CN105208855B - 表达嵌合的主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子的转基因小鼠 - Google Patents

表达嵌合的主要组织相容性复合物(mhc)ii类分子的转基因小鼠 Download PDF

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Abstract

本发明提供了基因修饰的非人类动物，所述动物表达人源化MHC II蛋白(人源化的MHC II和多肽)，也提供了包括相同的人源化MHC II蛋白的胚胎、细胞和组织。本发明还提供了用于制备所述基因修饰动物的构建体及其制备方法。本发明提供了使用所述基因修饰动物以研究人类免疫***各方面的方法。

Description

表达嵌合的主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的转基因 小鼠
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月11日提交的美国专利申请13/793,935的权益，其内容在此全部并入本申请。
发明领域
本发明涉及一种非人动物，例如，啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)，所述动物经基因工程改造以表达人源化主要组织相容性复合物(MHC)II类蛋白，以及表达其的胚胎、组织和细胞。本发明还涉及到用于制备表达人源化MHC II类蛋白质的基因修饰非人动物的方法。本发明还提供了使用表达人源化MHC II类蛋白的非人动物、细胞和组织来鉴定激活淋巴细胞并衔接T细胞的肽的方法，并且用于开发人用疫苗和其他疗法的方法。
发明背景
在适应性免疫应答中，外源抗原被在B淋巴细胞和T淋巴细胞上的受体分子(例如，免疫球蛋白和T细胞受体或TCR)识别。这些外来抗原由特定的蛋白在细胞表面上以蛋白片段的形式递呈，统称为主要组织相容性复合物(MHC)分子。MHC分子是由跨度约4Mb的、被发现为基因的连接簇的多个基因座编码。在小鼠中，在17号染色体上发现MHC基因，由于历史原因，其被称为组织相容性2(H-2)基因。在人类中，在染色体6上发现该基因，被称为人类白细胞抗原(HLA)基因。小鼠和人类中的基因座是多基因的；它们包括三个高多态类MHC基因(I、II和III类)，在人类和小鼠基因组(分别参见图2和图3)中表现出类似的组织。
MHC基因座在基因组中表现出最高的多态性；一些基因由>300等位基因代表(例如，人HLA-DRβ和人HLA-B)。所有I和II类MHC基因都可以递呈肽片段，但每个基因表达具有不同结合特性、反映多态性和等位基因变体的蛋白质。任何给定的个体具有独特的肽片段范围，其可以在免疫应答过程中被递呈在B和T细胞的细胞表面上。
人类和小鼠都具有II类MHC基因(见图2和3)。在人类中，经典MHC II基因被称为HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，而在小鼠中它们是H-2A和H-2E(通常分别缩写为I-A和I-E)。由MHC II基因座中的基因编码的额外的蛋白，人类中的HLA-DM和HLA-DO，和小鼠中的H-2M和H-20，都没有出现在细胞表面上，但它们驻留在内吞隔室并且确保MHC II分子正确装载肽。II类分子由两条多肽链组成：α链和β链。所述α链的胞外部分包括两个胞外域，α1和α2；并且β链的胞外部分也包括两个胞外域，β1和β2(见图1)。所述α链和β链非共价地相互连接。
MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)上表达，例如，炎症的过程中的B细胞、巨噬细胞、树突细胞、内皮细胞等。在APC表面上表达的MHC II类分子通常针对CD4+T细胞递呈在细胞内囊泡中产生的抗原。为了参与CD4+T细胞衔接，所述具有目的抗原的MHC II类复合物必须是足够稳定的，以存活足够长以衔接CD4+T细胞。当CD4+辅助T细胞由在APC表面上的外源肽/MHC II复合物衔接时，所述T细胞被激活以释放协助针对入侵者的免疫反应的细胞因子。
因耐受机制,不是所有的抗原都引发T细胞活化。然而，在一些疾病(例如，癌症、自身免疫性疾病)中，来自自体蛋白的肽成为免疫***的细胞成分的靶标，这导致递呈这些肽的细胞遭受破坏。在临床上具有显著意义的识别抗原方面(例如，与不同类型的癌症相关的抗原)已经有显著进步。但是，为了提高对将引发人T细胞的适当的响应的肽的识别和选择，特别是临床显著的抗原的肽，仍然需要模仿人免疫***方面的体内和体外***。因此，需要可以显示人的免疫***组件的生物***(例如，遗传修饰的非人类动物和细胞)。
发明概述
本发明提供了一种生物***，其用于产生或鉴定与人MHC II类蛋白质及其嵌合物相关联，并且与CD4+T细胞结合的肽。本发明提供了非人类动物，其包括表达在细胞免疫反应中起作用的人源化分子的非人类细胞。本发明还提供了编码人源化MHC II蛋白质的人源化啮齿动物基因座。还提供了表达人源化MHC分子的人源化啮齿动物细胞。本发明提供了包括人源化啮齿动物细胞的体内和体外***，其中，所述啮齿动物细胞表达一种或多种人源化的免疫***分子。
本发明提供了非人类动物，例如，啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)在其基因组中包括编码人源化MHC II复合物的核苷酸序列，其中所述人源化MHC II复合物的人类部分包括人MHC II复合物的胞外域，例如，人源化MHC IIα胞外域和人源化MHC IIβ胞外域。
在一个方面，本发明提供一种非人类动物，其在内源性MHC IIα基因座包括编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种嵌合的人/非人MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα胞外域。在一个实施方式中，所述非人类动物在该动物的细胞的表面上表达功能性的MHC II复合物。在一个实施方式中，在该动物中所述人MHC IIα胞外域包括人MHC IIα1和α2域；在一个实施方式中，所述嵌合人/非人MHC IIα多肽的非人类部分包括内源非人MHC IIα多肽的跨膜域和胞质域。在一个实施方式中，编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的核苷酸序列与内源非人MHC IIα启动子和调控元件可操作地连接(例如，在调节控制下被表达)。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分来自人HLA II类蛋白，所述人HLA II类蛋白选自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，例如所述人类部分来自人HLAII类蛋白，所述人HLA II类蛋白选自下组：HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8蛋白。所述非人类动物可以是啮齿动物，例如，小鼠。在一个方面，包括在内源性MHC IIα基因座编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的核苷酸序列的所述非人类动物进一步包括在内源性MHC IIβ基因座编码嵌合人/非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列。本发明还提供了一种制备基因修饰的非人类动物的方法，所述非人类动物包括在内源性MHC IIα基因座编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的核苷酸序列。这种方法可以包括在内源性MHC IIα基因座用编码嵌合的人/非人MHCIIα多肽的核苷酸序列取代编码内源性非人MHC IIα多肽的核苷酸序列。
本发明还提供一个非人动物，其包括在内源MHC IIβ基因座编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列。在一个实施方式中，这种嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ胞外域。在一个实施方式中，所述非人动物在该动物的细胞的表面上表达功能性MHC II复合物。在一个实施方式中，在该动物中的所述人MHC IIβ胞外域包括人MHCIIβ1和β2域；在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的非人类部分包括内源性非人MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域。在一个实施方式中，编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的所述核苷酸序列与内源性非人MHC IIβ启动子和调控元件可操作地连接(例如，在调节控制下被表达)。在一个实施方式中，所述嵌合多肽的人类部分来自人HLA II类蛋白，所述HLA II类蛋白选自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP，例如所述人类部分来自HLA II类蛋白，所述HLA II类蛋白选自下组：HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8蛋白。所述非人类动物可以是啮齿动物，例如，小鼠。在一个方面，包括在内源性MHC IIβ基因座编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列的所述非人动物进一步包括在内源性MHC IIα基因座编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的核苷酸序列。本发明还提供一种制备基因修饰非人动物的方法，所述动物包括在内源性MHC IIβ基因座编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列。这种方法可以包括在内源性MHC IIβ基因座以编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列取代编码内源非人MHC IIβ多肽的核苷酸序列。
在一个方面中，本发明提供了一种非人动物，所述非人动物包括在内源性MHC II基因座编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα胞外域并且嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人MHC IIα和β多肽在细胞表面上形成功能性嵌合MHC II复合物(例如，人/非人MHC II复合物)。在一个实施方式中，所述人MHC IIα胞外域包括人MHC II的人α1和α2域。在一个实施方式中，所述人MHC IIβ胞外域包括人MHC II的人β1和β2域。在各个方面，所述第一核苷酸序列在内源性非人MHC IIα启动子和调节元件的调节控制下(例如，可操作地连接)表达。在各个方面，所述第二核苷酸序列在内源性非人MHC IIβ启动子和调节元件的调节控制下(例如，可操作地连接)表达。在一些实施方式中，所述嵌合的人/非人MHCIIα多肽的非人类的部分包括内源性非人MHC IIα多肽的跨膜域和胞质域。在一些实施方式中，所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的非人类的部分包括内源性非人MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域。
在各种实施方式中，所述非人类动物是啮齿动物，并且所述嵌合的人/啮齿动物MHC IIα和β多肽的人类部分包括来自HLA II类蛋白的人序列，所述HLA II类蛋白选自下组：HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物MHC IIα和β序列的人类部分来自人HLA-DR4序列；因而，编码MHC IIα胞外域的所述核苷酸序列是来自HLA-DRα*01基因的序列，并且编码MHC IIβ胞外域的所述核苷酸序列是来自HLA-DRβ1*04基因序列。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物的MHC IIα和β序列的人的部分均来自于人HLA-DR2序列；因而，编码所述MHC IIα胞外域的核苷酸序列是来自HLA-DRα1*01基因的序列，并且编码所述MHC IIβ胞外域的核苷酸序列是来自HLA-DRβ1*02基因的序列(例如，HLA-DRβ1*02(1501)基因)。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物MHC IIα和β序列的人的部分均来自于人HLA-DQ2序列；因而，编码所述MHC IIα胞外域的核苷酸序列来自HLA-DQα1*05基因的序列(例如，HLA-DQA1*1501基因)，并且编码所述MHCIIβ胞外域的核苷酸序列是来自HLA-DQβ1*02基因的序列。在本发明的一些实施方式中，所述嵌合的人/啮齿动物MHC IIα和β序列的人的部分均来自于人HLA-DQ8序列；因而，编码所述MHC IIα胞外域的核苷酸序列是来自HLA-DQα1*0301基因的序列，并且编码所述MHC IIβ胞外域的核苷酸序列是来自HLA-DQβ1*0302基因的序列。
在本发明的各种实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列位于同一条染色体上。在一些方面中，所述动物包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的两个拷贝，而在其它方面，所述动物包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的一个拷贝。因此，所述动物对包括第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座可为纯合或杂合的。在一个实施方式中，本发明所述嵌合MHC II是在非人类动物的种系中。
在一些方面，所述嵌合的MHC IIα多肽和/或嵌合MHC IIβ多肽与非人前导序列可操作地连接。
在一个方面，基因工程改造的非人类动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。因此，在一些实施方式中，所述嵌合的MHC IIα和β基因的非人序列来源于编码小鼠MHC II类蛋白质的核苷酸序列，例如，鼠H-2A或H-2E蛋白。在一个实施方式中，本发明的所述啮齿动物(例如，大鼠或小鼠)不在其内源性的基因座表达功能性内源性MHC II多肽。在一个实施方式中，其中所述啮齿动物是小鼠，所述小鼠不在其内源性基因座表达功能性内源性H-2E和H-2A多肽。
因此，在一些实施方式中，本发明提供了一种小鼠，所述小鼠在内源性小鼠MHC II基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠MHCIIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括来自人HLA II类蛋白的α多肽的胞外域，所述人HLA II类蛋白选自HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8并且所述嵌合的人/小鼠的MHC IIβ多肽的人类部分包括来自人HLA II类蛋白的β多肽的胞外域，所述人HLA II类蛋白选自HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8，其中所述嵌合的MHCIIα多肽的小鼠部分包括小鼠H-2A或H-2Eα链的跨膜域和胞质域，并且所述嵌合MHC IIβ多肽的小鼠部分包括小鼠H-2A或H-2Eβ链的跨膜域和胞质域，其中所述小鼠表达功能性嵌合的HLA II类复合物。在一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DR4/H-2E。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DR2/H-2E。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DQ2/H-2A。在另一个实施方式中，所述功能性嵌合的HLA II类复合物是HLA-DQ8/H-2A。在一些方面，所述嵌合的MHC IIα多肽的胞外域包括人α1和α2域；在一些方面，所述嵌合MHC IIβ多肽的胞外域包括人β1和β2域。在一些实施方式中，所述第一核苷酸序列在内源性小鼠MHC IIα启动子和调节元件的调节控制下(例如，可操作地连接)表达，并且所述第二核苷酸序列在内源性非人MHC IIβ启动子和调节元件的调节控制下(例如，可操作地连接)表达。在各种实施方式中，所述小鼠不在它们的内源基因座表达功能性内源性MHC II多肽，例如，H-2E和H-2A多肽。在一些方面中，所述小鼠包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的两个拷贝，而在其它方面，所述小鼠包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的一个拷贝。
此外，本发明提供一种小鼠，其在其基因组，例如，在其内源性MHC II基因座，包括一个或多个，例如一个、两个、三个、四个编码嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列。在一个实施方式中，每种复合物都包括MHC IIα和MHC IIβ多肽，并且所述嵌合的MHC IIα和MHC IIβ多肽的人类部分分别包括人MHC IIα和MHC IIβ多肽的胞外域，而小鼠部分分别包括小鼠MHC IIα和MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域。因此，所述小鼠可以表达一种或多种，例如一个、两个、三个、四个嵌合的人/小鼠MHC II复合物。
本发明在此还提供了一种制备基因工程非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)的方法。在各种实施方式中，本发明的非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)通过用编码嵌合的人/非人(例如人/小鼠)MHC IIα和β多肽的核苷酸序列取代内源性MHCII序列而制备。在一个实施方式中，本发明提供一种修饰啮齿动物的MHC II基因座(例如，小鼠或大鼠)以表达嵌合的人/啮齿动物MHC II复合物的方法，所述复合物包括在内源性啮齿动物MHC II基因座用编码嵌合的人/啮齿动物MHC II复合物的核苷酸序列取代编码啮齿动物MHC II复合物的核苷酸序列。在所述方法的一个方面，所述编码嵌合的人/啮齿动物MHC II复合物的核苷酸序列包括编码人MHC IIα链的胞外域和MHC IIα链的跨膜域和胞质域的第一核苷酸序列和编码人MHC IIβ链的胞外域和啮齿动物MHC IIβ链的跨膜域和胞质域的第二核苷酸序列。在一些方面中，所述嵌合的MHC II复合物的啮齿动物部分来自小鼠H-2E蛋白并且人类部分来自人HLA-DR4蛋白。在一些方面，所述嵌合的MHC II复合体的啮齿动物部分来自小鼠H-2E蛋白并且人类部分来自人HLA-DR2蛋白。在一些方面，所述嵌合的MHC II复合物的啮齿动物部分来自小鼠H-2A蛋白并且人类部分来自人HLA-DQ2蛋白。在其它方面，所述嵌合的MHC II复合物的啮齿动物部分来自小鼠H-2A蛋白并且人类部分来自人HLA-DQ8蛋白。在一些实施方式中，本申请描述的所述内源性MHC II基因座的取代发生在单个ES细胞中，并且所述单个ES细胞被引入啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)胚胎，以制备遗传修饰的啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)。
本发明还提供一种编码嵌合的人/非人MHC II复合物的非人嵌合的MHC II基因座，其包括编码人MHC IIα链的胞外域和非人MHC IIα链的跨膜域和胞质域的第一核苷酸序列和编码人MHC IIβ链的胞外域和非人MHC IIβ链的跨膜域和胞质域的第二核苷酸序列。在一个方面，所述嵌合的MHC II基因座是在非人类动物的基因组中的内源性MHC II的位置。在一个方面，所述嵌合的MHC II基因座表达嵌合的人/非人(例如，人/啮齿动物，例如，人/小鼠或人/大鼠)MHC II复合物。在一个实施方式中，所述人MHC II选自HLA-DQ、HLA-DR和HLA-DP(例如，HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2和HLA-DQ8)。在一个实施方式中，所述非人类MHCII是选自H-2A和H-2E的小鼠MHC II。在一个方面，所述嵌合的MHC II基因座可以通过本发明所述的用于产生转基因非人类动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)的任何方法获得。
本申请还提供来自本发明所述的非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)细胞，例如，分离的抗原递呈细胞。本发明还提供了本申请描述的来自非人动物的组织和胚胎。
除非另有明示或者从上下文中是显而易见的，本申请所述的任意实施方式和方面均可以用于彼此之间组合。通过对随后详细描述的回顾，其他实施方式对本领域技术人员将是显而易见的。下述的详细描述包括对本发明不同实施方式的示例性表述，其对所主张本发明不具有限制作用。附图构成本说明书的一部分，其与该描述一起，仅用于说明实施方式，并非用于限制本发明。
附图简述 图1是表示在抗原递呈细胞(APC)的表面上MHC II类分子的示意图，包括四个结构域：α1，α2，β1和β2。灰色的圆圈代表结合在肽结合裂隙的肽。
图2是所述人HLA的相对基因组结构的示意图(未按比例)，表示I、II和III类基因。
图3是所述小鼠MHC的相对基因组结构的示意图(未按比例)，表示I、II和III类基因。
图4(A-D)是用于产生靶向载体的策略的示意图(未按比例)，所述靶向载体包括人源化的I-Eβ和I-Eα(即，分别为H-2Eβ/HLA-DRβ1*04和H-2Eα/HLA-DR*01嵌合体)。在图4C中，来自图4B的最终人源化的MHC II序列连接在如图4A的最终构建体的PI-SceI和I-CeuI限制性位点之间以产生包括人源化MHC II和来自BALB/c的I-Eα的外显子1的构建体。Pg＝假基因；BHR＝细菌同源重组；CM＝氯霉素；spec＝大观霉素；hyg＝潮霉素；neo＝新霉素；EP＝电穿孔。三角形表示外显子，实心三角形表示来自C57BL/6小鼠的小鼠外显子(散列三角形除外，它们代表来自BALB/c小鼠的I-Eα的外显子1)和空心三角形代表人类外显子。
图5示出未按比例绘制的MHC II类I-E和I-A基因的示意图，显示了使用潮霉素表达盒敲除小鼠基因座，接着引入一个包括人源化的I-Eβ和I-Eα的载体(即，分别为H-2Eβ/HLA-DRβ1*04和H-2Eα/HLA-DRα*01嵌合体)。空心三角形代表人类外显子；实心三角形代表小鼠的外显子。用于基因分型的探针用圆圈标出。
图6示出未按比例绘制的图5的Cre-介导的去除新霉素表达盒的示意图。空心三角形代表人类外显子；实心三角形代表小鼠的外显子。顶端两条链代表在人源化的MHC II杂合的小鼠内的MHC II的基因座，所述小鼠具有新霉素表达盒，和底部的两条链代表在人源化的MHC II杂合的小鼠中的MHC II基因座，所述小鼠已移除新霉素表达盒。
图7示出未按比例的小鼠和人II类基因座的示意性对比说明。II类基因由框表示。各种核酸片段的相对尺寸(kb)均包括在内。
图8，在左侧面，是未按比例的用于MHC IIα链的人源化策略的示意图；特别地，图中显示了对α1和α2域的替换，由MHC IIα基因的外显子2和3编码，同时保持小鼠跨膜和胞质尾序列。在人源化基因座，所述MHC IIα前导序列来自小鼠BALB/c菌株。右侧图显示了MHCIIβ链的人源化；特别地，图中显示了对β1和β2域的替换，由MHC IIβ基因的外显子2和3编码，同时保留了小鼠前导序列和小鼠跨膜和胞质尾序列。上排都是人类序列；中间一排都是小鼠序列；底部一排都是人源化序列，具有来自人的HLA-DR基因外显子2和3。
图9显示了，用来自针对嵌合的HLA-DR4(移除neo表达盒)(在存在(1681HET+聚(I:C)或不存在聚(I:C)的(1681HET)下)杂合的小鼠和野生型小鼠(WT小鼠)的B细胞的抗HLA-DR抗体的进行的FACS的分析。
图10是用于产生人源化MHC II基因的靶向载体的(未按比例)的示意图，具体地，用于产生的HLA-DQ2.5/H2-A小鼠的靶向载体(图10A)，用于产生HLA-DQ8.1/H-2A小鼠的靶向载体(图10B)，以及用于产生HLA-DR2/H-2E小鼠(图10C)的靶向载体。在图中，除非另有说明(例如，loxP基因座等)，空心盒状或三角形是人类外显子的序列，双线是人类内含子序列，实心盒状或三角形是小鼠外显子的序列，单线是小鼠内含子序列，和散列三角形是来自BALB/c小鼠的I-Eα的外显子。在每个靶向载体图下都指示了连接处序列的位置并在表1和序列表中列明。
图11显示在获取自WT的或杂合的HLA-DQ2.5/H-2A(“6040Het”)小鼠的CD19+B细胞上的小鼠H-2A/H-2E(IA/IE)和人类HLA-DQ2.5的表达。
发明详述
定义
本发明提供了表达人或人源化的MHC II多肽的基因修饰的非人动物(例如小鼠、大鼠、家兔等)；包含其的胚胎、细胞和组织；制备其的方法；以及使用其的方法。除非另有定义，本申请中使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在现有技术中已有的含义，除非存在相反的明确指示或从该术语或短语使用的上下文中是显而易见的。
术语“保守的”当用于描述保守的氨基酸取代时，包括氨基酸残基被带有具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链R基团的其他氨基酸残基取代。可以通过修饰核苷酸序列实现保守的氨基酸取代，以引入编码保守的取代的核苷酸改变。在通常情况下，保守的氨基酸取代将基本上不改变目的蛋白的功能性性质，例如MHC II分子递呈目的肽的能力。带有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括脂肪族侧链如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；脂肪族-羟基侧链如丝氨酸和苏氨酸；含有酰胺的侧链如天冬酰胺和谷氨酰胺；芳香侧链如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；碱性侧链如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；酸性侧链如天冬氨酸和谷氨酸；以及含硫侧链如半胱氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基团包括例如缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、赖氨酸/精氨酸、丙氨酸/缬氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和天冬酰胺/谷氨酰胺。在一些实施方式中，保守的氨基酸取代可以是使用丙氨酸取代蛋白中的任意天然残基，如用在例如丙氨酸扫描诱变中。在一些实施方式中，Gonnet等((1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein SequenceDatabase,Science 256:1443-45)披露保守的氨基酸取代使得在PAM250 log-似然性矩阵中具有正值，其通过引用并入本申请。在一些实施方式中，所述取代是适度保守的取代，其中所述取代在PAM250 log-似然性矩阵中具有非负值。
因此，本发明也包括转基因非人动物，其基因组包括编码人或人源化MHC II多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包括在本申请中所描述的氨基酸序列中的保守氨基酸取代。
本领域技术人员将理解，除了在本申请中所述的编码人或人源化MHC II多肽的核酸残基，由于遗传密码的简并性，其它核酸可以编码本发明的多肽。因此，除了转基因的非人类动物外(其基因组中包括用保守的氨基酸取代基编码MHC II多肽的核苷酸序列)，本申请也提供了一种非人动物，由于遗传密码的简并性，其基因组包括不同于本申请中所描述的核苷酸序列。
术语“同一性”当与序列结合使用时包括根据本领域公知的能够用于测定核苷酸和/或氨基酸序列同一性的多种不同算法确定的同一性。在本申请所述的一些实施方式中，使用开放缺口罚分为10.0，延伸缺口罚分为0.1的ClustalW v.1.83(slow)比对和使用Gonnet相似性矩阵(MacVectorTM10.0.2,MacVector Inc.,2008)确定同一性。针对序列的同一性比较序列的长度将取决于特定的序列。在不同实施方式中，通过从其N-末端至其C-末端比较成熟蛋白的序列确定其同一性。在不同实施方式中，当将嵌合的人/非人序列与人序列进行比较时，将所述嵌合的人/非人序列的人部分(而不是非人部分)用于进行针对确定人序列与嵌合的人/非人序列的人部分之间的同一性水平目的的比较(例如将嵌合人/小鼠蛋白的人胞外域与人蛋白的人胞外域进行比较)。
术语“同源性”或“同源的”涉及序列例如核苷酸或氨基酸序列时指两条序列根据最佳比对和比较，至少约75％的核苷酸或氨基酸、例如至少约80％的核苷酸或氨基酸、例如至少约90-95％的核苷酸或氨基酸、例如超过97％的核苷酸或氨基酸是一致的。本领域技术人员将理解对于最佳基因靶向所述靶向构建体应含有与内源性DNA序列具有同源性的臂(“即同源臂”)；因此，同源重组可以发生在靶向构建体与被靶向的内源性序列之间。
术语“可操作地连接”指并列的，其中这样描述的所述组分与允许其以其意向的方式发挥功能相关。正因如此，编码蛋白的核酸序列可以与调控序列(例如，启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接以保持正确的转录调控。此外，本发明嵌合或人源化蛋白的不同部分可以可操作地连接以保持合适的折叠、加工、靶向、表达，以及所述蛋白在细胞中的其他功能性性质。除非另有说明，本发明嵌合或人源化蛋白的不同结构域彼此之间可操作地连接。
如本申请所用的术语“MHC II复合物”，“MHC II蛋白”等，包括MHC IIα多肽和MHCIIβ多肽之间的复合物。如本申请所用的术语“MHC IIα多肽”或“MHC IIβ多肽”(等)，分别包括单独的MHC IIα多肽或单独的MHC IIβ多肽。类似地，术语“HLA-DR4复合物”、“HLA-DR4蛋白”、“H-2E复杂”、“H-2E”蛋白，等(例如，指其他MHC II等位基因的类似的术语)，指α和β多肽之间的复合物。典型地，术语“人MHC”和“HLA”可互换使用。
关于基因取代的术语“取代”是指在内源基因座放置外源遗传物质，由此以直系同源的或同源的核酸序列取代所有或一部分的内源基因。如以下实施例中所述，内源性MHCII基因座的核酸序列被包括编码人MHC IIα和β多肽部分的序列的核苷酸序列所取代；具体地是编码MHC IIα和β多肽的胞外部分的序列。
关于功能性多肽，如本申请所用的“功能性”是指一种多肽，其保留通常与天然蛋白相关联的至少一种生物活性。例如，在本发明的一些实施方式中，在内源基因座(例如，在内源非人MHC II基因座的取代)的取代导致不能表达功能性内源多肽的基因座。同样，在本申请中所用的关于蛋白的功能性胞外域的术语“功能性”，是指保留其功能的胞外域，例如，在MHC II的情况下，能够结合抗原，结合T细胞共同受体的能力等。在本发明的一些实施方式中，在内源性MHC基因座的取代导致基因座不能表达内源性MHC的胞外域(例如，功能性胞外域)，而表达人MHC的胞外域(例如，功能性的胞外域)。
基因修饰的MHC II动物
在各个方面，本发明一般提供了基因修饰的非人动物，在其基因组中，其包括编码人或人源化MHC II复合物的核苷酸序列；因而，所述动物表达人或人源化MHC II复合物(例如，MHC IIα和β多肽)。
MHC基因被分为三类：I类，II类和III类，所有这些都是或者在人6号染色体或者在小鼠17号染色体上编码的。图2和3分别显示了人类和小鼠的MHC类的相对结构的示意图。多数MHC基因是多态的，实际上它们是小鼠和人基因组的最具多态性的基因。MHC多态性被假定为在提供进化优势时非常重要；序列变化可导致肽结合的差异，其允许更好的抗原呈递。一个例外是人HLA-DRα链及其小鼠同源物，Eα(即，H-2Ea)，它们是单态。
MHC II类复合物包括两个非共价连接的结构域：α链和β链，在本申请中也称作α多肽和β多肽(图1)。蛋白质跨越细胞膜；因而它包括胞外域、跨膜结构域和胞质域。所述α链的胞外部分包括α1和α2域并且所述β链的胞外部分包括β1和β2域。所述α1和β1域在细胞表面上形成肽结合裂隙。由于MHC II复合物的肽结合裂隙的三维构型，理论上结合抗原的长度没有上限，但通常由MHC II递呈的肽在长度上介于13和17个氨基酸之间。
除了其与抗原肽相互作用，所述MHC II分子的肽结合裂隙与不变链(Ii)在MHC II复合物形成和肽获得过程中相互作用。所述α/βMHC II二聚体在内质网中组装并且和Ii链结合，所述Ii链是负责控制肽结合和将MHC II靶向到内吞途径。在核内体中，Ii经历蛋白水解，并且Ii的小片段，与II类结合的不变链肽(CLIP)，保留在肽结合裂隙处。在核内体中，在HLA-DM(在人类中)的控制下，CLIP被抗原肽所替换。
MHC II与T细胞的共受体CD4在α2和β2域之间的连接处的疏水裂缝处相互作用。Wang and Reinherz(2002)Structural Basis of T Cell Recognition of PeptidesBound to MHC Molecules,Molecular Immunology,38:1039-49.当CD4和T细胞受体与和肽复合的相同的MHC II分子结合时，T细胞对抗原的灵敏度提高，并且它只需要低100倍的抗原来激活。参见Janeway’s Immunobiology,7th Ed.,Murphy et al.eds.,GarlandScience,2008，其通过引用并入本申请。
已经提出了MHC II类分子的跨膜和胞质域的大量功能。胞质域已被证明对细胞内信号，运输到细胞膜，并且最终的抗原递呈十分重要。例如，T细胞杂交瘤对用在胞质域处截断的MHC IIβ链转染的抗原递呈细胞(APCs)的响应很低，并且B细胞分化的诱导受到阻碍。参见，例如，Smiley et al.(1996)Truncation of the class IIβ-chain cytoplasmicdomain influences the level of class II/invariant chain-derived peptidecomplexes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:241-44.II类分子的截断似乎削弱了cAMP产生。已经假定缺失MHC II的胞质尾影响细胞内运输，从而阻止了复合物通过内吞途径时与相关抗原相遇。Smiley等(同上)的研究表明，II类分子在胞质域的截断减少CLIP/II类复合物的数量，假设这会影响CLIP的有效调节抗原呈递的能力。
据推测，由于MHC II群集对T细胞受体(TCR)的触发十分重要，如果在胞质域处截断的MHC II类分子不能与细胞骨架结合并从而聚集，则对T细胞的抗原呈递会受到影响。Ostrand-Rosenberg et al.(1991)Abrogation of Tumorigenicity by MHC Class IIAntigen Expression Requires the Cytoplasmic Domain of the Class II Molecule,J.Immunol.147:2419-22。事实上，最近表明，在胞质域处截断的HLA-DR未能在低聚反应后与细胞骨架相结合。El Fakhy et al.(2004)Delineation of the HLA-DR Region andthe Residues Involved in the Association with the Cytoskeleton,J.Biol.Chem.279:18472-80。重要的是，肌动蛋白细胞骨架是会影响抗原呈递局部信号转导活性的位点。除了与细胞骨架结合，最近的研究还表明，高达20％的HLA-DR分子构成性地驻留在APCs的脂筏中，它们是富集胆固醇和鞘糖脂的微区，而且这样的定位对抗原呈递、免疫突触的形成，以及MHC II-介导信号转导很重要。参见，例如，Dolan等.(2004)InvariantChain and the MHC II Cytoplasmic Domains Regulate Localization of MHC ClassII Molecules to Lipid Rafts in Tumor Cell-Based Vaccines,J.Immunol.172:907-14.Dolan等提示了MHC II的胞质域截断减少了MHC II向脂筏构成性地定位。
另外，MHC II的胞质域，特别是β链，包括通过泛素连接酶(膜结合的RING-CH I(MARCH I))发生泛素化的亮氨酸残基，所述MARCH控制内吞运输、内化和MHC II的降解；并且已经证明，MARCH介导的泛素化因树突细胞成熟而停止后导致MHC II的水平在细胞膜增加。Shin et al.(2006)Surface expression of MHC class II in dendritic cells iscontrolled by regulated ubiquitination,Nature 444:115-18；De Gassart et al.(2008)MHC class II stabilization at the surface of human dendritic cells isthe result of maturation-dependent MARCH I down-regulation,Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:3491-96.
MHC II的α和β链的跨膜域彼此相互作用并且该相互作用对II类MHC复合物的正确组装很重要。Cosson and Bonifacino(1992)Role of Transmembrane DomainInteractions in the Assembly of Class II MHC Molecules,Nature 258:659-62.事实上，如果MHC II类分子的α和β链的跨膜域被IL-2受体的α链取代，则MHC II类分子被留在ER，并且在细胞表面几乎检测不到。同上。通过诱变研究，在α和β跨膜域的保守Gly残基被认为是负责在细胞表面的MHC II组装。同上。因此，跨膜和胞质域两者对MHC II复合物的正常功能是至关重要的。
在各种实施方式中，本发明提供了一种转基因非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)，在其基因组中包括编码人或人源化MHC II复合物的核苷酸序列，例如，人或人源化MHCIIα和/或β多肽。非人动物可以在其基因组中包括编码部分人和部分非人(例如，表达嵌合的人/非人MHC II复合物的非人动物(例如，表达嵌合人/非人MHC IIα和β多肽的非人动物))的MHC II复合物的核苷酸序列。在一个方面，所述非人动物只表达人或人源化MHC II复合物，例如，嵌合的人/非人MHC II复合物，并不表达来自内源性MHC II基因座的内源非人MHC II复合物。在一些实施方式中，所述动物不能表达来自内源性MHC II基因座的任何内源非人MHC II复合物，但只表达人或人源化MHC II复合物。在其他实施方式中，所述动物保留编码功能性的内源小鼠MHC II多肽的核苷酸序列。在各种实施方式中，转基因的非人类动物(例如，小鼠、大鼠、兔等)在其种系中包括编码人或人源化MHC II复合物的核苷酸序列，例如，人或人源化MHC IIα和/或β多肽。
在一个实施方式中，本申请提供的一种非人动物，例如，啮齿动物，例如，大鼠或小鼠，在其基因组中包括，例如，在内源性非人类MHC II基因座，编码人类MHC II多肽的核苷酸序列。在另一个实施方式中，本申请提供了非人动物，例如，啮齿动物，例如，大鼠或小鼠，在其基因组中包括，例如，在内源性MHC II基因座，编码嵌合的人/非人类MHC II多肽的核苷酸序列。因此，本申请中还提供了一种非人动物，在其基因组中包括，例如，在内源性非人类MHC II基因座，编码人或嵌合的人/非人MHC II复合物的核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种嵌合的人/非人MHC II复合物。在一个实施方式中，所述嵌合的人/非人MHC II复合物包括嵌合的人/非人MHC IIα多肽和嵌合的人/非人MHC IIβ多肽。在一个方面，嵌合的MHC IIα多肽的人类部分和/或嵌合MHC IIβ多肽的人类部分分别包括人MHC IIα多肽和/或人MHC IIβ多肽的肽结合结构域。在一个方面，所述嵌合的MHC IIα和/或β多肽的人类部分分别包括人MHC IIα和/或β多肽的胞外域。在一个实施方式中，所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα多肽α1域；在另一个实施方式中，所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα多肽的α1和α2域。在其它的实施方式中，所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ多肽的β1域；在另一个实施方式中，所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ多肽的β1和β2域。
本申请描述的所述MHC IIα和β多肽的人类部分可以通过HLA-DP，-DQ和-DR基因座的任意一个来编码。在Shankarkumar et al.((2004)The Human Leukocyte Antigen(HLA)System,Int.J.Hum.Genet.4(2):91-103)中描述了常用的HLA抗原和等位基因的列表，通过引用并入本申请。Shankarkumar等也给出了应用于本领域的HLA命名的简要说明。关于HLA命名法和各种HLA等位基因的其他信息可以在Holdsworth等.(2009)The HLA dictionary2008:a summary of HLA-A,-B,-C,-DRB1/3/4/5,and DQB1 alleles and theirassociation with serologically defined HLA-A,-B,-C,-DR,and–DQ antigens,TissueAntigens 73:95-170，以及最近的更新Marsh等.(2010)Nomenclature for factors ofthe HLA system,2010,Tissue Antigens 75:291-455中找到，二者通过引用并入本申请。因此，人类的或人源化MHC II多肽可以来自本申请所描述的任何功能性人HLA分子。
在一个特定方面，本申请中所描述人源化MHC II复合物的人类部分是来自于人的HLA-DR，例如，HLA-DR4或HLA-DR2。通常地，HLA-DRα链是单形态的，例如，HLA-DR复合物的α链由HLA-DRA基因(例如，HLA-DRα1*01基因)编码。另一方面，所述HLA-DRβ链是多态的。因此，HLA-DR4包括由HLA-DRA基因编码的α链和由HLA-DRB1基因编码的β链(例如，HLA-DRβ1*04基因)。如下文所述，HLA-DR4是已知与众多自身免疫性疾病，例如，风湿性关节炎，I型糖尿病，多发性硬化症等的发病率相关。HLA-DR2包括由HLA-DRA基因编码的α链和由HLA-DRB1基因(如HLA-DRβ1*02基因)编码的β链。HLA-DR2是已知与众多疾病，例如，肺出血肾炎综合征，多发性硬化症等相关联。在本发明的一个实施方式中，所述HLA-DRA等位基因为HLA-DRα*01等位基因，例如，HLA-DRα*01:01:01:01。在另一个实施方式中，所述HLA-DRB等位基因为HLA-DRβ1*04，例如，HLA-DRβ1*04:01:01。在另一个实施方式中，所述HLA-DRB等位基因是HLA-DRβ1*02，例如，HLA-DRβ1*1501。
在另一具体实施方式中，本申请描述的人源化MHC II复合物的人的部分是来自于人HLA-DQ，例如，HLA-DQ2和HLA-DQ8。HLA-DQ2包括由HLA-DQA基因(例如，HLA-DQα1*05基因)编码的α链。在一个实施方式中，HLA-DQα1*05基因是HLA-DQα1*0501。HLA-DQ2还包括由HLA-DQB基因(例如，HLA-DQβ1*02基因)编码的β链。HLA-DQ8包括由HLA-DQA基因(例如，HLA-DQα1*0301基因)编码的α链。HLA-DQ8还包括由HLA-DQB基因(例如，HLA-DQβ1*0302基因)编码的β链。HLA-DQ2.5和HLA-DQ8等位基因已知与此类疾病如腹腔疾病和I型糖尿病相关。
虽然本实施例描述了这些特定HLA序列；但任何合适的HLA-DR或HLA-DQ序列在本申请中均被涵盖，例如，在人类群体中显出的多态变体，具有一个或多个保守或非保守氨基酸修饰的序列，由于遗传密码的简并性与本申请所述序列不同的核酸序列等。
人源化MHC II复合物的人类部分可以由已知的与常见的人类疾病相关的HLA等位基因的核苷酸序列编码。这种HLA等位基因包括但不限于HLA-DRB1*0401、-DRB1*0301、-DQA1*0501、-DQB1*0201、DRB1*1501、-DRB1*1502、-DQB1*0602、-DQA1*0102、-DQA1*0201、-DQB1*0202、-DQA1*0501，以及它们的组合。对于HLA等位基因/疾病关联的总结，参见Bakker等.(2006)A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease associationstudies in the extended human MHC,Nature Genetics 38:1166-72和补充信息，其通过引用并入本申请。
在一个方面，嵌合的人/非人MHC II复合物的非人类的部分包括内源非人(例如，啮齿动物，例如，小鼠，大鼠等)MHC II复杂物的跨膜和/或胞质域。因此，所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽的非人部分可以包括内源非人MHC IIα多肽的跨膜和/或胞质域。嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的非人类部分可以包括内源非人MHC IIβ多肽的跨膜和/或胞质域。在一个方面，所述动物是小鼠，所述嵌合α和β多肽的非人部分来源于小鼠H-2E蛋白。因此，所述嵌合的α和β多肽的非人部分可以包括来源于小鼠H-2E蛋白的跨膜和胞质域。在另一个方面，所述动物是小鼠，并且所述嵌合的α和β多肽的非人部分来源于小鼠H-2A蛋白。因此，所述嵌合的α和β多肽的非人部分可以包括来源于小鼠H-2A蛋白的跨膜和胞质域。虽然在实施例中对特定的H-2E和H-2A序列有所预期，但是任何合适的序列，例如，多态变体，保守/非保守的氨基酸取代物等，都包括在本申请中。
在本发明的各个方面，所述编码嵌合的人/非人MHC II复合物的序列位于内源非人MHC II基因座(例如，小鼠H-2A和/或H-2E基因座)。在一个实施方式中，这导致用编码人或人源化MHC II蛋白的核苷酸序列取代内源性MHC II基因或其一部分，例如，本申请描述的编码嵌合的人/非人MHC II蛋白的嵌合基因。由于编码MHC IIα和β多肽的所述核苷酸序列在染色体上的位置彼此接近，可以将取代设计为独立地或同时针对两个基因；这两种可能性在本申请中均被涵盖。在一个实施方式中，所述取代包括用编码嵌合的人/非人MHCα多肽和嵌合的人/非人MHCβ多肽的核苷酸序列取代编码MHC IIα和β多肽的的内源性核苷酸序列。在一个方面，所述取代包括取代表示一个或多个(例如，两个)内源性MHC II基因的核苷酸序列。因此，所述非人类动物在内源性MHC II基因座包括嵌合的人/非人核苷酸序列，并表达来自内源性非人基因座的嵌合的人/非人MHC II蛋白。
因此，本申请提供了一种非人动物，其在内源MHC II基因座包括编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα胞外域并且所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ胞外域，以及其中所述嵌合的人/非人MHCIIα和MHC IIβ多肽在细胞的表面上形成功能性MHC II复合物。
嵌合的人/非人多肽可以是这样的，其包括人或非人前导(信号)序列。在一个实施方式中，所述嵌合的MHC IIα多肽包括内源性MHC IIα多肽的非人前导序列。在一个实施方式中，所述嵌合MHC IIβ多肽包括内源性MHC IIβ多肽的非人前导序列。在一个替代性实施例中，所述嵌合的MHC IIα和/或MHC IIβ多肽分别包括来自另一个非人动物(例如，另一个啮齿动物或另一种小鼠品系)的MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的非人前导序列，。因此，编码所述嵌合的MHC IIα和/或MHC IIβ多肽的核苷酸序列可以与分别编码非人MHC IIα和/或MHCIIβ前导序列的核苷酸序列可操作地连接。在另一个实施方式中，所述嵌合的MHC IIα和/或MHC IIβ多肽分别包括人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的人前导序列。在一个实施方式中，所述人MHC IIα的人前导序列是人HLA-DRA的前导序列并且所述人MHC IIβ多肽的人前导序列的是人HLA-DRβ1*04的前导序列。在另一个实施方式中，所述人MHC IIα的人前导序列是人HLA-DRA的前导序列并且所述人MHC IIβ多肽的人前导序列是人HLA-DRβ1*02的前导序列。在另一个实施方式中，所述人MHC IIα的人前导序列是人HLA-DQα1*05并且所述人MHCIIβ多肽的人前导序列是人HLA-DQβ1*02的前导序列。在又一个实施方式中，所述人MHC IIα的人类前导序列是人HLA-DQα1*0301的前导序列并且所述人MHC IIβ多肽的人前导序列是人HLA-DQβ1*0302的前导序列。
嵌合的人/非人MHC IIα和/或MHC IIβ多肽可以在其人类部分分别包括人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的完全或基本上完全的胞外域。因此，人类部分可包括至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，例如，95％或更多的编码人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的胞外域的氨基酸。在一个实施例中，所述人MHC IIα和/或人MHC IIβ多肽的基本上完全的胞外域缺乏人前导序列。在另一个实施例中，所述嵌合的人/非人MHC IIα和/或所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽包括人前导序列。
此外，所述嵌合的MHC IIα和/或MHC IIβ多肽可以分别与内源性非人启动子和调控元件可操作地连接(例如，可以在其控制下表达)(例如，与小鼠MHC IIα和/或MHC IIβ调控元件)。这样的安排有利于嵌合MHC II多肽在非人类动物中适当表达，例如，在非人类动物的免疫应答期间。
基因修饰的非人类动物可以选自下组：小鼠、大鼠、兔、猪、牛(如牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(如狨猴、恒河猴)。对于非人动物，当合适的基因修饰的ES细胞不容易获得时，使用其它方法来制备包括基因修饰非人动物。这样的方法包括，例如，修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)以及使用核转移技术以转移经修饰的基因组到合适的细胞，例如，***，并在合适的条件下在非人类动物中孕育经修饰的细胞(例如，经修饰的***)以形成胚胎。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL品系的小鼠。在另一个实施方式中，所述小鼠是选自由以下品系构成的组的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等(1999)Revised nomenclature for strain 129mice(对129小鼠品系修订的命名法)，Mammalian Genome 10:836，亦参见Auerbach等(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived MouseEmbryonic Stem Cell Lines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合。在另一个特定实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合或前述BL/6品系的混合。在一个特定实施方式中，所述混合的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在又另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系和另一个前述品系的混合。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和黑刺鼠。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和黑刺鼠。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种基因修饰小鼠，在其基因组中包括编码嵌合的人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，例如，嵌合的人/小鼠MHC IIα和β多肽。在一个实施方式中，所述嵌合的人类/小鼠MHC IIα多肽的人类部分包括人MHC IIα肽结合或胞外域并且所述嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽的人类部分包括人MHC IIβ肽结合或胞外域。在一些实施方式中，所述小鼠不表达来自内源性小鼠基因座(例如，H-2A和/或H-2E基因座)的内源性小鼠α和/或β多肽的肽结合或胞外域。在一些实施方式中，所述小鼠不表达来自内源性小鼠MHC II基因座的内源性小鼠MHC II多肽的功能性肽结合或胞外域。在一些实施方式中，所述小鼠包括缺乏编码功能性MHC II类分子的基因的基因组，所述MHC II类分子包括H-2Ab1、H-2Aa、H-2Eb1、H-2Eb2、H-2Ea以及它们的组合。所述人MHC IIα多肽的肽结合域可包括α1域并且人MHC IIβ多肽的肽结合域可包括β1域；因而，所述嵌合的MHC II复合物的肽结合域可包括人α1和β1域。所述人MHC IIα多肽的胞外域可以包括α1和α2域并且所述人MHCIIβ多肽的胞外域可包括β1和β2域；因而，所述嵌合的MHC II复合物的胞外域可包括人α1，α2，β1和β2域。在一个实施方式中，所述嵌合的MHC II复合物的小鼠部分包括小鼠MHC II的跨膜和胞质域，例如小鼠H-2E或H-2A(例如，小鼠H-2Eα和β链或小鼠H-2Aα和β链的跨膜和胞质域)。
因此，在一个实施方式中，提供了一种转基因的小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠MHC II基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括来源于人HLA-DR4蛋白的α多肽的胞外域并且所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分包括来源于人HLA-DR4蛋白的β多肽的的胞外域，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Eα链的跨膜和胞质域并且所述嵌合MHC IIβ多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Eβ链的跨膜和胞质域，并且其中所述小鼠表达功能性的嵌合HLA-DR4/H-2E MHC II复合物。在一个实施方式中，所述嵌合的HLA-DR4/H-2E MHC II复合物包括MHC IIα链和MHC IIβ链，所述MHC IIα链包含来源于HLA-DR4蛋白(HLA-DRAα1，和α2域)的胞外域(例如，α1，和α2域)和来自小鼠H-2Eα链的跨膜和胞质域并且所述MHC IIβ链包含来自HLA-DR4(HLA-DRβ1*04β1和β2域)的胞外域(例如，β1，和β2域)和来自小鼠H-2Eβ链的跨膜和胞质域。
在另一个实施方式，本发明提供了一种基因修饰小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠MHC II基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人个/小鼠MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括来源于人HLA-DR2蛋白的α多肽的胞外域并且所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分来源于人HLA-DR2蛋白的β多肽的的胞外域，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Eα链的跨膜和胞质域并且所述嵌合MHC IIβ多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Eβ链的跨膜和胞质域，并且其中所述小鼠表达功能性的嵌合HLA-DR2/H-2E MHC II复合物。在一个实施方式中，所述嵌合的HLA-DR2/H-2E MHC II复合物包括MHC IIα链和MHC IIβ链，所述MHC IIα链包含来源于HLA-DR2蛋白(HLA-DRAα1，和α2域)的胞外域(例如，α1，和α2域)和来自小鼠H-2Eα链的跨膜和胞质域并且所述MHC IIβ链包含来自HLA-DR2(HLA-DRβ1*02β1和β2域)的胞外域(例如，β1，和β2域)和来自小鼠H-2Eβ链的跨膜和胞质域。
在另一个实施方式，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠MHC II基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人个/小鼠MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括来源于人HLA-DQ2蛋白的α多肽的胞外域并且所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分包括来源于人HLA-DQ2蛋白的β多肽的的胞外域，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Aα链的跨膜和胞质域并且所述嵌合MHC IIβ多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Aβ链的跨膜和胞质域，并且其中所述小鼠表达功能性的嵌合HLA-DQ2/H-2A MHC II复合物。在一个实施方式中，所述嵌合的HLA-DQ2/H-2A MHC II复合物包括MHC IIα链和MHC IIβ链，所述MHC IIα链包含来源于HLA-DQ2蛋白(HLA-DQα1*05α1，和α2域)的胞外域(例如，α1，和α2域)和来自小鼠H-2Aα链的跨膜和胞质域并且所述MHC IIβ链包含来自HLA-DQ2(HLA-DQβ1*02β1和β2域)的胞外域(例如，β1，和β2域)和来自小鼠H-2Aβ链的跨膜和胞质域。
在另一个实施方式，本发明提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性小鼠MHC II基因座包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽的第一核苷酸序列和编码嵌合的人个/小鼠MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的人类部分包括来源于人HLA-DQ8蛋白的α多肽的胞外域并且所述嵌合的MHC IIβ多肽的人类部分来源于人HLA-DQ8蛋白的β多肽的的胞外域，其中所述嵌合的MHC IIα多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Aα链的跨膜和胞质域并且所述嵌合MHC IIβ多肽的小鼠部分包括小鼠H-2Aβ链的跨膜和胞质域，并且其中所述小鼠表达功能性的嵌合HLA-DQ8/H-2A MHC II复合物。在一个实施方式中，所述嵌合的HLA-DQ8/H-2A MHC II复合物包括MHC IIα链和MHC IIβ链，所述MHC IIα链包含来源于HLA-DQ8蛋白(HLA-DQα1*0301α1，和α2域)的胞外域(例如，α1，和α2域)和来自小鼠H-2Aα链的跨膜和胞质域并且所述MHC IIβ链包含来自HLA-DQ8(HLA-DQβ1*0302β1和β2域)的胞外域(例如，β1，和β2域)和来自小鼠H-2Aβ链的跨膜和胞质域。
在一个方面，小鼠不在其的内源性小鼠基因座表达功能性内源性H-2A和H-2E多肽(例如，小鼠不表达H-2Ab1，H-2Aa，H-2Eb1，H-2Eb2和H-2Ea多肽)。在各种实施方式中，第一和第二核苷酸序列的表达是在各自内源性小鼠的启动子和调控元件(例如，第一和第二核苷酸序列与内源启动子和调控元件可操作地连接)的控制下。在本发明的各种实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列位于同一条染色体上。在一些方面中，所述小鼠包括含有所述第一和第二核苷酸序列的嵌合MHC II基因座的两个拷贝，而在其它方面，所述小鼠包括含有所述第一和第二核苷酸序列的MHC II基因座的一个拷贝。因此，所述小鼠对于包括第一和第二核苷酸序列的嵌合MHC II基因座可以是纯合的或杂合的。在各种实施方式中，所述第一和第二核苷酸序列包括在所述小鼠的种系中。
在本申请描述的一些实施方式中，提供了一种小鼠，其在内源性小鼠MHC II基因座处包括嵌合的MHC II基因座，例如，通过对内源性小鼠H-2A和H-2E基因的取代。在一些方面中，所述嵌合的基因座包括编码人HLA-DRA的胞外域和小鼠H-2Eα链的跨膜和胞质域，以及人HLA-DRβ1*04或HLA-DRβ1*02的胞外域和小鼠H-2Eβ链的跨膜和胞质域的核苷酸序列。在其它方面，所述嵌合的基因座包括编码人HLA-DQα1*05或HLA-DQα1*0301的胞外域和小鼠H-2Aα链的跨膜和胞质域，以及人HLA-DQβ1*02或HLA-DQβ1*0302的胞质外域和小鼠H-2Aβ链的跨膜和胞质域的核苷酸序列。所述嵌合基因座的不同域以所述基因座表达功能性嵌合的人/小鼠MHC II复合物这样的方式连接。
在各种实施例中，在此描述的表达来自嵌合的MHC II基因座的功能性嵌合的MHCII蛋白的非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)在细胞表面上展示所述嵌合的蛋白。在一个实施方式中，所述非人类动物在细胞表面上以在人类中观察到的相同的细胞分布形式表达所述嵌合的MHC II蛋白。在一个方面，所述细胞展示与所述嵌合的MHC II蛋白的胞外部分(例如，人的HLA-DR4、-DR2、-DQ2或-DQ8胞外部分)结合的肽片段(抗原片段)。
在各种实施方式中，显示嵌合的MHC II蛋白(例如，HLA-DR4/H-2E，HLA-DR2/H-2E，HLA-DQ2/H-2A，或HLA-DQ8/H-2A蛋白)的细胞是一种抗原呈递细胞(APC)，例如，巨噬细胞、树突细胞或B细胞。在一些实施例中，由嵌合的蛋白呈递的肽片段来源于肿瘤。在其他实施方式中，由所述嵌合的MHC II蛋白呈递的肽片段是来源于病原体，例如，细菌，病毒，或寄生虫。
本申请中所描述的嵌合的MHC II蛋白可以与在相同的细胞或第二细胞的表面上的其它蛋白质发生相互作用。在一些实施方式中，所述嵌合的MHC II蛋白在所述细胞的表面上与内源性非人蛋白相互作用。所述嵌合MHC II蛋白还可以与在相同细胞或第二细胞表面上的人或人源化蛋白相互作用。在一些实施方式中，所述第二细胞是T细胞，并且所述嵌合的MHC II蛋白与T细胞受体(TCR)和它的共受体CD4相互作用。在一些实施方式中，所述T细胞是内源性小鼠T细胞。在其他实施方式中，所述T细胞是人T细胞。在一些实施方式中，所述TCR是人或人源化TCR。在另外的实施方式中，所述CD4是人或人源化的CD4。在其他实施例中，TCR和CD4其中之一或两者均是非人的，例如，小鼠或大鼠。不
在一个实施方式中，如本申请所述，提供了一个基因修饰的非人动物，其以不比野生型动物更高的速率发展肿瘤，所述野生型动物缺乏嵌合的MHC II基因。在一些实施方式中，所述动物以不比野生型的动物更高的速率发展恶性血液病，例如，各种T细胞和B细胞淋巴瘤，白血病，复合淋巴瘤(例如，Hodgkin淋巴瘤)。
除了基因修饰的非人类动物，本发明还提供了一种非人胚胎(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠胚胎)，其中所述胚胎包括如本申请所述的来源于非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)的供体ES细胞。在一个方面，所述胚胎包括ES供体细胞，所述ES供体细胞包括嵌合的MHC II基因和宿主胚胎细胞。
本申请还提供了一种组织，其中所述组织来源于如本申请所述的非人动物(例如，啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)，并且表达嵌合的MHC II蛋白(例如，HLA-DR4/H-2E，HLA-DR2/H-2E，HLA-DQ2/H-2A，或HLA-DQ8/H-2A蛋白)。
另外，本发明还提供了分离自从如本申请所述的非人动物的一种非人动物细胞。在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是抗原呈递细胞，例如树突细胞，巨噬细胞，B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是免疫细胞。在一个实施方式中，所述免疫细胞是淋巴细胞。
本发明还提供了一种非人细胞，其包括如本申请所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人细胞包括如本申请所述的非人动物的核。在一个实施方式中，所述非人类细胞包括作为核转移的结果的染色体或其片段。
在一个方面，本发明还提供了一种非人诱导多能细胞，其包括编码如本申请所述的嵌合MHC II类蛋白(例如，HLA-DR4/H-2E，HLA-DR2/H-2E，HLA-DQ2/H-2A，或HLA-DQ8/H-2A蛋白)的基因。在一个实施方式中，所述诱导多能细胞来源于如本申请所述的非人类动物。
在一个方面，本发明提供了一种杂交瘤或四价体瘤，其来源于如本申请所述非人动物的细胞。在一个实施方式中，非人类动物是小鼠或大鼠。
在一个方面，本申请提供了一种体外制备物，其包括携带嵌合的人/啮齿动物MHCII表面蛋白的第一细胞，所述嵌合的人/啮齿动物MHC II表面蛋白包括结合的肽以形成嵌合人/啮齿动物MHC II/肽复合物，以及结合所述嵌合人/啮齿动物MHC II/肽复合物的第二细胞。在一个实施方式中，所述第二细胞包括人或人源化T细胞受体，并且在一个实施方式中还包括人或人源化的CD4。在一个实施方式中，所述第二细胞是啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)细胞，其包括人或人源化T细胞受体和人或人源化CD4蛋白。在一个实施方式中，所述第二细胞是人细胞。
本发明还提供了一种用于制备本申请中描述的基因工程改造的非人动物(例如，基因工程改造的啮齿动物，例如，小鼠或大鼠)的方法。所述制备基因工程改造的非人动物的方法产生基因组包括编码嵌合MHC II蛋白(例如，嵌合的MHC IIα和β多肽)的核苷酸序列的动物。在一个实施方式中，该方法产生基因工程改造的小鼠，其基因组在内源性MHC II基因座包括编码嵌合人/小鼠MHC II蛋白的核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC II蛋白的人类部分包括人HLA-DR4或HLA-DR2的胞外域并且小鼠部分包括小鼠H-2E的跨膜和胞质域。在另一个实施方式中，该方法产生基因工程改造的小鼠，其基因组在内源性MHC II基因座包括编码嵌合人/小鼠MHC II蛋白的核苷酸序列，其中所述嵌合的MHC II蛋白的人部分包括人HLA-DQ2或HLA-DQ8的胞外域并且小鼠部分包括小鼠H-2A的跨膜和胞质域。在一些实施方式中，该方法利用了如在实施例中所述的使用技术制备的靶向构建体，使用技术将该构建体引入到ES细胞中，并将靶向的ES细胞克隆引入到小鼠胚胎。在一个实施方式中，所述ES细胞是129和C57BL/6小鼠品系的混合；在一个实施方式中，所述ES细胞是BALB/c和129小鼠品系的混合。
本发明还提供了一种用于产生本申请所述的基因工程改造的非人类动物的核苷酸构建体。在一个方面，所述核苷酸构建体包括：5'和3'非人类同源臂，包括人HLA-DRα和β链序列的DNA片段，和在重组位点之间的选择性表达盒。在一个实施方式中，所述人HLA-DRα和β链序列是包括人HLA-DRα和β链基因的内含子和外显子的基因组序列。在一个实施方式中，所述非人同源臂与非人MHC II基因组序列同源。
在一个实施方式中，所述人HLA-DRα链序列包括α1和α2域编码序列。在一个具体的实施方式，它包括，从5'到3'：α1外显子(外显子2)，α1/α2内含子(内含子2)，和α2外显子(外显子3)。在一个实施方式中，所述人HLA-DRβ链序列包括β1和β2域编码序列。在一个具体的实施方式，它包括，从5'到3'：β1外显子(外显子2)，β1/β2内含子(内含子2)，和β2外显子(外显子3)。
类似地，本发明还在此提供了用于产生基因工程改造的包括人HLA-DQα和β链序列(例如，人HLA-DQα1和α2域编码序列和人HLA-DQβ1和β2域编码序列)的非人类动物的核苷酸构建体。此类构建体的具体实施方式示于图10。
选择性表达盒是***靶向构建体以便于选择具有已整合了目标构建体的细胞(例如ES细胞)的核苷酸序列。许多适宜的选择性表达盒是本领域公知的。通常，在存在特定抗生素(例如Neo、Hyg、Pur、CM、SPEC等)的情况下能够对选择性表达盒进行阳性选择。此外，选择性表达盒的翼侧可以是重组位点，其能够使所述选择性表达盒在经过重组酶处理后缺失。通常使用的重组位点是loxP和Frt，其分别被Cre和Flp酶所识别，但是，其他的也是本领域公知的。选择性表达盒可以位于构建体编码区以外的任意位置。在一个实施方式中，所述选择性表达盒位于β链内含子，例如，β2/跨膜域内含子(内含子3)。
在一个实施方式中，5'和3'同源臂在内源性非人类MHC II基因座的5'和3'的位置包括基因组序列。在一个实施方式中，所述5'同源臂包括小鼠H 2Ab1基因上游的基因组序列并且所述3'同源臂包括小鼠H 2Ea基因下游的基因组序列。在本实施方式中，构建体允许同时取代小鼠H-2E和H-2A基因。
因此，在一个方面，本发明提供了一种核苷酸构建体，其包括从5'到3'：含有小鼠H2Ab1基因上游的小鼠基因组序列的5'同源臂，包括编码嵌合人/小鼠MHC IIβ链的序列的第一核苷酸序列，包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIα链的序列的第二核苷酸序列，含有小鼠H-2Ea基因下游的小鼠基因组序列的3'同源臂。在一个具体的实施方式中，所述包括编码嵌合的人/小鼠MHC IIβ链的序列的第一核苷酸序列包括人类β1外显子，β1/β2内含子，β2外显子，和***到人类β2外显子序列和小鼠跨膜域外显子的序列之间的内含子区域的在重组位点之间的选择性表达盒。在一个具体的实施方式中，所述包括编码嵌合人类/小鼠MHC IIα链的序列的第二核苷酸序列包括人α1外显子，α1/α2内含子，和人α2外显子。本发明的示例性构建体示于图5和10。
在完成基因靶向后，对ES细胞或基因修饰的非人动物进行筛选以确证目标外源性核苷酸序列的成功掺入或外源性多肽的表达。多种技术是本领域技术人员公知的，并且包括(但不限于)Southern印迹、长PCR、定量PCR(例如使用的实时PCR)、荧光原位杂交、Northern印迹、流式细胞术、Western分析、免疫细胞化学、免疫组织化学等。在一个例子中，可以通过使用Valenzuela等，(2003)High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis(与高分辨率表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotech.21(6):652-659描述的改良的等位基因测定对小鼠等位基因的丢失和/或人等位基因的获得情况进行筛选对携带目标基因修饰的非人动物(例如小鼠)进行鉴定。鉴定基因修饰动物中的特定核苷酸或氨基酸序列的其他测定是本领域技术人员公知的。
本发明还提供了一种修饰非人类动物的MHC II基因座以表达本申请所述的嵌合的人/非人MHC II复合物的方法。在一个实施方式中，本发明提供了一种修饰小鼠的MHC II基因座以表达嵌合的人/小鼠MHC II复合物的方法，所述嵌合的人/小鼠MHC II复合物包括在内源性小鼠MHC II基因座用编码嵌合人类/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列取代编码小鼠MHC II复合物的核苷酸序列。在一个具体方面，编码所述嵌合的人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列包括编码人MHC IIα链(例如，HLA-DR或-DQα链)的胞外域和小鼠MHC IIα链(例如，H-2E或H-2Aα链)的跨膜和胞质域的第一核苷酸序列和编码人MHC IIβ链(例如，HLA-DR或-DQβ链)的胞外域和小鼠MHC IIβ链(例如，分别为H-2E或H-2Aβ链，例如，H-2Eb1或H-2Ab1链)的跨膜和胞质域的第二核苷酸序列。在一些实施方式中，经修饰的小鼠MHC II基因座表达嵌合的HLA-DR4/H-2E蛋白。在其他实施方式中，经修饰的小鼠MHC II基因座表达嵌合的HLA-DR2/H-2E蛋白，嵌合的HLA-DQ2/H-2A蛋白，或嵌合的HLA-DQ8/H-2A蛋白。
在一个方面，本发明提供了一种用于制造嵌合的人HLA II类/非人MHC II类分子，包括如本申请所述在单个细胞中表达来自核苷酸构建体的嵌合的人/非人MHC II蛋白(例如，嵌合的HLA-DR4/H-2E，HLA-DR2/H-2E，HLA-DQ2/H-2A，或HLA-DQ8/H-2A蛋白)。在一个实施方式中，所述核苷酸构建体是病毒载体；在一个具体的实施方式中，所述病毒载体是慢病毒载体。在一个实施方式中，所述细胞选自表达病毒核酸序列的CHO、COS、293、HeLa和视网膜细胞(例如，PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本发明提供了一种表达嵌合的HLA-DR4/H-2E、HLA-DR2/H-2E、HLA-DQ2/H-2A或HLA-DQ8/H-2A蛋白的细胞。在一个实施方式中，所述细胞包括含有如本申请所述的嵌合的MHC II类序列的表达载体。在一个实施方式中，所述细胞选自表达病毒核酸序列的CHO、COS、293、HeLa和视网膜细胞(例如，PERC.6TM细胞)。
本发明还提供了一种通过如本申请所述的非人类动物制备的嵌合的MHC II类分子，其中所述嵌合的MHC II类分子包括来自人MHC II类蛋白的α1、α2、β1、和β2域，例如，HLA-DR4、HLA-DR2、HLA-DQ2或HLA-DQ8，并且来自非人类MHC II蛋白的跨膜和胞质域，例如，小鼠H-2E或H-2A蛋白。如本申请描述的包括HLA-DR4或HLA-DR2的胞外域的所述嵌合的MHCII复合物可以由抗HLA-DR抗体检测。如本申请描述的包括HLA-DQ2或HLA-DQ8的胞外域的所述嵌合MHC II复合物可以由抗HLA-DQ抗体检测。因此，展示嵌合的人/非人MHC II多肽的细胞可以使用抗HLA-DR或抗HLA-DQ抗体来检测和/或选择。
虽然随后的实施例中描述了一种基因工程改造的动物，其基因组包括用编码嵌合人/小鼠HLA-DR4/H-2E、HLA-DR2/H-2E、HLA-DQ2/H-2A或HLA-DQ8/H-2A蛋白的核苷酸序列取代编码小鼠H-2A和H-2E蛋白的核苷酸序列，本领域技术人员将理解，类似的策略可以被用于引入包括其他人MHC II基因(其它的HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP基因)的嵌合体。此外，本发明还提供了多个人源化MHC II类分子(如，嵌合的HLA-DR/H-2E和HLA-DQ/H-2A)的引入。
本发明提供了在多个MHC II基因座的取代。因此，在此还提供了一种非人类动物，例如，啮齿动物，例如，小鼠，其在内源性MHC II基因座包括一个或多个，例如一个，两个，三个或四个编码嵌合的人/非人(例如，人/啮齿动物，例如，人/小鼠)MHC II复合物(或多个)的核苷酸序列。在一种情况下，两个小鼠姐妹染色体17中的每一个均包括包含H-2A和H-2E基因的MHC II基因座；因此，在一个方面，每个姐妹染色体在它们的内源基因组的位置可编码多达两个嵌合的人/小鼠复合物。因此，在一个实施方式中，转基因的非人动物，例如，小鼠，可在它们的内源MHC基因座包括多达四个不同的编码多达四个嵌合的人/非人，例如，人/小鼠，MHC II复合物的核苷酸序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种小鼠，其在内源MHC II基因座包括一种或多种，例如，一个，两个，三个或四个，编码嵌合的人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，其中所述MHC II复合物的人类部分包括人MHC II复合物的胞外域，(即，人MHC IIα和β多肽的胞外域)，并且其中所述嵌合的MHC II复合物的小鼠部分包括小鼠MHC II复合物的跨膜和胞质域(即，小鼠MHC IIα和β多肽的跨膜和胞质域，例如，H-2A和H-2E跨膜和胞外域)，并且其中所述小鼠表达一个或多个，例如一个，两个，三个或四个，嵌合的人/小鼠MHC II复合物。在一个实施方式中，所述小鼠MHC II选自H-2E和H-2A。在一个实施方式中，所述人MHC II选自HLA-DR、-DQ和-DP(例如，-DR2、-DR4、-DQ2和-DQ8)。
此外，本发明在此提供了一种用于产生非人动物(例如，小鼠)的方法，其包括在多个内源性MHC基因座(例如，非人类，例如，小鼠)的取代，所述基因座包括一个或多个(例如一个，两个，三个或四个)编码嵌合的人/非人(例如，人/小鼠)MHC II复合物的核苷酸序列。由于在小鼠染色体17上各个MHC II基因座的密切联系，在一些实施方式中，该方法包括在基因座连续取代。在一个实施方式中，该方法包括用在ES细胞编码第一嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列取代编码第一小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，产生表达第一嵌合MHC II复合物的小鼠，从所述小鼠产生ES细胞，在所述ES细胞用编码第二嵌合人/小鼠MHCII复合物的核苷酸序列取代编码第二小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，并产生表达两种嵌合人/小鼠MHC II复合物的小鼠。或者，该方法可以包括用在ES细胞中编码第一嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列取代编码第一小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，随后在相同的ES细胞中用编码第二嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列取代编码第二小鼠MHC II复合物的核苷酸序列，并产生表达两种嵌合人/小鼠MHC II复合物的小鼠。包括编码第三或第四嵌合的人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列的小鼠可以通过，例如，交配来产生。本领域技术人员将理解，包括两个或多个嵌合MHC II复合物的小鼠也可以通过交配而不是连续取代产生；这种动物可以对所有嵌合MHC II序列是杂合的(例如，在其每个姐妹染色体上包括不同嵌合基因的小鼠将针对两个MHC基因是杂合的，等等)。可替代在基因座上的连续取代的是，包括多于一个，例如，两个编码嵌合人/小鼠MHC II复合物的核苷酸序列的小鼠可以通过用编码一个以上的，例如，两个嵌合的人/小鼠MHC II复合物的外源性核苷酸序列取代编码一个以上的，例如，两个MHC II复合物的核苷酸序列来产生(例如，可以由编码嵌合的HLA-DR/H-2E和HLA-DQ/H-2A复合物的核苷酸序列取代同时编码小鼠H-2A和H-2E基因的核苷酸序列)。
基因修饰动物的用途
在各种实施方式中，在此描述的所述基因修饰的非人类动物产生在细胞表面上有人或人源化MHC II的APC，并且作为结果，来自胞质蛋白的肽作为表位以类人的形式呈递到T细胞，这是因为基本上复合物的所有的组分都是人或人源化的。本发明的基因修饰的非人类动物可用于在人源化动物中研究人免疫***的功能；识别引发的免疫反应的抗原和抗原表位(如T细胞表位，如独特的人类癌症表位)，例如，用于疫苗开发；候选疫苗和其他疫苗策略的评价；研究人类自身免疫性疾病；研究人类感染性疾病；或者用于基于人MHC表达制定更好的治疗策略。
MHC II复合物结合来自胞外蛋白的肽，例如，胞外细菌，相邻细胞，或被B细胞受体结合并内化至B细胞内的多肽。一旦胞外蛋白质进入内吞途径，它们被降解成肽，并且肽由MHC II结合并呈递。一旦通过MHC II类呈递的肽被CD4+T细胞识别，T细胞被激活，增殖，分化为各种T细胞辅助亚型(例如，TH1，TH2)，并导致一些事件，包括巨噬细胞介导的病原体杀伤的激活，B细胞增殖和抗体生产。由于MHC II在免疫应答中的的作用，对MHC II肽呈递的理解对人类疾病治疗方法的发展十分重要。然而，由于人和小鼠MHC复合物识别抗原不同，例如，小鼠MHC II类分子可能不识别相同抗原或可能呈递不同于人MHC II的表位，因此在小鼠MHC II的环境中的抗原呈递仅与人类疾病稍许相关。因此，对人类疾病最相关的数据是通过用人MHC II研究抗原表位呈递来获得的。
因此，在不同实施方式中，除其他事项，本发明的基因修饰的动物在用于评估抗原在人体内激发免疫应答的能力，以及产生多样性的抗原和鉴定可以用于人用疫苗研发的特定抗原方面是有益的。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定肽序列在人类中的抗原性的方法，其包括将如本申请所述的基因修饰非人动物暴露于包括所述肽序列的分子，允许所述非人类动物产生免疫应答，并在非人类动物中检测细胞，所述细胞结合了由本申请中描述的人源化MHC II复合物呈递的肽的序列。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定肽是否在人体内引起免疫应答的方法，其包括将如本申请所述的基因修饰非人类动物暴露于所述肽，允许所述非人类动物产生免疫应答，并在非人类动物中检测细胞，所述细胞通过如本申请所述的嵌合的人/非人MHC II类分子结合了所述肽的序列。在一个实施方式中，所述非人类动物在暴露后包括结合所述肽的MHC II类限制的CD4+T细胞。
在一个方面，本发明提供了一种用于识别人CD4+T细胞表位的方法，其包括将如本申请所述的非人类动物暴露于包括推定的T细胞表位的抗原，允许所述非人类动物产生免疫应答，并通过MHC II类限制的CD4+T细胞识别所述表位。
在一个方面，本发明提供了一种用于识别在人体内产生CD4+T细胞反应的抗原的方法，包括将推定抗原暴露于如本申请所述的小鼠，允许所述小鼠产生免疫应答，检测特异于在人MHC II分子(例如，与HLA-DR或HLA-DQ分子)环境中的抗原的CD4+T细胞应答，并识别被人MHC II限制的分子(例如，人HLA-DR或HLA-DQ限制性分子)结合的抗原。
在一个实施方式中，所述抗原包括细菌蛋白。在一个实施方式中，所述抗原包括人肿瘤细胞抗原。在一个实施方式中，所述抗原包括用于人类的推定的疫苗或其他生物制药。在一个实施方式中，所述抗原包括在人体中产生抗体的人表位。在又一个实施方式中，抗原包括酵母或真菌细胞抗原。在又一个实施方式中，抗原来自于人寄生虫。
在一个方面，本发明提供了一种用于确定推定的抗原是否包括的表位的方法，所述表位在暴露于人免疫***时将产生HLA-DR限制性的免疫应答(例如，HLA-DR2-或HLA-DR4-限制性应答)，所述方法包括将如本申请所述的小鼠暴露于推定抗原并测量在小鼠体内测量抗原特异性HLA-DR限制性(例如，HLA-DR2-或HLA-DR4限制性)的免疫应答。在另一个方面，本发明提供了一种方法，其用于确定推定的抗原是否包括表位，所述表位在暴露于人免疫***时将产生HLA-DQ限制性(例如，HLA-DQ2-或HLA-DQ8限制性)的免疫应答。
本发明还提供了一种产生针对抗原的抗体的方法，例如，来自细菌，寄生虫等的抗原，所述抗原在人MHC II复合物的环境下呈递，所述方法包括将本申请所述的小鼠暴露于抗原，允许小鼠产生免疫应答，其中所述免疫应答包括抗体的产生，并且分离识别在人MHCII复合物环境下呈递的抗原的抗体。在一个实施方式中，为了产生针对所述肽-MHC II的抗体，所述MHC II人源化小鼠用肽-MHC II免疫原免疫。
在一个方面中，本发明提供了一种用于识别T细胞受体可变域的方法，所述T细胞受体可变域识别在MHC II环境中呈递的抗原(例如，人肿瘤抗原，疫苗等)，所述方法包括将包含本申请中描述的人源化MHC II复合物的小鼠暴露于抗原，允许小鼠产生免疫应答，并且从所述小鼠分离编码结合MHC II限制性抗原的T细胞受体的可变域的核酸序列。在一个实施方式中，所述抗原在人源化MHC II(例如，人HLA II胞外域/小鼠MHC II跨膜和/或胞质域)的环境下呈现。
在MHC II(例如，人HLA II胞外域/小鼠MHC II类的跨膜和/或胞质结构域)的环境中T细胞与呈递肽的APC之间相互作用的结果可以通过多种在本领域中已知的技术测量，例如，T细胞增殖测定法，细胞因子释放测定法等。
除了识别来自病原体或肿瘤的抗原和它们的T细胞表位的能力，本发明的基因修饰动物可用于识别与人类自身免疫性疾病相关的自身抗原，以及以其他方式研究人类自身免疫疾病的进展。已知所述HLA基因座内的多态性在对人的自身免疫性疾病的易感体质中起作用。事实上，在HLA-DR和HLA-DQ基因座中的特异性多态性已经被鉴定与类风湿性关节炎，I型糖尿病，桥本甲状腺炎，多发性硬化症，重症肌无力，格雷夫斯病，***性红斑狼疮，乳糜泻，克罗恩病，溃疡性结肠炎，以及其他自身免疫性疾病的发展有关。参见，如，Wong和Wen(2004)What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmunediabetes？,Diabetologia 47:1476-87；Taneja和David(1998)HLA Transgenic Mice asHumanized Mouse Models of Disease and Immunity,J.Clin.Invest.101:921-26；Bakker et al.(2006),同上；和International MHC and Autoimmunity GeneticsNetwork(2009)Mapping of multiple susceptibility variants within the MHCregion for 7immune-mediated diseases,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106:18680-85.
因此，本申请所述的制备人源化MHC II复合物的动物的方法可以用于引入MHC II分子，所述MHC II分子被认为与特定的人类自身免疫性疾病相关联，并且可以研究人类自身免疫性疾病的进展。此外，本申请所述的非人类动物可用于开发人类自身免疫性疾病的动物模型。根据本发明，携带本申请中所描述的人源化MHC II蛋白的小鼠可用于确定潜在的自身抗原，以得到涉及疾病进展的表位图，并设计用于自身免疫性疾病调节的策略。
此外，本申请描述的基因修饰动物，可以在人类过敏性反应的研究中使用。由于过敏性反应似乎与MHC II等位基因相关，本申请中所描述的基因修饰动物可被用来确定过敏原特异性T细胞应答的HLA限制，并发展针对过敏反应的策略。
此外，本发明的基因修饰动物以及其表达的人或人源化的HLA分子可用于检验阻断由人类疾病进展相关的人类HLA分子呈递的抗原的抗体。因此，本发明提供了一种测定抗体是否能够通过与人类疾病相关的HLA分子阻断抗原的呈递，例如上述的人类疾病，其包括将表达本申请描述的人或人源化的HLA的细胞暴露于测试抗体并测定所述测试抗体是否能够阻断由人或人源化的HLA对免疫细胞(例如，T细胞)呈递抗原，例如，通过测量其阻断人或人源化HLA限制性免疫应答的能力来确定。在一个实施方式中，该方法是在表达人或人源化的HLA的动物中进行的，例如，表达疾病相关的人类或人源化HLA的动物，所述动物用作针对疾病的疾病模型。
实施例
将通过下述非限制性实施例对本发明进行进一步解释。列出这些实施例用于帮助理解本发明，其不以任何方式构成对其保护范围的限制。所述实施例不包括对本领域普通技术人员熟知的常规方法(分子克隆技术等)的详细描述。除非另有明示，以重量份表示重量，分子量是平均分子量，以摄氏度表示温度和压力为处于或接近大气压。
实施例1.删除内源性MHC II类H-2A和H-2E基因座
使用基因工程技术制备用于引入内源性MHC II类的H-2Ab1、H-2Aa、H-2Eb1、H-2Eb2和H-2Ea缺失的靶向载体(参见，例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，同上)。对细菌人工染色体(BAC)RP23-458i22(Invitrogen)DNA进行修饰以删除内源性MHC II类基因H-2Ab1、H-2Aa、H-2Eb1、H-2Eb2、和H-2Ea。
简言之，通过对H-2Ab1基因5’端和来自H-2Ea基因3'端位置的小鼠的BAC DNA分别进行PCR产生上游和下游同源臂。如图5所描绘的，这些同源臂被用来制备通过细菌同源重组(BHR)删除RP23-458i22的～79kb的表达盒，所述表达和包括MHC II类基因座的基因H-2Ab1，H-2Aa，H-2Eb1，H-2Eb2，和H-2Ea。这个区域被替换为lox66和lox71位点之间的潮霉素选择性表达盒。从5'至3'的最终靶向载体包括34kb的同源臂，其包括内源性MHC II类基因座的H-2Ab1基因5'端的小鼠基因组序列、5'端的lox66位点，潮霉素选择性表达盒，3'端的lox71位点并且63kb的同源臂包括内源性MHC II类基因座(MAID5111，见图5)的H-2Ea基因3'端的小鼠基因组序列。
将BAC DNA靶向载体(如上所述)用于对小鼠ES细胞进行电穿孔以形成包括内源性MHC II类基因座缺失的经修饰的ES细胞。使用TAQMANTM探针通过定量PCR分析对含缺失的内源性MHC II类基因座的阳性ES细胞进行鉴定(Lie and Petropoulos(1998)Curr.Opin.Biotechnology 9:43-48)。通过使用引物5111U F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC；SEQID NO:1)和5111U R(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC；SEQ ID NO:2)和探针5111U P(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA；SEQ ID NO:3)进行PCR以确认经删除的基因座的上游区域。而使用引物5111D F(GTGGGCACCATCTTCATCATTC；SEQ ID NO:4)和5111D R(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC；SEQ ID NO:5)和探针5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT；SEQID NO:6)确定所述缺失的基因座的下游区域。通过使用引物HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC；SEQID NO:7)和HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG；SEQ ID NO:8)和探针HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC；SEQ ID NO:9)确认来自靶向载体的潮霉素选择性表达盒的存在。跨过上游缺失点(SEQ ID NO:10)的核苷酸序列包含以下内容，其表明在缺失点上游的内源性小鼠序列(包含在下方的括号内)与在所述缺失点的选择性表达盒序列连续地连接：(TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGGGACCAACCCT)CTCGAGTACC GTTCGTATAA TGTATGCTAT ACGAAGTTAT ATGCATCCGG GTAGGGGAGG。跨过下游缺失点(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列包含以下内容，其表明选择性表达盒序列与在所述缺失点下游的内源性小鼠序列(包含在下方的括号内)连续：CCTCGACCTGCAGCCCTAGG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAC GGTAGAGCTC(CACAGGCATT TGGGTGGGCAGGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA)。随后用阳性ES细胞克隆使用方法(如下描述)植入雌性小鼠以产生含有内源性MHCII类基因座缺失的同窝小鼠。
将如上所述的靶向的ES细胞用作供体ES细胞并用方法引入8细胞期的小鼠胚胎(见，例如，美国专利号7,294,754和Poueymirou等人(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)。对在内源性MHC II类基因座中带有H-2Ab1、H-2Aa、H-2Eb1、H-2Eb2和H-2Ea基因缺失的小鼠用改良等位基因检测法通过基因分型(Valenzuela等人，同上)来鉴定，所述改良等位基因检测法检测到潮霉素选择性表达盒的存在，并确认不存在内源性MHC II类序列。
可将在内源性MHC II类基因座带有H-2Ab1、H-2Aa、H-2Eb1、H-2Eb2和H-2Ea基因缺失的小鼠与Cre清除小鼠品系交配(参见，例如，国际专利申请公开号WO2009/114400)以除去如在ES细胞或在胚胎阶段由所述未除去的靶向载体引入的任何在lox P位点之间的潮霉素选择性表达盒。可选地，将潮霉素选择性表达盒保持在小鼠中。
实施例2.产生包括嵌合HLA-DR4/H-2E基因的大型靶向载体(LTVEC)
如图4所示设计了为引入人源化MHC II序列的靶向载体。使用基因工程技术，将细菌人工染色体(BAC)RP23-458i22 DNA在不同步骤中进行修饰：(1)制备包含来自BALB/c H-2Ea基因的功能性I-Eα外显子1(图4A)；(2)制备包括用人DRβ1*04的外显子2和3取代小鼠I-Eβ基因的外显子2和3以及用人DRα1*01的外显子2和3取代小鼠I-Eα的外显子2和3的载体(图4B)；(3)制备载体，所述载体在保留的小鼠I-Eβ外显子的同时携带人DRβ1*04的外显子2和3，和在保留包括来自BALB/c小鼠的功能性I-Eα外显子1的小鼠I-Eα外显子的同时携带人DRα1*01的外显子2和3(步骤(1)(图4C)；并且(4)在经(3)中产生的载体中移除隐蔽剪接位点(图4D)。
特别地，因为在C57BL/6小鼠中，由于存在非功能性的外显子1，所以所述I-Eα基因是假基因，首先，制备了包括来自BALB/c小鼠H-2Ea基因的功能性I-Eα外显子1的载体(图4A)。由细菌同源重组(1.BHR)对RP23-458i22 BAC进行修饰以用大观霉素(spectromycin)抗性基因取代氯霉素抗性基因。所得载体通过BHR进一步修饰，以便用在重组位点(2.BHR)之间的新霉素选择性表达盒取代整个I-A和I-E编码区。通过包含编码BALB/c I-Eα前导(外显子1)和在PI-SceI和I-CeuI限制性位点之间的氯霉素基因的外显子的构建体的另一轮的BHR(3.BHR)获得了包含功能性的BALB/c H-2Ea外显子1的载体。
独立地，为了生成包括用人DRβ1*04的外显子2和3取代小鼠I-Eβ基因的外显子2和3以及用人DRα1*01的外显子2和3取代小鼠I-Eα的外显子2和3的载体，通过几个同源重组步骤修饰RP23-458i22BAC，4.BHR–8.BHR(图4B)。所得核酸序列在PI-SceI/I-CeuI限制性位点之间，以允许连接到上述携带BALB/cI-Eα外显子1的构建体(图4C)。
图4C所示的最终构建体的序列在BALB/c内含子的3'端含有隐蔽剪接位点。进行几个BHR步骤(11.BHR-12.BHR)随后进行缺失步骤，以获得最终的靶向载体(MAID 1680)，所述载体用于经电穿孔引入ES细胞(图4D)。
详细地，最终靶向载体(MAID 1680)，从5'到3'，由以下组成：5'小鼠同源臂(由～26kb的小鼠基因序列组成，所述小鼠基因组序列恰好在内源性MHC II类基因座的H2Ab1基因的上游结束)；～59kb的包含所述人源化MHC IIβ链基因(人源化H-2Eb1基因)和人源化MHC IIα链基因(人源化H-2Ea基因)和在lox P位点之间的新霉素选择性表达盒的***；和3'小鼠同源臂(由～57kb的小鼠基因组序列组成，所述小鼠基因组序列恰好在内源性MHCII类基因座的H-2Ea基因的下游起始)。跨越5'臂和所述***(SEQ ID NO:12)之间的连接处的核苷酸序列包括以下：(TGCTGATTGG TTCCTCACTT GGGACCAACC C)TAAGCTTTA TCTATGTCGGGTGCGGAGAA AGAGGTAATG AAATGGCACA AGGAGATCAC ACACCCAAAC CAAACTCGCC，其中斜体序列是独特的PI-SceI位点，并且在5'同源臂中的小鼠基因组序列是在括号中。跨越***和3'臂之间的连接处的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)包括以下：CACATCAGTG AGGCTAGAATAAATTAAAAT CGCTAATATG AAAATGGGG(ATTTGTACCT CTGAGTGTGA AGGCTGGGAA GACTGCTTTCAAGGGAC)，其中在3’同源臂中的小鼠的基因组序列在括号中。
在所述～59kb的***中，对所述H-2Eb1基因进行如下修饰：H-2Eb1的5136bp的区域，包括内含子1，外显子2，内含子2，外显子3的最后的153bp，并且内含子3的前122bp被取代为人HLA-DRB1*04的3111bp同源区，包括内含子1，外显子2，内含子2，外显子3的最后的148bp，和内含子3的前132bp。在内含子3的人类和小鼠序列之间的连接处***了由5'lox2372位点的选择性表达盒，UbC启动子，新霉素抗性基因，和3'lox2372位点。所得基因编码嵌合的HLA-DRB1*04/H-2Eb1蛋白，所述蛋白包括小鼠H-2Eb1前导，来自DRB1*04的人β1和β2域，以及小鼠跨膜域和胞质尾。在内含子1(SEQ ID NO:14)中跨越小鼠/人连接处的核苷酸序列包括：(TCCATCACTT CACTGGGTAG CACAGCTGTA ACTGTCCAGC CTG)GGTACCGAGCTCGGATCCAC TAGTAACGGC CGCCAGTGTG CTGGAATTC GCCCTTGATC GAGCTCCCTG GGCTGCAGGTGGTGGGCGTT GCGGGTGGGG CCGGTTAA，其中斜体序列是在克隆步骤中引入的多克隆位点，小鼠内含子1序列在括号中。跨越人内含子3和新霉素选择性表达盒之间的连接处的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)包括如下：(ATCTCCATCA GAAGGGCACC GGT)ATAACTT CGTATAAGGTATCCTATACG AAGTTATATG CATGGCCTCC GCGCCGGGTT，其中的5'lox2372位点为斜体，并且人内含子3序列在括号中。跨越新霉素选择性表达盒和小鼠内含子3之间的连接处的核苷酸序列(选择性表达16)包括如下：ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG(TGGCTTACAG GTAGGTGCGT GAAGCTTCTA CAAGCACAGT TGCCCCCTGG)，其中3'lox2372位点是斜体，并且小鼠内含子3的序列在括号中。
还是在～59kb***中，对所述H-2Ea基因作如下修饰：H-2Ea的1185bp的区域，包括内含子1，外显子2，内含子2，外显子3的最后101bp，和内含子3的前66bp，被人HLA-DRA1*01的1189bp的同源区，包括内含子1，外显子2，内含子2，外显子3的最后的104bp和内含子3的前66bp取代。如上所述，由于所述H-2Ea的C57BL/6等位基因的外显子1包含使得该基因无功能的缺失，因此H-2Ea外显子1和内含子1的其余部分被来自H-2Ea的BALB/c等位基因的等价2616bp区域(其是功能性的)取代。所得基因编码的嵌合H-2Ea/HLA-DRA1*01蛋白包括来自BALB/c的小鼠H-2Ea前导，来自DRA1*01的人α1和α2，以及小鼠跨膜域和胞质尾。在内含子1中跨越小鼠/人连接处的核苷酸序列(SEQ ID NO:17)包括以下：(CTGTTTCTTC CCTAACTCCCATTCTATGCT CTTCCATCCC GA)CCGCGGCCCA ATCTCTCTCC ACTACTTCCT GCCTACATGTATGTAGGT，其中斜体序列是在克隆步骤引入的限制酶位点，BALB/c内含子1的序列在括号中。在内含子3中跨越人/小鼠连接处的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)包括以下：CAAGGTTTCCTCCTATGATG CTTGTGTGAA ACTCGGGGCC GGCC(AGCATTTAAC AGTACAGGGA TGGGAGCACAGCTCAC)，其中斜体序列是在克隆步骤引入的限制酶位点，和小鼠内含子3的序列在括号中。在外显子1的5'端的跨越C57BL/6-BALB/c连接处(SEQ ID NO:19)的核苷酸序列包括：(GAAAGCAGTC TTCCCAGCCT TCACACTCAG AGGTACAAAT)CCCCATTTTC ATATTAGCGA TTTTAATTTATTCTAGCCTC，其中所述的C57BL/6特异性序列在括号中。在外显子1的3'端的跨越BALB/c-C57BL/6连接处(SEQ ID NO:20)的核苷酸序列包括：TCTTCCCTAA CTCCCATTCT ATGCTCTTCCATCCCGA CCG CGG(CCCAATC TCTCTCCACT ACTTCCTGCC TACATGTATG)，其中SacII限制性位点为斜体，C57BL/6的序列在括号中。
实施例.3基因修饰的HLA-DR4小鼠的产生
用于使用实施例2的载体产生人源化MHC II小鼠的策略的简化图示于图5和8。
特别地，MAID1680BAC DNA(如上所述)被用于对MAID5111ES细胞电穿孔以形成修饰的ES细胞，其包含用包括嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座的基因组片段取代内源性小鼠I-A和I-E基因座。阳性ES细胞包含缺失的内源性I-A和I-E基因座，其被包括嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座的基因组片段所取代，所述阳性ES细胞通过使用TAQMANTM探针(Lee和Petropoulos，同上)进行定量PCR分析确定。所述人DRα序列的***通过使用引物hDRA1F(CTGGCGGCTTGAAGAATTTGG；SEQ ID NO:21)、hDRA1R(CATGATTTCCAGGTTGGCTTTGTC；SEQ IDNO:22)和探针hDRA1P(CGATTTGCCAGCTTTGAGGCTCAAGG；SEQ ID NO:23)经PCR确认。所述人DRβ序列的***通过使用引物hDRA1F(AGGCTTGGGTGCTCCACTTG；SEQ ID NO:24)、hDRB1R(GACCCTGGTGATGCTGGAAAC；SEQ ID NO:25)和探针hDRB1P(CAGGTGTAAACCTCTCCACTCCGAGGA；SEQ ID NO:26)经PCR证实。用引物HYGF(TGCGGCCGATCTTAGCC；SEQ ID NO:7)和HYGR(TTGACCGATTCCTTGCGG；SEQ ID NO：8)和探针HYGP(ACGAGCGGGTTCGGCCCATTC；SEQ ID NO：9)对来自靶向载体的潮霉素选择性表达盒的缺失进行确认。
然后使用方法(同上)将阳性ES细胞克隆植入雌性小鼠以产生同窝小鼠，其含有用嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座取代内源性I-A和I-E基因座的取代。将如上所述经靶向的ES细胞用作供体ES细胞并用方法导入8-细胞期的小鼠胚胎。带有嵌合人DR4/小鼠的I-E基因座的小鼠通过使用等位基因测定法的基因型分型来鉴定(Valenzuela等人，同上)，所述方法检测出嵌合的人DR4/小鼠I-E基因座的存在。
可以将带有嵌合人DR4/小鼠的I-E基因座的小鼠与Cre清除小鼠品系(参见，例如，国际专利申请公开号WO 2009/114400)交配以除去，例如，在ES细胞或在胚胎阶段，由未被去除的靶向载体引入的任何在lox P位点之间的新霉素选择性表达盒，(参见图6)。
实施例4.在基因修饰的小鼠中表达嵌合HLA-DR4/H-2E
将来自WT或杂合的人源化HLA-DR4小鼠的脾脏(“1681HET”)用胶原酶D(罗氏生物科学)灌流并且用ACK裂解液裂解红细胞。用25微克/毫升的聚(I：C)培养脾细胞两天以刺激MHC-II基因的表达。通过使用荧光染料缀合的抗-CD3(17A2)、抗-CD19(1D3)、抗-CD11c(N418)、抗F480(BM8)、抗I-A/I-E(M15)和抗HLADR(L243)经FACS分析人HLA-DR4在细胞表面的表达。使用BD-LSRII进行流式细胞术分析。人HLA-DR4的表达在CD19+B细胞的表面上可清楚地检测到并且在通过Toll样受体(toll-like receptor)激动剂聚(I：C)的刺激后显著上调(参照图9)。
实施例5.基因修饰的HLA-DQ2.5、HLA-DQ8和HLA-DR2小鼠
用基因工程技术制备携带嵌合的人HLA-DQ2.5/H-2A、HLA-DQ8/H-2A和HLA-DR2/H-2E的小鼠(见，例如，美国专利号6,586,251和Valenzuela等人，同上)。通过基因合成和经细菌同源重组以及消化/连接技术对BAC的修饰产生带有人源化基因的LTVEC。
蓝鹭基因合成公司(华盛顿州，美国)基于公开可得的基因序列合成了人HLA-DQ2.5、-DQ8.1和DR2α和β链序列。具体地，修饰合成的人HLA-DQ2.5α(DQA1*05)和β(DQB1*02)链和小鼠BAC RP23-444J20并用于产生带有嵌合的HLA-DQ2.5/H-2A的LTVEC，如图10A所示。同样地，修饰合成的人HLA-DQ8.1α(DQA1*0301)和β(DQB1*0302)链和小鼠BAC RP23-444J20并用于产生带有嵌合的HLA-DQ8.1/H-2A的LTVEC，如图10B所示。对于HLA-DR2/H-2E，使用合成的人HLA-DR2β链(DRB1*1501)来产生载体，所述载体包含DRβ1*02(1501)外显子和内含子，并且通过使用细菌同源重组交换进入包括嵌合的HLA-DR4/H-2E基因(上述实施例2的MAID 1680)的LTVEC。所得的HLA-DR2/H-2E LTVEC如图10C所示。所得LTVEC的各种核苷酸序列连接处(例如小鼠/人序列连接处，人/鼠序列连接处，或小鼠或人序列与选择盒的连接处)总结在下面表1中，并在序列表中列出；其位置示于图10的示意图中。在下面的表1中，所述小鼠序列以常规字体表示；所述人序列是在括号中；Lox序列是斜体；并且在克隆步骤中引入的限制性位点和其它基于载体的序列(例如，多克隆位点等)以粗体表示。在HLA-DR2/H-2E中的人源化H-2Ea的核苷酸序列连接处与上述实施例2(SEQ ID NO：17-20)中所述的HLA-DR4/H-2E相同。
大型靶向载体用于对MAID51 11 ES细胞进行电穿孔以形成经修饰的ES细胞，所述经修饰的ES细胞包括用包含嵌合的HLA-DQ2.5/H-2A，HLA-DQ8/H-2A，或HLA-DR2/H-2E的基因组片段取代内源性小鼠I-A和I-E基因座。对包含用包括嵌合的基因座的基因组片段取代删除的内源性I-A和I-E基因座的阳性ES细胞经定量PCR测试使用TAQMANTM探针(Lie和Petropoulos，同上)鉴定。
然后使用方法(同上)将阳性ES细胞克隆用于植入雌性小鼠以产生含有用嵌合的人/小鼠基因座取代内源性I-A和I-E基因座的同窝小鼠。将经靶向的ES细胞用作供体ES细胞并用方法将其引入8细胞期的小鼠胚胎。对带有嵌合的人/小鼠位点的小鼠用改良等位基因检测通过基因分型(Valenzuela等人，同上)来鉴定，并检测嵌合的人/小鼠基因座的存在。
将带有嵌合人/小鼠基因座的小鼠与Cre清除小鼠品系(参见，例如，国际专利申请公开号WO 2009/114400)交配以除去，例如，在ES细胞或在胚胎阶段，由未被去除的靶向载体引入的任何在lox P位点之间的新霉素或潮霉素选择性表达盒。
对嵌合的人/小鼠蛋白的表达进行测试。具体地，对HLA-DQ2.5/H-2A基因修饰的动物而言，将来自WT或杂合的人源化HLA-DQ2.5小鼠(“6040HET”；选择性表达盒被删除)的血液虹吸到肝素包被的毛细管中，并且用ACK裂解液裂解红细胞。通过使用荧光染料缀合的抗-CD3(17A2)、抗-CD19(1D3)、抗I-A/I-E(M15)和抗-HLA-DQ(Tu169)抗体经FACS分析人HLA-DQ2.5在细胞表面的表达。使用BD-Fortessa进行流式细胞术分析。小鼠MHC-II(I-A/I-E)和人HLA-DR2.5的表达在递呈抗原的CD19+小鼠B细胞的表面上均可清楚地检测到。
等同方式
本领域技术人员将认识到或能够仅仅使用常规实验来确定本文中所描述的本发明的具体实施方式的许多等同方式。这样的等同方式亦由本发明的权利要求所涵盖。
引用在本申请的所有非专利文献、专利申请和专利的全部内容通过引用整体并入申请。

Claims (34)

1.一种制备基因修饰的非人类动物的方法，所述方法包括修饰非人动物基因组以在其内源性MHC II基因基因座包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽，所述第二核苷酸序列编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽，
其中所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽包括与非人MHC IIα多肽的非人跨膜域和胞质域可操作连接的人HLA-DR2α多肽的α2结构域，
并且所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽包括与非人MHC IIβ多肽的非人跨膜域和胞质域可操作连接的人HLA-DR2β多肽的β2结构域，以及
其中所述嵌合的人/非人MHC IIα和MHC IIβ多肽在所述动物的细胞表面上形成MHC II复合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽进一步包括与所述HLA-DR2α多肽的人α2结构域可操作连接的人HLA-DR2α多肽的α1结构域。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合的人/非人MHC IIβ多肽进一步包括与所述HLA-DR2β多肽的人β2结构域可操作连接的人HLA-DR2β多肽的β1结构域。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一核苷酸序列与内源性非人MHC IIα启动子和调控元件在内源性MHC II基因基因座可操作地连接，以及所述第二核苷酸序列与内源性非人MHC IIβ启动子和调控元件在内源性MHC II基因基因座可操作地连接。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人MHC IIα多肽的非人跨膜域和胞质域是内源性非人MHC IIα多肽的跨膜域和胞质域。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人MHC IIβ多肽的非人跨膜域和胞质域是内源性非人MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述动物在细胞表面不表达来自内源性MHC II基因基因座的功能性内源性MHC II多肽。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述动物是啮齿动物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述啮齿动物是大鼠或小鼠。
10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述非人动物是小鼠，其中所述嵌合的MHC IIα多肽包括来自小鼠H-2Eα多肽的跨膜域和胞质域，并且所述嵌合的MHC IIβ多肽包括来自小鼠H-2Eβ多肽的跨膜域和胞质域。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述内源性基因基因座是内源性H-2E基因座。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述小鼠不表达来自所述内源性H-2E基因座的小鼠H-2Eα多肽的功能性胞外域。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述小鼠不表达来自所述内源性H-2E基因座的小鼠H-2Eβ多肽的功能性胞外域。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述小鼠不表达来自所述内源性H-2E基因座的小鼠H-2Eβ多肽的功能性胞外域。
15.根据权利要求11所述的方法，其中所述内源性H-2E基因座缺乏内源性核苷酸序列，所述内源性核苷酸序列编码小鼠H-2Eα多肽的α1和α2结构域。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述内源性H-2E基因座缺乏内源性核苷酸序列，所述内源性核苷酸序列编码小鼠H-2Eβ多肽的β1和β2结构域。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述内源性H-2E基因座缺乏内源性核苷酸序列，所述内源性核苷酸序列编码小鼠H-2Eβ多肽的β1和β2结构域。
18.一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括
(1)在第一内源性MHC II基因座修饰小鼠基因组以包括：
第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码第一嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽，所述第一嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽包括由HLA-DR2的α链基因的至少一部分编码的α2结构域，其可操作地连接至第一小鼠MHC IIα多肽的跨膜域和胞质域，以及
第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码第一嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽，所述第一嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽包括由HLA-DR2的β链基因的至少一部分编码的β2结构域，其可操作地连接至第一小鼠MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域；并且
(2)在第二内源性MHC II基因座修饰小鼠基因组以包括：
第三核苷酸序列，所述第三核苷酸序列编码第二嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽，所述第二嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽包括由HLA-DQ8的α链基因的至少一部分编码的α2结构域，其可操作地连接至第二小鼠MHC IIα多肽的跨膜域和胞质域，以及
第四核苷酸序列，所述第四核苷酸序列编码第二嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽，所述第二嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽包括由HLA-DQ8的β链基因的至少一部分编码的β2结构域，其可操作地连接至第二小鼠MHC IIβ多肽的跨膜域和胞质域；且
其中所述小鼠在所述小鼠的细胞表面上表达两种嵌合的人/小鼠MHC II复合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述小鼠不表达来自所述第一和第二内源性MHCII基因座的小鼠MHC IIα多肽的功能性胞外域或小鼠MHC IIβ多肽的功能性胞外域。
20.根据权利要求18中所述的方法，其中：
所述第一内源性MHC II基因座是H-2E基因座，
所述小鼠MHC IIα多肽是H-2Eα多肽，
以及
所述第一小鼠MHC IIβ多肽是H-2Eβ多肽。
21.根据权利要求18中所述的方法，其中：
所述第二内源性MHC II基因座是H-2A基因座，
所述第二小鼠MHC IIα多肽是H-2Aα多肽，以及
所述第二小鼠MHC IIβ多肽是H-2Aβ多肽。
22.一种编码嵌合的人/非人MHC II复合物的核苷酸序列，包括：
(1)编码嵌合的人/非人MHC IIα多肽的第一核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHCIIα多肽包括与非人MHC IIα多肽的非人跨膜域和胞质域可操作连接的HLA-DR2的α2结构域，和
(2)编码嵌合的人/非人MHC IIβ多肽的第二核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHCIIβ多肽包括与非人MHC IIβ多肽的非人跨膜域和胞质域可操作连接的HLA-DR2的β2结构域。
23.根据权利要求22所述的核苷酸序列，其中所述嵌合的人/非人MHC IIα多肽进一步包括与所述α2结构域可操作连接的HLA-DR2的α1结构域，并且其中所述嵌合的人/非人MHCIIβ多肽进一步包括与所述β2结构域可操作连接的HLA-DR2的β1结构域。
24.根据权利要求22所述的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列位于非人类动物的基因组中内源性MHC II基因座。
25.根据权利要求22-24任一项所述的核苷酸序列，其中所述非人MHC IIα和β多肽分别是选自由H-2A和H-2E组成的组的小鼠MHC II的α和β多肽。
26.一种在小鼠ES细胞中修饰内源性MHC II基因座以表达两种嵌合的人/小鼠MHC II复合物的方法，其中所述方法包括：
在单个ES细胞中的第一内源性MHC II基因座：
用至少编码第一人MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列，以及
用至少编码第一人MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列以产生第一经修饰的MHCII基因座；并且
在所述单个ES细胞中的第二内源性MHC II基因座：
用至少编码第二人MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列，以及
用至少编码第二人MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列以产生第二经修饰的MHCII基因座，
其中，所述第一内源性MHC II基因座和所述第二内源性MHC II基因座在所述单个的ES细胞中被依次修饰。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一人MHC IIα和人MHC IIβ多肽分别为选自下组：HLA-DR4、HLA-DQ2、HLA-DQ2.5、HLA-DQ8和HLA-DQ8.1的人MHC II的α和β链。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述第一内源性MHC II基因座是H-2A基因座或H-2E基因座。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一内源性MHC II基因座是H-2A基因座。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第二内源性MHC II基因座是H-2E基因座。
31.一种制备基因修饰小鼠的方法，所述方法包括：
修饰小鼠的第一内源性MHC II基因座以表达第一嵌合的人/小鼠MHCIIα多肽和第一嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽，所述修饰包括
在所述第一内源性MHC II基因座用至少编码人MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列，以及
在所述第一内源性MHC II基因座用至少编码人MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列以产生第一经修饰的MHC II基因座；以及
修饰所述小鼠的第二内源性MHC II基因座以表达第二嵌合的人/小鼠MHC IIα多肽和第二嵌合的人/小鼠MHC IIβ多肽，所述修饰包括
在所述第二内源性MHC II基因座用至少编码人MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列，以及
在所述第二内源性MHC II基因座用至少编码人MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列以产生第二经修饰的MHC II基因座；以及
其中所述小鼠表达两种嵌合的人/小鼠MHC II复合物，所述复合物来自所述第一和所述第二经修饰的MHC II基因座。
32.根据权利要求1-9和18任一项的方法，其中所述修饰包括在所述内源性MHC II基因基因座：
用至少编码人HLA-DR2α多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码非人动物MHC IIα多肽的α2结构域的核苷酸序列，以及
用至少编码人HLA-DR2β多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码非人动物MHC IIβ多肽的β2结构域的核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述动物是小鼠和所述内源性MHCII基因座是H-2E基因座。
34.根据权利要求33所述的方法，包括：
在所述内源性H-2E基因座用至少编码人HLA-DR2α多肽的α2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠H-2Eα多肽的α2结构域的核苷酸序列，并且
在所述内源性H-2E基因座用至少编码人HLA-DR2β多肽的β2结构域的核苷酸序列替换至少编码小鼠H-2Eβ多肽的β2结构域的核苷酸序列以产生经修饰的MHC II基因座；并且
其中所述小鼠在所述小鼠的细胞表面上表达嵌合的人/小鼠MHC II复合物。
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