油的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用的，术语“乙醇生产途径”指由碳水化合物原料产生乙醇的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用的，术语“氮同化途径”指导致由无机氮化合物形成有机含氮化合物的生物化学途径的集合。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用的，术语“铵同化途径”指将氨或铵(NH4⁺)同化成谷氨酸和/或谷氨酰胺的生物化学途径的集合。铵同化途径是更大氮同化途径的一部分。该途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用的，术语“糖酵解”或“糖分解途径”指基础代谢的标准途径，其中糖如葡萄糖分解成氧化程度更高的产物，转化成细胞生长需要的能量和化合物。途径的组分由途径中的所有底物、辅助因子、副产物、中间体、终产物和酶组成。

如本文所使用的，术语“醇脱氢酶”或“ADH”旨在包括催化乙醇转化成乙醛的酶。非常常见地，相同的酶催化从乙醛至乙醇的逆反应，其是与发酵更相关的方向。醇脱氢酶包括对应EC1.1.1.1和1.1.1.2的那些酶，例如GenBank登记号为U49975的公开的酶。

如本文所使用的，术语“醛脱氢酶”、“ALD”或“ALDH”旨在包括催化醛氧化的酶。醛脱氢酶包括“乙醛脱氢酶”，其催化乙醛转化成乙酰辅酶A。非常常见地，相同的酶催化从乙酰辅酶A至乙醛的逆反应，其是与发酵更相关的方向。醛脱氢酶包括对应于EC1.2.1.3、1.2.1.4和1.2.1.10的那些酶。

如本文所使用的，术语“甘油-3-磷酸脱氢酶”或“GPD”旨在包括能够将二羟基丙酮磷酸转化成甘油-3-磷酸的那些酶。GPD包括对应于EC1.1.1.8的那些酶。在一些实施方案中，GPD是来自酿酒酵母的GPD1和/或GPD2(GDP1：SEQIDNO：4和5；GDP2：SEQIDNO：6和7)。

如本文所使用的，术语“甘油-3-磷酸磷酸酶”或“GPP”旨在包括能够将甘油-1-磷酸转化成甘油的那些酶。甘油-3-磷酸旨在包括对应于EC3.1.3.21的那些酶(GPP1：SEQIDNO：158和159；GPP2：SEQIDNO：160和161)。

如本文所使用的，术语“甲酸脱氢酶”或“FDH”旨在包括能够将甲酸盐转化成碳酸氢盐(二氧化碳)的那些酶。甲酸脱氢酶包括对应于EC1.2.1.43和EC1.2.1.2的那些酶。在一些实施方案中，FDH来自酿酒酵母(FDH1：SEQIDNO：1和2；FDH2：SEQIDNO：3)

如本文所使用的，术语“双功能”旨在包括催化多于一种生物化学反应步骤的酶。本文使用的双功能酶的具体实例是催化醇脱氢酶和乙醛脱氢酶反应的酶(adhE)，并且包括对应于EC1.2.1.10和1.1.1.1的那些酶。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶来自青春双歧杆菌(B.adolescentis)(adhE：SEQIDNO：12和13)。在一些实施方案中，双功能酶是NADPH特异性双功能乙醛-醇脱氢酶，并且包括对应于EC1.2.1.10和1.1.1.2的那些酶。在一些实施方案中，NADPH特异性双功能乙醛-醇脱氢酶来自肠膜明串珠菌(SEQIDNO：14和15)或酒类酒球菌(O.oenii)(SEQIDNO：16和17)。

如本文所使用的，术语“丙酮酸甲酸裂解酶”或“PFL”旨在包括能够将丙酮酸盐转化成甲酸盐和乙酰辅酶A的酶。PFL包括对应于EC2.3.1.54的那些酶并且实例为SEQIDNO：8和9。

如本文所使用的，术语“PFL-活化酶”旨在包括能够有助于PFL的活化的那些酶。PFL-活化酶包括对应于EC1.97.1.4的那些酶并且实例为SEQIDNO：10和11。

如本文所使用的，术语“谷氨酸脱氢酶”、“GDH”或“GLDH”旨在包括将谷氨酸转化成α-酮戊二酸的那些酶以及催化逆反应的那些酶。谷氨酸脱氢酶可以是NADPH依赖性的(例如酿酒酵母中的GDH1或GDH3)。谷氨酸脱氢酶可以是NADH依赖性的(例如酿酒酵母中的GDH2)。谷氨酸脱氢酶包括对应于EC1.4.1.2和EC1.4.1.4的那些酶。谷氨酸脱氢酶包括对应于以下登记号的那些酶：M10590、S66436、S66039.1、U12980、NP_015020、ΝΡ_010066、S66039.1和AAC04972。在一些实施方案中，谷氨酸脱氢酶来自酿酒酵母(GDH1：SEQIDNO：25和25；GDH2：SEQIDNO：26和27；GDH3：SEQIDNO：30和31)或粗糙脉胞菌(N.crassa)(GDH2：SEQIDNO：28和29)。

如本文所使用的，术语“谷氨酸合酶”或“GLT”旨在包括将L-谷氨酰胺和2-酮戊二酸转化成L-谷氨酸的那些酶，以及催化逆反应的那些酶。谷氨酸合酶包括对应于EC1.4.1.14和EC1.4.1.13的那些酶。在一些实施方案中，谷氨酸合酶是来自酿酒酵母的GLT1(SEQIDNO：32和33；登记号：X89221和ΝΡ_010110.1)。

如本文所使用的，术语“谷氨酰胺合酶(glutaminesynthase)”、“谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase)”或“GLN”旨在包括将谷氨酸转化成谷氨酰胺的那些酶。谷氨酰胺合酶包括对应于EC6.3.1.2的那些酶。在一些实施方案中，谷氨酸合酶是来自酿酒酵母的GLN1(SEQIDNO：34和35；登记号：M65157和NP_015360.2)。

如本文所使用的，术语“尿素-酰胺裂解酶”旨在包括将尿素转化为1-羧酸脲的那些酶。尿素-酰胺裂解酶包括对应于EC6.3.4.6的那些酶。在一些实施方案中，尿素-酰胺裂解酶是来自酿酒酵母的DUR1/2(DUR1，2)(SEQIDNO：36和37；登记号：M64926和NP_009767.1)。

如本文所使用的，术语“尿素转运蛋白”是一种将尿素跨细胞膜转运的膜蛋白。在一些实施方案中，尿素转运蛋白是来自酿酒酵母的Dur3或Dur4(DUR3：SEQIDNO：38和39；登记号：AY693170和NP_011847.1)。

如本文所使用的，术语“蛋白酶”是任何使蛋白质内的氨基酸之间的肽键一起水解的酶。外切蛋白酶是破坏蛋白质内末端氨基酸的肽键的蛋白酶。内切蛋白酶是破坏蛋白质内非末端氨基酸的肽键的蛋白酶。蛋白酶包括对应于EC3.4.23.41的那些酶。蛋白酶包括对应于以下登记号的那些酶：NP_001151278、NP_001150196、NP_001148706、NCU00338、XP_001908191、XP_369812、EU970094.1、NM_001156724、NM_00115234.1、XP_957809.2、XP_010908156.1和XM_003717209.1。在一些实施方案中，蛋白酶来自玉蜀黍属(Z.mays)(SEQIDNO：40-45)、粗糙脉胞菌(SEQIDNO：46-47)、鹅绒棒胞菌(P.anserine)(SEQIDNO：48-49)或稻瘟菌(M.oryzae)(SEQIDNO：50-51)。

如本文所使用的，术语“葡糖淀粉酶”或“γ-淀粉酶”指作用于1,6-糖苷键的淀粉酶。葡糖淀粉酶包括对应于EC3.2.1.3的那些酶。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶是扣囊复膜孢酵母菌(S.fibuligera)葡糖淀粉酶(glu-0111-CO)(SEQIDNO：162和163)。

如本文所使用的，术语“通透酶”是指有助于分子通过使用被动转运扩散进或出细胞的膜转运蛋白。在一些实施方案中，通透酶是来自酿酒酵母的氨基酸通透酶GAP1(SEQIDNO：52和53)。

如本文所使用的，术语“铵转运蛋白”是指通透酶且意图包括参与铵和氨转运的酶，其示例为：酿酒酵母MEP1、MEP2和MEP3酶(MEP1：SEQIDNO：18和19；MEP2：SEQIDNO：20和21；MEP3：SEQIDNO：22和23)。铵转运蛋白包括对应于以下登记号的那些酶：X77608、X83608、AY692775、NP_011636.3、NP_014257.1和NP_015464.1。

如本文所使用的，术语“URE2”是指本领域已知的取该名称的转录因子，其通过控制转录因子来抑制谷氨酸的氮代谢。URE2是GLN3的调节蛋白。在一些实施方案中，URE2来自酿酒酵母(SEQIDNO：54和55)。

如本文所使用的，“AUA1”指本领域已知的取该名称的转录因子，其是Gap1的负调节所需的。在一些实施方案中，AUA1来自酿酒酵母(SEQIDNO：56和57)。

如本文所使用的，“GLN3”指本领域已知的取该名称的转录因子，其激活由氮分解产物代谢调节的基因。在一些实施方案中，GLN3来自酿酒酵母(SEQIDNO：156和157)。术语“原料”定义为提供给可由其制备其他产物的微生物或发酵过程的原材料或原材料的混合物。例如，碳源，如生物质或源自生物质的碳化合物是用于在发酵过程中产生产物的微生物的原料。原料可包含碳源之外的养分。

生物质可包括本领域已知的或本文所述的任何类型的生物质。术语“木质纤维素材料”、“木质纤维素底物”和“纤维素生物质”是指任何类型的含碳原料，其包括木质生物质，如回收的木浆纤维，锯屑，硬木，软木，草，糖加工残渣，农业废物，例如但不限于稻秸、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦外壳、玉米纤维、秸秆，肉质植物，龙舌兰或其任何组合。

术语“产率”定义为每单位重量的原料获得的产物的量并且可表达为克产物/克底物(g/g)。产率可表达为理论产率的百分比。“理论产率”定义为每给定量的底物可产生的产物的最大量，如通过用于产生产物的代谢途径的化学计量所表示的。例如，葡萄糖到乙醇的一种典型转化的理论产率是0.51gEtOH/1g葡萄糖。这样，来自10g葡萄糖的4.8g乙醇的产率可表达为94％的理论值的或94％的理论产率。

术语“效价”定义为溶液的强度或溶液中物质的浓度。例如，发酵液中产物的效价被描述为每升发酵液的溶液中产物的克数(g/L)或描述为g/kg发酵液。

如本文所使用的，术语“通量”是分子通过代谢途径的流动速率，与过程中材料流类似。

“细菌”或“真细菌”指原核生物体的范围。细菌包括革兰氏阳性(gram+)细菌和革兰氏阴性(gram-)细菌。

“酵母”指为单细胞真菌的真核生物体的范围。

术语“衍生物”和“类似物”指与本发明的酶不同，但是保持其基本特性的多肽。一般而言，衍生物和类似物总体上非常类似，并且，在许多区域与本发明的酶相同。当提及本发明的酶时，术语“源自”、“衍生物”和“类似物”包括保留相应的天然多肽的至少一些活性或其催化结构域活性的任何多肽。

本文公开的酶的衍生物是可能已经被改变以显示天然多肽中未出现的特征的多肽。衍生物可通过用除了天然存在的氨基酸以外的部分(例如，可检测的部分比如酶或放射性同位素)替换(例如氨基酸替换)、化学、酶或其他适当的方式共价修饰。衍生物的实例包括融合蛋白，或基于天然存在的蛋白质序列但是已经被改变的蛋白。例如，蛋白质可根据具体氨基酸序列，和/或具体二级、三级和四级结构的知识来设计。衍生物包括基于之前天然的或合成的序列的知识而修饰的蛋白质，其随后任选地但是通常不是必须地被修饰，以赋予一些改善的功能。然后认为这些序列或蛋白质源自具体的蛋白质或氨基酸序列。在本发明的一些实施方案中，衍生物与衍生物所“源自”的序列必须保持至少约50％的同一性、至少约60％的同一性、至少约70％的同一性、至少约80％的同一性、至少约90％的同一性、至少约95％的同一性、至少约97％的同一性或至少约99％的同一性。在本发明的一些实施方案中，如果使用分子遗传技术，部分或全部的酶的DNA序列被扩增并且置入新的宿主细胞中，则认为该酶源自天然存在于具体物种中的酶。

如本文所使用的“分离自”指一种工艺，借以采用分子生物学技术，从特定的生物体收获遗传材料，通常的最终目标是将该遗传材料放入非天然的环境中。

如本领域已知的，术语“同一性百分比”是两条或更多条多肽序列或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所测定的。在现有技术中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，这根据具体情况而定，如通过这样的序列串之间的匹配而测定的。

如本领域已知的，两条多肽之间的“相似度”是通过比较多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸替换与第二多肽的序列而测定的。

“同一性”和“相似度”可容易通过已知的方法计算，包括但不限于以下描述的那些：计算分子生物学(ComputationalMolecularbiology)(Lesk,A.M.,ed.)OxfordUniversityPress,NY(1988)；生物计算：信息学和基因组工程(Biocomputing：InformaticsandGenomeProjects)(Smith,D.W.，ed.)AcademicPress，NY(1993)；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysisofSequenceData)，I部分(Griffin,A.M.，和Griffin,H.G.，eds.)HumanaPress，NJ(1994)；分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysisinMolecularBiology)(vonHeinje，G.，ed.)AcademicPress(1987)；和序列分析引物(SequenceAnslysisPrimer)(Gribskov,M.和Devereux,J.,eds.)StocktonPress，NY(1991)。测定同一性的优选方法被设计为给出测试序列之间的最佳匹配。测定同一性和相似度的方法编码在公众可用的计算机程序中。可使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc.，Madison，Wis.)的Megalign程序进行序列比对和同一性百分比计算。使用比对的Clustal方法(Higgins和Sharp(1989)CABIOS.5:151-153)，使用默认参数(空隙罚分＝10、空隙长度罚分＝10)进行本文公开的序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数是KTUPLE1、空隙罚分＝3、窗口＝5和保存的对角线＝5。

适当的核酸序列或其片段(本发明的分离多核苷酸)编码的多肽与本文公开的氨基酸序列具有至少约70％至75％的同一性，与本文公开的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，或与本文公开的氨基酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。适合的核酸片段与本文公开的核酸序列具有至少约70％、至少约75％或至少约80％的同一性，与本文公开的核酸序列具有至少约80％、至少约85％或至少约90％的同一性，或与本文公开的核酸序列具有至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％的同一性。适合的核酸片段不仅仅具有上述同一性/相似度，而且通常编码具有至少约50个氨基酸、至少约100个氨基酸、至少约150个氨基酸、至少约200个氨基酸或至少约250个氨基酸的多肽。

密码子优化

在本发明的一些实施方案中，外源性基因可以是密码子优化的，以便表达它们在宿主细胞中最有效编码的多肽。密码子优化的方法是本领域熟知的。(参见，例如Welch等“设计用于成功表达蛋白质的基因(Designinggenesforsuccessfulproteinexpression)”MethodsEnzymol。2011.498:43-66.)

一般而言，生物体中高度表达的基因偏向该生物体中最丰富的tRNA种类识别的密码子。该偏好的一种量度是“密码子适应指数”或“CAI”，其测量用于编码具体基因中每个氨基酸的密码子是最频繁出现在来自生物体的高度表达基因参考组中的那些的程度。密码子适应指数更详细描述在Sharp等，“密码子适应指数：方向性同义密码子使用偏好的量度，和其潜在应用(TheCodonAdaptationIndex:aMeasureofDirectionalSynonymousCodonUsageBias,andItsPotentialApplications)”NucleicAcidsResearch(1987)。15：1281-1295，将其全部内容引入本文作为参考。

密码子优化的序列可以根据生物体的生物学限制而被进一步修饰，用于在具体的生物体中表达。例如，大的“A”或“T”连续序列(例如，大于3、4、5、6、7、8、9或10个连续碱基的连续序列)可不利地影响转录。因此，例如，通过用另一核苷酸替换连续序列中的至少一个核苷酸可用于去除连续序列。此外，通过用另一核苷酸替换限制酶切位点中的至少一个核苷酸可去除特异性限制酶位点以用于分子克隆目的。这样的限制酶位点的实例包括PacI、AscI、BamHI、BglII、EcoRI和XhoI。另外，可检查DNA序列的长度为约5、6、7、8、9或10个碱基或更长的正向重复序列、反向重复序列和镜像重复序列。可通过用“第二最佳”密码子替换序列中的至少一个密码子来修饰“A”或“T”连续序列、限制酶切位点和/或重复序列，所述“第二最佳”密码子即，对于序列被优化的具体的生物体中具体的氨基酸以第二最高频率出现的密码子。

包括编码任何多肽链的氨基酸的密码子的核苷酸序列的差异允许编码基因的序列中有变化。因为每个密码子由三个核苷酸组成，并且包括DNA的核苷酸限于四种特定碱基，有64种可能的核苷酸组合，其中61种编码氨基酸(剩下的三个密码子编码终止翻译的信号)。显示哪个密码子编码哪个氨基酸的“遗传密码”在本文再现为表1。因此，许多氨基酸由多于一种密码子指定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四种三联体编码，丝氨酸和精氨酸各自由六种三联体编码，而色氨酸和甲硫氨酸仅由一种三联体编码。该简并性使得DNA碱基组成在宽范围内变化，而不改变DNA编码的蛋白质的氨基酸序列。

表1：标准遗传密码

许多生物体显示使用具体密码子编码的偏好，用于在生长肽链中***具体氨基酸。密码子偏向或密码子偏好、生物体之间密码子使用的差异由遗传密码的简并性提供，并且在许多生物体中充分记载。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，转而认为其尤其取决于待翻译的密码子的特性和具体转运RNA(tRNA)分子的可用性。细胞中选择的tRNA的优势一般是肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，基于密码子优化，基因可被调节，用于在给定生物体中的最佳基因表达。

宿主细胞

在本发明的一些实施方案中，宿主细胞是真核微生物。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母。在一些实施方案中，宿主细胞能够消化和发酵纤维素。在一些实施方案中，宿主细胞来自酵母属。在一些实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母。

在一些实施方案中，在约20℃以上、约25℃以上、约27℃以上、约30℃以上、约33℃以上、约35℃以上、约37℃以上、约40℃以上、约43℃以上、约45℃以上或约47℃以上的温度下培养本发明的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码下述多肽的一个或多个基因下调：所述多肽与SEQIDNO：2、5、7、25、31、55、57、159和161编码的一种或多种多肽和SEQIDNO：3编码的多核苷酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的同一性。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码与EC编号：1.1.1.8、3.1.3.21、1.2.1.43、1.2.1.2、1.4.1.2和1.4.1.4相关的活性的多肽表达或上调。

在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码下述多肽的一种或多种基因表达或上调：所述多肽与SEQIDNO：9、11、13、15、17、19、21、23、27、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、157和163编码的一种或多种多肽具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的同一性。在一些实施方案中，本发明的宿主细胞包含遗传构建体，其导致编码与EC编号：1.1.1.1、1.1.1.2、1.2.1.3、1.2.1.4、1.2.1.10、2.3.1.54、1.97.1.4、1.4.1.2、1.4.1.4、1.1.1.14、1.4.1.13、6.3.1.2、6.3.4.6和3.2.1.3相关的活性的多肽表达或上调。

在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶被上调。在一些实施方案中，上调的双功能乙醛-醇脱氢酶来自对应于选自EC编号EC1.2.1.0和1.1.1.1的一种酶。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶是选自具有酶学委员会编号EC1.2.1.10和1.1.1.2的NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶对应于选自SEQIDNO：13、15和17的多肽。在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶是adhE。

在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶被上调。在一些实施方案中，上调的丙酮酸甲酸裂解酶来自对应于EC2.3.1.54的酶。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶对应于SEQIDNO：2编码的多肽。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调。在一些实施方案中，上调的丙酮酸甲酸裂解酶活化酶来自对应于EC1.97.1.4的酶。在一些实施方案中，丙酮酸甲酸裂解酶活化酶对应于SEQIDNO：3编码的多核苷酸。

在一些实施方案中，谷氨酸脱氢酶被上调。在一些实施方案中，上调的谷氨酸脱氢酶是NADH依赖性的。在一些实施方案中，上调的谷氨酸脱氢酶对应于EC1.4.1.2。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的谷氨酸脱氢酶被上调。在一些实施方案中，上调的来自酿酒酵母的谷氨酸脱氢酶是GDH2并对应于SEQIDNO：29的多肽。在一些实施方案中，谷氨酸合酶被上调。在一些实施方案中，上调的谷氨酸合酶对应于EC1.4.1.14。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的谷氨酸合酶被上调。在一些实施方案中，上调的来自酿酒酵母的谷氨酸脱氢酶是GLT1并对应于SEQIDNO：33的多肽。在一些实施方案中，谷氨酸合酶被上调。在一些实施方案中，上调的谷氨酸合酶对应于EC6.3.1.2。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的谷氨酰胺合酶被上调。在一些实施方案中，上调的来自酿酒酵母的谷氨酸脱氢酶是GLN1并对应于SEQIDNO：35的多肽。

在一些实施方案中，尿素-酰胺裂解酶被上调。在一些实施方案中，上调的尿素-酰胺裂解酶对应于EC6.3.4.6。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的尿素-酰胺裂解酶被上调。在一些实施方案中，上调的来自酿酒酵母的尿素-酰胺裂解酶是DUR1/2并对应于SEQIDNO：37的多肽。

在一些实施方案中，蛋白酶被上调。在一些实施方案中，上调的蛋白酶对应于EC3.4.23.41。在一些实施方案中，蛋白酶是内切蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶是外切蛋白酶。在一些实施方案中，来自玉蜀黍属(Z.mays)、粗糙脉胞菌(N.crassa)、鹅绒棒胞菌(P.anserine)或稻瘟菌(M.oryzae)的蛋白酶被上调。在一些实施方案中，上调的蛋白酶对应于SEQIDNO：41、43、45、47、49或51相应的多肽。在一些实施方案中，通透酶被上调。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的通透酶被上调。在一些实施方案中，上调的通透酶是GAP1并对应于SEQIDNO：53相应的多肽。

在一些实施方案中，葡糖淀粉酶被上调。在一些实施方案中，上调的葡糖淀粉酶对应于EC3.2.1.3。在一些实施方案中，来自扣囊复膜孢酵母菌(S.fibuligera)的葡糖淀粉酶被上调。在一些实施方案中，来自扣囊复膜孢酵母菌的上调的葡糖淀粉酶对应于SEQIDNO：163相应的多肽。

在一些实施方案中，铵转运蛋白被上调。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的铵转运蛋白被上调。在一些实施方案中，上调的来自酿酒酵母的铵转运蛋白是MEP1、MEP2或MEP3并对应于SEQIDNO：19、21和23相应的多肽。在一些实施方案中，尿素转运蛋白被上调。在一些实施方案中，尿素转运蛋白来自酿酒酵母。在一些实施方案中，上调的尿素转运蛋白是来自酿酒酵母的DUR3或DUR4并对应于SEQIDNO：39相应的多肽。

在一些实施方案中，甘油-3-磷酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，下调的Gpd来自对应于EC1.1.1.8.的酶。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸脱氢酶选自甘油-3-磷酸脱氢酶1(“Gpd1”)、甘油-3-磷酸脱氢酶2(“Gpd2”)及其组合。在一些实施方案中，Gpd1来自酿酒酵母并对应于SEQIDNO：5编码的多肽。在一些实施方案中，Gpd2来自酿酒酵母并对应于SEQIDNO：7编码的多肽。在一些实施方案中，甲酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，下调的甲酸脱氢酶对应于选自EC1.2.1.43和EC1.2.1.2的EC编号。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的甲酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的甲酸脱氢酶对应于SEQIDNO：2相应的多肽，或者对应于SEQIDNO：3相应的核苷酸。在一些实施方案中，甘油-3-磷酸磷酸酶被下调。在一些实施方案中，下调的甘油-3-磷酸磷酸酶对应于EC3.1.3.21。在一些实施方案中，下调的甘油-3-磷酸磷酸酶对应于SEQIDNO：158或160相应的多核苷酸，或者对应于SEQIDNO：159或161相应的多肽。

在一些实施方案中，谷氨酸脱氢酶被下调。在一些实施方案中，下调的谷氨酸脱氢酶是NADPH依赖性的。在一些实施方案中，下调的谷氨酸脱氢酶对应于EC1.4.1.4。在一些实施方案中，下调的谷氨酸脱氢酶来自酿酒酵母。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的谷氨酸脱氢酶是GDH1并对应于SEQIDNO：25相应的多肽。

在一些实施方案中，调节元件被下调。在一些实施方案中，下调的调节元件来自酿酒酵母。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的调节元件是Ure2且对应于SEQIDNO：55相应的多肽。在一些实施方案中，来自酿酒酵母的调节元件是Aua1并对应于SEQIDNO：57相应的多肽。

在一些实施方案中，双功能乙醛-醇脱氢酶(AdhE)、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd1和Gpd2被下调。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd1、Gpd2、Fdh1和Fdh2被下调。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，Gpd1、Gpd2、Fdh1和Fdh2被下调，GPD1的表达受控于GPD2启动子，且GPD2的表达受控于Gpd1启动子。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，Gpd1、Gpd2、Fdh1、Fdh2、Gdh1被下调，GPD1的表达受控于GPD2启动子，且GPD2的表达受控于GPD1启动子。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶和Glt1被上调，Gpd1、Gpd2、Fdh1、Fdh2、Gdh1被下调，GPD1的表达受控于GPD2启动子，且GPD2的表达受控于Gpd1启动子。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶和Gln1被上调，Gpd1、Gpd2、Fdh1、Fdh2、Gdh1被下调，GPD1的表达受控于GPD2启动子，且GPD2的表达受控于GPD1启动子。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶、Gln1和Glt1被上调，Gpd1、Gpd2、Fdh1、Fdh2、Gdh1被下调，GPD1的表达受控于GPD2启动子，且GPD2的表达受控于Gpd1启动子。在一些实施方案中，调节元件Ure2被下调。在一些实施方案中，调节元件Aua1被下调。在一些实施方案中，Gln3被上调。

在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd2、Fdh1和Fdh2被下调。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd2、Fdh1、Fdh2和Gdh1被下调。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd1、Fdh1和Fdh2被下调。在一些实施方案中，AdhE、青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶和青春双歧杆菌丙酮酸甲酸裂解酶活化酶被上调，而Gpd1、Fdh1、Fdh2和Gdh1被下调。在一些实施方案中，Dur1/2另外地被表达。在一些实施方案中，Dur1/2表达自TEF2启动子。在一些实施方案中，Dur1/2表达自HXT7启动子。在一些实施方案中，Dur1/2表达自GPM1启动子。在一些实施方案中，Dur1/2表达自ADH1启动子。在一些实施方案中，Dur1/2表达自HXT7/TEF2启动子。在一些实施方案中，Gln3被上调。在一些实施方案中，GPD1表达自GPD2启动子。在一些实施方案中，GPD2表达自GPD1启动子。

乙醇产生

对于最经济地生产乙醇的微生物，期望以高产率生产。在一种实施方案中，产生的唯一产物是乙醇。另外的产物导致产物产率下降并且增加资本和操作成本，尤其是在额外的产物具有极少价值或没有价值的情况下。额外的产物也需要另外的资本和操作成本以将这些产物从乙醇中分离。

可使用本领域已知的任何方法测量乙醇产生。例如，可使用HPLC分析评估发酵样品中乙醇的量。另外，许多乙醇分析试剂盒是有市售的，例如，基于醇氧化酶的分析。确定乙醇产生的方法通过本文的教导在本领域技术人员的范围内。

在本发明的一些实施方案中，其中改变的碳通量的方向使得乙醇的产生增加，可通过与生长关联的选择改善乙醇输出。例如，可进行连续培养或连续稀释培养，以选择在期望的原料上生长较快和/或更有效产生乙醇(或任何期望的产物)的细胞。

本发明的一个实施方案涉及使用本文所述的微生物生产乙醇的方法，其中在存在含碳原料的情况下培养所述微生物足够的时间以生产乙醇，并且任选地，提取乙醇。在一些实施方案中，氮被添加到含有重组微生物和原料的培养物中。

可通过本领域已知的方法提取乙醇。(参见，例如，第2011/0171709号美国公开申请，其全文通过引用并入本文。)

本发明的另一个实施方案涉及使用由至少两种微生物组成的共培养物生产乙醇的方法，其中至少一种生物体是本文所述的生物体，和至少一种生物体是基因不同的微生物。在一些实施方案中，基因不同的微生物是酵母或细菌。在一些实施方案中，基因不同的微生物是来自以下属的任何生物体：伊萨酵母属、毕赤酵母属、棒孢酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、酵母属、木霉属、嗜热子囊菌属、埃希氏菌属、梭菌属、热解纤维素菌属、嗜热厌氧杆菌属和嗜热厌氧菌属。

在一些实施方案中，重组微生物产生比野生型非重组生物体高约2％至约3％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约2％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约5％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约7％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约10％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约15％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约20％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约30％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约50％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约75％的乙醇效价；比野生型非重组生物体高至少约1％至至少约100％的乙醇效价。在一些实施方案中，在含碳原料，例如玉米醪液上孵育每至少约24小时、至少约48小时或至少约72小时，重组微生物产生至少约0.5g/L的乙醇至至少约2g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约3g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约5g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约7g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约10g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约15g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约20g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约30g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约40g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约50g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约75g/L的乙醇，至少约0.5g/L的乙醇至至少约99g/L的乙醇、至少约0.5g/L的乙醇至至少约125g/L的乙醇、或至少约0.5g/L的乙醇至至少约150g/L的乙醇。

在一些实施方案中，重组微生物以至少约55％至至少约75％的理论产率、至少约50％至至少约80％的理论产率、至少约45％至至少约85％的理论产率、至少约40％至至少约90％的理论产率、至少约35％至至少约95％的理论产率、至少约30％至至少约99％的理论产率或至少约25％至至少约99％的理论产率生产乙醇。在一些实施方案中，生产乙醇的方法可包括使生物质原料接触宿主细胞或本发明的共培养物和另外使生物质原料接触外部产生的糖解酶。在一些实施方案中，宿主细胞是用编码糖解酶的多核苷酸基因工程化的(例如，转导、转化或转染的)。

淀粉分解酶可以是任何参与淀粉消化、代谢和/或水解的酶。术语“淀粉酶”是指将淀粉分解成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中开始消化的化学过程。含有大量淀粉但少量糖的食物，例如大米和土豆，咀嚼时感觉有点甜，因为淀粉酶在口腔内将其一些淀粉转化成糖。胰腺也产生淀粉酶(α-淀粉酶)以将膳食淀粉水解成二糖和三糖，二糖和三糖被其他酶转化成葡萄糖，以向身体提供能量。植物和一些细菌也产生淀粉酶。所有淀粉酶都是糖苷水解酶并作用于α-1,4-糖苷键。某些淀粉酶，例如γ-淀粉酶(葡糖淀粉酶)还作用于α-1,6-糖苷键。淀粉酶包括α-淀粉酶(EC3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC3.2.1.2)和γ-淀粉酶(EC3.2.1.3)。α-淀粉酶是钙金属酶，在没有钙的情况下无法发挥功能。通过沿淀粉链在随机的位置处作用，α-淀粉酶分解长链碳水化合物，最终由直链淀粉生成麦芽三糖和麦芽糖、或由支链淀粉生成麦芽糖、葡萄糖和“极限糊精”。因其能够作用在底物的任何地方，α-淀粉酶往往比β-淀粉酶作用更快。在动物中，它是主要的消化酶并且其最佳pH为约6.7-7.0。另一种形式的淀粉酶，β-淀粉酶也由细菌、真菌和植物合成。从非还原端开始工作，β-淀粉酶催化第二个α-1,4-糖苷键的水解，一次切割下两个葡萄糖单元(麦芽糖)。许多微生物产生淀粉酶以降解胞外淀粉。除了切割位于直链淀粉和支链淀粉的非还原端的最后的α(1-4)糖苷键，生成葡萄糖以外，γ-淀粉酶将切割α(1-6)糖苷键。另一种淀粉分解酶是α-葡糖苷酶，其作用于由α-、β-和γ-淀粉酶产生的麦芽糖和其他短的麦芽寡糖，并将它们转化为葡萄糖。另一种淀粉分解酶是支链淀粉酶。支链淀粉酶是降解葡聚糖的特定种类的葡聚糖酶，是一种淀粉分解外切酶。葡聚糖被认为是由α-1,6-糖苷键连接的麦芽三糖单元的链。支链淀粉酶(EC3.2.1.41)又称葡聚糖-6-葡聚糖水解酶(脱支酶)。另一种淀粉分解酶，异支链淀粉酶，将葡聚糖水解成异戊糖(6-α-麦芽糖基葡萄糖)。异支链淀粉酶(EC3.2.1.57)又称葡聚糖-4-葡聚糖水解酶。“淀粉酶”可以是任何参与淀粉酶消化、代谢和/或水解的酶，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、异支链淀粉酶和α-葡糖苷酶。

在一些实施方案中，本发明的重组微生物进一步包括一种或多种编码糖解酶的天然和/或异源酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解酶和淀粉分解辅助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖糖利用酶。在一个方面，糖解酶是淀粉酶，其中淀粉酶选择来自灰腐质霉(H.grisea)、嗜热子囊光孢菌(T.aurantiacus)、嗜热埃默森篮状菌(T.emersonii)、嗜热里氏木霉(T.reesei)、乳白梭菌(C.lacteus)、家白蚁(C.formosanus)、高山象白蚁(N.takasagoensis)、矛颚家白蚁(C.acinaciformis)、达尔文澳白蚁(M.darwinensis)、沃克里脉胞菌(N.walkeri)、扣囊复膜孢酵母菌(S.fibuligera)、拉克文梭菌(C.luckowense)、栖北散白蚁(R.speratus)、嗜热子囊菌(Thermobfidafusca)、热纤维梭菌(Clostridumthermocellum)、解纤维梭菌(Clostridumcellulolyticum)、约氏梭菌(Clostridumjosui)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilis)、粪肥纤维单胞菌(Cellulomonasfimi)、产微球茎菌(Saccharophagusdegradans)、阿奇瘤胃菌(Piromycesequii)、新美鞭菌(Neocallimastixpatricarum)或拟南芥(Arabidopsisthaliana)。在另一个方面，糖解酶是来自扣囊复膜孢酵母菌(S.fibuligera)的葡糖淀粉酶(glu-0111-CO)。

术语“木聚糖分解活性”旨在包括水解寡木糖和多木糖中的糖苷键的能力。术语“木聚糖酶”是为一类将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖，从而分解植物细胞壁的主要成分—半纤维素的酶所命名的名称。因此，其在植物来源上繁荣生长的微生物中发挥重要的作用(哺乳动物相反，不产生木聚糖酶)。另外，木聚糖酶存在于真菌中以将植物物质降解成能够利用的营养成分。木聚糖酶包括对应于EC编号3.2.1.8的那些酶。“木糖代谢酶”可以是任何参与木糖消化、代谢和/或水解的酶，包括木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖脱水酶、木糖转酮醇酶和木糖转醛醇酶蛋白。

术语“果胶酶”是一类酶的通用术语，例如果胶分解酶、果胶糖酶(pectozyme)和聚半乳糖醛酸酶，在酿造中通常指果胶酶。这些酶分解果胶—一种在植物细胞壁中发现的多糖底物。被研究最多且被广泛使用的一种商业果胶酶是聚半乳糖醛酸酶。果胶酶通常用在涉及植物材料降解的过程中，例如加速从水果，包括苹果和山榄果提取水果汁。自20世纪60年代以来，果胶酶已经用在葡萄酒生产中。

“糖解酶”可以是任何参与碳水化合物消化、代谢和/或水解的酶，包括淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、纤维素分解和淀粉分解辅助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖利用酶。

“戊糖利用酶”可以是任何参与戊糖消化、代谢和/或水解的酶，包括木聚糖酶、***糖酶、***木聚糖酶、***糖苷酶、***呋喃糖苷酶、***木聚糖酶、***糖苷酶、***呋喃糖苷酶、***糖异构酶、核酮糖-5-磷酸-4-表异构酶、木糖异构酶、木酮糖激酶、木糖还原酶、木糖脱氢酶、木糖醇脱氢酶、木糖酸脱水酶、木糖转酮醇酶和/或木糖转醛醇酶。

甘油产生

在本发明的一些实施方案中，其中改变碳通量方向使乙醇的产生增加，可通过生长相关的选择减少甘油输出。例如，可进行连续培养或连续稀释培养，以选择在期望的原料上产生较少甘油的细胞。可以例如通过代谢物浓度的HPLC分析测量甘油。

在一些实施方案中，重组微生物产生比野生型非重组生物体少至少约20％至至少约30％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约30％至至少约50％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约40％至至少约60％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约50％至至少约70％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约60％至至少约80％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约70％至至少约90％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约75％至至少约95％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约70％至至少约99％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约15％至至少约30％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约40％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约50％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约60％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约70％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约80％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约90％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约99％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约10％至至少约100％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约5％至至少约100％的甘油；比野生型非重组生物体少至少约1％至至少约100％的甘油。在一些实施方案中，重组微生物不产生甘油。在一些实施方案中，重组微生物的生长速率为野生型非重组生物体生长速率的至少约1/2至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/4至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/8至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/10至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/25至至少约相等，野生型非重组生物体生长速率的至少约1/50至至少约相等或野生型非重组生物体生长速率的至少约1/100至至少约相等。

野生型-非重组生物体在厌氧生长期间，以至少约每克干燥细胞重量(DCW)8-11mM甘油的速率产生甘油。在一些实施方案中，在厌氧生长期间，甘油产生被降低至每克干燥细胞重量1-10mM甘油之间的速率。

实施例

以下实施例使用的菌株均采用Mascoma装配体(MascomaAssemblies，“MA”)产生。MA的示意性图表可见于图6-44。用于制造产MA的质粒可见于图45-图68和表2中。用于产生MA的引物可见于下表3以及SEQIDNO：66-155。本发明中使用的菌株可见于下表4。对于可用于产生菌株的分子方法的一般描述，参见第61/728,450号美国申请，其通过引用并入本文中。

表2用于制造MA的质粒

实施例1

GDH1的缺失和GDH2或GLT1/GLN1的过表达

当M3624(Δgpd1::GPD2-B.adolescentispflA/pFlB/adhEΔgpd2::GPD1-B.adolescentispflA/pFlB/adhEΔfdh1Δfdh2::B.adolescentispflA/pFlB/adhE)在>30％固体的玉米醪液上生长时，其甘油形成具有约85％的降低。但是，即使在延长的孵育期后，该菌株无法完成发酵。对铵同化途径的两项修饰被构建在M3624中并对发酵性能进行评估。这些修饰是GDH1的缺失和Gdh2的过表达，得到菌株M4117(M3634Gdh2；Δgdh1)。第二项修饰是GDH1的缺失和GLT1和GLN1的过表达，得到菌株M4118(M3634Glt1；Gln1；Δgdh1)。将31％固体的玉米醪液发酵之后，将这些菌株与M3624和常规的酵母对照(M2390(分离自工业来源的野生型未修饰菌株))进行了对比。

将工业玉米醪液制成31％的最终固体浓度，补加青霉素(0.006mg/mL)和尿素(0.5g/l)。葡糖淀粉酶按0.6AGU/gTS的浓度添加。通过将每个菌株添加至0.1g/l的最终起始浓度而停止发酵。用橡胶塞将小瓶盖上并密封。将23号针刺穿橡胶塞以排气且为实验的安全。在35℃下孵育小瓶，在125rpm下摇动。实验终止时，制备样品以用于对乙醇和残留糖进行HPLC分析。

图69中的结果说明，M4117和M4118均达到比不能完成发酵的M3624高得多的最终乙醇效价。相对于M2390，M4117和M4118均分别具有高4.2％和5.2％的乙醇效价。

实施例2

GDH1的缺失

如图5所示，M3465(Δgpd2::B.adolescentispflA/pflB/adhEΔfdh1Δfdh2::B.adolescentispflA/pflB/adhE)、M3467(Δfdh1Δfdh2::PFK-pro-adhE-HXT-terENO1-pro-PflB-ENO1-terADH1-pro-adhE-PDC10-terTPI-pro-pflA-FBA-terΔgpd1::GPD2::PFK-pro-adhE-HXT-terENO1-pro-pf1B-ENO1-terADH1-pro-adhE-FDC10-terTPI-pro-pflA-FBA-ter)和M3469(Δgpd1::B.adolescentispflA/pflB/adhEfdh1Δfdh2::B.adolescentispflA/pflB/adhE)相对于对照菌株M2390具有范围在20％-45％的甘油减少度。在这些背景的每一个中构建GDH1的完全缺失，得到M4400(M3465Δgdh1)、M4401(M3467Δgdh1)和M4402(M3469Δgdh1)并在31％固体的玉米醪液发酵之后与常规的酵母对照(M2390)进行比较(发酵按实施例1的描述进行)。如图70所示，采用GDH1的缺失工程化的所有三个甘油减少菌株均达到比其各自的亲代菌株更高的乙醇效价。

实施例3

DUR1/2的过表达

在M3467(Δfdh1Δfd2::PFK-pro-adhE-HXT-terENO1-pro-pf1B-ENO1-terADH1-pro-adhE-PDC10-terTPI-Pro-pflA-FBA-terΔgpd1::GPD2::PFK-pro-adhE-HXT-terENO1-pro-pflB-ENO1-terADH1-pro-adhE-PDC10-terTPI-pro-pflA-FBA-ter)和M3469(Δgpd1::B.adolescentispflA/pflB/adhEfdh1Δfdh2Δ::B.adolescentispflA/pflB/adhE)中构建四种不同的DUR1/2表达盒，得到菌株M4427-M3343(表5)。在31％固体的玉米醪液发酵后(发酵按实施例1的描述进行)，将这些菌株与其亲代菌株和常规酵母对照(M2390)进行比较。如图71所示，所有含有DUR1/2的过表达的菌株均达到与其各自亲代菌株相同或比其各自亲代菌株更高的乙醇效价，但是TEF2和ADH1启动子显得特别地有效。使用的以及可以使用的启动子和终止子包括：酿酒酵母TEF2启动子：SEQIDNO：58，酿酒酵母HXT7启动子：SEQIDNO：59，酿酒酵母，酿酒酵母ADH1启动子：SEQIDNO：60，酿酒酵母TP1启动子：SEQIDNO：61，酿酒酵母FBA1终止子：SEQIDNO：62，酿酒酵母PDC1终止子：SEQIDNO：63，酿酒酵母PMA1终止子：SEQIDNO:64，和酿酒酵母ADH3终止子：SEQIDNO：65。

表5含有DUR1/2的过表达的结构和菌株名称说明

亲代菌株	菌株名称	基因修饰
			M3467	M4427	MA0464.1：由TEF2启动子表达DUR1，2
M3467	M4428	MA0465.1：由HXT7启动子表达DUR1，2
			M3467	M4429	MA467.1：由ADH1启动子表达DUR1，2
M3467	M4430	MA454.14：由HXT7/TEF2启动子表达DUR1，2
			M3469	M4431	MA0464.1：由TEF2启动子表达DUR1，2
M3469	M4432	MA0465.1：由HXT7启动子表达DUR1，2
			M3469	M4433	MA467.1：由ADH1启动子表达DUR1，2
M3469	M4434	MA454.14：由HXT7/TEF2启动子表达DUR1，2

实施例4

URE2的缺失

为评价甘油减少背景中的酿酒酵母氮分解代谢物阻遏体系的改变，URE2的缺失被构建在M3624中(实施例1)，产生菌株M4406(M3624Δure2)。在31％固体的玉米醪液发酵之后(发酵按实施例1的描述进行)，将该菌株与M3624和常规的酵母对照(M2390)进行比较。如图72所示，M4406达到比M3624更高的效价，但未观察到相对于常规的菌株的产率提高，并且具有～15g/l的残留葡萄糖。这表明对NCR体系的另外修饰可能给出改进的性能或者可能需要M4406的适应以获得潜在的产率提高。

实施例5

氮利用的调节

优选的氮源一般抑制利用非优选氮源的基因的转录。尿素作为补充氮源被添加到玉米醪液发酵中。但是，存在大量的氨基酸和氨，这两者相对于尿素均是优选的氮源。在氨基酸和氨的存在下，尿素转运蛋白(Dur3)和负责胞内降解的尿素-酰胺分解酶(Dur1/2)的表达可能受到抑制，作为被称为氮分解代谢物阻遏(NCR)现象的一部分。这种抑制可以降低尿素摄取的速率或者需要添加更大的量。如果Dur3和Dur1/2的结构性表达允许它们减少所需的尿素的量或加速发酵速率，对玉米乙醇生产商将是经济效益。

NCR受到Ure2以及被称为Gln3、Gat1、Dal80和Gzf3的四种转录因子的控制。Ure2参与抑制在非优选氮源存在下的基因的表达。已观察到，URE2的缺失激活了参与非优选氮源的摄取的基因的表达。Ure2的灭活导致转录因子Gln3的去磷酸化和核定位。

实施例5A

URE2缺失导致核GLN3的核定位以及NCR敏感基因的激活。

为评价甘油减少背景中的酿酒酵母氮分解代谢物阻遏体系的改变，URE2的缺失按实施例4进行构建。URE2缺失将构建在M3624中(实施例1)。URE2被删除的菌株显示出Gln1的核定位，以及NCR敏感基因的激活，包括Dur3和Dur1/2。

实施例5B

GLN3的过表达导致NCR敏感基因的激活

为评价甘油减少背景下酿酒酵母氮分解代谢物阻遏体系中的改变，使Gln3(SEQIDNO：156和157)过表达。Gln3过表达的菌株显示出NCR敏感基因(包括Dur3和Dur1/2)的激活。

实施例6

GDH1的缺失和酿酒酵母GDH2的表达

这些结果显示，菌株M3624(实施例1)能够达到比菌株M2390(WT)稍高的效价，产生多1.5g/l的乙醇(图73)。为了产生菌株M4117(M3634Gdh2；Δgdh1)。GDH1基因被删除并采用4拷贝的酿酒酵母GDH2基因表达盒代替。下图73中的结果表明，当与M3624进行比较时，M4117具有多于3.7g/1乙醇的明显改进。图74示出的数据显示，M3624产生1.3g/l的甘油，比产生10g/1的野生型菌株M2390少87％。GDH1的缺失和酿酒酵母GDH2表达盒的加入使甘油效价降低至约1g/l。这些结果说明，通过甲酸产生的甘油减少的组合与铵同化途径的修饰是协同的。

实施例7

GDH1缺失和粗糙脉胞菌GDH2的表达

为了产生M5841-M5844，GDH1基因被删除并采用4拷贝的图10中的粗糙脉胞菌GDH2基因表达盒来代替。每个菌株由独立菌落产生，并且具有相同的基因型(表6)。图73中显示的结果表明，将粗糙脉胞菌GDH2添加到M3624中得到比M3624高出3.6g/l和4.3g/l之间的效价。图74所示的数据显示，M3624产生1.3g/1的甘油，比产生10g/1甘油的野生型菌株M2390少87％。GDH1的缺失和粗糙脉胞菌GDH2表达盒的加入使甘油效价减少至约1g/1。这些结果支持的结论是：即使当使用GDH2的异源表达时，通过甲酸产生的甘油减少的组合与铵同化途径的修饰是协同的。

表6进一步包括Gdh1缺失和Gdh2表达的甘油缺失菌株

菌株	基因型
		M2390	WT
M3624	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2p
		M4117	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2pΔScgdh1：：4gdh2
M5841	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2pΔNcrassagdh1：：4gdh2
		M5842	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2pΔNcrassagdh1：：4gdh2
M5843	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2pΔNcrassagdh1：：4gdh2
		M5844	Δfdh1Δfdh2：：4a2pΔgpd1：：gpd24a2pΔgpd2：：gpd14a2pΔNcrassagdh1：：4gdh2

表6的菌株接种在含有4ml工业玉米醪液的小瓶(微型瓶)中。使发酵进行68小时，然后将样品在HPLC上运行以获得乙醇和甘油值。

将本文引用的所有文献，包括期刊论文或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请、公布的或外国专利或任何其他文献的全部内容均各自引入本文作为参考，包括引用的文献中存在的所有的数据、表格、图和文本。

本领域技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被以下权利要求书囊括。

Claims (215)

1.一种重组微生物，其包括：

a.至少一种导致在一种或多种乙醇生产途径中发挥作用的一种或多种天然酶和/或异源酶上调或下调的工程化基因修饰；

b.至少一种导致甘油生产途径中的酶下调的工程化基因修饰；以及

c.至少一种导致氮同化途径中的酶上调或下调的工程化基因修饰。

2.权利要求1所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中的下调的酶是谷氨酸脱氢酶(Gdh)(EC1.4.1.4)。

3.权利要求1所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：25和31(酿酒酵母Gdh1和Gdh3)的多肽序列至少约80％的同一性。

4.权利要求3所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：25和31(酿酒酵母Gdh1和Gdh3)的多肽序列至少约90％的同一性。

5.权利要求3-4任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：25和31(酿酒酵母Gdh1和Gdh3)的多肽序列至少约95％的同一性。

6.权利要求3-5任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：25和31(酿酒酵母Gdh1和Gdh3)的多肽序列相同。

7.权利要求2-6任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包括至少一种导致在氮同化途径中的酶上调的基因修饰。

8.权利要求1-7任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是异源酶。

9.权利要求1-7任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是天然酶。

10.权利要求1-9任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是至少一种选自谷氨酸脱氢酶(Gdh)(EC1.4.1.2)、谷氨酸合酶(Glt)(EC1.4.1.14)和谷氨酰胺合酶(Gln)(EC6.3.1.2)的酶。

11.权利要求10所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是分离自选自酿酒酵母属和脉胞菌属的生物体的Gdh2(Gdh2)。

12.权利要求1-10任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：27和29(Gdh2)的多肽序列至少约80％的同一性。

13.权利要求12所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：27和29(Gdh2)的多肽序列至少约90％的同一性。

14.权利要求12-13任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与选自SEQIDNO：27和29(Gdh2)的多肽序列至少约95％的同一性。

15.权利要求12-14任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：27和29(Gdh2)的多肽序列相同。

16.权利要求1-10任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是分离自酿酒酵母属生物体的Glt1(Glt1)。

17.权利要求16所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：33(Glt1)编码的多肽序列至少约80％的同一性。

18.权利要求16-17任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO33(Glt1)编码的多肽序列至少约90％的同一性。

19.权利要求16-18任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：33(Glt1)编码的多肽序列至少约95％的同一性。

20.权利要求16-19任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：33(Glt1)编码的多肽序列相同。

21.权利要求1-10任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是分离自来自酿酒酵母属的生物体的Gln1(Gln1)。

22.权利要求21所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：35(Gln1)编码的多肽序列至少约80％的同一性。

23.权利要求21-22任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：35(Gln1)编码的多肽序列至少约90％的同一性。

24.权利要求21-23任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：35(Gln1)编码的多肽序列至少约95％的同一性。

25.权利要求21-24任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：35(Gln1)编码的多肽序列相同。

26.权利要求1-10任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是铵转运蛋白。

27.权利要求26所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是天然的铵转运蛋白。

28.权利要求26-27任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是分离自来自选自酿酒酵母属的属的生物体的MEP蛋白。

29.权利要求26-28任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶选自Mep1、Mep2和Mep3。

30.权利要求29所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：19(Mep1)编码的多肽序列至少约80％的同一性。

31.权利要求29-30任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：19(Mep1)编码的多肽序列至少约90％的同一性。

32.权利要求29-31任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：19(Mep1)编码的多肽序列至少约95％的同一性。

33.权利要求29-32任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：19(Mep1)编码的多肽序列相同。

34.权利要求29所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列具有与SEQIDNO：21(Mep2)编码的多肽序列至少约80％的同一性。

35.根据权利要求34所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：21(Mep2)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

36.根据权利要求34-35任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：21(Mep2)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

37.根据权利要求34-36任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：21(Mep2)编码的多肽序列相同。

38.根据权利要求29所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：23(Mep3)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

39.根据权利要求38所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：23(Mep3)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

40.根据权利要求38-39任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：23(Mep3)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

41.根据权利要求38-40任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：23(Mep3)编码的多肽序列相同。

42.根据权利要求1-9任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是尿素-酰胺裂解酶(EC6.3.4.6)。

43.根据权利要求42所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是天然的尿素-酰胺裂解酶。

44.根据权利要求42-43任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是分离自来自细菌酿酒酵母属的生物体的尿素-酰胺裂解酶。

45.根据权利要求42-44任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：37(Dur1/2)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

46.根据权利要求42-45任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：37(Dur1/2)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

47.根据权利要求42-46任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：37(Dur1/2)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

48.根据权利要求42-47任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：37(Dur1/2)编码的多肽序列相同。

49.根据权利要求1-9任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是尿素转运蛋白。

50.根据权利要求49所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是天然的尿素转运蛋白。

51.根据权利要求49-50任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶选自DUR3和DUR4并分离自来自酿酒酵母属的生物体。

52.根据权利要求49-50任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶选自Dur3和Dur4。

53.根据权利要求52所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：39(Dur3)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

54.根据权利要求52-53任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：39(Dur3)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

55.根据权利要求52-53任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：39(Dur3)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

56.根据权利要求52-53任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：39(Dur3)编码的多肽序列相同。

57.根据权利要求1-9任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是Gln3。

58.根据权利要求57所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶是天然的Gln3。

59.根据权利要求57-58任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶分离自酿酒酵母属。

60.根据权利要求57-58任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：156(Gln3)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

61.根据权利要求60所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：156(Gln3)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

62.根据权利要求60-61任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：156(Gln3)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

63.根据权利要求60-62任一项所述的重组微生物，其中所述在氮同化途径中上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：156(Gln3)编码的多肽序列相同。

64.根据权利要求1-63任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由至少一种选自以下的酶编码：甘油-3-磷酸脱氢酶1多核苷酸(GPD1)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶1多肽(Gpd1)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶2多核苷酸(GPD2)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸脱氢酶2多肽(Gpd2)(EC1.1.1.8)、甘油-3-磷酸磷酸酶1多核苷酸(GPP1)(EC3.1.3.21)、甘油-3-磷酸磷酸酶多肽1(Gpp1)(EC3.1.3.21)、甘油-3-磷酸磷酸酶2多核苷酸(GPP2)(EC3.1.3.21)和甘油-3-磷酸磷酸酶多肽2(Gpp2)(EC3.1.3.21)。

65.根据权利要求64所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：5(Gpd1)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

66.根据权利要求64-65任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：5(Gpd1)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

67.根据权利要求64-66任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：5(Gpd1)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

68.根据权利要求64-67任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：5(Gpd1)编码的多肽序列相同。

69.根据权利要求64所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：7(Gpd2)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

70.根据权利要求69所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：7(Gpd2)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

71.根据权利要求69-70任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：7(Gpd2)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

72.根据权利要求69-71任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：7(Gpd2)编码的多肽序列相同。

73.根据权利要求64所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：159(Gpp1)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

74.根据权利要求73所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：159(Gpp1)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

75.根据权利要求73-74任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：159(Gpp1)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

76.根据权利要求73-75任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：159(Gpp1)编码的多肽序列相同。

77.根据权利要求64所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：161(Gpp2)编码的多肽序列与具有至少约80％的同一性。

78.根据权利要求77所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：161(Gpp2)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

79.根据权利要求77-78任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：161(Gpp2)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

80.根据权利要求77-79任一项所述的重组微生物，其中所述在甘油生产途径中的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：161(Gpp2)编码的多肽序列相同。

81.根据权利要求1-80任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的上调的酶是丙酮酸甲酸裂解酶(EC2.3.1.54)。

82.根据权利要求1-81任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：9(青春双歧杆菌Pfl)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

83.根据权利要求1-82任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：9(青春双歧杆菌Pfl)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

84.根据权利要求1-83任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：9(青春双歧杆菌Pfl)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

85.根据权利要求1-84任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：9(青春双歧杆菌Pfl)编码的多肽序列相同。

86.根据权利要求1-85任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的上调的酶是丙酮酸甲酸裂解酶活化酶(EC1.91.1.4)。

87.根据权利要求1-86任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：11(青春双歧杆菌Pfl活化酶)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

88.根据权利要求1-87任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：11(青春双歧杆菌Pfl-活化酶)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

89.根据权利要求1-88任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：11(青春双歧杆菌Pfl-活化酶)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

90.根据权利要求1-89任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：11(青春双歧杆菌Pfl-活化酶)编码的多肽序列相同。

91.根据权利要求1-90任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的上调的酶是选自同时具有以下酶学委员会编号的一组酶的双功能乙醛-醇脱氢酶：EC1.2.1.10和EC1.1.1.1。

92.根据权利要求1-91任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：13(青春双歧杆菌AdhE)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

93.根据权利要求1-92任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：13(青春双歧杆菌AdhE)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

94.根据权利要求1-93任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：13(青春双歧杆菌AdhE)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

95.根据权利要求1-94任一项所述的重组微生物，其中所述双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列进行编码，所述多肽序列与SEQIDNO：13(青春双歧杆菌AdhE)编码的多肽序列相同。

96.根据权利要求1-90任一项所述的重组微生物，其中所述在乙醇生产途径中发挥作用的上调的酶是选自同时具有以下酶学委员会编号的一组酶的NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶：EC1.2.1.10和EC1.1.1.2。

97.根据权利要求96所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶分离自选自明串珠菌属和酒球菌属的属。

98.根据权利要求97所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：15和17的多肽序列具有至少约80％的同一性。

99.根据权利要求97-98任一项所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：15和17的多肽序列具有至少约90％的同一性。

100.根据权利要求97-99任一项所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：15和17的多肽序列具有至少约95％的同一性。

101.根据权利要求1-100任一项所述的重组微生物，其中所述NADPH依赖性双功能乙醛-醇脱氢酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：15和17的多肽序列相同。

102.根据权利要求1-101任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包括在一种或多种天然酶中的下调，所述天然酶由选自EC1.2.1.43和EC1.2.1.2的甲酸脱氢酶编码。

103.根据权利要求1-102任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：2(Fdh1)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

104.根据权利要求1-103任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：2(Fdh1)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

105.根据权利要求1-104任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：2(Fdh1)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

106.根据权利要求1-105任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：2(Fdh1)编码的多肽序列相同。

107.根据权利要求1-106任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：3(Fdh2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

108.根据权利要求1-107任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：3(Fdh2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

109.根据权利要求1-108任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：3(Fdh2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

110.根据权利要求1-109任一项所述的重组微生物，其中所述下调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：3(Fdh2)的多核苷酸序列编码的多肽序列相同。

111.根据权利要求1-110任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物进一步包括可操作地连接至天然GPD2启动子的异源GPD1多核苷酸。

112.根据权利要求1-111任一项所述的重组微生物，其中所述重组微生物进一步包括可操作地连接至天然GPD1启动子的异源GPD2多核苷酸。

113.根据权利要求1-112任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包括调节元件的上调或下调。

114.根据权利要求113所述的重组微生物，其中所述调节元件选自Ure2和Aua1。

115.根据权利要求113-114任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：55(Ure2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

116.根据权利要求113-115任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：55(Ure2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

117.根据权利要求113-116任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：55(Ure2)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

118.根据权利要求113-117任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：55(Ure2)的多核苷酸序列编码的多肽序列相同。

119.根据权利要求113-114任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：57(Aua1)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

120.根据权利要求119所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：57(Aua1)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

121.根据权利要求119-120任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：57(Aua1)的多核苷酸序列编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

122.根据权利要求119-121任一项所述的重组微生物，其中所述调节元件由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：57(Aua1)的多核苷酸序列编码的多肽序列相同。

123.根据权利要求1-122任一项所述的重组微生物，其中所述微生物进一步包括至少一种另外的上调的酶。

124.根据权利要求123所述的重组微生物，其中所述另外的上调的酶是具有EC编号3.2.1.3的葡糖淀粉酶。

125.根据权利要求124所述的重组微生物，其中所述上调的酶分离自酿酒酵母属。

126.根据权利要求124所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：163(葡糖淀粉酶)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

127.根据权利要求126所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：163(葡糖淀粉酶)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

128.根据权利要求126-127任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：163(葡糖淀粉酶)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

129.根据权利要求126-128任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：163(葡糖淀粉酶)编码的多肽序列相同。

130.根据权利要求123所述的重组微生物，其中所述上调的酶是通透酶。

131.根据权利要求130任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶分离自酿酒酵母属(通透酶)。

132.根据权利要求130所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：53(Gap)编码的多肽序列具有至少约80％的同一性。

133.根据权利要求132所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：53(Gap)编码的多肽序列具有至少约90％的同一性。

134.根据权利要求132-133任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：53(Gap)编码的多肽序列具有至少约95％的同一性。

135.根据权利要求132-134任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与SEQIDNO：53(Gap)编码的多肽序列相同。

136.根据权利要求123所述的重组微生物，其中所述上调的酶是具有EC编号3.4.23.41的蛋白酶。

137.根据权利要求136所述的重组微生物，其中所述上调的酶分离自选自以下的属：玉蜀黍属(Zea)、脉胞菌属、柄胞壳菌属和稻瘟菌属(蛋白酶)。

138.根据权利要求136所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：41、43、45、47、49和51的多肽序列(蛋白酶)具有至少约80％的同一性。

139.根据权利要求138所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：41、43、45、47、49和51的多肽序列(蛋白酶)具有至少约90％的同一性。

140.根据权利要求138-139任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：41、43、45、47、49和51的多肽序列(蛋白酶)具有至少约95％的同一性。

141.根据权利要求138-140任一项所述的重组微生物，其中所述上调的酶由多肽序列编码，所述多肽序列与选自SEQIDNO：41、43、45、47、49和51的多肽序列(蛋白酶)相同。

142.根据权利要求1-141任一项所述的重组微生物，其中所述上调的或下调的酶受控于异源启动子。

143.根据权利要求142所述的重组微生物，其中所述异源启动子选自TEF2(SEQIDNO：58)、HXT7(SEQIDNO：59)、ADH1(SEQIDNO：60)和TP1(SEQIDNO：61)。

144.根据权利要求1-143任一项所述的重组微生物，其中所述微生物是酵母。

145.根据权利要求144所述的重组微生物，其中所述酵母来自酿酒酵母属。

146.根据权利要求144-145任一项所述的重组微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。

147.根据权利要求1-146任一项所述的重组微生物，其中所述微生物以比缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物更高的产率产生乙醇。

148.根据权利要求1-147任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生比缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物高约1％至约10％的乙醇效价。

149.根据权利要求1-148任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生至少约125g/L的乙醇效价。

150.根据权利要求1-149任一项所述的重组微生物，其中所述微生物以低于缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物的产率产生甘油。

151.根据权利要求1-150任一项所述的重组微生物，其中所述微生物产生比缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物低约10％至约100％的甘油效价。

152.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶以及上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

153.根据权利要求152所述的重组微生物，其中所述Gdh1被下调。

154.根据权利要求152-153任一项所述的重组微生物，其中所述Glt1被上调。

155.根据权利要求152-154任一项所述的重组微生物，其中所述Gln1被上调。

156.根据权利要求152-155任一项所述的重组微生物，其中所述Aua1被下调。

157.根据权利要求152-156任一项所述的重组微生物，其中所述Ure1被下调。

158.根据权利要求152-157任一项所述的重组微生物，其进一步包括Dur1/2。

159.根据权利要求152-158任一项所述的重组微生物，其进一步包括选自Dur3和Dur4的上调的酶。

160.根据权利要求152-159任一项所述的重组微生物，其进一步包括选自Mep1、Mep2和Mep3的上调的酶。

161.根据权利要求152-160任一项所述的重组微生物，其进一步包括上调的Gln3。

162.根据权利要求152-161任一项所述的重组微生物，其进一步包括由GPD2启动子表达的GPD1。

163.根据权利要求152-162任一项所述的重组微生物，其进一步包括由GPD1启动子表达的GPD2。

164.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶以及上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

165.根据权利要求164所述的重组微生物，其中所述Gdh1被下调。

166.根据权利要求164-165任一项所述的重组微生物，其中所述Glt1被上调。

167.根据权利要求164-166任一项所述的重组微生物，其中所述Gln1被上调。

168.根据权利要求164-167任一项所述的重组微生物，其中所述Aua1被下调。

169.根据权利要求164-168任一项所述的重组微生物，其中所述Ure1被下调。

170.根据权利要求164-169任一项所述的重组微生物，其进一步包括Dur1/2。

171.根据权利要求164-170任一项所述的重组微生物，其进一步包括选自Dur3和Dur4的上调的酶。

172.根据权利要求164-171任一项所述的重组微生物，其进一步包括选自Mep1、Mep2和Mep3的上调的酶。

173.根据权利要求164-172任一项所述的重组微生物，其进一步包括上调的Gln3。

174.根据权利要求164-173任一项所述的重组微生物，其进一步包括由GPD2启动子表达的GPD1。

175.根据权利要求164-174任一项所述的重组微生物，其进一步包括由GPD1启动子表达的GPD2。

176.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶以及上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

177.根据权利要求176所述的重组微生物，其中所述Gdh1被下调。

178.根据权利要求176-177任一项所述的重组微生物，其中所述Glt1被上调。

179.根据权利要求176-178任一项所述的重组微生物，其中所述Gln1被上调。

180.根据权利要求176-179任一项所述的重组微生物，其中所述Aua1被下调。

181.根据权利要求176-180任一项所述的重组微生物，其中所述Ure1被下调。

182.根据权利要求176-181任一项所述的重组微生物，其还包括Dur1/2。

183.根据权利要求176-182任一项所述的重组微生物，其还包括选自Dur3和Dur4的上调的酶。

184.根据权利要求176-183任一项所述的重组微生物，其还包括选自Mep1、Mep2和Mep3的上调的酶。

185.根据权利要求176-184任一项所述的重组微生物，其还包括上调的Gln3。

186.根据权利要求176-185任一项所述的重组微生物，其还包括由GPD2启动子表达的GPD1。

187.根据权利要求176-186任一项所述的重组微生物，其还包括由GPD1启动子表达的GPD2。

188.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2以及上调的Gdh2。

189.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2、上调的Glt1以及上调的Gln1。

190.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、受控于GPD1启动子的GPD2、上调的Glt1以及上调的Gln1。

191.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶以及上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

192.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶以及受控于GPD1启动子的GPD2。

193.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Gdh1、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶以及上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶。

194.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、上调的DUR1/2以及受控于GPD1启动子的GPD2。

195.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶以及上调的DUR1/2。

196.根据权利要求195所述的重组微生物，其中所述DUR1/2由TEF2启动子驱动。

197.根据权利要求195所述的重组微生物，其中所述DUR1/2由HXT7启动子驱动。

198.根据权利要求195所述的重组微生物，其中所述DUR1/2由ADH1启动子驱动。

199.根据权利要求195所述的重组微生物，其中所述DUR1/2由HXT7/TEF2启动子驱动。

200.一种重组微生物，其包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、下调的Ure2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、受控于GPD2启动子的GPD1、以及受控于GPD1启动子的GPD2。

201.根据权利要求200所述的重组微生物，其还包括上调的DUR3。

202.根据权利要求200-201任一项所述的重组微生物，其还包括上调的DUR1/2。

203.根据权利要求188-202任一项所述的重组微生物，其还包括上调的Gln3。

204.一种重组微生物，包括：下调的Gpd1、下调的Gpd2、下调的Fdh1、下调的Fdh2、上调的AdhE、上调的丙酮酸甲酸裂解酶、上调的丙酮酸甲酸裂解酶-活化酶、上调的GDH2、受控于GPD2启动子的GPD1以及受控于GPD1启动子的GPD2。

205.一种包含根据权利要求1-204任一项所述的重组微生物和含碳原料的组合物。

206.根据权利要求205所述的组合物，其中所述原料选自木质生物质、草、糖加工残渣、市政废弃物、农业废弃物或其任何组合。

207.根据权利要求206所述的组合物，其中所述原料选自回收的木浆纤维、锯屑、硬木、软木、稻秸、稻壳、大麦秸秆、玉米芯、谷类秸秆、小麦秸秆、油菜秸秆、燕麦秸秆、燕麦壳、玉米纤维、秸秆、肉质植物、龙舌兰、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、造纸泥浆、市政废弃物或其任何组合。

208.一种生产发酵产品的方法，其包括：

a)提供根据权利要求205-207任一项所述的组合物；

b)使所述组合物与含碳原料接触，其中，所述重组微生物能够使含碳原料发酵以产生发酵产品；以及

c)任选地回收发酵产品。

209.一种生产乙醇的方法，其包括：

a.提供根据权利要求1-204任一项所述的重组微生物。

b.在含碳原料的存在下培养重组微生物足够的时间以生产乙醇；以及任选地

c.提取乙醇。

210.一种减少甘油产生的方法，其包括提供根据权利要求1-204任一项所述的重组微生物，其中甘油效价比缺少所述基因修饰的在其他方面相同的微生物的速率低约10至约100％。

211.根据权利要求208-210任一项所述的方法，其中与缺少基因修饰的在其他方面相同的微生物相比，所述甘油产生是减少的，并且其中当所述重组微生物在含碳原料的存在下培养足够的时间以生产乙醇时，乙醇效价升高至少约1％至约10％。

212.根据权利要求208-211任一项所述的方法，其中氮被添加到含有重组微生物和原料的培养物中。

213.一种包括至少两种宿主细胞的共培养物，其中

a.一种宿主细胞包括根据权利要求1-204任一项所述的重组微生物；以及

b.基因上不同于(a)的另一种宿主细胞。

214.根据权利要求213所述的共培养物，其中所述基因上不同的宿主细胞是酵母或细菌。

215.根据权利要求213或214所述的共培养物，其中所述基因上不同的宿主细胞是来自以下属的任何生物体：酵母属、伊氏酵母属、毕赤酵母属、棒孢酵母属、假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、木霉属、嗜热子囊菌属、埃希氏菌属、梭菌属、热解纤维素菌属、发酵单胞菌属、嗜热厌氧杆菌属或嗜热厌氧菌属。