CN105209071A - 用于提高疗效的基于鼻内递送中和抗体的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过将药剂，特别是中和抗体或其活性片段直接施用(包括通过鼻内或吸入给药)至呼吸道来治疗或预防病毒，特别是流感病毒的方法。本发明提供适合于鼻内或吸入治疗和给药的组合物。本发明包括将抗体的鼻内或吸入给药与腹膜内或静脉内给药结合的治疗或预防方法。

Description

用于提高疗效的基于鼻内递送中和抗体的组合物和方法
发明领域
本发明主要涉及通过将药剂、特别是抗体或其活性片段、特别是中和抗体直接施用(包括通过鼻内或吸入给药)至呼吸道来治疗或预防呼吸道传染原、特别是病毒、特别是流感病毒的方法。本发明涉及适合于鼻内或吸入治疗和给药的组合物，以及用于经由抗体的鼻内或吸入给药或者将抗体的鼻内或吸入给药与腹膜内或静脉内给药相结合的治疗或预防方案或方法。
背景技术
流感是主要的死亡和疾病原因，并影响上下呼吸道。流感病毒造成高度传染性的呼吸道疾病，其在美国在恶劣的季节引起超过200,000例住院和36,000例伤亡。在全球，每年有20％的儿童和5％的成人发生症状性流感(Nicholson,K.G.等人,(2003)Lancet362:1733-1745)。发病率和死亡率因流感病毒株的致病力和宿主的暴露史、年龄和免疫状态而变化。除季节性流行病以外，大流行性感冒病毒株以一定的规律出现。由于缺少针对主要病毒抗原的预存免疫，大流行性感冒会经常以比季节性流感更严重的疾病迅速传播(Swartz,K.A.&Luby,J.P.(2007)TexMed103:31-34)，例如，1918-1919的“西班牙流感”大流行性病毒株是二十世纪最致命的瘟疫，感染32％的全球人口，导致超过2千万例死亡(Webster,R.G.(1999)ProcNatlAcadSciUSA96:1164-1166)。最近，2009H1N1病毒在美国传播至6千1百万人，从2009年4月至2010年4月引起预计274,000例住院(Lagace-Wiens,P.R.等人,(2010)CritCareMed38:e1-9)。由于如何应对威胁的不确定性，这一大流行致使学校和商业机构关闭。
有三种类型的流感病毒，即甲型(A)、乙型(B)和丙型(C)流感。人甲型和乙型流感病毒引起季节性的疾病流行。丙型流感的感染引起温和的呼吸道疾病，并且不认为其引起流行。甲型流感病毒基于病毒表面上的两种蛋白而划分成亚型：血凝素(H)和神经氨酸苷酶(N)。有17种不同的血凝素亚型和10种不同的神经氨酸苷酶亚型。甲型流感病毒可以进一步分解成不同的病毒株。目前发现于人群中的甲型流感病毒亚型为甲型流感(H1N1)和甲型流感(H3N2)病毒。乙型流感病毒不划分成亚型，但还可以进一步分解成不同的谱系。甲型流感(H1N1)、甲型流感(H3N2)、和乙型流感病毒均包括在每年的流感疫苗中。
目前，有5种临床上相关的流感病毒在人群中传播，有3种是甲型流感，另外2种是乙型流感。甲型流感病毒划分成两个不同的***发生组1和2。组1包括血凝素亚型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H13和H16。组2包括H3、H4、H7、H10、H15和H14。目前相关的传播组1甲型流感病毒是H1亚型，其进一步划分成人和猪来源，组2相关的传播病毒目前是H3亚型。甲型流感病毒引起大量的季节性疾病，在美国，在过去的12个流感季中，有8个由H3病毒主导(CDC季节性流感；美国监控数据)。在1968年，H3造成二十世纪三个主要流感大流行的其中之一，H3病毒自那时起就持续作为人类疾病的主要致病因子。除人以外，H3流感病毒常常感染鸟、猪和马。乙型流感病毒已经在人类中传播了100多年，目前的病毒株分成两个谱系，即山形(Yamagata)系和维多利亚系。目前，三价流感疫苗已经扩展至覆盖乙型流感的两个谱系以及H1病毒和H3病毒的四价疫苗。
目前对于流感的治疗并不充分，且可能是无效的。尽管疫苗接种广泛，但对流感的易感性仍然保持。促成易感性的因素包括(1)疫苗接种覆盖率不完全，例如，2009H1N1的流行，当时疫苗短缺广泛，(2)在例如2008年的年份，当时疫苗制剂很差地呈现传播中的病毒株，(3)疫苗接种在老年人中的效力降低，在65岁平均效力范围在40-50％，在70岁以上仅为15-30％，和(4)出现在季节性疫苗中没有呈现的流行病毒株。而且，针对目前可用于治疗流感的抗病毒疗法的耐药性已经成为严重问题。对于作用于M2蛋白并抑制病毒融合的药物金刚烷(金刚烷胺和金刚烷乙胺)的耐药性在2004-2005流感季的最初6个月间从2004年的1.9％增加至14.5％，且目前已经超过90％(Sheu,T.G.等人(2011)JInfectDis203:13-17)。对抑制流感神经氨酸苷酶蛋白的抗病毒药物达菲的耐药性已经在2006-2007流感季从H1N1病毒的1-2％戏剧性地增加至2007-2008年为止的12％，并在2009年超过了99％的季节性H1N1病毒。幸运的是，2009年的流行H1N1病毒株对达菲敏感，且很可能在流行期间引起较少的死亡。如此，对于新的流感治疗剂有着势不可挡的需求。
开发用于流感的治疗性抗体正在获得关注，因为最近已发现血凝素(HA)分子内的保守表位。已经有若干关于能够识别并中和不同数目的甲型流感病毒亚型的人单克隆抗体(MAb)的分离和表征的报道。它们当中有许多靶向血凝素(HA)糖蛋白，其在接种疫苗或自然感染的过程中引起最强健的中和抗体。HA由两个亚基HA1和HA2组成，其为在病毒感染中至关重要的组分。HA1涉及与宿主细胞受体唾液酸的连接，且HA2介导病毒和核内体膜的融合。MAbCR6261是充分表征的抗体，其与H1病毒以及组1内的其他亚型(H5)结合，并结合在HA2亚基上(ThrosbyM等人,(2008)PLoSONE3:e3942；EckertDC等人,(2009)Science324:246-251；FriesenRHE等人,(2010)PLoSONE5(2):e1906；US专利8,192,927)。MAbCR8020与H3和作为组2病毒的另一亚型(H7)病毒上的HA2的近膜区结合(EckertDC等人,(2011)Science333:843-850)。来自瑞士研究者的抗体FI6v3可以与组1(H1)和组2(H3)病毒上存在的表位结合，但已经显示FI6在小鼠中的效力有限(CortiD等人,(2011)Science333:850-856)。Palese和同事已经用不同血凝素在小鼠中进行顺序免疫而报道了针对H3流感病毒的保护性广泛的单克隆抗体(WangTT等人,(2010)PLoSPathog6(2):e1000796；US申请20110027270)。使用该方法，分离出反应性广泛的H1抗体(TanGS等人,(2012)JVirol86(11):6179-6188)。
目前，基于迄今为止许多种重组抗体的研究和临床经验，包括在美国已经在临床上许可的超过20种的单克隆抗体，通常的抗体疗法剂量明确为每次给药多个mg/kg(NewsomeBWandErnstoffMS(2008)BrJClinPharmacol66(1):6-19)。例如，许可用于结肠直肠癌的抗-EGFR全人抗体帕尼单抗每2周以6mg/kg在小时内静脉内给药。使用平均的人体重70kg，该量为每次给药420mg抗体。
目前尚无单克隆抗体已许可用于流感。动物中流感抗体的研究报道表明，当出于治疗或预防目的而静脉内或腹膜内施用时这些抗体的有效剂量范围要求是1mg/kg直至100mg/kg的范围。这些抗体中一些(CR6261、CR8020、TCN-032)在美国的I期临床试验在安全性和耐受性研究中使用2mg/kg直至50mg/kg的剂量递增(clinicaltrials.gov；NCT01390025、NCT01406418、NCT01756950)。大量的材料在这一新系列的抗体治疗开发中呈现出较大障碍。具体地，该范围内的全身剂量导致材料的较大成本，以及涉及在输注中的时间和个人成本。如此，迫切需要增加效力和/或降低所需的材料的量，以使针对流感的抗体治疗或预防成为可行的选择。
本文参考文献的引用不应理解成对其构成本发明现有技术的承认。
发明内容
本发明提供通过将中和抗体直接施用(包括通过鼻内或吸入给药)至呼吸道或气道来有效地治疗和预防病毒感染特别是包括流感病毒的新的方法和装置。本发明表明，将中和抗体直接递送至呼吸道，包括通过吸入(IH)和/或鼻内(IN)递送和给药，在较低剂量时，比相同量的相同抗体的全身给药(IV或IP)更加优越、更有效力且起作用。在病毒暴露或感染之前或者甚至之后，IN或IV递送抗体的治疗或预防是有效的。
本发明提供有效地用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含一种或多种病毒中和单克隆抗体。在第一个方面，本发明提供有效地用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含单一单位剂量(singleunitdose)为1mg/kg或更低的病毒中和单克隆抗体。本发明提供有效地用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含一种或多种单一单位剂量为10mg/kg或更低的病毒中和单克隆抗体。本发明提供有效用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含一种或多种单一单位剂量小于1mg/kg的病毒中和单克隆抗体。本发明提供有效用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含单一单位剂量小于0.5mg/kg的病毒中和单克隆抗体。本发明提供有效用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含单一单位剂量小于0.1mg/kg的病毒中和单克隆抗体。
在特定的方面，本发明提供有效用于治疗或预防哺乳动物中流感病毒包括流感病毒感染的吸入或鼻内组合物，其包含一种或多种流感病毒中和单克隆抗体。在另一方面，本发明提供有效用于在哺乳动物中治疗、预防流感病毒或降低其传播的吸入或鼻内组合物，其包含针对流通的流感病毒株的流感中和抗体的组合。在一个方面，本发明提供由针对流通的流感病毒株的流感中和抗体的组合所组成的，特别是由甲型流感抗-H1抗体、甲型流感抗-H3抗体和抗-乙型流感抗体组成的用于鼻内给药的组合物。在一个方面，组合物包含有效针对或进一步有效针对其他流感病毒株，包括但不限于H2、H5和H7病毒株的甲型流感抗体。
组合物适合于并且可应用于治疗或预防流感病毒。在特定的方面，组合物适合于降低呼吸道病毒的传播。组合物适合于降低流感病毒的传播。
在一个方面，组合物包含单一单位剂量为0.5mg/kg或更低的病毒中和单克隆抗体。在一个方面，组合物包含单一单位剂量为0.1mg/kg或更低的病毒中和单克隆抗体。在另一方面，组合物包含单一单位剂量为0.05mg/kg或更低的病毒中和单克隆抗体。
在一个方面，组合物包含单一单位剂量小于0.5mg/kg的病毒中和单克隆抗体。在一个方面，组合物包含单一单位剂量小于0.1mg/kg的病毒中和单克隆抗体。在另一方面，组合物包含单一单位剂量小于0.05mg/kg的病毒中和单克隆抗体。
在示例性的方面，组合物可以包含一种或多种作为流感病毒中和抗体的病毒中和抗体。组合物可以特别地包含一种或多种针对甲型流感，特别是针对甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感病毒中和抗体。组合物可以特别地包含一种或多种针对乙型流感，特别是针对山形谱系和/或维多利亚谱系的流感病毒中和抗体。组合物可以包含一种或多种针对甲型流感病毒，特别是针对组1和组2甲型流感病毒(包括H1病毒和/或H3病毒)，和/或针对乙型流感病毒(包括山形谱系和/或维多利亚谱系)的流感病毒抗体。在特定的方面，组合物可以包含一种或多种针对甲型流感病毒，特别是针对组1和组2甲型流感病毒(包括H1病毒和/或H3病毒)的流感病毒抗体，以及一种或多种针对乙型流感病毒(包括山形谱系和/或维多利亚谱系)的流感抗体。组合物可以包含抗体组合，其包含一种或多种针对甲型流感病毒，特别是针对1组和组2甲型流感病毒(包括H1病毒和/或H3病毒)的抗体以及一种或多种针对乙型流感病毒的流感抗体。
根据本发明，包括如本文提供的研究中所例示的，当例如通过鼻内或吸入给药而施用至气道或呼吸道时，许多种不同的中和抗体在较低剂量下具有提高的效力。因此，本发明的组合物可以包含中和抗体或其片段，包括Fab片段，其能够中和流感病毒并且可以针对甲型流感和/或乙型流感病毒。本发明的组合物可以包含一种或多种选自CR6261、CR8020、CR9114、6F12、GG3、5A7、Mab53和Mab579或其片段、其合成的或重组的衍生物、其人源化或嵌合的形式、以及具有其重链和轻链CDR中抗体中的流感病毒中和抗体。
组合物可以特别地包含流感中和抗体6F12、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合的形式以及具有其重链和轻链CDR的抗体。组合物可以特别地包含流感中和抗体GG3、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合的形式和具有其重链和轻链CDR的抗体。组合物可以特别地包含流感中和抗体5A7、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合的形式和具有其重链和轻链CDR的抗体。组合物可以特别地包含流感中和抗体Mab53、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合的形式和具有其重链和轻链CDR的抗体。组合物可以特别地包含流感中和抗体Mab579、其片段、其合成或重组衍生物、其人源化或嵌合的形式和具有其重链和轻链CDR的抗体。
组合物可以特别地包含一种或多种针对甲型流感，特别是针对甲型流感组1和/或甲型流感组2的流感病毒中和抗体。在示例性的方面，组合物可以包含一种或多种针对甲型流感，特别是针对甲型流感组1，特别是针对H1病毒亚型的流感病毒中和抗体，其中一种或多种抗体选自CR6261或CA6261、6F12、GG3、mAb53或其活性片段。组合物可以包含一种或多种针对甲型流感，特别是针对甲型流感组2，特别是针对H3病毒亚型的流感病毒中和抗体，其中一种或多种抗体选自CR8020或CA8020、mAb579或其活性片段。在一个方面，组合物可以包含流感病毒中和抗体CR9114或CA9114或其活性片段，该抗体提供针对甲型流感和/或针对乙型流感的流感病毒中和抗体。组合物可以包含一种或多种针对乙型流感，特别是针对山形谱系和/或维多利亚谱系的流感病毒中和抗体，其中一种或多种抗体选自5A7、CR9114、CA9114或其活性片段。
病毒中和抗体可以特别地为能够中和的抗体片段。在一方面，抗体片段缺少Fc，和/或缺少效应子功能或效应子功能降低。抗体片段可以选自Fab、Fab’和F(ab’)2。病毒中和抗体或片段可以得自重组蛋白，可以重组表达，包括作为活性片段，或者可以得自其他手段或方法或由其他手段或方法产生，包括在气道或呼吸道内提供中和抗体或片段的手段或方法，包括通过遗传材料或DNA或DNA载体表达的方式，例如，通过递送编码中和抗体或其片段的DNA或RNA。
本发明的组合物还可以包含药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂。组合物可以包含适合于或适于鼻或肺递送以及用于鼻内或吸入给药的赋形剂、载体、稀释剂或添加剂。组合物可以包含适合于或适于刺激或促进免疫反应和/或抗体介导的细胞或全身作用的赋形剂、载体、稀释剂或添加剂。组合物可以包含免疫调节物或免疫反应刺激物。
本发明提供用于治疗、预防或降低或抑制病毒，特别是呼吸道病毒，特别是流感病毒的传播的方法。本发明提供用于治疗或预防暴露于、已接触或患有呼吸道病毒的哺乳动物中的病毒感染的方法，其包括鼻内(IN)或经由吸入而对该哺乳动物施用一种或多种能够中和呼吸道病毒的单克隆抗体。
在方法的一个方面，单克隆抗体是IgG抗体。在方法的一个方面，呼吸道病毒是流感病毒。流感病毒可以是甲型或乙型或者未知或未确定类型的流感病毒。在一个方面，抗体是能够中和并针对甲型或乙型流感的中和抗体。在一个方面，抗体是能够中和并针对甲型和乙型流感病毒的单克隆抗体的组合。
根据该方法，可以在感染后或者在假定感染、暴露或显现临床症状之后施用抗体。在其一个方面，可以在感染后至多8小时的时间段内施用抗体。另外可选地，可以在感染后至多24小时的时间段内施用抗体。在其他可选方式中，在感染后至多48小时的时间段内施用抗体。在其他可选方式中，在感染后至多72小时的时间段内施用抗体。可以在感染后至多8小时(8hpi)、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi、72hpi、感染后1天、感染后2天、感染后3天、感染后4天、感染后5天、感染后6天、感染后7天、感染后1周、感染后10天、感染后2周、感染后3周、感染后4周、感染后1个月、感染后数月施用抗体，包括作为单一给药或者以多次按序给药。
抗体可以以单剂量施用。单剂量可以是小于10mg/kg体重，小于5mg/kg体重，小于2mg/kg体重，1mg/kg体重或更低。单剂量可以是小于1mg/kg体重，小于0.5mg/kg，小于0.1mg/kg，小于0.05mg/kg。抗体可以在多次给药中施用。剂量在各次给药中可以是相同的，或者可以在各次给药中变化，或者可以是初始的较高剂量、后续为较低剂量。单剂量或多剂量或者任何剂量可以是小于1mg/kg体重，小于0.5mg/kg，小于0.1mg/kg，小于0.05mg/kg。初始剂量可以大于1mg/kg，且其他的或随后的剂量可以低于或者可以小于1mg/kg。
可以将抗体以每次给药小于1mg/kg的多次给药施用至气道或呼吸道。可以将抗体以每次给药小于1mg/kg的多次给药经鼻内或经由吸入进行施用。在这一方面，多次给药可以间隔至少2小时施用，并且在假定感染、暴露或者显现出临床症状后至多72小时或更晚。因此，抗体剂量可以间隔数分钟或数小时或数天施用。抗体剂量可以在感染后或假定感染或暴露后间隔数小时或数天施用。抗体剂量可以在感染后或假定感染或暴露后在至多2、4、6、8、12、24、36、48或72小时后施用。
本发明的给药方案或方法可以特别地包括将抗体具体地通过抗体的吸入或鼻内给药而施用至气道或呼吸道的第一给药，与其结合或在其之后，不经由吸入或鼻内路径，例如全身递送如IP或IV给药的第二或者一次或多次其他给药。因此，方法可以包括病毒特异性单克隆抗体的另外的IP或IV给药，其中另外施用的抗体是中和或非中和抗体。另外IP或IV施用的抗体可以是与IN或经由吸入施用相同的抗体，或者可以是与IN或经由吸入施用不同的或改变的抗体。例如经由IP或IV另外施用的抗体可以在IN或吸入施用抗体的同时、相继地或随后给药。任何这样的随后的给药可以是数小时后，可以是2、4、6、8、12或至多24小时后。随后的给药可以是数天后，可以是1天、2天或3天后。随后的给药可以是数天后，可以是至多7天后、1周后或数周后。随后的给药可以是在数小时和/或数天和/或数周后的单一给药或多次给药。
在另一方面，本发明提供一种用于施用针对呼吸道病毒特别是流感病毒的单克隆抗体的方案，其包括施用第一鼻内或吸入剂量的中和抗体，随后或同时施用第二剂量或者一个或多个其他剂量的不施用至呼吸道并可以腹膜内或静脉内给药的抗体，其中第二剂量或其他剂量的抗体是与第一剂量的抗体相同或不同的抗体。第二剂量或其他剂量的抗体可以是改变的或修饰的抗体，其改变或修饰成更加起作用或有效力IV或IP。在一个方面，第一剂量的抗体可以缺少效应子功能，例如Fab抗体，且第二剂量的抗体可以具有效应子功能，具有Fc，或者可以修饰成具有提高的效应子功能。
该方案可以包括多剂量的经由吸入或鼻内路径的抗体，并且可以包括多剂量的经由IP或IV路径的相同的或另外可选的抗体。在方案的一个方面，可以监测被施用抗体的受试者或患者的例如疾病或病毒感染的临床显现，并且剂量或多剂量可以改变、降低或提高或者更紧密或间隔更大地给药，其取决于患者或受试者以及感染或疾病的状态。
在方案的一个方面，呼吸道疾病可以是流感病毒，并且可以是甲型流感或乙型流感或者是未知的或不确定的流感病毒。不施用至呼吸道的第二剂量的抗体可以是中和或非中和抗体，并且可以具有效应子功能或提高的效应子功能。
在方案的一个方面，第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，小于0.5mg/kg，小于0.1mg/kg。第二或其他的IP或IV剂量特别地以高于第一鼻内或吸入剂量的剂量给药。第二或其他的IP或IV剂量特别地以比第一鼻内或吸入剂量高至少10倍量的抗体剂量给药。第二或其他的IP或IV剂量可以是至少1mg/kg，至少5mg/kg，至少10mg/kg，至少15mg/kg，或者高于10mg/kg，或高于20mg/kg，或高于50mg/kg。
在方案的其他方面，第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，并且第二IP或IV剂量比第一鼻内剂量高至少10倍mg/kg。在方案的其他方面，第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，并且第二IP或IV剂量以mg/kg计比第一鼻内剂量高至少50倍。在其他的方面，第一鼻内或吸入剂量可以小于0.5mg/kg，并且第二IP或IV剂量为至少5mg/kg。
第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，并在假定感染、暴露或显现出临床症状后24小时内给药。第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，并在假定感染、暴露或显现出临床症状后48小时内给药。第一鼻内或吸入剂量可以小于1mg/kg，并在假定感染、暴露或显现出临床症状后72小时内给药。
本发明的另一方面是用于抑制呼吸道病毒的传播的方法，其包括以1mg/kg或更低的单一单位剂量将病毒中和抗体经鼻内或经吸入施用至暴露于呼吸道病毒、处于呼吸道病毒暴露风险中或者表现出呼吸道病毒感染临床体征的受试者。单一单位剂量可以小于10mg/kg，或小于1mg/kg。方法的单一单位剂量可以小于0.5mg/kg，或者小于0.1mg/kg，或者小于0.05mg/kg。
病毒具体地可以是流感病毒，可以是甲型或乙型流感病毒或者是未知的或未确定的流感病毒，且抗体可以是IgG抗体。
上述方法的病毒中和抗体可以在假定感染、暴露或显现出临床症状后48小时内给药。病毒中和抗体可以在假定感染、暴露或显现出临床症状后24小时内给药。病毒中和抗体可以在假定感染、暴露或显现出临床症状后12小时内给药。病毒中和抗体可以在假定感染、暴露或者显现出临床症状后的24小时后并在72小时以内给药。病毒中和抗体可以在最初显现临床症状时或其之后给药。
根据用于抑制传播的方法，可以将抗体以小于0.5mg/kg的剂量、以小于0.1mg/kg的剂量、以小于0.05mg/kg的剂量给药。
基于对以下参考示例性附图而进行的描述的综述，其他目的和优势对本领域技术人员来说将是明显的。
附图说明
图1.中和和非中和MAb在感染后IP是有效的。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒(小鼠适应的A/维多利亚/361/2011，以下称作Vic/11MA)，并在感染后24小时(24hpi)用10mg/kgIP的各所示抗体—6P15、1P19、1K17(均为非中和)和CA8020(中和)—以及作为对照的PBS或无病毒进行处理。感染后每天监测动物的体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图2.中和和非中和MAb的IP递送在预防上是有效的。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒VIC/11MA，在感染之前1小时(-1hpi)用10mg/kgIP各所示抗体—1K17、1P19、1H16(均为非中和)和CA8020(中和)—以及PBS或同种型对照抗体对照进行处理。感染后每天监测动物(每组10只动物)的体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图3.IV或IP施用的抗体表现出相似的效力。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒VIC/11MA，在感染后1小时(1hpi)用10mg/kg的抗体CA8020IP或IV以及作为对照的PBS进行处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图4示出中和和非中和抗体的鼻内(IN)给药与腹膜内(IP)给药的比较。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒VIC/11MA，24hpi时用10mg/kg的中和性抗体CA8020IN或IP，或者用非中和抗体6P15IN或IP，用作为对照的PBS进行处理。当施用中和MabIN时，与IP施用相同剂量的相同抗体相比较，治疗效力增加。与此对比，当施用非中和MabIN时，与相同剂量的IP相比较，治疗效力降低。感染后每天监测动物的体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图5提供CA6261抗体的抗体片段Fab在针对H1病毒的治疗效力方面对IN与IP给药进行比较的结果。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒，24hpi时用IN或IP给药的10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg中和CA6261Fab，以及作为对照的PBS处理和无病毒进行处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。所有剂量的IN给药FabCA6261抗体均表现出比任何IP剂量更高的效力。中和FabIP给药即使在最高剂量10mg/kg下也未表现出可检测的效力。
图6提供CA8020抗体的Fab与非中和6P15的Fb的IN给药在针对H3病毒治疗效力方面的比较结果。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒，24hpi时用10mg/kg的中和CA8020Fab、非中和6P15Fab，或者针对H1病毒的Fab，以及作为对照的无病毒进行IN处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。IN给药的FabCA8020抗体表现出效力，但Fab6P15没有。
图7示出在可比较的剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP给药的相同Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒(A/波多黎各/8/1934)，24hpi时用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg中和CA6261Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图8示出在可比较的剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP给药的相同Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒，24hpi时用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA8020Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图9示出在可比较的剂量下的IN和IP的比较，表明当在48hpi给药时，MabIN比IP给药的相同Mab效力仍高出10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒，在48hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA6261Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图10示出超低IN剂量能够提供保护。在8hpiIN施用的CA8020抗体在低至0.005mg/kg的剂量下可针对10LD50的H3病毒进行保护。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒，在8hpi用0.1mg/kg、0.05mg/kg、0.01mg/kg和0.005mg/kg的中和CA8020Mab进行IN处理，在8hpi时用0.1mg/kg的CA8020Mab进行IP处理，以PBS和无病毒作为对照。0.1mg/kg的IP剂量与PBS相当，没有表现出作用。所有剂量IN均表现出效力。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图11示出中性抗体的反复超低给药的效力研究。将动物接种以10XLD50的H3流感病毒，在8hpi、32hpi并再次在56hpi用CA8020Mab的反复IN给药进行处理。反复给药以每次给药0.005mg/kg和0.001mg/kg的中和CA8020Mab进行，以PBS和无病毒作为对照。两种反复给药方案均表现出效力。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图12示出鼻内与全身给药途径的模型。在全身给药的情况下(包括IP和IV给药)，病毒的清除主要通过底外侧的效应子功能(EF)而介导，而在施用至气道的情况下(包括鼻内和吸入给药)，主要通过暴露于气道的顶侧的中和而进行。
图13A-13D示出使用示例性抗体CA6261进行的单独IN或IP给药与IN和IP路径联合给药的抗体给药研究。2mg/kg的总抗体给药剂量示于A和B中，在A中IN基线为0.3mg/kg，在B中IN给药为0.1mg/kg。5mg/kg的总给药示于C和D中，在C中IN基线为0.3mg/kg，在D中IN给药为0.1mg/kg。在所有情况中，IN加IP给药均远远优于单独的IP，并且相对于单独的IN有所提高。施用0.3mg/kgCA6261IN加1.7mg/kgIP，或者0.3mg/kgCA6261加4.7mg/kgIP基本上没有表现出病毒感染效果，与无病毒相当。
图14提供6F12抗体的IN与IP给药在针对H1病毒的治疗效力方面的比较结果。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒PR8，在24hpi用IN或IP施用的10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的6F12，以及作为对照的PBS和无病毒进行处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。IN施用的相当剂量的Mab6F12抗体表现出比相当的IP剂量更高的效力。以1mg/kg剂量在24hpiIN施用的6F12保护动物完全免受感染。
图15示出在相当剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP施用的相同的Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒(A/波多黎各/8/1934)，在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和GG3Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图16示出在相当剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP施用的相同的Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒(A/波多黎各/8/1934)，在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA9114Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图17示出在相当剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP施用的相同的Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒(A/加利福尼亚/07/09-小鼠适应的)，在24hpi用10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的中和CA6261Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图18示出在相当剂量下的IN和IP的比较，并表明MabIN比IP施用的相同的Mab效力高10至100倍。将动物接种以10XLD50的H1流感病毒(A/波多黎各/8/1934)，在72hpi用20mg/kg、10mg/kg和5mg/kg的中和CA6261Mab，以及作为对照的PBS和无病毒进行IN或IP处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图19示出以10XLD50的H3病毒(维多利亚/11)接种，在24hpi单独的IN或IP给药与IN和IP路径的抗体CA8020或6P15的联合给药的联合给药研究。施用0.6mg/kg的总给药剂量，0.5mg/kgIP，0.1mg/kgIN。在两种情况中，用中和抗体的IN给药均优于非中和抗体的IN给药。
图20示出以乙型流感病毒(B/马来西亚)接种，在24hpiIN和IP施用不同剂量的CA9114抗体。CA9114抗体以10mg/kg、1mg/kg或0.1mg/kgIN或IP给药。抗体CA8020和无病毒示为对照。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图21提供在小鼠中用乙型流感病毒(B/佛罗里达)进行的研究，以评价一系列针对乙型流感的抗体的效力。所有抗体均在接种10XLD50的乙型流感病毒的24hpi以1mg/kgIN给药。测试的抗体为所示的43K16、59G1、112A22、11G23、114O22、CA9114和40J7。PBS和无病毒示为对照。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图22显示出针对乙型流感的不同抗体，以测试其针对B/马来西亚病毒的效力。所有抗体均在接种10XLD50的B病毒的24hpi以1mg/kgIN给药。测试的抗体为43K16、59G1、112A22、114G23、114O22和CA9114。对照为同种型对照Mab、PBS和无病毒。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图23提供在接种B/马来西亚病毒的8hpi施用不同的乙型流感抗体的动物效力研究。所有的抗体均在接种10XLD50病毒的8hpi以1mg/kg给药。测试的抗体为CA9114、54H5、110C16、43K16、59G1、114G23、43J23、112A22、58O8、55K6、114D22和40J7。对照为PBS和无病毒。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图24示出使用包含H1抗体、H3抗体和乙型流感病毒抗体的混合抗体(cocktail)进行的动物效力研究。混合抗体使用H1抗体GG3、H3抗体CA8020和B抗体43J23。在混合抗体中，各种抗体在接种10xLD50的B/佛罗里达(山形乙型流感病毒)的24hpi以单一50μl体积剂量以1mg/kgIN施用。出于比较，对B抗体43J23针对B/佛罗里达病毒进行单独测试，在24hpiIN施用1mg/kg的43J23。在接种B/佛罗里达的24hpi以1mg/kgIP施用CA9114抗体。使用PBS和无病毒作为对照。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图25提供使用包含H1抗体GG3、H3抗体CA8020和乙型流感病毒抗体43J23的混合抗体进行的动物效力研究。在用B/马来西亚病毒感染后24小时(24hpi)IN施用1mg/kg的每种抗体。出于比较，对B抗体43J23针对B/马来西亚病毒进行单独测试，在24hpiIN施用1mg/kg的43J23，并且在B/马来西亚的24hpi以1mg/kgIP施用CA9114抗体。使用PBS和无病毒作为对照。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图26示出在接种甲型流感H1病毒PR8的24hpi各自均以1mg/kg联合鼻内施用混合抗体(H1抗体GG3、H3抗体CA8020和乙型流感病毒抗体43J23)的效力，总共为在50μl中的3mg/kg抗体。将混合抗体与单独的INGG3抗体、IP施用的抗体CA6261以及PBS进行比较。感染后每天监测动物体重，监测14天，将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图27提供针对H3病毒Vic/11的组合抗体混合物的研究。将抗体GG3、CA8020和43J23在混合抗体中分别以1mg/kg在24hpi给药。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。在该研究中比较以1mg/kgIN或IP单独施用的抗体CA8020以及PBS。
图28显示出在用甲型流感H1亚型病毒、甲型流感H3亚型病毒、B(山形)病毒和B(维多利亚)病毒的每一种感染之后，在24hpi给药的流感抗体GG3、CA8020和43J23的混合抗体(混合抗体中每种抗体为1mg/kg，所有抗体共计3mg/kg)与PBS的结果。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。三种抗体的混合物对于所有测试的病毒均有效，特别是H1、H3、B(Yam)和B(Vic)病毒中的每一种及全部。
图29示出对三种抗体的混合物在保护小鼠免受流感亚型中的评价，使用体重作为死亡替代指标。将小鼠用10XLD50的甲型流感H1或H3亚型或者来自山形或维多利亚谱系的乙型流感病毒处理，并在处理24小时后(24hpi)用由三种抗体，即各自均为1mg/kg的抗体5A7、CA6261和CA8020组成的通用流感混合抗体处理。三种抗体混合物针对任何测试的病毒，即H1、H3、B(Yam)和B(Vic)病毒感染均有效。
图30示出感染后24小时用抗体TRL579(Mab579)治疗H3亚型流感病毒。在24hpi将抗体579以1mg/kgIN给药，或者在感染10XLD50的H3Vic11病毒后24小时以10mg/kgIP给药。对照为PBS和无病毒。感染后每天监测动物(每组5只小鼠)体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图31示出在感染后24小时用抗体TRL53(Mab53)治疗H1流感病毒。在24hpi以1mg/kgIN施用抗体53，或者在用10XLD50的H1Cal09病毒感染之后24小时以10mg/kgIP给药。对照为PBS和无病毒。感染后每天监测动物(每组5只小鼠)体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图32示出在用病毒感染之前的3或4天预防性地IN和IP给药的研究。在用3XLD50的H1流感病毒A/波多黎各/8/1934(称作PR8)攻击之前的3或4天，IN或IP施用抗体CA6261。用H1流感病毒攻击，在感染之前3天(-3dpi)或感染之前4天(-4dpi)，IN(0.1mg/kg)或IP(0.1mg/kg和1mg/kg)施用CA6261抗体。对照为无病毒和无处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图33示出在病毒感染之前的5、6或7天预防性地IN和IP给药的研究。在用3XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前的5、6或7天，IP(以1mg/kg)或IN(以0.1mg/kg)施用抗体CA6261。对照为达菲(口服施用10mg/kg，1天两次，5天)、无处理和无病毒。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图34示出在病毒感染之前的5、6或7天预防性地IN和IP给药的研究。在用3XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前的5、6或7天，IP(以1mg/kg)或IN(以1mg/kg)施用抗体CA6261。对照为达菲(口服施用10mg/kg，1天两次，5天)、无处理和无病毒。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图35示出在病毒感染之前的3或4天预防性地IN和IP给药的研究，病毒攻击在较高剂量的10XLD50。在用10XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前的3或4天，以0.1mg/kgIN或IP施用抗体CA6261。对照为无病毒和无处理。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图36示出病毒感染之前的5、6或7天预防性地IN和IP给药的研究，病毒攻击在较高剂量的10XLD50。在用10XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前的5、6或7天，IP(以1mg/kg)或IN(以1mg/kg)施用抗体CA6261。对照为达菲(口服施用10mg/kg，1天两次，5天)、无处理和无病毒。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图37示出在接种10XLD50的乙型流感病毒(B/马来西亚/2506/2004)后的24hpi，IN施用抗体5A7、CR8033和mAb809。各种乙型流感抗体以1mg/kgIN施用。PBS示为对照。感染后每天监测动物体重，监测14天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
图38示出在接种10XLD50的乙型流感病毒(B/佛罗里达/05/2006)后的24hpi，IN施用抗体5A7、CR8033和mAb809。各种乙型流感抗体以1mg/kgIN施用。PBS示为对照。感染后每天监测动物体重，监测7天，并将体重相对于初始第0天体重的百分比进行作图。
具体实施方式
根据本发明，可以采用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中得以充分解释。参见，例如，Sambrook等人,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(1989)；"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-III[Ausubel,R.M.,编辑(1994)]；"CellBiology:ALaboratoryHandbook"VolumesI-III[J.E.Celis,编辑(1994))]；"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-III[Coligan,J.E.,编辑(1994)]；"OligonucleotideSynthesis"(M.J.Gait编辑1984)；"NucleicAcidHybridization"[B.D.Hames&S.J.Higgins编辑(1985)]；"TranscriptionAndTranslation"[B.D.Hames&S.J.Higgins,编辑(1984)]；"AnimalCellCulture"[R.I.Freshney,编辑(1986)]；"ImmobilizedCellsAndEnzymes"[IRLPress,(1986)]；B.Perbal,"APracticalGuideToMolecularCloning"(1984)。
因此，如果在本文中出现，以下术语将具有下述定义。
本文使用和提及的抗体包括具有所报道并为公众知晓的氨基酸序列的那些抗体，包括具有对已知或公开的氨基酸序列的修饰、并且保持或表现出基本上相当的活性(包括目标中和或识别以及结合活性)的抗体、蛋白、多肽。因此，也同样考虑表现出基本上相同的或改变的活性的蛋白。这些修饰可以是有意的，例如，通过定点诱变获得，或者可以是意外的，例如通过在作为复合物或其所称亚基的产生者的宿主中的突变而获得的那些。抗体意在在其范围内包括在本文具体描述的蛋白以及所有基本上同源的类似物和等位基因变体。
以下是各种氨基酸分组的例子：具有非极性R基团的氨基酸：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸；具有不带电的极性R基团的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；具有带电的极性R基团的氨基酸(在pH6.0为带负电)：天冬氨酸、谷氨酸；碱性氨基酸(在pH6.0为带正电)：赖氨酸、精氨酸、组氨酸(在pH6.0)；另一分组可以是带苯环的氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸。
另一分类可以根据分子量(即，R基团的大小)；
特别优选的替换为：
-Lys换成Arg，以及反过来，使得可以保持正电荷；
-Glu换成Asp，以及反过来，使得可以保持负电荷；
-Ser换成Thr，使得可以保持游离-OH；和
-Gln换成Asn，使得可以保持游离NH2。
另外可以引入氨基酸替换，以替换具有特别优选的特性的氨基酸。例如，可以将Cys引入到与另一Cys形成二硫键的潜在位点。His可以特别地作为“催化”位点而引入(即，His可以起到酸或碱的作用，是生化催化中最常见的氨基酸)。可以引入Pro，由于其特别的平面结构，其诱导蛋白结构中的翻转。
当至少约70％的氨基酸残基(优选至少约80％、最优选至少约90％或95％)是相同或代表保守替换时，两个氨基酸序列是“基本上同源的”。
对根据本发明的应用或用途使用的抗体进行编码的核酸可以用于制备和/或制造用于本发明的抗体或其活性片段。包含这些核酸的载体可以用于表达或分离抗体，如本文所提供或使用的。
“复制子”是作为体内DNA复制的自主元件；即，能够在其控制下进行复制的任何基因元件(例如，质粒、染色体、病毒)。
“载体”是复制子，例如，质粒、噬菌体或粘粒，另一DNA链可以与其连接，以引起所连接链的复制。
“DNA分子”是指其单链形式或双链螺旋的脱氧核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式。该术语仅指分子的一级和二级结构，并非将其限于任何特定的三级形式。因此，该术语包括在线性DNA分子(例如，限制性酶切片段)、病毒、质粒和染色体等中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，可以在此根据正常惯例对序列加以描述，即仅给出沿着DNA的非转录链(即，具有与mRNA相应的序列的链)在5’至3’方向上的序列。
“复制来源”是指参与DNA合成的那些DNA序列。
DNA“编码序列”是当置于适当的调节序列的控制下时在体内转录并翻译成多肽的双链DNA序列。编码序列的边界由5’(氨基)端的起始密码子和3’(羧基)端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括，但不限于，原核序列、来自真核生物mRNA的cDNA、来自真核生物(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，乃至合成的DNA序列。聚腺苷酸化信号和转录终止序列通常位于编码的3’处。
转录和翻译控制序列是DNA调节序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子等，其在宿主细胞中提供编码序列的表达。
“启动子序列”是能够在细胞中与RNA聚合酶结合并引发下游(3’方向)编码序列的转录的DNA调节区。出于定义本发明的目的，启动子序列在其3’端以转录起始位点为界，并向上游(5’方向)延伸，以包括以背景之上可检测的水平起始转录而必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(方便地通过用核酸酶S1定位绘图而界定)，以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白结合结构域(共有序列)。真核启动子将常常，但不总是，含有“TATA”框和“CAT”框。原核启动子除-10和-35共有序列以外，还含有SD序列。
“表达控制序列”是控制并调节另一DNA序列的转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA(mRNA在之后翻译成由编码序列编码的蛋白)时，编码序列“处于”细胞中转录和翻译控制序列的“控制下”。
当这些DNA已经引入到细胞内部时，细胞已被外源或异源DNA所“转化”。转化DNA可以整合(共价连接)或不整合到构成细胞基因组的染色体组DNA中。在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，例如，转化DNA可以保持在游离型(episomal)元件例如质粒上。对于真核细胞，稳定转化的细胞是转化DNA已经整合到染色体中从而其可以通过染色体复制由子细胞继承的细胞。这种稳定性通过真核细胞建立由含有转化DNA的子细胞群组成的细胞系或克隆而进行表明。“克隆”是由单细胞或共同祖先通过有丝***得到的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
当至少约75％(优选至少约80％，最优选至少约90％或95％)的核苷酸在限定长度的DNA序列上匹配时，两个DNA序列是“基本上同源的”。通过使用序列数据库中可得的标准软件进行序列比较，或者在例如对特定***限定的严格条件下进行DNA印迹杂交实验，可以识别出基本上同源的序列。限定适当的杂交条件在本领域技术范围内。参见，例如，Maniatis等人,同上；DNACloning,Vols.I&II,同上；NucleicAcidHybridization,同上。
应当认识到，也在本发明的范围内的是，本发明的或在本发明中使用的编码抗体的DNA序列，其编码具有相同氨基酸序列抗体、多肽或其活性片段，但对于原始或已知编码序列为简并的。“简并”是指不同的三联密码子用来指定特定的氨基酸。在本领域公知的是，以下密码子可以互换地用于编码各个特定氨基酸：
苯丙氨酸(Phe或F)UUU或UUC
亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG
异亮氨酸(Ile或I)AUU或AUC或AUA
甲硫氨酸(Met或M)AUG
缬氨酸(Val或V)GUU或GUC或GUA或GUG
丝氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC
脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG
苏氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG
丙氨酸(Ala或A)GCU或GCG或GCA或GCG
酪氨酸(Tyr或Y)UAU或UAC
组氨酸(His或H)CAU或CAC
谷氨酰胺(Gln或Q)CAA或CAG
天冬酰胺(Asn或N)AAU或AAC
赖氨酸(Lys或K)AAA或AAG
天冬氨酸(Asp或D)GAU或GAC
谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG
半胱氨酸(Cys或C)UGU或UGC
精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG
甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG
色氨酸(Trp或W)UGG
终止密码子UAA(赭石)或UAG(琥珀)或UGA(蛋白石)
应当理解到，以上指出的密码子是对于RNA序列。对于DNA的相应密码子用T来替换U。
突变可以在抗体或活性片段的编码序列上进行，使得特定的密码子变成编码不同氨基酸的密码子。这样的突变通常通过进行尽可能最少的核苷酸变化而进行。可以进行该类型的替换突变，以非保守的方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特性的氨基酸分组的氨基酸改变到属于另一分组的氨基酸)，或者以保守的方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特性的氨基酸分组的氨基酸改变成属于同一分组的氨基酸)，改变所产生的蛋白中的氨基酸。这种保守改变通常引起所得蛋白的结构和功能的较少变化。非保守变化更可能改变所产生蛋白的结构、活性或功能。本发明应当考虑包括含有不显著改变所产生蛋白的活性或结合特性的保守变化的序列。
如上所述，编码抗体、多肽或其活性片段的DNA序列可以合成制备，而不是克隆制备。可以用对于抗体或片段的氨基酸序列适当的密码子设计DNA序列。通常，如果序列将用于表达，人们将会选择对于既定宿主来说优选的密码子。完整的序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装，并组装成完整的编码序列。参见，例如，Edge,Nature,292:756(1981)；Nambair等人,Science,223:1299(1984)；Jay等人,J.Biol.Chem.,259:6311(1984)。合成的DNA序列使得方便地构建表达类似物或“突变蛋白”的基因。另外可选地，编码突变蛋白的DNA可以通过内生基因或cDNA的定点诱变而产生，且突变蛋白可以通过使用常规的多肽合成而直接产生。
DNA构建体的“异源”区是在较大DNA分子内的在天然界未发现与该较大分子有关的可识别的DNA链段。因此，当异源区编码哺乳动物基因时，基因将通常位于与来源有机体基因组中不在哺乳动物基因组DNA侧边的DNA的侧边。异源性编码序列的另一例子是构建体，在该构建体中，编码序列本身未在天然界中发现(例如，cDNA，其基因组编码序列含有内含子，或者具有与内生基因不同的密码子的序列)。等位基因变化或天然突变事件不会产生本文所定义的DNA的异源区。
DNA序列在表达控制序列控制并调节该DNA序列的转录和翻译时与表达控制序列“可操作地连接”。术语“可操作地连接”包括在要表达的DNA序列前具有适当的起始信号(例如，ATG)，并保持正确的阅读框，以使得DNA序列在表达控制序列的控制下得以表达，并产生由DNA序列编码的所需产物。如果希望***到重组DNA分子中的基因不含适当的起始信号，这样的起始信号可以***到基因的前面。
术语“标准杂交条件”是指盐和温度条件基本上等同于5xSSC和65℃，以用于杂交和洗涤。但是，本领域技术人员将会意识到，这样的“标准杂交条件”取决于特定的条件，包括缓冲液中钠和镁的浓度、核苷酸序列的长度和浓度、错配百分比、甲酰胺百分比等。在确定“标准杂交条件”时另外重要的一点是，杂交的两个序列是RNA-RNA、DNA-DNA还是RNA-DNA。这些标准杂交条件可以由本领域技术人员很容易地根据公知的公式而确定，其中杂交通常低于预计或确定的Tm10-20NC，且洗涤更加严格，如果需要的话。
在其主要的方面，本发明涉及新方法、方案和手段的识别，以通过将中和抗体施用至气道或消化道，例如通过鼻内或吸入施用中和抗体来有效治疗和预防病毒感染，具体包括流感病毒。中和抗体，特别是流感病毒中和抗体的鼻内或吸入给药比另外可选的给药方式例如IP给药在治疗上或预防上更加有效地治疗或阻断病毒。在其主要方面，本发明涉及识别新的方法和手段，其通过中和抗体的鼻内给药而有效治疗和预防病毒感染，具体包括流感病毒。比起相同量的相同抗体的全身给药(IV或IP)，较低剂量的吸入和/或鼻内递送和给药要更加优越、更为有效力和起作用。在病毒暴露或感染之前或乃至之后用IN递送的抗体治疗或预防是有效的。
将鼻内的抗体给药与IP的抗体给药结合的方法或方案在治疗上或预防上针对病毒特别是流感病毒特别有效。这些方法或方案包括，其中一种或多种鼻内或吸入给药的抗体与一种或多种IP或IV给药的抗体结合。鼻内或吸入给药可以在IP或IV给药之前、之后、同时或相继施用。可以施用一个或多个鼻内、吸入、IP或IV剂量。鼻内施用的抗体可以是缺少Fc或效应子功能的抗体片段，例如Fab，而IP施用的抗体可以具有效应子功能或提高的效应子功能。
根据本发明，将中和抗体施用至气道或呼吸道，用于提高针对病毒特别是流感病毒的效力。施用至气道或呼吸道可以通过任何公认或已知的方式，且可以包括吸入给药或鼻内给药。为提高有效性，将中和抗体施用至一种或多种的上呼吸道和下呼吸道，并且可以包括鼻腔、鼻、鼻窦、喉咙、咽、喉、气管、支气管和肺。
吸入是指摄入，特别是在摄入或者施用/被施用药剂或化合物包括抗体或其活性片段或包含这些的组合物的背景下，由此药剂、化合物、抗体、片段，包括包含在组合物中的，被递送至呼吸道。呼吸道可以包括上呼吸道和、或、和/或下呼吸道。上呼吸道包括鼻、鼻腔、鼻窦、喉、气管。下呼吸道包括肺、气道(支气管和细支气管)和气囊(肺泡)。吸入可以经由鼻或经由嘴、或者如在气管内给药中那样经由直接施用下呼吸道而进行。因此，吸入可以包括仅仅或主要地鼻、鼻内、经由嘴吸入、口腔吸入、气管内吸入、气管滴注。因此，吸入提供并考虑任何给药方式，由此药物、药剂、组合物、抗体、片段专有地、特异性地或偏好地到达呼吸道或沉积于其上或其中，包括上和/或下呼吸道。
如本文所用，术语鼻内包括，但不限于，在鼻或鼻结构内或经由其的给药、施用或发生。如本文所用并在实施例中作为实施方式例示，术语鼻内并不意在限制于或暗示限制于直接地或特异性地或仅仅经由鼻或鼻腔给药，特别是无意于排除其他的给药方式，由此药物、药剂、抗体、片段、组合物递送至或以其他方式提供至呼吸道，沉积在呼吸道中或其上或者以其他方式分布于呼吸道。
用于施用或递送至呼吸道或气道的装置在本领域以及在临床或医学实践中是已知和公认的，并且可以应用于本发明的方法、方案和组合物。装置包括计量剂量吸入器、计量喷雾泵、手持球(hand-bulb)雾化器、小或大体积喷雾器、超声喷雾器和干粉吸入器。
本发明在特别是靶向、侵染或感染呼吸道的致病因子或病原体的治疗或预防中具有应用和用途。因此，本发明在呼吸道感染特别是呼吸道病毒以及与呼吸道疾病相关或有因果关系的致病因子的治疗或预防中具有应用和用途。常见的病毒性呼吸道疾病是由多种具有类似特性并感染上呼吸道的病毒造成的疾病。涉及的病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、副流感病毒和呼吸道腺病毒。副流感病毒是年幼儿童中义膜性喉炎的主要原因，可以导致支气管炎、肺炎和细支气管炎。腺病毒主要侵袭呼吸道和胃肠道，以及眼结膜。腺病毒可以导致从咽炎到肺炎、结膜炎和腹泻的许多种疾病。症状可以在暴露于病毒后的1-10天出现。
抗体的用于治疗或减轻病状(癌症、炎性疾病、抗病毒和抗感染)的临床给药已经排外地使用全身给药，通常为IV给药，其要求大而昂贵的抗体的量、医学人士的辅助以及大量的给药时间(通常IV给药为2小时)。尽管可以提及其他的给药方式，例如鼻内，特别是在涉及这些抗体的患者或应用中，鼻内给药最多被视为是相当的替代方式，完全被忽略，或不被推行，可能是因为对它的了解较少，认为其不太有吸引力或者不太有效，且被视作是间接调用免疫***，或者不如IP或IV给药路径直接。但是，本发明以及在此提供的出色研究表明，鼻内给药实际上是优选的并且是更为有效的替代方式，特别是对于中和抗体来说。具体地，可以在初始病原体侵入或暴露的位点或位置处在鼻内发挥作用的中和抗体比起另外可选的给药方式更加有效。
因此，根据本发明，与全身路径例如IV或IP路径相比较，抗体的鼻内递送在效力方面提供明显和显著的提高。而且，中和性的抗体表现出提高的鼻内效力。非中和抗体，特别是使用公认或已知的中和或病毒阻断检验时没有表现出呼吸道致病因子或病毒特别是流感病毒的直接抑制或阻断的抗体，在鼻内递送时相对于全身或IP给药表现出受损的效力。当前的研究说明，使用公认且已知的流感小鼠模型，与腹膜内(IP)或静脉内(IV)递送路径相比较，中和抗体的鼻内(IN)递送可以将治疗和预防效力大大地增加10倍多。当以IN代替IV或IP路径施用时，使用少于相同剂量的十分之一便可以实现相当的效力。鼻内给药的中和抗体可以以数个数量级大大增加治疗效力。鼻内给药的中和抗体可以最少10-100倍地大大增加治疗效力。与同一抗体在类似条件下的腹膜内(IP)给药相比较，鼻内给药的中和抗体可以将治疗效力大大增加至少10倍、至少50倍、多于10倍、多于50倍、多于100倍、多至100倍。中和抗体的鼻内给药对感染特别是包括流感感染的预防和治疗提供出人意料的新方法。IN给药现在可以有效地实施，并且与其他的给药形式结合，以提供更加有效且成本更低的治疗和预防方法。
在本领域定义或公认并且在本文中提及和使用的抗体介导的病毒中和可以以多种检验进行测试。中和检验的例子包括基于抑制对培养细胞的病毒致细胞病变效应(CPE)的常规中和检验。例如，流感中和可以通过降低或阻断感染流感的MDCK细胞中的CPE形成而进行测试。可以将病毒和中和剂在加入到细胞中之前预混，然后测量病毒进入的阻断。血凝素抑制(HI)可以在体外测试，并且可以检测病毒与红血球结合的能力的阻断。示例性的已知并接受的中和检验提供在WHO动物流感手册中(who/cds/csr/ncs/2002.5,第48-54页)。阻断唾液酸受体结合位点的抗体将中和病毒与细胞的结合，从而阻断感染。相反地，中和检验可以检测病毒外出的阻断，如在神经氨酸苷酶抑制剂如达菲的情况下那样。最近，已经识别出中和抗体以类似方式通过防止病毒外出而发挥作用，该中和的例子包括乙型流感病毒上的CR9114抗体(Dreyfus等人,(2012)Science337:1343-1348)。另外，利用微中和检验，其中使用微滴定板结合ELISA在感染细胞中检测病毒核蛋白(NP)。已经描述了定量PCR检验测量病毒蛋白(DreyfusC等人,(2012)EmergingInfDiseases19(10:1685-1687))。
非中和抗体是不表现出与感染细胞上的病毒或病毒靶标的任何直接相互作用或结合的抗体，这可以解读为非中和的。非中和抗体可以与病毒结合，但在任何上述或公认的中和检验中不中和或抑制病毒或病毒复制。非中和抗体可以与病毒中的保守蛋白或蛋白上的表位结合。例如，在临床试验中的M2抗体TCN-032可以与范围很宽的甲型流感病毒结合，但是在常规的中和检验中不表现出中和。类似地，可以识别出与HA结合的不中和抗体。
我们已经识别出非中和的、但是广泛地对HA有反应性的抗体。这些包括抗体6P15、1P19和1K17，其在包括CPE抑制、HI、微中和以及空斑减数检验的中和检验中呈阴性。如本文在实施例中所说明的，这些抗体以鼻内给药时相对于腹膜内给药并没有表现出提高的治疗效力。
在本发明的一个方面，病毒结合抗体或其结合片段，尤其是其中抗体或片段是中和的，可以与药剂或药物组合，形成用于呼吸道或气道给药包括吸入或鼻内给药的用于本发明的抗体-药物或抗体-药剂缀合物。与抗体或片段结合或缀合的药物或药剂可以是病毒中和药物或药剂。
在另一特定方面，中和抗体IN与抗体IP或IV给药的联合或连续给药为病毒感染的治疗和/或预防提供有效和提高的协同方式。全身给药包括IP或IV的抗体可以是中和的或非中和的，从而可以是与IN给药相同的抗体，或者可以是修饰的抗体、或不同的抗体。因此，用于鼻内递送的抗体(中和抗体)可以是与其联合使用的用于经由其他方式递送，特别是全身递送(包括IP或IV递送)的抗体有区别的或不同的抗体。
本发明表明，对于鼻内提高的效力来说，中和抗体的Fc功能和Fc部分，以及由此的效应子功能，不是所需的。因此，抗体和片段例如Fab片段或者缺少Fc或缺少效应子功能的抗体是鼻内有效的。相反地，抗体(中和或非中和)的Fab片段或者缺少Fc或缺少效应子功能的抗体是IP或IV无效的。
抗体
术语“抗体”描述的是免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或全部合成产生的。该术语还涵盖任何具有为抗体结合结构域或与其同源的结合结构域的多肽或蛋白。该术语还考虑CDR移植的抗体。“抗体”是任何免疫球蛋白，包括与特定表位结合的抗体或其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后提及者在美国专利第4,816,397和4,816,567号中有进一步详述。术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，通常包含4个全长多肽链，两个重链(H)和两个轻链(L)，或者其等同的Ig同系物(例如，仅包括重链的骆驼纳米抗体)；包括保留Ig分子的必要表位结合特征的其全长功能突变体、变体或衍生物，并包括双重特异性、双特异性、多特异性和双可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可以是任何类别(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。优选的抗体是IgG类别的。还包含在术语“抗体”含义内的是任何“抗体片段”。
“抗体结合位点”是由重链和轻链可变区和高变区组成的特异性地与抗原结合的抗体分子的结构部分。
如本文以其各种语法形式所用的短语“抗体分子”考虑完整的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的免疫活性部分。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同源的抗体群得到的抗体，即，构成群的个体抗体是相同的和/或与相同表位结合，除可能的变异抗体以外，例如含有天然发生的突变或在单克隆抗体制剂的制备过程中产生，这样的变体通常少量存在。单克隆抗体是具有一种能够与特定抗原发生免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此，单克隆抗体通常表现出对于任何与其发生免疫反应的抗原的单一结合亲和力。与通常包含针对不同抗原决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一抗原决定簇。如果单克隆抗体含有具有多个分别对于不同抗原具有免疫特异性的抗体结合位点的抗体分子，其可以是多重特异性的；例如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。修饰语“单克隆”是指抗体从基本上同源的抗体群获得的特性，而不应理解成要求抗体通过任何特定的方法进行制备。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术产生，其包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和使用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，这些方法和制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
“抗体片段”是指并非完整的抗体的包含完整抗体的与完整抗体所结合的抗原结合的部分的分子。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双特异抗体；直链抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。此外，抗体片段包括单链多肽，其具有VH结构域的特性，即能够与VL结构域组装在一起，或者具有VL结构域的特性，即能够与VH结构域组装在一起，成为功能性抗原结合位点，从而提供全长抗体的抗原结合特性。“抗体片段”包括含有至少一个不是全长的多肽链的分子，包括：(i)Fab片段，其是由可变轻(VL)结构域、可变重(VH)结构域、恒定轻(CL)结构域和恒定重1(CH1)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其为包含两个在铰链区通过二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fab(Fd)片段的重链部分，其由VH和CH1结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由单臂抗体的VL和VH结构域组成；(v)结构域抗体(dAb)片段，其包含单个可变结构域(Ward,E.S.等人,Nature341,544-546(1989))；(vi)骆驼抗体；(vii)分离的互补决定区(CDR)；(viii)单链Fv片段，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接头连接，使得两个结构域缔合形成抗原结合位点(Bird等人,Science,242,423-426,1988；Huston等人,PNASUSA,85,5879-5883,1988)；(ix)双特异抗体，其为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用的连接头太短，以至于无法使同一链上的两个结构域之间配对，从而迫使结构域与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点(WO94/13804；P.Holliger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448,(1993))；和(x)直链抗体，其包含一对串联Fv链段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区；(xi)多价抗体片段(scFv二聚体、三聚体和/或四聚体)(PowerandHudson,JImmunol.Methods242:193-2049(2000))；(xii)小抗体，其为由与恒定免疫球蛋白结构域CH3或CH4融合的scFv组成的二价分子，其中恒定结构域CH3或CH4充当二聚结构域(OlafsenT等人,(2004)ProtEngDesSel17(4):315-323；HollingerPandHudsonPJ(2005)NatureBiotech23(9):1126-1136)；和(xiii)重链和/或轻链的其他非全长部分或者其突变体、变体或衍生物，单独的或者任意组合的。单链Fab(scFAb)是已知的，且记载于，包括US20070274985中。
由于抗体可以以多种方式加以修饰，术语“抗体”应当解读成涵盖任何特异性结合构件或物质，其具有具备所需特异性的结合结构域以及根据本文可应用的中和能力。因此，该术语涵盖抗体的抗体片段、衍生物、功能等同物和同源物，包括任何包含免疫球蛋白结合结构域的多肽，无论是天然的还是全合成或部分合成的。因此，包括了含有与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达记载于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美国专利第4,816,397和4,816,567号中。
如本文所用，“Fab片段”是指包含轻链片段(包括轻链(CL)的VL结构域和恒定结构域)以及重链的VH结构域和第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。抗体分子的Fab和F(ab')2部分可以通过公知的方法在基本完整的抗体分子上分别通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反应而制备，或者可以合成制备或重组制备。Fab'抗体分子部分也是公知的，且可以由F(ab')2部分产生，然后如用巯基乙醇还原连接两个重链部分的二硫键，然后用例如碘代乙酰胺的试剂将产生的蛋白硫醇烷基化。
术语“Fc结构域”在本文中用于定义含有至少一部分恒定区的免疫球蛋白重链的C端区。例如，在天然抗体中，Fc结构域由两个相同的蛋白片段组成，其源自于IgG、IgA和IgD同种型中的抗体两条重链的第二和第三恒定结构域；IgM和IgEFc结构域在各个多肽链中包含三个重链恒定结构域(C.sub.H结构域2-4)。
示例性的抗体分子为完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的含有补位的那些部分，包括在本领域已知为Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)的那些部分，这些部分优选用于在本文所述的治疗方法中。
在本发明教导的某些情形中，一定水平或量的中和活性是抗体使用，特别是用于鼻内或吸入给药所需和必要的特征。因此，根据本发明鼻内使用的任何片段、变体、衍生物、合成或抗体部分均需要保留针对目标病毒或病原体，在一方面为流感病毒的中和能力和活性。另一方面，将会经由另外可选的全身路径包括腹膜内或静脉内给药的抗体必须结合或识别目标病毒或病原体，在一方面为流感病毒，但是，不要求中和性。因此，作为例子，保留中和性的抗体Fab片段可以鼻内使用。经由Fc介导的效应子功能不是鼻内效力和中和所要求的。相反，全身递送的抗体将会大量地通过效应子功能来介导其效力。
术语“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的包含与部分或全部抗原特异性结合并与其互补的区域的部分。当抗原较大时，抗原结合分子可以仅仅与抗原的特定部分结合，该部分称作表位。抗原结合结构域可以通过例如一种或多种抗体可变结构域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。内生抗体的重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有类似的结构，其各个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVS)(参见，例如，Kindt等人,KubyImmunology,6.sup.thed.,W.H.FreemanandCo.,page91(2007))。单个VH或VL结构域可以足以产生抗原结合特异性。而且，可以使用与抗原结合的抗体的VH或VL结构域来分别筛选互补性VL或VH结构域的文库，从而分离与特定抗原结合的抗体。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature352:624-628(1991)。
术语“抗体的抗原结合位点”在本文使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是那些本文定义的除高变区残基以外的可变结构域区。因此，抗体的轻链和重链可变结构域从N-端至C-端包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大并规定抗体特性的区域。抗体可以充分地以其重链和轻链CDR的氨基酸序列进行定义，且可以特别地根据其重量可变区CDR1、CDR2和CDR3序列及其轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列进行描述并表征。抗体可以定义或表征为包含重链和轻链的抗体或片段，其中重链可变区包含特定的CDR1、CDR2和CDR3序列，且轻链可变区包含特定的CDR1、CDR2和CDR3序列。抗体的CDR和FR区可以根据本领域技术人员可得并已知的标准方法和分析进行确定。因此，CDR和FR区可以根据Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thed.,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)的标准定义和/或根据国际免疫遗传学信息***(IMGT)(imgt.org；LeFranc,M-P(1999)NuclAcidsRes27:209-212；LeFranc,M-P(2005)NuclAcidsRes33:D539-D579)来确定。
术语“表位”包括任何能够特异结合抗体的多肽决定簇。在某些实施方式中，表位决定簇包括化学活性表面类别的分子，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的电荷特征。表位是抗原通过抗体结合的区域。
通过杂交瘤或其他方式和方法制备单克隆抗体的方法和方法学是公知的。可以对针对病原体、病毒或流感肽产生的单克隆抗体组进行各种特性即中和、同种型、表位、亲和力等的筛选。特别值得关注的是中和病毒或其亚基的活性的单克隆抗体。这些单克隆抗体可以很容易地在中和活性检验中识别出。高亲和力抗体也可用于有效的结合和/或中和，或者当要求或关注于内生或重组病毒的免疫亲和力纯化时。
实施本发明时可用的单克隆抗体可以通过起始单克隆杂交瘤培养而产生，上述培养包括含有分泌具有适当抗原特异性的抗体分子的杂交瘤的营养培养基。将培养物在条件下保持一段足以使杂交瘤将抗体分子分泌至培养基中的时间。然后收集含有抗体的培养基。然后可以通过公知的技术对抗体分子进行进一步分离。
用于制备这些组合物的培养基是本领域公知的，而且市售可得，其包括合成的培养基、近交小鼠等。示例性的合成培养基为补充有4.5gm/l葡萄糖、20mm谷氨酰胺和20％胎牛血清的Dulbecco's极限必需培养基(DMEM；Dulbecco等人,Virol.8:396(1959))。示例性的近交小鼠品系为Balb/c。
产生单克隆抗病毒抗体的方法也是本领域公知的。参见Niman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:4949-4953(1983)。通常，将病毒、病毒蛋白或肽类似物单独使用或者与免疫原性载体缀合使用，作为产生单克隆抗体的免疫原。对杂交瘤产生与病毒、蛋白或肽类似物发生免疫反应的抗体的能力进行筛选。
抗体还可以是双特异性的，例如，其中抗体的一个结合结构域是用于本发明的病毒中和抗体，另一结合结构域具有不同的特异性，例如，与细胞顶面结合或缔合，与气道表皮细胞结合等。本发明的双特异抗体包括其中抗体的一个结合结构域是用于本发明的中和剂，包括其片段，且另一结合结构域是不同的抗体或其片段，包括不同的抗病毒特异性抗体的，包括另外可选的中和抗体或非中和抗体。另一结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如对肺上皮细胞、肺泡巨噬细胞、神经或胶质细胞特异的抗体。在本发明的双特异抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可以与其他结合结构域或分子结合，其他结合结构域或分子以特定的方式识别特定的细胞受体和/或调节细胞，例如，免疫调节物(例如，白介素)、生长调节物或细胞因子或毒素(例如蓖麻毒素)或抗有丝***或细胞凋亡剂或因子。因此，在例如感染、炎症等的适应症中，本发明的抗体可以用于导向或靶向致病因子、标记、其他分子或化合物或抗体。
本发明使用的双特异抗体可以包含至少两个Fab片段，在一个实例中，其中第二Fab片段的重链和轻链的可变区或恒定区是交换的。由于可变区或恒定区的交换，所述第二Fab片段也称作“跨Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。这些双特异抗体描述于US2013006011中。
本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白，其中本发明中使用的抗体、抗体分子或其片段与其他分子或药剂缀合或连接，还包括，但不限于，与化学消融剂、毒素、免疫调节物、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂、抗病毒剂、抗微生物剂或肽、细胞壁和/或细胞膜破坏物或药物缀合的这些抗体、分子或片段。在一个方面，免疫缀合物或抗体融合物可以包括与抗病毒剂特别是抗流感剂缀合的抗体、分子或片段。抗流感剂可以是神经氨酸苷酶抑制剂。抗流感剂可以选自达菲和瑞乐砂。抗流感剂可以是M2抑制剂，例如金刚烷胺或金刚烷乙胺。抗流感剂可以是病毒复制抑制剂。
任何这些抗流感剂也可以配合或结合为本文提供的组合物的一部分，或者与抗体或其活性片段联合或者分别地给药。抗流感剂可以经由与本发明的抗体或其片段或者吸入或鼻内组合物相同的或另外可选的方式(例如经由吸入或经由口服(例如片剂)方式)进行施用。因此，本发明的抗体和本发明的吸入或鼻内组合物还可以包含抗流感剂或抗病毒剂，或者可以与其结合给药或者依次或在其之前给药，上述药剂例如为神经氨酸苷酶抑制剂，包括选自达菲和瑞乐砂的药剂。许多种抗体已得以表征，并作为用于流感的治疗抗体处于开发中，包括基于病毒的保守表位。一些交叉反应性抗体靶向血凝素(HA)糖蛋白，其在接种或自然感染过程中引起最强健的中和抗体。HA由两个亚基HA1和HA2组成，其为病毒感染中的关键组分。MAbCR6261是一种得以透彻研究的抗体，其与H1病毒以及组1内的其他亚型(H5)结合，并在HA2亚基上结合(ThrosbyM等人,(2008)PL0SONE3:e3942；EckertDC等人,(2009)Science324:246-251；FriesenRHE等人,(2010)PLoSONE5(2):e1906；US专利8,192,927)。MAbCR8020与作为组2病毒的H3和其他亚型(H7)病毒上的HA2的近膜区结合(EckertDC等人,(2011)Science333:843-850)。来自瑞士研究者的抗体FI6v3可以与组1(H1)和组2(H3)病毒上存在的表位结合，但FI6在小鼠中表现的效力有限(CortiD等人,(2011)Science333:850-856)。Palses和同事已经报道了针对H3流感病毒的广泛保护性单克隆抗体，其以不同的血凝素在小鼠中使用顺序免疫(WangTT等人,(2010)PLoSPathog6(2):e1000796；美国申请20110027270)。使用该方法，分离出广泛反应性的H1抗体(TanGS等人,(2012)JVirol86(11):6179-6188)。
下表1提供出各种已知流感抗体的列表。在此提供对本发明的方法和组合物中表1中的各种抗体进行评价的示例性研究，特别是对于提高的经由鼻内或吸入给药的效力。包括如表1中所列的已知抗体适合于在本发明的方法和组合物中评价和应用。当中和是未知或未评价的时，其可以使用本领域技术人员已知并且可用的方法(包括如本文所述和参考的)进行评测。
表2提供示例性抗体序列的示例性列表，提供已表明适用于此处本发明的一些抗体的重链和轻链CDR序列。CDR序列基于并得自已公开的或可得的序列，包括表1中注释的公开物。
本发明表明，多种不同的中和抗体，包括已知抗体和新分离的抗体，在低剂量下的鼻内效力。具体地，对于多种不同的已知抗体提供了示例性的鼻内效力，作为示例性的抗体，包括抗体CR6261、CR8020、CR9114、6F12、GG3、5A7、mAb53和mAb579。尽管有例如对于CR6261和CR8020的多项研究，包括临床前试验，这些特定抗体的这些活性和效力尚未得以阐明。许多种不同的抗体，包括已知和新分离的抗体，在本文中加以评价，并且类似地有效力。根据本发明的有活性且有效的抗体针对不同的表位，并识别不同的亚型，包括甲型流感病毒的H1、H3、H5亚型，以及乙型流感。因此，本发明提供通常适用的情况，其中通过鼻内施用一种或多种针对病毒、特别是针对流感病毒的抗体，特别是一种或多种单克隆抗体，能够中和病毒的抗体可以用在方法和组合物中，以用于鼻内给药和治疗或预防病毒、感染和/或传播。如果抗体能够中和，其靶标或表位及其同种型(IgG同种型)并不显得相关。因此，具有类似的或相当的能力和中和能力的其他抗体在本发明中有用。考虑抗体片段、衍生物或变体。在本文中表明，抗体片段，包括Fab，根据本发明是有效的。在本发明的一个方面，抗体Fab片段在鼻内或经由吸入给药时是有活性且有效力的，而在IP或IV给药时是无效的。
可用于IN递送和给药的中和抗体可以与非中和抗体结合。本申请表明，IN给药可以与另外可选的给药路径包括IP或IV给药结合，以给出提高的总体结合效力。如本文所提供，抗体的组合IN和IP给药相对于单独的IN或IP均给出提高的协同活性和效力。除提供替代或另外可选的给药或治疗方法以外，本发明还提供对于抗体介导的治疗和预防的提高的组合方法，其中为达到最好效力，将IN给药与全身给药包括IP给药结合。
本发明提供另外可选的给药方式、较低的剂量、较低剂量的制剂和新的给药方法。
组合物
根据本发明，提供鼻内使用和给药的组合物。组合物特别地包含中和抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段，特别是抗病毒抗体，特别是流感抗体。组合物可以包含一种或多种中和抗体，特别是一种或多种单克隆抗体或其活性片段，特别是抗病毒抗体，特别是流感抗体。组合物特别地包含多于一种的中和抗体，特别是单克隆抗体或其活性片段，特别是抗病毒抗体，特别是流感抗体。中和抗体可以中和多于一种类型或亚型的流感，或者可以与中和不同类型或组别流感的抗体组合。本发明的组合物特别地包含针对流通的流感病毒株的流感中和抗体的组合。组合物特别地可以包含针对流通的流感病毒株的流感中和抗体，特别是抗甲型流感和抗乙型流感抗体的组合。组合物特别地可以包含针对流通的流感病毒株的流感中和抗体，特别是一种或多种抗甲型流感和一种或多种抗乙型流感抗体的组合。组合物特别地可以包含流感中和抗体的组合，该组合总体地针对适当且相关的流通的流感病毒株，特别是总体地针对甲型流感H1和H3亚型并针对山形和维多利亚谱系的乙型流感。组合物可以包含一种、两种、三种或更多种中和抗体，其条件是甲型和乙型流感病毒均被组合或抗体所中和。
组合物特别地可以包含针对流通的流感病毒株的流感中和抗体的组合，特别地为甲型流感抗-H1抗体、甲型流感抗-H3抗体和抗乙型流感抗体的组合。组合物可以包含有效针对或进一步有效针对流感H5和H7病毒株的甲型流感抗体。流感抗体可以是病毒株特异性的或非特异性的或泛特异性的(pan-specific)，并可以中和甲型流感，包括H1亚型和/或H3亚型和/或H5和/或H7或者其他甲型流感病毒株或亚型，和/或可以中和乙型流感，包括山形和/或维多利亚系。组合物可以与抗体的例如IV或IP的另外可选的给药组合物具有相同组分或者不同的或其他的组分。
本发明提供鼻内抗体组合的组合物，或者适合于或选择用于鼻内给药的抗体，特别是流感抗体以及特别是单克隆流感抗体的组合的组合物，其中抗体的组合包括、包含针对流通的病毒株的抗体或者由其组成。因此，由于流感流通病毒株目前是乙型流感(山形)、乙型流感(维多利亚)、甲型流感H1亚型和甲型流感H3亚型，提供具有或者包含针对乙型流感(山形)、乙型流感(维多利亚)、甲型流感H1亚型和甲型流感H3亚型中每一个的抗体的本发明的组合组合物。
值得注意的是，组合中的抗体可以针对多于一种的流感病毒株或亚型，例如表1所示以及本文所述。因此，如本文所述，如本文所用的抗体CR9114或CA9114针对甲型流感和乙型流感病毒株均有效。如本文所用，抗体CR6261或CA6261针对不同的组1甲型流感亚型包括H1、H5等均有效。如本文所用，抗体CR8020或CA8020针对不同的组2甲型流感亚型包括H3和H7均有效。抗体Mab53针对组1和组2甲型流感H1、H9、H7和H5亚型均有效。抗体Mab579针对H3和H7亚型均有效。因此，尽管目前流通的流感病毒株是H1、H3和乙型，可以生成具有针对其他病毒株和亚型包括可能在新的或单一流感季节发生并显现的亚型的组合，并在此提供。
比起另外可选的剂量或给药形式例如IP或IV，组合物特别地可以配制成或含有较低剂量或量的抗体。因此，本发明中使用的组合物可以包含量相对于或相比较于其用于另外可选的给药特别是IP或IV给药的组合物降低5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、大于10倍、大于100倍的中和抗体。
本发明的组合物可以特别地以基于哺乳动物的体重小于1mg/kg的量包含意在特别是鼻内给药的抗体剂量。在特定的方面，其组合物包含基于人体重的给药量为小于1mg/kg的抗体。本发明的组合物可以特别地以基于哺乳动物体重的小于1mg/kg、小于0.5mg/kg、小于0.1mg/kg、小于0.05mg/kg、小于0.01mg/kg、小于0.005mg/kg、小于0.0025mg/kg、小于0.001mg/kg的量包含意在特别是鼻内给药的抗体剂量，哺乳动物包括临床相关的哺乳动物，例如小鼠、狗、马、猫或人。
包括基于动物模型中的效力以及考虑到临床和生理学反应、病毒负荷和病毒传播速率，本领域技术人员可以确定哺乳动物包括人中的适当且有效的剂量。因此，本发明和给药参数不受本文所提供的实施例或所例示的具体剂量的限定。本发明表明，就效力和降低、限制或阻断临床上显现的病毒感染作用包括流感病毒感染而言，吸入或鼻内给药是优选的可选方式。相对于其他的给药路径包括IP或IV，中和抗体的吸入或鼻内给药提供改善和提高的效力，这一点是没有被预计或预测到。经由IN或吸入路径给药的量和时机可以由本领域技术人员进一步评价和确定。本文提供的研究表明，相对于IP或IV，IN或吸入给药在较低剂量下更加有效，并且给药可以在感染之后数日进行，并仍保持效力。
在此在小鼠模型中应用和说明的剂量和剂量范围可以由技术人员或临床或医学专家使用本领域已知的参数酌情转换或应用。因此，小鼠中的mg/kg剂量可以外推至相当的或合理地相当的人或其他动物的剂量。例如，实验室小鼠的平均重量为20g，而人的平均重量为70kg。
在临床研究中将动物剂量转化成人的剂量是常规做法，而且技术人员将会有强烈预期到这种转换的剂量在人中将会是成功的。种间缩放比例以及预测的人中的药代动力学参数已有过记载(例如，Mahmood等人,(2003)JClinPharmacol43:692-697；Mordenti(1986)JournalofPharmaceuticalSciences,75:1028-1040)。例如，常常假定治疗水平与毒性平行，因此，应用于将动物毒性转化成人毒性的转化因子常常用于将动物中的最小有效剂量转化成人中的最小有效剂量。而且，FDA提供有“行业指南(GuidanceforIndustry)”，其提供用于在治疗剂临床试验中推测最大安全起始剂量的转化因子，包括用于将动物(小鼠)剂量转换成人剂量(例如在一个例子中，小鼠剂量乘以0.08)的因子。
短语“药学可接受”是指分子实体和组合物在施用至人时是生理学可耐受的，并且通常不会产生变应性或类似的不良反应，例如胃不适、头晕等。
“治疗有效量”是指将会引起医生或其他临床医师寻求的受试者中的生物学或医学反应的药物、化合物、抗微生物剂、抗体或药剂的量。具体地，关于病毒感染和病毒增殖，术语“有效量”意在包括将会引起病毒复制或病原的量或程度在生物学上有意义的降低或者受试者中疾病(发热、关节痛、不适)长度的降低或者感染个体中体重减轻的降低的化合物或药剂的有效量。短语“治疗有效量”在本文中用于表示量足以预防、优选降低至少约30％、更优选至少50％、最优选至少90％的临床上显著的体重变化、病毒负荷、病毒复制、病毒传播或其他可能伴随其存在和活性的病理特征例如发热或白细胞计数。
在某些实施方式中，在对受试者进行治疗的背景中，“有效量”是指足以实现一种、两种、三种、四种或更多种以下效果的治疗量：(i)降低或减轻流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的严重程度；(ii)减少流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的持续时间；(iii)预防流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的进展；(iv)流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的消退；(v)预防流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的发展或发作；(vi)预防流感病毒感染、流感病毒疾病或与其相关的症状的复发；(vii)降低或预防流感病毒从一个细胞到另一个细胞、从一个组织到另一个组织或者从一个器官到另一个器官的扩散；(viii)预防或降低流感病毒从一个受试者到另一个受试者的扩散/传播；(ix)降低与流感病毒感染或流感病毒疾病有关的器官衰竭；(x)降低受试者的住院治疗；(xi)降低住院治疗的长度；(xii)增加患有流感病毒感染或与其相关的疾病的受试者的存活；(xiii)消除流感病毒感染或与其相关的疾病；(xiv)抑制或降低流感病毒复制；(xv)抑制或降低流感病毒对宿主细胞的结合或融合；(xvi)抑制或降低流感病毒进入宿主细胞；(xvii)抑制或降低流感病毒基因组的复制；(xviii)抑制或降低流感病毒蛋白的合成；(xix)抑制或降低流感病毒颗粒的组装；(xx)抑制或降低流感病毒颗粒从宿主细胞中释放；(xxi)降低流感病毒滴度；(xxii)降低与流感病毒感染或流感病毒疾病有关的症状的数目；(xxiii)增强、提高、补充、互补或放大另一治疗的预防或治疗效果；(xxiv)预防与流感病毒感染相关的二次感染的发作或进展；和/或(xxv)预防在继发于流感病毒感染而发生的细菌性肺炎的发作或减少其疾病严重性。在一些实施方式中，治疗的“有效量”具有有益的作用，但不治愈流感病毒感染或与其相关的疾病。在某些实施方式中，治疗的“有效量”可以包括以某一频率施用多剂量的治疗剂，以实现具有预防和/或治疗效果的治疗剂的量。在其他情形中，治疗的“有效量”可以包括以某一量施用单剂量的治疗剂。
病毒感染有关的症状，具体包括流感感染、疾病或暴露，可以包括，但不限于100°F或更高的发热、感觉发热、咳嗽和/或咽喉痛、流鼻涕或鼻塞、头痛和/或身体痛、发冷、疲劳、全身无力、恶心、呕吐和/或腹泻、关节和肌肉和/或眼周疼痛。
术语“预防”或“防止”是指在可能暴露于致病因子或在疾病发作前易感于疾病的受试者中降低获得或发展疾病或不适的风险(即，引起至少一种疾病临床症状不发展)。
术语“预防”与术语“防止”有关并包括在其内，是指目的在于防止而不是治疗或治愈疾病的措施或方法。预防性措施的非限定性例子可以包括施用抗感染剂或疫苗；对例如因固定化而处于血栓形成风险中的住院患者施用低分子量肝素；和在到访疟疾流行或接触疟疾风险高的地理区域之前施用抗疟疾药剂例如氯奎。
在一个实施方式中，对于任何疾病或感染，术语“治疗”或“处理”是指减轻疾病或感染(即，抑制疾病或感染因子或病毒的生长，或者降低至少其一种临床症状的显现、程度或严重性)。在另一实施方式中，“治疗”或“处理”是指减轻至少一种物理参数，其可能无法由受试者察觉。在另一实施方式中，“治疗”或“处理”是指在身体上(例如，可分辨的症状的稳定)、生理上(例如，物理参数的稳定)或者二者上调节疾病或感染。在进一步的实施方式中，“治疗”或“处理”涉及减缓疾病进展、疾病传播或者降低感染。
如本文所用，“pg”是指皮克，“ng”是指纳克，“ug”或“μg”是指微克，“mg”是指毫克，“ul”或“μl”是指微升，“ml”是指毫升，“l”是指升。
本发明还考虑可用于实施本发明的治疗方法的治疗组合物。题述治疗组合物包含混合的药学可接受的赋形剂(载体)和作为活性成分的一种或多种抗体或其活性片段，特别是中和抗体、其多肽类似物或其片段，如本文所述。在优选的实施方式中，组合物包含能够在目标细胞或受试者或患者内中和病毒，特别是流感病毒的抗体或片段。
含有抗体、多肽、类似物或活性片段作为活性成分的治疗组合物的制备是本领域公知的。通常，这些组合物制备用于作为液体溶液或混悬液进行给药，但是，也可以制备适合于在给药前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。活性治疗成分常常与药学可接受并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，如果需要的话，组合物可以含有少量提高活性成分有效性的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。
抗体、多肽、类似物或活性片段可以配制成作为中和的药学可接受的盐形式的治疗组合物。药学可接受的盐包括酸加成盐(与多肽或抗体分子的游离氨基形成)，并且其与无机盐例如盐酸或磷酸或者有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。由游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
含有治疗性抗体、多肽、类似物或活性片段的组合物进行常规给药，例如通过单位剂量给药。当涉及本发明的治疗组合物时，所使用的术语“单位剂量”是指适合作为用于人的单次给药的物理上分离的单位，每个单位含有经计算为与所需稀释剂即载体或媒介物一起产生所需治疗效果的预定量的活性材料。
如在本文中所提供，相对于另外可选的给药所指示或要求的，例如IP或IV给药要求的，有效用于治疗或预防病毒，特别是流感病毒的用于鼻内给药的中和抗体的单位剂量相对降低。因此，在其一个方面，提供用于给药，特别是鼻内给药的抗体组合物，其中相对于另外可选的给药所指示或要求的，例如IP或IV给药要求的，单位剂量有数量级上的减少，特别是减少数个或多个数量级。因此，在其一个方面，提供用于给药，特别是鼻内给药的抗体组合物，其中单位剂量减少至少10倍、10倍、20倍、25倍、50倍、至少100倍、100倍、500倍乃至1000倍。因而，具体地，相比较于用于IP或IV给药的等同的单位剂量，特别是对于相同或相当的表征或效果和/或活性，组合物得以减少。出于提高的效力，IN单位剂量可以与IP或IV剂量组合。
组合物以与剂型相容的方式以治疗有效量给药。给药的量取决于要治疗的受试者、受试者免疫***使用活性成分的能力和所需的病毒抑制或中和程度。需要给药的活性成分的精确量取决于实施者的判断，且对于每个个体来说是独特的。但是，对于鼻内给药，合适的剂量可以为约0.001至10、优选为约0.005至约1、小于1、小于0.5、小于0.1、小于0.05、小于0.01、更优选低于1、低于0.5、低于0.1毫克活性成分/千克个体体重/给药。用于初始给药和后续给药的合适的方案也是可变的。在一个方案中，有最初的给药，然后是反复的后续给药，单一或多次后续给药，通过后续的注射或其他给药间隔一个或多个小时。
最初的IN给药之后可以是通过IP或IV或其他合适的路径施用更高剂量的抗体。在本发明的一个方面，提供新的给药方法或参数，其中对患者或受试者鼻内施用中和抗体，同时、后续或后来通过IP或IV给药施用中和或非中和抗体。
治疗组合物，特别是鼻内组合物，还可以包含有效量的中和抗体或其片段以及一种或多种以下活性成分：抗生素、抗病毒剂、甾体、抗炎药。在特定的方面，组合物包含抗病毒剂。组合物可以包含抗流感药剂。抗流感药剂可以是神经氨酸苷酶抑制剂，包括选自达菲和瑞乐砂的药剂。
如本文所用，“pg”是指皮克，“ng”是指纳克，“ug”或“μg”是指微克，“mg”是指毫克，“ul”或“μl”是指微升，“ml”是指毫升，“l”是指升。
可以使用本领域和医学领域和临床实践中已知并可接受的方法将组合物配制成鼻喷雾或吸入溶液或混悬液。FDA提供关于这些喷雾、溶液和混悬液以及喷雾药物产品的指南和指导，包括可在fda.gov获得的行业指南文件。示例性的题为鼻喷雾和吸入溶液、混悬液和喷雾药物产品—化学、制造和控制文件(NasalSprayandInhalationSolution,SuspensionandSprayDrugProducts–Chemistry,ManufacturingandControlsDocumentation)的2002年7月的行业指南文件包括有关配制组分和组成、其规格、制造和密闭容器***的细节。
鼻喷雾是含有溶解或悬浮在通常为水性的制剂中的活性成分的药物产品，其可以含有其他的赋形剂，并意在通过鼻吸入而使用。用于鼻喷雾的容器封闭***包括容器和所有负责制剂的计量、雾化和递送至患者的部件。鼻喷雾药物产品含有治疗活性成分(药物物质)，其在递送含有定量剂量活性成分的喷雾的不加压分配器中溶解或悬浮在赋形剂(例如，防腐剂、粘度调节剂、乳化剂、缓冲剂)的溶液或混合物中。剂量可以通过喷雾泵定量，或者可以在制造过程中预定量。鼻喷雾装置可以设计成用于单位给药，或者可以排放许多次含有药物物质的制剂的定量喷雾。鼻喷雾可以应用于鼻腔，以用于局部和/或全身效果。
吸入溶液和混悬液药物产品通常是水性制剂，其含有治疗活性成分，还可以含有其他的赋形剂。水性口服吸入溶液和混悬液必须是无菌的(21CFR200.51)。吸入溶液和混悬液是要通过口服吸入而递送至肺，以用于局部和/或全身效果，并且要以特定的喷雾器使用。吸入喷雾药物产品由制剂和容器封闭***组成。制剂通常是水性的，不含任何推进剂。
目前用于吸入喷雾药物产品的容器封闭***设计包括预定量的和装置定量的表现形式，使用机械或电力辅助和/或来自患者吸气的能量以产生喷雾柱。预定量的表现形式在一些类型的装置(例如，单泡或多泡或其他腔)中含有预先测量的剂量或剂量份，其随后在制造过程中或者在使用之前由患者***到装置中。典型的设备定量装置具有含有足以用于多次给药的制剂的储液器，当患者激活时由设备自身作为定量喷雾而递送。
也可以通过使用生物粘附性聚合物、微球、壳聚糖或者通过增加制剂的粘度，实现在鼻腔中延长的停留时间。鼻黏膜纤毛清除也可以通过药物、赋形剂、防腐剂和/或吸收促进剂来刺激或抑制，从而影响药物至吸收位点的递送。
微球技术是用于设计鼻产品的专门***之一。微球可以提供与鼻黏膜更持久的接触，从而提高吸收或效力。用于鼻应用的微球已经使用生物相容的材料例如淀粉、白蛋白、右旋糖和明胶得以制备(BjorkE,EdmanP(1990)IntJPharm62:187-192)。
鼻制剂的pH非常重要，以避免刺激鼻黏膜，使药物以未离子化的形式可供吸收，防止致病菌在鼻腔通道中生长，保持赋形剂例如防腐剂的功能性，以及维持正常的生理纤毛运动。优选地，考虑到药物或活性成分的物化特性，制剂保持在pH4.5-6.5。鼻制剂通常以25-200μL的小体积给药，最常用的剂量体积为100μL。
药物的水溶性可以是溶液中鼻药物递送的相关参数限制。常规的溶剂或共溶剂例如甘油、少量的醇、Transcutol(二乙二醇单***)、中链甘油酯和Labrasol(饱和聚二醇化C8-C10甘油酯)可以用于提高药物的溶解性。其他选择包括表面活性剂或环糊精的使用，例如HP-β-环糊精，其用作与亲脂性吸收促进剂结合的生物相容的增溶剂和稳定剂。在这些情形中，应当考虑其对鼻刺激的影响。
大多数鼻制剂是水性的，需要防腐剂来防止微生物生长。对羟基苯甲酸酯、苯扎氯铵、苯基乙醇、EDTA和苄醇是一些鼻制剂中常用的防腐剂。含汞防腐剂对于纤毛运动具有快速和不可逆的作用，不推荐用于鼻***。
需要少量的抗氧化剂来防止药物氧化。常用的抗氧化剂为焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、丁羟甲苯和生育酚。通常，抗氧化剂不影响药物吸收或造成鼻刺激。抗氧化剂和防腐剂与药物、赋形剂、制造设备和包装组件的化学/物理相互作用应当作为制剂研发项目的一部分考虑。
许多过敏和慢性疾病常常与黏膜的痂皮和干燥有关。除其他赋形剂外，某些防腐剂/抗氧化剂也可能造成鼻刺激，特别是当以较高的量使用时。足够的鼻内湿度对于防止脱水是必要的。因此，特别是在凝胶基鼻产品中可以加入润湿剂。润湿剂避免鼻刺激，并且不可能影响药物吸收。常见的例子包括甘油、山梨醇和甘露醇。
递送***的选择取决于使用的药物、提出的适应症、患者群体和最后但同样重要的市场偏好。这些递送***中的一些包括滴鼻剂、鼻喷雾、鼻凝胶和鼻粉末。
给药
再次要注意到，通常的和合理预计的抗体治疗剂量公认为在mg范围内的IV或IP剂量。这是基于迄今为止的大量重组抗体的研究和临床经验。迄今，超过二十(20)种单克隆抗体已经在美国得以临床许可(参见，例如，NewsomeBWandErnstoffMS(2008)BrJClinPharmacol66(1):6-19)。目前应用的临床许可的抗体均以mg/kg的范围使用并IP或IV给药。
迄今在临床上尚未许可流感单克隆抗体。目前所有进展中或报道的试验均使用静脉递送作为标准。具体地，TheraCloneSciences抗体TCN-023在1-40mg/kg的单剂量-逐级扩增中加以评价(NCT01390025,clinicaltrails.gov)。TCN-032抗体是与流感病毒基质蛋白(M2)的氨基端胞外结构域(M2e)的保守表位结合的人抗体(GrandeaAG等人,(2010)PNASUSA107(28):12658-12663；Epub2010Jul1)。抗体CR6261和CR8020正在进行类似的安全性和耐受性评价研究，其使用在2小时内进行的从2mg/kg到50mg/kgIV施用的逐渐增加的剂量(分别为CrucellHollandBV临床试验NCT01406418和NCT01756950)。
流感疫苗通过注射给药。流感疫苗的一个例外是鼻内给药的FluMist流感活疫苗(MedImmune)。FluMist是三种活的流感病毒株A/H1N1株、A/H3N2株和B病毒株的组合，其以0.2ml剂量使用在单剂量预充填鼻内喷雾器中供应的混悬液而给药。除病毒株以外，每剂量还含有谷氨酸单钠、水解的猪明胶、精氨酸、蔗糖、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾，无防腐剂(FluMist处方信息精选(FluMistHighlightsofPrescribingInformation),2012-2013配方,MedImmune,RAL-FLUV12,成分No.:11294)。
本发明提供一种新的且有效力的抗体给药方式和抗体给药方案，用于治疗和预防病毒感染，特别是经由呼吸道路径感染或传播的病毒，特别是包括流感病毒。因此，本发明通过鼻内施用能够中和病毒的抗体而提供病毒感染、特别是流感病毒感染的治疗、预防或减轻。可以将一种或多种中和抗体鼻内给药，包括同时、组合或依序或分开给药。抗体可以通过单独的IN给药而施用，或者可以在多次单独给药中给予。单独的给药可以接连地进行，每次给药相隔数秒、数小时或数天。
在特定的方面，本发明通过鼻内施用针对流通的流感病毒株的抗体组合，提供病毒、特别是流感病毒感染的治疗、预防或减轻。因此，根据本发明，通过鼻内施用针对乙型流感和流通的甲型流感病毒的抗体组合，特别地在其一个方面为抗-乙型流感抗体、抗-组1甲型流感抗体例如抗-H1抗体和抗-组2甲型流感抗体例如-H3抗体的组合，提供并实现病毒、特别是流感病毒感染的治疗、预防或减轻。根据本发明，抗-乙型流感抗体、抗-组1甲型流感抗体例如抗-H1抗体和抗-组2甲型流感抗体例如抗-H3抗体的组合的鼻内给药有效地预防乙型流感或甲型流感病毒造成的感染或治疗流感感染。至抗体可获得以及在本文中测试和表明为有效针对多于一种的病毒亚型或株的程度，本文提供并考虑的组合充当有效针对许多病毒株和/或亚型的通用混合抗体或组合，特别是针对流感病毒，包括已知的流通的病毒株或亚型、新出现的病毒株或亚型以及未知的、未预期的和变异的病毒株或亚型。
本发明使用的抗体可以鼻内或通过吸入给药，然后为另一抗体或相同抗体的全身给药(特别是IP或IV给药)，或与另一抗体或相同抗体的全身给药一起，包括同时、组合或按序或分开地。因此，在本文中考虑并提供组合给药方案或方法，其中将鼻内和IP(或IV)给药组合，用于提高针对致病因子、具体为病毒、特别为流感病毒的效力。实际上，本文提供的研究表明，使用鼻内与另外可选的给药(IP或IV)的组合给药，组合效力是协同的，作为例子，IN和IP均可以使用低的剂量。
本发明提供一种用于治疗或预防哺乳动物中病毒感染的方法，上述哺乳动物暴露于呼吸道病毒或处于暴露于呼吸道病毒的风险中、已经接触呼吸道病毒、在临床上显现出症状或受害于呼吸道病毒，上述方法包括对哺乳动物鼻内(IN)或经由吸入施用能够中和呼吸道病毒的单克隆抗体。单克隆抗体具体地可以是IgG抗体。呼吸道病毒可以是流感病毒或疑似流感病毒或者未知的呼吸道病毒。
抗体可以在感染后或者假定感染之后施用。在其一个方面，抗体可以在感染后至多8小时(hpi)的时间内施用，包括2hpi、4hpi、6hpi、8hpi。另外可选地，抗体在感染后至多24小时的时间内施用，包括4hpi、8hpi、12hpi、18hpi、24hpi。在另一可选方式中，抗体在感染后至多48小时的时间内施用，包括12hpi、24hpi、36hpi、48hpi。在其他可选方式中，抗体在感染后至多72小时的时间内施用，包括24hpi、36hpi、48hpi、60hpi、72hpi。抗体可以在感染后或者假定感染之后或者显现出临床症状例如发热、疼痛、关节痛、昏睡之后的数天施用。抗体可以在感染后1天、感染后2天、感染后3天、感染后4天、感染后5天、感染后6天、感染后7天、感染后10天、感染后12天、感染后14天施用。抗体可以在感染或假定感染之后的数周施用，包括1周后、2周后、3周后、4周后、1个月后。
可以在感染之前或者为减少或防止传播或者在疾病、不适或感染的任何临床适应症之前施用抗体。在其一个方面，抗体可以在感染之前或者在可能的或假定的暴露或者处于暴露风险之前数天的一段时间作为预防剂施用。抗体可以在1天以前或之前、2天之前或以前、3天以前或之前、4天以前或之前、5天以前或之前、6天以前或之前、7天以前或之前、1周以前或之前、多于7天以前或之前、多于1周以前或之前、至多9天以前或之前、至多10天以前或之前给药。抗体可以在以前或之前以一个或多个剂量进行一次或多次给药，间隔数小时、数天或数周。
可以将抗体以单一剂量或以多剂量施用。每剂量可以在单位或mg/kg的量上相同，或者可以在量上不同。例如，初始剂量可以是相对较高的剂量，例如，但不限于约1mg/kg，大于1mg/kg，小于1mg/kg，或者约是被给药的哺乳动物的最大或接近最大耐受剂量，或者二分之一最大耐受剂量。后续剂量可以与初始剂量相同，或者可以小于或大于初始剂量，并且可以取决于受试者或患者的反应或应答或者临床症状的减轻或程度。
每次相同或不同量的多剂量或者任意剂量可以间隔数小时、数分钟、数天或数周给药。时机可以变化，并可以取决于反应和症状而缩短或延长。例如，但不限于，给药可以间隔至少2小时、间隔至少4小时、间隔至少6小时、间隔至少8小时、间隔至少24小时、间隔至少48小时、间隔至少72小时。抗体的剂量可以在感染后或假定感染后施用，至多为2、4、6、8、12、24、36、48、72小时后，至多1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、1个月或更久。
该方法可以包括病毒特异性单克隆抗体的另外IP或IV给药，其中另外施用的抗体是中和或非中和抗体。另外IP或IV给药的抗体可以是与IN或经由吸入给药相同的抗体。另外IP或IV施用的抗体可以与IN或吸入施用的抗体同时、相继或随后给药。任何这样的后续给药可以晚数小时，可以晚2、4、6、8、12、24、36、48、72或更多小时。后续的给药可以晚数天，并且可以晚1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天。后续的给药可以晚数周，并且可以晚1、2、3、4或5周。
吸入或鼻内给药可以用于促进在初始的IN或IP或IV或组合给药之后病症特别严重或者持续表现出感染或疾病症状的患者或受试者中的反应或效力。
在另一方面，本发明提供一种施用针对呼吸道病毒的单克隆抗体的方案，其包括施用第一鼻内或吸入剂量的中和抗体，随后或同时腹膜内或静脉内、或者再次鼻内或通过吸入施用第二剂量的抗体，其中第二剂量的抗体是与第一剂量的抗体相同或不同的抗体。第二剂量或任何其他剂量的抗体可以是中和或非中和抗体。
参考以下作为本发明例子的实施例可以更好地理解本发明。以下实施例被呈现出，以更充分地说明本发明的优选实施方式，但其绝不应当理解成限制本发明的宽范围。
实施例1
用HA单克隆抗体进行的流感治疗性处理是剂量依赖性的，并且在感染后越晚的时间还要求越高的剂量。典型的IP或IV施用的广泛反应性HA特异性抗体的治疗剂量要求剂量范围在2mg/kg-50mg/kg，以观察到保护免受死亡攻击。在感染后较晚的时间，相同的效果要求剂量在>10mg/kg之上。北美成年人平均体重为约80.7kg，如果施用10mg/kg，将会需要807mg抗体。目前CrucellHollandBV的两项流感单克隆抗体CR6261和CR8020的1期研究正在以从1mg/kg到50mg/kg逐渐增加的单剂量进行安全性和耐受性评价(分别为试验NCT01406418和NCT01756950；clinicaltrials.gov)。在小鼠中，这些抗体需要15mg/kg以保护小鼠免于死亡(Friesen,RHE等人,(2010)PLoSONE5(2):e1906)；EkiertDC等人,(2011)Science333:843-850)。这样，使用目前可应用的方法，基于人的体重(约70kg)，将会要求接近或是克量抗体/患者。这在任何针对多种流感亚型的治疗中需要多于一种抗体治疗三种不同亚型的流通中的流感(甲型流感H3、甲型流感H1和乙型流感)时是混合的，因此，假设每种抗体约1克，要求总计3克量级的抗体。大量的抗体变得成本过高，这在流感的治疗抗体开发中呈现为主要障碍。
我们已经找到一种将抗体的量显著降低10倍多并同时明显保持甚至提高效力的解决方案。我们已经发现，与IV或IP路径相比较，抗体的鼻内递送提供明显且显著的效力提高。而且，这一鼻内效力现象对于中和性抗体是特定的，因为非中和抗体在通过该路径递送时表现出效力受损。
使用公认的已知流感小鼠模型，我们的研究表明，与腹膜内(IP)或静脉内(IV)递送路径相比较，中和抗体的鼻内(IN)递送可以将治疗效力大大增加10倍多。当以IN来代替IV或IP路径施用时，使用相同剂量的小于十分之一便可以实现相当的效力。目前用于治疗流感的治疗设计使用静脉内递送作为标准(ClinicalTrials.gov标识符：NCT01390025、NCT01756950、NCT01406418)。这一递送方法是本领域的标准，因为对抗体的中和特性进行利用的能力尚未知晓。绝大多数抗体治疗剂方面的研究使用IV或IP递送，且尚未意识到，与IV或IP递送相比较，将中和抗体IN递送至呼吸道病原体将会提高效力。相反地，该领域未能认识到，中和对于全身递送的抗体来说可能不是必需的，因为针对HA的非中和抗体与中和抗体类似地有效。在这一方面，比起抗体的中和能力，能够反应性更广的抗体将会更加临床相关。
之前有关IN递送的报道已经评价了多克隆血清γ球蛋白IVIG或IgA类抗体(IgA抗体固有地对于肺是常见的)(AkerfeldtS等人,(1973)BiochemPharmacol22:2911-2917；RamisseF等人,(1998)ClinExpImmmunol111:583-587；YeJ等人,(2010)ClinVaccineImmunol17(9):1363)。一个小组通过IN路径测试了抗体(C179)的腹水制剂，并示出保护性的IN递送(在攻击前)与IP相当(SakabeS等人,(2010)AntiviralRes88(3):249-255)。C179对2009年流行的H1N1病毒表现出较低的中和活性，但不能保护小鼠免于感染。
与此相反，我们发现，重要的是，效力增加并不简单地对于交叉反应性的抗流感抗体例如交叉反应性抗-HA抗体发生，事实上，当IN施用时不发生中和的抗体不会表现出针对流感的效力。现有技术和之前的研究未能认识到，这一效应可以更广泛地应用于表现出体外中和活性的抗体，而不论其病毒表位或蛋白靶标。而且，抗体不需要对HA有交叉反应性，因为当IN施用时，可以中和的病毒株特异性抗体将会表现出效力增加。我们发现，中和抗体(而不仅是交叉反应性抗-HA抗体)对于取决于给药路径而显著降低实现相当效力所需的抗体量是必要的。实际上，我们发现，当使用非中和的交叉反应性抗-HA抗体时，发生相反的情况。尽管当使用IP或IV递送路径比较这些抗体时表现出类似的效力，这些交叉反应性非中和抗-HA抗体的治疗应用在鼻内处理小鼠时引起治疗效力显著降低。
我们得出结论，这一现象背后的机制在于以下事实：鼻内递送在气道中达到可以利用抗体中和能力的IgG抗体水平，而抗体的IV或IP递送是依赖于Fc的。图解显示于图12中。在气道中，抑制性机制依赖于抗体的中和特性，且Fc依赖作用受到严重限制。当通过IP或IV施用IgG抗体时，到达气道中该空间的抗体量太低，不能利用抗体的中和作用。例如，当通过IP或IV施用中和抗体时，观察到的治疗效果主要来自抗体效应子功能。我们已经发现，当IP或IV施用而不是通过IN施用时，中和或非中和抗体的效力水平相当。为进一步说明该效果依赖于中和，针对M2蛋白的抗体不在体外表现出中和，且仅仅能够表现出Fc介导的作用。之前使用针对M2离子通道(比HA在遗传上更加保守的分子)的抗体的工作已经在临床前模型中显示出有成功希望，并且已经完成了I期研究(TN-032，来自Theraclone；NCT01390025、NCT01719874；GrandeaAG等人,(2010)ProcNatlAcadSciUSA107(28):12658-12663)。针对M2蛋白的抗体不能中和病毒，但可以具有有据可查的通过效应子功能介导的治疗效力(Wang,R.等人,(2008)Antiviralresearch80:168-177；Grandea,A.G.,3rd等人(2010)ProcNatlAcadSciUSA107(28):12658-12663)。我们相信，当IP或IV施用时，中和和非中和抗体二者均主要通过类似于M2靶向抗体的效应子功能来发挥作用。我们注意到，已知M2蛋白的丰度显著小于HA，另外不会从表面伸出。针对HA的抗体可以中和病毒，提供进一步提高效力的潜力。这样，通常，HA抗体比抗-M2抗体的治疗有效性更高。然而，当IP施用时，不是中和物并且仍然靶向HA的抗体可以表现出与中和抗体水平相当的效力，表明这一递送路径不能利用当IN施用时会利用的潜在作用。因此，通过IN而不是IP递送中和Fab引起治疗效力。IN施用的非中和Fab不表现治疗效力。总之，只有IN施用的中和抗体表现出这种增加的效力。扩展这一观察结果，这种现象将会对于靶向其他蛋白(例如神经氨酸苷酶)的中和抗体发生，以及对于针对其他呼吸道病原体的中和抗体(例如用于RSV的帕里珠单抗)发生。由于通过IN和IP/IV两种路径的抗体递送可以以其自身不同的方式而起作用，我们相信，组合使用两种路径将利用中和抗体的最大治疗潜力。通过利用经由IN路径的增加的中和活性以及通过IP/IV路径增加的Fc依赖性活性，该方法将会实现最大的效力。
材料和方法
以下提供用于在此提供的实施例的材料和方法。
抗体：使用以下描述的噬菌体展示分离出Mab6P15、1P19和1K17，其为反应性广泛的抗-H3抗体，并且不在微中和检验、空斑减数检验或HI中中和病毒。MabCR8020和CR6261是表征充分的分别针对组2和组1病毒的反应性广泛的抗体(ThrosbyM等人,(2008)PL0SONE3:e3942；EckertDC等人,(2009)Science324:246-251；FriesenRHE等人,(2010)PLoSONE5(2):e1906；US专利8,192,927；EckertDC等人,(2011)Science333:843-850)。抗体CR9114与HA主干中的保守表位结合，当IV施用时保护免受甲型和乙型流感病毒的死亡攻击(DreyfusC等人,(2012)ScienceExpress9August201210.1126/science.1222908)。我们通过合成可变区来克隆这些中和抗体，并亚克隆到小鼠IgG2a表达载体中。使用公开的重链GI:339779688和轻链GI:339832448克隆CR8020的可变区。使用公开的重链GI:313742594和轻链GI:313742595克隆CR6261的可变区。使用Genbank序列重链编号JX213639和轻链编号JX213640克隆CR9114的可变区。将用在这些研究中的所有Mab均克隆到含有与小鼠IgG2a融合的人可变区的IgG表达载体中。小鼠抗体CR6261、CR8020和CR9114的嵌合抗体分别称作CA6261、CA8020和CA9114。Mab6F12和GG3来自结合并中和组1和抗-H1病毒的小鼠杂交瘤(WangTT等人,(2010)PLoSPathog6(2):e1000796；TanGS等人,(2012)JVirol86(11):6179-6188；US申请20110027270)。Mab5A7与乙型病毒HA上的共同表位结合并中和病毒，当IP施用时保护小鼠免受死亡攻击(YasugiM等人,(2013)PLoSPathog9(2):e1003150,doi:10.1371/journal.ppat.1003150)。人抗体Mab53(也称作TRL53)记载于US2012/0020971和WO2011/160083中，并有效地中和组1和组2的H1、H9、H7和H5亚型。抗体Mab579(也称作TRL579)记载于WO2013/086052中，并有效地中和H3和H7。公开序列，包括抗体重链和轻链可变区序列、特别是上述和本文示例的抗体(特别地包括CR6261、CR8020、CR9114、5A7、Mab53和Mab579)的重链和轻链CDR结构域(CDR1、CDR2和CDR3)序列，是已知且可公开获得的，包括在上述并通过引用的方式并入本文的参考文献中。
噬菌体展示：通过数轮针对流感重组血凝素(HA)(ImmuneTechnologiesCorp,NewYork)或蔗糖垫提纯的流感病毒的淘选，选择抗体片段。简言之，将抗原在PBS中稀释，并在4℃下在MaxiSorpNunc-Immuno板(Nunc)上孵育过夜。将板用PBS洗涤两边。将板在持续震摇下在室温下与PBS中5％牛乳孵育2小时。将噬菌体文库在具有2.5％胎牛血清和0.005％吐温的PBS中2.5％牛乳中封闭。将封闭的噬菌体在室温下加入到约400rpm的振动平台上的已封闭板上2小时。将板用PBST洗涤，将结合的噬菌体在DTT稀释缓冲液中稀释。将稀释的噬菌体在37℃下与TG1细胞孵育45分钟。将细胞铺在含有LB、氯霉素(Cam)和葡萄糖(Glc)的15cm培养板上，在30℃下孵育过夜。从板上刮下群落，用聚乙二醇沉淀，以用于后续的数轮淘选。使用来自相同病毒株的HA抗原或者在不同病毒株的HA上进行3或4轮淘选。将淘选的最后一轮铺在更大的Q盘上，用于Q-pix群落拣取到384孔板中。
Fab验证：将编码Fab的噬菌体溶解物通过ELISA针对重组HA进行筛选。将拣取到含有2XYT/Cam/Glc培养基的384孔板中的单个群落在30℃下生长过夜。将384孔板中的TG1细胞使用Qpix复制到含有具有低葡萄糖的2XYT/Cam的384孔表达板中。将板在30℃和400rpm下生长2-4小时。Fab表达用0.5mMIPTG诱导，并在22℃和400rpm下生长过夜。将含有Fab的细胞用含有核酸酶(Benzonase)的BEL缓冲液在22℃和400rpm下裂解1小时。将含有Fab的裂解物用12.5％MPBST在400rmp和22℃下封闭30分钟。将裂解物在RT下加入到涂有HA的ELISA板上1小时。将板用PBST洗涤5次，然后在RT下与缀合在碱性磷酸酶上的抗-FabIgG孵育1小时。将板用TBST洗涤5次，并用AutoPhos(Roche,NewJersey)显影。使用InfiniteProF200读板。对阳性噬菌体裂解物进行测序，将独特的Fab亚克隆到含有c-myc和his标记的Fab表达构建体中进行进一步的表征。
Fab表达：将Fab表达质粒电穿孔到TG1F-细胞中，并铺到LB/Cam琼脂板上。将板在37℃下孵育过夜。将5ml的2XYT/Cam/Glc接种以单个群落，并在30℃和350rpm下生长过夜。将500ml的2XYT/Cam/低Glc接种以2ml过夜培养物，并在30℃和180rpm下震摇，直至达到OD600nm为0.5。通过以0.75mM的终浓度加入IPTG来诱导Fab表达。将培养物在30℃和160rpm下震摇过夜。将培养物在5,000g和4℃下离心30分钟。将细菌球在-80℃下冷冻至少2小时。将细胞裂解，并在0.22um滤器上过滤，并进行IMAC纯化和尺寸排阻步骤。
抗体的克隆和表达：对编码Fab的噬菌体进行测序，并亚克隆到用于各自重链和轻链的IgG表达质粒中。IgG在摇瓶中的Invitrogen293F或Invitrogen293Expi细胞中产生。将细胞用重链和轻链的表达质粒转染。转染后6天收获培养物上清液，并使用蛋白A亲和力色谱和缓冲液交换步骤进行纯化。
小鼠中的治疗效力研究：在所有实验中使用6-7周龄雌性BALB/c小鼠。在开始实验之前，使所有小鼠适应并保持至少3天的时间。将小鼠在病毒攻击日称重，然后每日称重，持续2周。使用临床评分***作为临床终点以及从研究中去除的标准。对临床体征评分如下：蜷缩姿态＝3，立毛＝3，不饮食＝2，体重减轻≥30％＝10，神经学症状＝10。当评分达到16或更高时，将小鼠从研究中撤出，并安乐死。动物研究根据许可的动物关怀与应用委员会机构(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)的方案进行。在感染后所示的天数，进行小鼠的治疗性处理。在以50ul体积/小鼠进行鼻内施用病毒、Mab或Fab之前，首先将小鼠用***/甲苯噻嗪混合物麻醉。以100ul的体积进行Mab或Fab的腹膜给药。在14天的研究期间，每天测定平均体重，并相对于第0天的平均体重而加以显示。
病毒：将流感病毒株(包括A/加利福尼亚/7/09、A/维多利亚/11)根据Cottey,Rowe和Bender(当前的免疫学指南(CurrentProtocolsinImmunology),2001)进行小鼠适应。进行3轮小鼠适应，然后在胚化卵中进行1轮病毒繁殖。简言之，将三只6-8周龄的小鼠麻醉，并鼻内感染20ul病毒。感染后3天，将小鼠安乐死，取出肺。将肺机械均化，澄清，并离心，除去大块碎片。进行3轮对天然小鼠的20ul肺均化物的另外传代。
参考文献
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JegerlehnerA,SchmitzN,StorniT,BachmannMF:InfluenzaAvaccinebasedontheextracellulardomainofM2:weakprotectionmediatedviaantibody-dependentNKcellactivity.JImmunol2004,172:5598-5605.
FengJ,MozdzanowskaK,GerhardW:ComplementcomponentC1qenhancesthebiologicalsctivityofinfluenzavirushemagglutinin-specificantibodiesdependingontheirfineantigenspecificityandheavychainisotype.JVirol2002,76:1369-1378.
MozdzanowskaK,FengJ,EidM,ZharikovaD,GerhardW:Enhancementofneutralizingactivityofinfluenzavirus-specificantibodiesbyserumcomponents.Virology2006,352:418-426.
实施例2
中和抗体的鼻内有效性
实验研究
全身递送抗体的治疗效力不仅仅依赖于中和能力，因为通过IP路径施用的中和和非中和抗体在治疗和预防致死性感染中均表现出类似的效果。当在感染后24小时(24hpi)IP施用10mg/kg时，中和和非中和抗体是类似有效的(图1)。图1所示的结果表明，全身递送的针对HA的抗体可以通过效应子功能发挥有力的治疗效力，因为一些非中和抗体(6P15、1P19和1K17)以与中和抗体CA8020类似的程度保护小鼠免于死亡攻击。在病毒感染之前1小时(-1hpi)IP施用时，中和和非中和抗体类似地在预防上有效(图2)。在1hpi并使用不同的病毒时观察到类似的结果(数据未示出)。这些结果使人产生疑问，在全身递送过程中中和是否对治疗效力有显著贡献。通过IV或IP路径递送抗体并未引起显著的效力差异(图3，数据未示出)。
相反，与全身递送相比较，中和抗体的IN递送显著提高其治疗效力(图4)。这一治疗效力的增加特定于中和抗体，因为非中和性抗体不显示出类似的治疗效力提高。图4表明，Mab(CA8020)通过IN递送表现提高的效力的能力依赖于其中和能力。对H3病毒特异的中和性Mab通过IN路径表现出效力提高，但非中和Mab不会表现出这样的效力。不像图1所示的IP递送，与非中和性抗体相比较，中和抗体的IN递送提供显著的治疗益处。IN疗法的提高的效力与抗体的中和能力相关，因为非中和抗体例如6P15、1K17和1P19没有表现出提高的IN治疗效力。相反地，与IP相比较，当通过IN给药时，非中和Mab表现出显著降低的效力。如图4所示，以10mg/kgIP施用的非中和抗体(示例性抗体6P15)可以在24hpi保护小鼠免受10xLD50，与类似剂量下的中和抗体类似。但是，当通过IN路径给药时，非中和抗体没有表现出治疗效力的增加。非中和抗体6P15的代表性数据示为例子。在其他非中和抗体中，包括抗体1K17和1P19中观察到类似的结果(数据未示出)。
IN效力提高也由广泛识别的针对H1病毒的抗体CA6261(结合HA2亚基α短螺旋的IgG2a抗体)(图7)、由抗体6F12(靶向HA柄区的IgG2b抗体)(图14)和GG3抗体(图15)表明，证实多种不同抗体的效果，并确立了IN效力在针对多种流感病毒目标和亚型的中和抗体间是一致的。为进一步验证IN效力的效果，我们已经对另一交叉保护性抗体CR9114进行了评价，显示它是高度IN有效的(图16)。CR9114结合HA柄中的保守表位，在IV给药时，针对甲型和乙型流感病毒的死亡攻击提供保护(DreyfusC等人,(2012)ScienceExpress9August201210.1126/science.1222908)。
就鼻内给药而言，对于具有不同抗体同种型的抗体，我们没有观察到显著的差异。在IP给药中已观察到同种型的差异，说明可能与效应子功能相关。另外，单中和抗体能有效地阻断多种其目标H1或H3病毒的病毒株的感染，说明该效力不是病毒株特异的或有限的。我们已经表明，针对两种不同的H1病毒，具体为PR8(图5、7和9)和小鼠适应的Cal/09(图17)，通过IN施用的中和抗体CR6261比IP更有效10倍多。因此，对于针对流感病毒的中和抗体，IN给药提供可行的并且实际上更加有效的可选方式。
实施例3
中和性Fab的鼻内有效性
接下来我们考察了Fc的去除是否会废除IP或IN施用的中和和非中和Fab的治疗效力。如图5所示，IP施用的Fab(CA6261抗体Fab)在10mg/kg或更低时不提供针对H1病毒的治疗效力。与PBS处理的小鼠类似，用FabIP处理的小鼠均死于感染。相反，用剂量10mg/kg和1mg/kg的中和FabIN处理的小鼠能够于致死感染后存活(图5)。所有IN施用的剂量(甚至0.1mg/kg)均表现出高于任何IP施用的剂量的效力。在相同的实验中对IN与IP或IV的CA6261Fab进行比较，观察到相当的结果，其中FabCA6261在IP或IV施用时均没有保护性或没有效，但在IN施用相同剂量(5mg/kg)时，表现出显著的效力(动物保持95％或更大的体重)(数据未示出)。这些数据说明，对于中和性抗体，Fab在鼻内有效地阻断或治疗病毒感染。数据进一步说明，全身的Mab递送需要Fc效应子功能来用于治疗效力，因为Fab是无效的。
当通过IN或IP路径施用时，来自非中和抗体的Fab不保留治疗效力。在图6中，感染H3病毒的小鼠通过纯化的示例性抗体CA8020和6P15的Fab的IN递送进行治疗。尽管中和Fab能够表现出治疗效力，非中和Fab不能保护小鼠免于死亡攻击。这些数据说明，来自非中和抗体的Fab在IN施用时表现不出治疗效力。
实施例4
IN递送比IP更有效10-100倍
我们已经发现，显著地，中和抗体的鼻内(IN)递送比腹膜内(IP)递送更加有效10-100倍。将小鼠用10xLD50的PR8病毒(H1病毒)感染，并在24hpi用抗体治疗(图7)。将中和抗体CA6261以10倍连续稀释，并通过IN或IP路径给药(图7A)。如通过体重减轻所示，IN路径处理的小鼠表现出较少的疾病严重性，而且在所有稀释下均100％保护免于致死感染。与之相比，只有以最高剂量(10mg/kg)IP处理的小鼠表现出短暂的体重减轻，并保护免于致死感染。当IP施用时，所有较低的稀释均不对小鼠提供保护。相反地，用0.1mg/kg剂量的IN处理引起短暂的体重减轻，所有小鼠均存活。在感染后的所有时间，以10mg/kg和1mg/kg剂量通过IN递送处理的小鼠均被保护免于可检测的重量减轻。在所有剂量下通过IP路径施用的抗体均表现出一定程度的体重减轻，且只有以最高剂量10mg/kg处理的小鼠在感染后存活。
我们证实，中和抗体的鼻内递送类似地引起针对H3病毒的治疗效力提高。将小鼠用H3病毒感染，并在24hpi处理(图8)。将中和抗体CA8020以10倍连续稀释，并通过IN或IP给药。如我们H1病毒的研究所观察到的，通过IN路径施用的抗体在所有稀释下均针对H3病毒提供100％的存活，比起通过IP路径施用的抗体，表现出更少的体重减轻。
这些数据表明，当IN递送时，中和是提高治疗效力必要的。而且，全身递送的抗体的治疗效力不依赖于中和，因为对于中和和非中和抗体二者均观察到类似的效力水平。作为对这一观察结果的支持，当IP施用时，中和Fab的治疗效力消失，但在IN递送时中和Fab表现出效力。与IP施用相比较，IN施用的中和Fab表现出与其全Mab对应物的IN递送类似的效力提高。
实施例5
鼻内效力在感染后保持
IN递送的中和抗体的效力提高在感染后更晚时间仍保持。在图8中，将小鼠在48hpi通过IN或IP处理。再次地，中和抗体的IN递送比IP递送在治疗上更加有效。当通过IN路径施用时，在1mg/kg达到对死亡攻击的完全保护，而IP递送在10mg/kg的剂量下提供针对死亡攻击的完全保护。IN给药在72hpi表现出效力相对降低，但相对于72hpi相同量的IP给药保持了显著的提高。图18提供的存活图表明了在72hpiIN施用的CA6261的效力，以及相比较于相同剂量IP的存活的非常显著的提高。
实施例6
鼻内给药在低剂量下有效
在感染之后给药时，中和抗体的鼻内递送可以在非常低的剂量下针对死亡攻击提供完全的保护。如图10所示，针对10XLD50病毒，在8hpiIN施用的低至0.005mg/kg剂量的CA8020抗体引起100％存活。这些剂量比感染后IV或IP处理的标准剂量低千倍。这些数据说明，出人意料地，当IN施用时，很低的剂量便可以实现治疗效力。
对反复IN给药的效力进行评价。使用0.005mg/kg/剂量的较低反复给药以及0.001mg/kg的反复给药，在8hpi、32hpi并再次在56hpi的CA8020Mab的反复IN给药提供效力(图11)。相对于单次8hpi给药，效力在一定程度上得以提高。另外的研究示出，使用在8hpi施用的抗体CA6261的保护在0.045mg/kg具有保护性，而更低的剂量正在评估中(数据未示出)。
这些数据示出，中和对于IN效力增加是必要的，因为非中和物并不表现效力的增加。这样，当经由IN路径施用时，中和抗体的Fab保持提高的效力，而来自非中和抗体的Fab则表现不出可观察到的效力。相反地，中和或非中和Fab在IP施用时均不表现出效力，表明在IP施用时，中和和非中和Mab均依赖于Fc区效应子功能。图12所示的感染模型示出，IN给药的效力提高依赖于抗体的中和，而全身递送区别地依赖于效应子功能。
实施例7
组合IN/IP方案提供提高的效力
基于模型，如图12所示，我们考察了IN和IP递送的抗体表现出分别的非冗余功能的假说。如果正确，通过组合IN和IP路径而施用的抗体将会相比较于单独给药的单一路径表现出增加的效力。在13A-13D中，我们表明，在各种组合给药方案中(这些研究中的总抗体剂量为5mg/kg或2mg/kg)，组合的IN和IP递送比单独的IP递送更加有效。相比较于IP或IN组，使用IN和IP给药的组合提供的效力提高证实，通过IN和IP施用的Mab的作用机制和要求是不同的，且可能是非冗余(non-redundant)的。使用中和抗体用于IN，使用中和或非中和抗体用于组合的IP给药模式，使用IN和IP给药的组合方案，提供提高的抗病毒效力。进一步的研究表明，即使使用低剂量0.1mg/kgIN和0.5mg/kgIP的仅0.6mg/kg的总施用抗体，与相同的中和抗体或不同的非中和抗体(示例性6P15)的IP给药组合的中和抗体(示例性CA8020抗体)的IN给药是类似地有效的(图19)。即使是与相对低剂量的抗体IP组合，实施IN给药可以降低效力要求的总抗体。IN施用的抗体的作用机制可能主要是限制病毒扩散，而IP施用的抗体主要是通过效应子功能减少产生病毒的感染细胞的数目。
通过IN或IP施用的中和抗体的同种型转换来探讨作用机制。与小鼠IgG2a相比较，小鼠IgG1具有降低的效应子功能。IN递送的抗体表现出类似的效力水平，其不依赖于同种型，如对于CA6261和CA8020所观察到的。IP施用的抗体表现出依赖于同种型的治疗效力的显著差异。对于CA6261和CA8020，IgG2a同种型的抗体比小鼠IgG1抗体显著地更有效(数据未示出)。这说明全身递送的抗体的主要作用模式是通过效应子功能。这样，已知的通过各种方式(例如，但不限于Fc修饰或a-盐藻糖基化)提高效应子功能的方法将会提高全身递送的抗体的效力，并且可以包括在通过鼻内或吸入方法递送的抗体中。通过鼻内或吸入路径递送的抗体可以激活补体，衔接肺泡巨噬细胞，和/或具有向底侧面的有限扩散，其中效应子功能的参与可以提供提高的效力。
实施例8
针对乙型流感病毒的抗体效力
抗体CR9114结合并有效针对甲型流感以及乙型流感病毒，如以上所述及表1所示，并如之前所报道(DreyfusC等人,(2012)Science337(6100):1343-1348)。在小鼠模型中测试嵌合抗体CA9114(如上所述具有与小鼠IgG2a融合的人可变区)针对B/马来西亚株的效力。在24hpi测试以10mg/kg、1mg/kg和0.1mg/kg的IN和IP给药针对10XLD50的B/马来西亚(称作B/Mal)的效力。结果在图20中提供。在所有测试的剂量下，IN给药均比IP更加有效。在感染乙型流感病毒后1天鼻内递送的CA9114抗体有效地治疗动物，并消除因流感病毒造成的体重减轻。
对一系列在体外证实具有结合并中和乙型流感病毒的能力的单克隆抗体，包括许多种使用上述噬菌体展示而分离的B抗体，以及抗体CA9114，在鼻内针对B/佛罗里达和B/马来西亚病毒进行测试。在10xLD50的乙型流感病毒感染后24hpi，以1mg/kgIN施用每种抗体。结果在图21和22中表示，示出与CA9114抗体相比较的各种针对乙型流感B/佛罗里达和B/马来西亚的单克隆抗体的鼻内给药效力。对以1mg/kg在8hpi施用的CA9114和各种针对B/Mal的抗体进行类似的研究(图23)。所有测试的抗体均有效针对两种乙型流感病毒类型。这些研究证实了鼻内施用(包括在感染后8或24小时)的抗流感抗体针对乙型流感病毒的效力。
在用B/佛罗里达或B/马来西亚病毒感染的动物中测试其他乙型流感抗体的效力。用10XLD50的乙型流感病毒B/马来西亚病毒或B/佛罗里达病毒(分别为图37和图38)，评测在24hpi的1mg/kgIN施用的抗体5A7、CR8033和mAb809。所有IN施用的抗乙型流感抗体针对10XLD50剂量的各B谱系的感染完全有效，且抗体处理的感染后动物均保持100％体重。
实施例9
组合抗体研究
目前的流感疫苗包括诱导对人群中流通的流感病毒株的免疫力的抗原。四价流感疫苗涵盖甲型流感病毒，特别为H1病毒和H3病毒亚型，以及乙型流感病毒山形和维多利亚谱系。考虑到鼻内施用抗体针对甲型流感亚型以及乙型流感的上述效力，以及组合的多种抗体是有效的，进行了抗体组合的研究。这些组合包括模拟目前使用中的已确立的三价和四价疫苗并可以与其比较的组合。因此，致力于治疗流感、预防感染或预防传播，在动物模型中对组合鼻内抗体组合进行体内评价，并针对甲型流感和乙型流感病毒进行评价。
对两种甲型流感抗体和乙型流感抗体，具体为抗体43J23(通过噬菌体展示分离的抗乙型流感单克隆抗体)、抗体GG3(甲型流感抗-H1抗体)和CA8020(甲型流感抗-H3抗体)的混合抗体进行针对甲型流感H1、H3和乙型流感感染的效力组合的评价。在用流感病毒感染后24小时(24hpi)，将抗体43J23、GG3和CA8020各1mg/kg(抗体共3mg/kg)的混合抗体以50μl的总体积鼻内给药。在图24中，显示出在用乙型流感/佛罗里达(山形系)病毒感染后使用混合抗体进行的效力研究的结果。混合抗体针对乙型病毒感染的效力与1mg/kg单独的B抗体43J23的效力相当。抗体CA9114以1mg/kgIP给药未能保护动物不受乙型病毒感染，如通过百分比体重所评价的。值得注意的是，上述实施例说明，CA9114抗体在以1mg/kg鼻内(IN)给药时针对乙型病毒有效力。图25示出用抗体43J23、GG3和CA8020的混合抗体针对B/马来西亚病毒进行的类似研究的结果。确立了相同的混合抗体针对甲型流感病毒类似地有效，混合抗体在用H1病毒感染后的动物中保持体重(图26)。在该研究中(图26)，混合抗体的效力与以1mg/kgIN单独施用的抗-H1抗体GG3类似。混合抗体针对甲型流感H3亚型病毒类似地有效(图27)，再次，在CA8020的IP给药在相同剂量下不那么有效的条件下，在混合抗体中与用单一抗-H1抗体(CA8020)单独鼻内给药同样有效。图28示出鼻内混合抗体(抗-B抗体43J23、抗-AH1抗体GG3和抗甲型流感H3抗体CA8020)针对4种亚型的流通中流感病毒中每一个的研究，示出在单个实验中针对H1、H3、B(山形)和B(维多利亚)的效力。
在可比较的研究中，使用抗乙型流感和抗甲型流感抗体的不同组合评价另一鼻内混合抗体。在该研究中，将CA8020抗-H3抗体与抗-H1抗体CA6261和抗-B抗体5A7组合使用。据最近报道5A7抗体广泛地中和1985-2006年分离的属于山形和维多利亚系的乙型流感病毒株(YasugiM等人,(2013)PLoSPathog9(2):e1003150,doi:10.1371/journal.ppat.1003150)。将报道的抗体重链和轻链可变区克隆到含有与小鼠IgG2a融合的可变区的IgG表达载体中(与上文及实施例1中所述类似)。在用流感病毒感染之后24小时，将抗体5A7、CA6261和CA8020各1mg/kg(共3mg/kg抗体剂量)鼻内施用至动物。该混合抗体针对H1病毒、H3病毒、B(山形)和B(维多利亚)系病毒进行测试，针对所测试的任何和所有病毒均有效力(图29)。
实施例10
针对流感H1和H3病毒的替代抗体效力
用其他的可替代流感抗体，对使用鼻内给药而施用至气道的效力进行评价。人单克隆抗体直接从人受试者中分离，其中和组1和组2甲型流感病毒并针对其有效力。人抗体Mab53(也称作TRL53)记载于US2012/0020971和WO2011/160083中，其在中和组1和组2的H1、H9、H7和H5亚型中有效。抗体Mab579(也称作TRL579)记载于WO2013/086052中，在中和H3和H7中有效。在小鼠模型中对Mab579和53抗体进行针对甲型流感病毒感染的治疗效力的测试。Mab579针对H3流感测试，且Mab53病毒针对H1流感测试。对IN和IP给药进行比较，以1mg/kgIN给药，以高10倍的10mg/kgIP给药。在感染后24小时(24hpi)施用抗体Mab579，以用于针对10XLD50的H3流感病毒Vic11的治疗效力(图30)。在感染后24小时(24hpi)施用抗体Mab53，以用于针对10XLD50的H1流感病毒Cal09的治疗效力(图31)。在相同实验中即使以高10倍的剂量IP给药，IN给药也比IP给药更加有效。
实施例11
鼻内给药的抗体的预防研究
考虑到感染后中和抗体的鼻内给药的显著效力，进行研究以评价预防性及在感染病毒之前鼻内给药的效力。这些研究用于评价和说明鼻内给药在以下情形中的适用性：其中个体暴露于流感病毒并作为暴露或风险群体内预防或减少传播的有效方法，或者在临床上在感染或疾病整体上为更大健康风险的患者中。在小鼠动物模型中，在流感病毒感染之前数天对组1(H1)抗体CA6261进行给药评价。在感染攻击之前3、4、5、6和7天评价CA6261的给药，并直接比较不同剂量下的IN和IP给药。
在第一个研究中，将抗体CA6261IN或IP施用，然后将小鼠用3XLD50剂量的H1PR8病毒进行攻击。图32示出在感染病毒之前3或4天预防性地IN和IP施用的研究。在用3XLD50的PR8攻击之前3或4天，IN或IP施用抗体CA6261。将CA6261抗体IN(0.1mg/kg)或IP(0.1mg/kg和1mg/kg)施用。最多在感染前4天(-4dpi)的IN给药保护小鼠免于病毒攻击(在0.1mg/kg下评价)。感染前3或4天相同剂量(0.1mg/kg)的IP给药完全无效。在感染前3或4天以1mg/kgIP给药是有效的。在比较-3dpi和-4dip的IN(0.1mg/kg)和IP(1mg/kg)给药时，在两种情形中，低10倍的IN剂量比IP更加有效。
然后评价在病毒感染前5、6和7天的预防效力，结果显示于图33。剂量高10倍的IP相对于IN给药进行评价。在用3XLD50的H1流感病毒PR8攻击之前的5、6或7天，IP(以1mg/kg)或IN(以0.1mg/kg)施用抗体CA6261。另外对施用达菲(口服10mg/kg，一天两次，5天)进行评价，以用于对比。在-5dpi以0.1mg/kgIN给药表现出效力。在病毒攻击之前6或7天以0.1mg/kgIN给药，并非所有小鼠均存活。在攻击前5、6或7天，高10倍的IP剂量(10mg/kg)是有效的。攻击之前5天以0.1mg/kgIN施用抗体，至少与在攻击前7天以高10倍的剂量1mg/kgIP给药一样有效。
然后对病毒攻击前5、6和7天的1mg/kg的更高IN剂量进行评价。图34示出IN与IP给药的研究，在用3XLD50的病毒PR8攻击之前5、6或7天以1mg/kgIP或IN施用抗体CA6261。最多在病毒攻击之前7天，IN施用1mg/kg抗体在预防上是有效的，且在每种情形中，IN均比相同量IP施用的抗体更加有效。事实上，在任何时间(攻击之前5、6或7天)IN给药均比任何IP给药更加有效，即使IP给药更加接近于病毒攻击。在所有情形中，抗体均比达菲更加有效。
上述研究表明，对于预防性保护，IN给药实际上优于IP给药。在感染前至多5天(-5dpi)IN施用0.1mg/kg抗体对攻击(3xLD50)具有保护性。在病毒感染之前3-7天中的任意时间，相同剂量0.1mg/kg的IP施用的均不对动物提供保护(针对相同的3xLD50剂量的病毒)。在更高剂量的IN施用抗体(评价了1mg/kg)，如果提前至少多达7天给药，IN施用的抗体可以针对攻击提供保护。提前多于7天的IN给药未经评价，但可能是有效的。
而且，在攻击之前通过IN给药的多剂量被预测为潜在地更加有效(参见以上实施例和图11)。如图11所示，感染后的反复给药是有效的，且当多剂量间隔数小时(8小时、32小时、52小时)时，鼻内较低的剂量是有效的。类似地，在病毒感染或暴露之前的反复给药预计是有效的，并且可以允许更低的IN预防性剂量。
评价在更高剂量病毒攻击的预防性效力，具体地，在用10xLD50的H1病毒PR8攻击之前施用CA2621抗体。用10xLD50的PR8H1亚型病毒攻击之前的3和4天，IN或IP对动物施用0.1mg/kg的CA6261抗体(图35)。在病毒攻击之前3或4天IP施用0.1mg/kg抗体完全无效，与未接受处理的动物类似，IP处理的动物死于病毒感染。相反地，在高滴度病毒攻击之前3或4天鼻内施用0.1mg/kg抗体的动物受到保护免于感染。
对在高滴度攻击之前5、6和7天的抗体施用进行评价，抗体以1mg/kgIN或IP施用(图36)。在该研究中，只有抗体施用至气道(经由鼻内给药)的动物在病毒攻击后完全存活。在病毒攻击之前5、6或7天用施用的1mg/kg抗体处理的小鼠没有受到完全保护，小鼠死于感染。达菲在保护中完全无效。在病毒感染之前5或6天用0.1mg/kg抗体鼻内处理的小鼠于病毒攻击中存活，几乎与未感染的对照动物一样。
因此，抗流感抗体的鼻内给药用于针对抗体感染的预防是有效方案和方法。病毒感染之前至少多达7天鼻内施用的流感中和抗体对病毒攻击有保护性。已经针对高低度病毒(甚至高于合理预计的代表人对病毒的暴露的滴度)表明了在至少提前多达7天的鼻内给药的保护性。因此，在这些研究中观察到的保护水平表明，在人受试者中，鼻内抗体给药有效地针对病毒攻击而提供保护，并且阻断或降低病毒传播。鼻内施用的抗体在IP给药无效的条件和情形中具有保护性。
本发明可以在不偏离其精神或必需特征的前提下以其他方式实施或者以其他方式进行。因此，本公开内容在将在所有方面均视作是示例说明而并非限制性的，本发明的范围由所附权利要求说明，并且所有癌等同意义和范围内的变化均意在包括其中。
贯穿本说明书，引用了许多参考文献，其各个通过引用的方式全部并入本文。

Claims (39)

1.一种组合物，其配制成用于鼻内或吸入给药并有效用于治疗或预防哺乳动物中的流感病毒感染，其包含单一单位剂量为1mg/kg或更低的一种或多种流感病毒中和单克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，包含单一单位剂量各自为低于0.5mg/kg的一种或多种流感病毒中和单克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中，包含单一单位剂量各自为低于0.1mg/kg的一种或多种流感病毒中和单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中，包含单一单位剂量各自为低于0.05mg/kg的一种或多种流感病毒中和单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，一种或多种流感病毒中和抗体是能够中和并选自Fab、Fab’和F(ab’)2的抗体片段。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中，还包含药学可接受的赋形剂、载体或稀释剂、用于鼻或肺递送的添加剂、或免疫调节物或免疫反应刺激物。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中，包含流感中和抗体的组合，所述组合包含能够中和甲型流感H1病毒的抗体、能够中和甲型流感H3病毒的抗体、以及能够中和乙型流感病毒的抗体。
8.权利要求1所述的组合物在暴露于流感病毒或处于流感病毒暴露风险中或显现出呼吸道病毒感染临床症状的哺乳动物中治疗或预防流感病毒的用途。
9.一种用于在暴露于流感病毒或处于流感病毒暴露风险中或者显现出呼吸道病毒感染临床症状的哺乳动物中治疗或预防病毒感染的方法，包括鼻内(IN)或经由吸入而对所述哺乳动物施用一种或多种能够中和流感病毒的单克隆抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述单克隆抗体是IgG抗体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，包括施用一种或多种能够中和甲型流感病毒的单克隆抗体和一种或多种能够中和乙型流感病毒的抗体。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，包括施用能够中和甲型流感H1病毒的抗体、能够中和甲型流感H3病毒的抗体和能够中和乙型流感病毒的抗体。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体在感染后至多24小时的时间段内施用。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体在感染后至多48小时的时间段内施用。
15.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体在感染后至多72小时的时间段内施用。
16.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体在感染或暴露于病毒之前或者在病毒性疾病或与其有关的症状的临床显现之前以一个或多个剂量施用。
17.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述抗体以各自低于1mg/kg体重的单剂量施用。
18.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述抗体以各自低于0.5mg/kg的单剂量施用。
19.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述抗体以各自低于0.1mg/kg的单剂量施用。
20.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述抗体以各自低于0.05mg/kg的单剂量施用。
21.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述抗体以低于1mg/kg/剂量的多剂量鼻内或经吸入施用，所述多剂量间隔至少2小时施用，并且在假定感染、暴露或临床症状显现后至多72小时内首次施用。
22.根据权利要求9所述的方法，其中，还包括另外IP或IV施用病毒特异性单克隆抗体，另外施用的抗体是中和或非中和抗体。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，另外IP或IV施用的抗体是与IN或经吸入施用相同的抗体。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，另外IP或IV施用的抗体在IN或吸入施用抗体之前、同时、相继或随后进行施用。
25.一种用于施用针对流感病毒的单克隆抗体的方案，其包括施用一个或多个鼻内或吸入剂量的流感病毒中和抗体，并联合腹膜内或静脉内施用一种或多种流感抗体，所述鼻内或吸入剂量的抗体以1mg/kg或更低的剂量施用，且所述腹膜内或静脉内剂量的抗体以1mg/kg或更高的剂量施用并且是与所述鼻内或吸入剂量的抗体相同或不同的抗体。
26.根据权利要求25所述的方案，其中，所述腹膜内或静脉内剂量的抗体是非中和抗体。
27.根据权利要求25所述的方案，其中，所述鼻内或吸入剂量低于1mg/kg，且IP或IV剂量为至少5mg/kg。
28.根据权利要求25所述的方案，其中，所述鼻内或吸入剂量低于1mg/kg，并且IP或IV剂量以mg/kg计比所述鼻内剂量高出至少10倍。
29.根据权利要求25所述的方案，其中，所述鼻内或吸入剂量低于0.5mg/kg，并且IP或IV剂量为至少5mg/kg。
30.根据权利要求25所述的方案，其中，所述鼻内或吸入剂量低于1mg/kg，并且在假定感染、暴露或者临床症状显现后24小时内施用。
31.根据权利要求25所述的方案，其中，所述鼻内或吸入剂量低于1mg/kg，并且在假定感染、暴露或者临床症状显现后48小时内施用。
32.一种用于抑制流感病毒的传播的方法，其包括对暴露于呼吸道病毒、处于呼吸道病毒的暴露风险中或表现出呼吸道病毒感染的临床体征的受试者经鼻内或经吸入施用单一单位剂量为1mg/kg或更低的一种或多种流感病毒中和抗体。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述抗体是IgG抗体。
34.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒中和抗体在假定感染、暴露或者临床症状显现后48小时内施用。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒中和抗体在假定感染、暴露或者临床症状显现后24小时内施用。
36.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒中和抗体在假定感染、暴露或者临床症状显现后的24小时后以及72小时内施用。
37.根据权利要求32所述的方法，其中，所述病毒中和抗体在暴露或临床症状显现前以一个或多个剂量施用。
38.根据权利要求32所述的方法，其中，所述抗体以低于0.5mg/kg的剂量施用。
39.根据权利要求32所述的方法，其中，所述抗体以低于0.1mg/kg的剂量施用。
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