CN105198969B - 一种1型鸭甲肝病毒vp3蛋白的b细胞表位及其鉴定方法和应用 - Google Patents

一种1型鸭甲肝病毒vp3蛋白的b细胞表位及其鉴定方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用，其鉴定方法包括以下步骤：获取VP3目的片段、构建重组表达质粒pGEX‑VP3、制备VP3重组蛋白、制备VP3重组蛋白多克隆抗体、测定DHAV‑1病毒对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD50、测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价、VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定。本发明综合运用生物信息学软件预测了VP3蛋白的线性B细胞表位并人工合成表位肽，结合间接ELISA方法对人工表位肽进行了鉴定，可为后续DHAV‑1免疫学研究的深入开展、建立新型诊断制剂和开发多肽疫苗提供参考。

Description

一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和 应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用。
背景技术
鸭肝炎又名鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis，DVH)，是由鸭肝炎病毒(Duckhepatitis virus，DHV)引起的一种高度接触性和致死性的鸭病毒性传染病，其特征为发病急、传播快、病程短、病死率高，病鸭剖检可见肝肿大、表面呈树枝状充血或出血性斑点，该病最早于1945年发现于美国。DHV最初分三个血清型(DHV-1，DHV-2和DHV-3)，后来DHV-2和DHV-3被划归星状病毒科，三个血清型之间无抗原相关性。现在DHV-1已被命名为鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)，归为小RNA病毒科的禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)，包含三个基因型(DHAV-1、2和3)，其中1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)是分布最广、危害最大的鸭甲型肝炎病毒。DHAV可在鸭胚、鸡胚和鹅胚的绒毛尿囊腔内增殖，也可经鸡胚胎成纤维细胞、鸡胚胎肾细胞、鸭胚胎成纤维细胞、鸭胚胎肝细胞、鸭胚胎肾细胞等多种细胞培养。DHAV抵抗力强，对常见的病毒灭活剂和消毒剂有较显著的抵抗力，且能耐受pH3.0的酸性环境，对热也有较强抵抗力。细胞培养物中的DHAV在50℃的半衰期为48min，一定浓度的NaCl、Na2SO4、MgCl2或MgSO4可防止病毒在50℃失活，但62℃30min可使其全部灭活。感染鸡胚液中的病毒于4℃可存活半年，置-20℃则能保持活力达9年之久。自然环境中，病毒可在未清洗的污染孵化器内可存活至少10w，在阴凉处的湿粪中可存活37d以上。DHAV可致雏鸭常年发病(自然状态下)，且可在感染后3～4d内死亡。成年种鸭感染后无临床症状，且不影响其产蛋性能。病毒主要通过消化道排出体外，然后又通过食物或饮水经呼吸道和消化道再次感染，病鸭、成年带毒鸭及康复鸭是主要的带毒体，可以通过粪便排毒，引起其他易感鸭群的感染，该病毒不经过卵垂直传播给后代，但明显可以在鸭群中水平传播。该病毒对雏鸭的致死率很高，1周龄以内的雏鸭死亡率高达95％，1～3周龄内死亡率降至50％以下，到4～5周龄死亡率会更低一些。
抗原表位是发挥抗原分子抗原性的结构和功能单位，它们为小的短肽，一般不超过20aa。从结构上可分为线性表位和构象型表位，线性表位既有T细胞表位也有B细胞表位，而构象型表位却是B细胞表位所特有的。B细胞表位上的特定位点能被B淋巴细胞特异性识别并结合，诱导机体体液免疫应答，从而有效清除病原。对抗原表位的研究是疾病诊断、定点改造蛋白类生物制品以及预防、治疗疾病的基础，尤其是目前表位疫苗的研究，都是以表位研究为基础。
目前，国内外研究抗原表位的方法主要有单克隆抗体技术、噬菌体展示技术、裂解法、交互重叠多肽法、肽芯片高通量扫瞄法等，诸多试验结果显示，单独或者综合利用以上技术开展抗原表位研究是可行的。随着生物信息学技术的发展，目前B细胞表位的研究可更多借助于软件预测，而且其准确性也越来越高。绝大多数B细胞表位的预测都是以一级结构为基础，而对构象表位预测的准确性却不及线性表位。综合亲水性、柔性、表面可及性、抗原性及二级结构可分析预测线性B细胞表位，VP3是小RNA病毒主要的结构蛋白，众多研究已经证明小RNA病毒的VP3蛋白上存在众多的B细胞表位，而DHAV的VP3蛋白的B细胞表位却尚未见研究和证实的报道，理论上推测，其VP3蛋白上也会存在大量B细胞表位，因此挖掘其表位信息具有研究价值。
目前针对1型鸭甲肝病毒的检测和预防手段尚需改进和完善，目前的检测方法主要还是传统的基于全病毒的血清学检测或基于病毒基因组序列的分子生物学检测，因此急需研发新型有效的诊断试剂。预防方面抗菌素只能预防细菌的继发感染，免疫接种仍是防控的主要手段。1型鸭甲肝病毒的预防主要是通过免疫弱毒活疫苗来实现，治疗主要通过被动免疫注射DHAV抗体，以上措施仍然存在效率不够理想的问题，因此，如何针对VP3蛋白的抗原表位多肽构建新型疫苗、建立更加准确敏感的诊断方法及其诊断试剂，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明为了解决上述技术难题，提供一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位及其鉴定方法和应用。本发明综合运用生物信息学软件预测了VP3蛋白的线性B细胞表位并人工合成表位肽，结合间接ELISA方法对人工表位肽进行了鉴定，可为后续DHAV-1免疫学研究的深入开展、提供新型诊断制剂和开发多肽疫苗等提供参考。本发明采用间接ELISA方法鉴定B细胞表位，结果显示该方法是切实可行的。
为了达到上述技术效果，本发明的技术方案包括：
一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或SEQ ID NO:5所示。
一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤一：获取VP3目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP3截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3’，见SEQ ID NO:2，下游引物为5'-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3’，见SEQ ID NO:3；增殖1型鸭甲肝病毒株，并提取1型鸭甲肝病毒株的RNA，利用随机引物对1型鸭甲肝病毒的RNA为模板进行cDNA合成后以特异性引物进行PCR扩增，得到VP3目的片段；
步骤二：构建重组表达质粒pGEX-VP3：将所述VP3目的片段T-A克隆至pMD19-T(Simple)载体中，构建重组T质粒pMD19-VP3，用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切空质粒pGEX-4T-1和鉴定正确的阳性重组质粒pMD19-VP3，回收、连接、鉴定，得到重组表达质粒pGEX-VP3；
步骤三：制备VP3重组蛋白：将所述重组表达质粒pGEX-VP3转化至大肠杆菌BL21DE3中，进行重组蛋白诱导表达，结束后，将菌液纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP3重组蛋白，所述VP3重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
步骤四：制备VP3重组蛋白多克隆抗体，检测血清效价并鉴定多克隆抗体的特异性；
步骤五：测定DHAV-1病毒对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD50；
步骤六：测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价；
步骤七：VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定：预测VP3蛋白B细胞抗原表位，人工合成表位肽，以VP3重组蛋白多克隆抗体和阴性血清进行间接ELISA。
进一步的，所述VP3重组蛋白多克隆抗体制备步骤包括：以纯化的VP3重组蛋白免疫雄兔制备抗血清，用琼脂扩散试验检测最后一次免疫后7d的血清效价，获得VP3重组蛋白多克隆抗体。
进一步的，所述免疫的程序包括：首免用0.5mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮内、皮下注射兔子；首免后11天用1mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，在兔子的颈背部皮下注射进行二免；二免后22天用1mg的VP3重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下注射兔子进行三免；首免后34和47天，用0.5mg的VP3重组蛋白耳缘静脉注射兔子进行四免和五免。
进一步的，所述测定DHAV-1病毒对鸡胚的半数致死量ELD50步骤包括：将DHAV-1弱毒株的病毒液作连续10倍稀释并接种9日龄鸡胚尿囊腔，对接种后的鸡胚每天照蛋观察，统计各组鸡胚死亡情况，采用Reed-Muench法计算病毒液的ELD50。
进一步的，所述测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价步骤包括：用测过ELD50的DHAV-1弱毒株的病毒液，按固定病毒-稀释血清法测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价，运用Reed-Muench法计算其中和效价。
进一步的，所述测定B细胞抗原表位鉴定步骤包括：先分别对VP3蛋白氨基酸序列的柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析；进一步预测序列抗原性，预测得到VP3重组蛋白的B细胞表位，人工合成表位肽段样品，然后以纯化的VP3重组蛋白作抗原，VP3重组蛋白多克隆抗体作为检测试剂，采用间接ELISA通过方阵滴定法，选择阳性孔OD值1.0左右、阴性对照OD值0.1左右的抗原包被浓度作为最佳抗原稀释度，最后以最佳抗原浓度稀释各抗原表位肽，以倍比稀释的兔抗VP3重组蛋白多克隆抗体作一抗，平行设置阴性兔血清对照，HRP-羊抗兔IgG作二抗，按照间接ELISA方法对人工合成的抗原表位肽段进行鉴定。
上述鉴定方法中，所述步骤一中的1型鸭甲肝病毒株为1型鸭甲肝病毒H株，小RNA病毒科(Picornaviridae)，禽肝病毒属(Avihepatovirus),学名为1型鸭甲肝病毒(DuckHepatitis A Virus type 1，DHAV-1)，所述1型鸭甲肝病毒H株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.V201539。
所述的DHAV-1弱毒株，该培养物已于2012年11月20日由保藏在中国典型培养物保藏中心收到，并登记入册。保藏号为CCTCC NO.V201248，并且为已在专利公报中授权的生物材料，专利号为ZL201310011872.3。
所述的1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位可应用于检测1型鸭甲肝病毒感染或1型鸭甲肝病毒抗体检测的试剂盒中。
所述的1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位用作检测1型鸭甲肝病毒感染或1型鸭甲肝病毒抗体检测的试剂盒组分中的抗原。
所述1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位在制备预防1型鸭甲肝病毒基因工程疫苗中应用。
本发明的有益效果包括：
1、本发明提供的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位可用于作为检测1型DHAV抗体的检测抗原及基因工程亚单位疫苗的序列；
2、本发明提供的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位，偶联之后可用于检测鸭血清中的1型鸭甲肝病毒抗体，建立1型鸭甲肝病毒感染及1型鸭甲肝病毒抗体检测的试剂盒及ELISA检测方法；
3、现有技术中的抗原表位的方法主要有单克隆抗体技术、噬菌体展示技术、裂解法、交互重叠多肽法、肽芯片高通量扫瞄法等，要么需要特殊仪器、试剂或技术，本发明仅采用常规的多克隆抗体鉴定，简便、快速。
生物材料保藏
本发明中1型鸭甲肝病毒H株保藏于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO.V201539，地址位于中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年8月31日，分类命名为1型鸭甲肝病毒H株。
附图说明
图1所示为本发明鸭甲型肝炎病毒基因组结构模式图。
图2所示为本发明实施例1的VP3重组蛋白表达情况的分析图。
图3所示为本发明实施例2重组蛋白表达IPTG浓度的优化检测图。
图4所示为本发明实施例2重组蛋白表达诱导温度的优化检测图。
图5所示为本发明实施例2重组蛋白表达诱导时间的优化检测图。
图6所示为本发明实施例1的VP3基因的RT-PCR扩增产物电泳检测图。
图7所示为本发明实施例1的pMD-VP3重组T质粒鉴定图。
图8所示为本发明实施例1的pGEX-VP3重组表达质粒鉴定图。
图9所示为本发明实施例1的pGEX-VP3重组表达质粒测序结果序列比对图。
图10所示为本发明实施例1的VP3重组蛋白纯化检测图。
图11所示为本发明实施例1的VP3重组蛋白免疫印记分析图。
图12所示为本发明实施例3中VP3重组蛋白多克隆抗体的鉴定图。
图13所示为本发明实施例4中酶标抗体工作浓度图。
图14所示为本发明实施例3中VP3蛋白B细胞表位鉴定分析图。
图15所示为本发明实施例4中ELISA检测方法敏感性分析图。
图16所示为本发明实施例4中ELISA检测方法交叉反应性分析图。
图17所示为本发明实施例4中DHAV-1阳性血清阻断分析图。
图18所示为本发明实施例4中DHAV-3阳性血清阻断分析图。
图19所示为本发明实施例4中表位肽和VP3重组蛋白在抗体检测中的对比分析图。
具体实施方式
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
本发明所述1型鸭甲肝病毒H株，序列已经公开于GenBank数据库中，登记号为JQ301467。
如图1所示，参照其他小RNA病毒进行生物信息学分析推测，DHAV的蛋白是由基因组中长2249nt的ORF表达的一个多聚蛋白(polyprotein)前体经过自身裂解加工而来。ORF可分为P1、P2和P3三个区，P1区编码VP0(1AB)、VP3(1C)和VP1(1D)三种结构蛋白，P2区和P3区分别编码2A(含2A1、2A2和2A3)、2B、2C及3A、3B、3C、3D七种非结构蛋白。病毒粒子进入细胞后，首先进行翻译，生成的2A、3C(3CD)蛋白酶具有水解功能，然后开始进行蛋白质前体的切割。切割为成熟的蛋白需要进行两个步骤，第一步是由3C(3CD)、2A切割P2-P3连接及P1-P2连接，生成P1(或P1-2A)、P2和P3三个多聚前体蛋白。第二步则由3C(3CD)完成余下的步骤。
实施例1
一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或SEQ ID NO:5所示。
一种上述1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位的用途，可应用于检测1型鸭甲肝病毒感染或疫苗抗体水平的试剂盒中。
进一步的，所述的1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位用作检测1型鸭甲肝病感染或疫苗抗体水平的试剂盒组分中的抗原。
一种上述1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位的用途，所述1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位在制备预防1型鸭甲肝病毒疫苗中应用。
一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，包括以下步骤：
步骤一：获取VP3目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP3截断基因酶切位点和特异性引物，所述上游引物为5'-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3’，下游引物为5'-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3’；
1、DHAV-1病毒株增殖：将DHAV-1病毒液用生理盐水作适当稀释后，1:100(v/v)加入双抗并37℃孵育1h，接种11日龄无DHAV-1母源抗体鸭胚的尿囊腔，0.2mL/枚。37℃常规孵化培养，弃24h内死亡的胚。收集24h～96h内死亡胚，4℃保存过夜后收集尿囊液，-20℃冻存备用。
2、提取DHAV-1病毒株的RNA：(1)取病毒悬液200μL到1.5mL EP管中，加入RNAisoPlus 1000μL，颠倒混匀，室温放置10min；(2)加入200μL氯仿，盖紧EP管盖，用力震荡，室温放置10min；(3)4℃，12000rpm离心15min，取上清转移至另一1.5mL进口无RNase EP管中(切忌吸动白色中间相)。(4)加入与所吸上清等体积的异丙醇，轻轻颠倒EP管以充分混匀液体，离心机中4℃沉淀20min。(5)4℃，12000r/min离心15min，用加样枪小心吸去所有上清。(6)用1mL DEPC水配制的75％乙醇轻轻洗一遍，4℃、12000r/min离心10min，用加样枪小心吸去所有上清，在超净台中静置5min，使其自然风干。(7)加适量RNase Free水溶解沉淀物，-20℃保存。
3、VP3基因的RT-PCR扩增：利用随机引物对1型鸭甲肝病毒的RNA为模板进行cDNA合成后用特异性引物进行PCR扩增，得到VP3目的片段；
按宝生物的PrimeScript Reverse Transcript说明书添加体系(20μL)，反转录合成cDNA，具体如下：1.5mL进口无RNase EP管中加入RNA 2μL，Random Primers(10μmol/L)5μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L each)4μL，65℃上保温5min后迅速冰上急冷2min，离心5s后向管中加入5×PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript Reverse Transcript Mix 1μL，最后加入RNase free水4μL。加完体系后30℃10min，再42℃40min，最后70℃保温15min后冰上冷却，-20保存备用。
随后参照EmeraldAmp PCR Master Mix的说明及对PCR反应条件的摸索来确定参数，待条件清楚后再用高保真酶扩增目的片段，扩增体系和程序见表1。
表1PCR扩增体系和程序
扩增完毕后取4.5μL PCR产物加入0.5μL的10×Loading buffer于1％的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像***中观察并记录结果。结果见图6所示，发现在约750bp处(实际大小774bp)出现特异性条带，与预期结果相符。图6中，M：DL2000分子量标准；1：VP3基因RT-PCR产物。
步骤二：构建重组表达质粒pGEX-VP3：将所述VP3目的片段T-A克隆至pMD19-T(Simple)载体中，构建重组T质粒pMD19-VP3，具体步骤包括：将鉴定正确的PCR产物按DNA凝胶回收试剂盒的操作步骤进行胶回收纯化，并对回收产物末端加A(7.5uL回收片段+2.5μLPCR Master Mix，72℃30min)，琼脂糖凝胶电泳估测浓度后，按两片段的摩尔比计算并添加连接体系见表2，连接pMD19-T(Simple)载体，16℃过夜。
表2T-A克隆连接体系
组分 体积
pMD19-T(Simple)载体 0.03pmol
VP3目的片段 0.18pmol
SolutionⅠ 5.0μL
总体积 10μL
取上述连接产物7.5μL加入到100μL DH5α感受态中，轻柔混匀后冰浴30min，然后立即置42℃水浴热激90s，取出后继续冰浴3min，加入800μL LB培养液于37℃振荡培养lh，3000r/min 2min离心，弃上清，留约250μL混匀沉淀后涂于LB平板(Amp+)上，37℃培养16h。随机挑取单菌落，接种到5mL LB培养基(Amp+)中，37℃振荡培养过夜，浑浊后进行菌液PCR鉴定，任选一份鉴定正确的菌参照Omega公司质粒小量抽提试剂盒说明抽提质粒，进一步酶切(37℃，1.5h)鉴定。菌液PCR鉴定体系(10μL)：PCR Master Mix 5μL，菌液1μL，P1、P2(10mmol/L)各0.5μL，灭菌蒸馏水3μL。酶切鉴定(10μL)：质粒8μL，BamH I、Xho I各0.5μL，10×K buffer 1μL，37℃酶切1.5h。
1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，将阳性克隆命名为pMD19-VP3，扩大培养后取一部分用30％甘油生理盐水保种，-70℃冻存。
用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切空质粒pGEX-4T-1和鉴定正确的阳性重组质粒pMD19-VP3，回收、连接、鉴定，得到重组表达质粒pGEX-VP3；具体步骤包括：酶切体系：pMD19-VP3或pGEX-4T-148μL，BamH I、Xho I(15U/μL)各3μL，10×K buffer 6μL。加好酶切体系后，20μL/管分装，37℃酶切2h。对酶切后产物用1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪下分别切VP3和pGEX-4T-1的凝胶目的条带，用DNA胶回收纯化试剂盒进行纯化。电泳估测浓度，计算并添加连接体系见表3，16℃过夜。
表3亚克隆连接体系
组分 体积
pGEX-4T-1酶切片段 0.03pmol
VP3胶回收产物 0.18pmol
Solution I 7.5μL
总体积 15μL
取上述连接产物7.5μL加入到100μL DH5α感受态中，轻柔混匀后冰浴30min，然后立即置42℃水浴热激90s，取出后继续冰浴3min，加入800μL LB培养液于37℃振荡培养lh，3000r/min 2min离心，弃上清，留约250μL混匀沉淀后涂于LB平板(Amp+)上，37℃培养。次日挑单菌落按T克隆的鉴定方法分别进行菌液PCR鉴定和酶切鉴定，正确的菌液送Invitrogen公司(上海)测序，对测序结果进行比对分析，命名阳性质粒为pGEX-VP3。
pMD-VP3重组T质粒的菌液PCR鉴定及酶切鉴定均得到预期大小的条带见图7(M1,M2：DL15000和DL2000分子量标准；1：BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；2：pMD-VP3的PCR鉴定)。pGEX-VP3重组表达质粒经菌液PCR鉴定和酶切鉴定也得到预期大小的条带见图8(M1,M2：DL15000和DL2000分子量标准；1：BamHⅠ单酶切鉴定；2：BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定；3：pGEX-VP3的PCR鉴定)。对测序结果通过NCBI上Blastn同源性比对分析表明，载体中***的基因片段大小为774bp，克隆得到的VP3基因序列与原始片段同源性为100％，结果见图9，中括号内区域为VP3基因序列。表明重组表达载体构建成功，命名为pGEX-VP3。
步骤三：制备VP3重组蛋白：将所述重组表达质粒pGEX-VP3转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，进行重组蛋白诱导表达，结束后，将菌液纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP3重组蛋白。
所述重组蛋白诱导表达步骤包括：挑取含重组质粒pGEX-VP3的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落至50mL LB液体培养基中37℃活化过夜，次日按菌液与LB培养基体积比1:100比例接种于100mL LB液体培养基中扩大培养，200r/min、37℃、培养3～4h至A600为0.5～0.7，加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L、37℃诱导8h。
所述的纯化步骤包括：将表达后含重组蛋白的菌液8000r/min离心5min收集菌体沉淀，并按Tris-Cl溶液和菌液体积比1:10加入20mmol/L pH为8.0的Tris-Cl悬浮，于冰水浴中超声波破碎菌体，超声60s，间隔60s，反复直至菌液清亮透明，超声破碎后的菌液10000rpm离心10min，收集沉淀并用8mol/L尿素充分溶解后制样，蛋白垂直电泳槽电泳并切下目的条带，放置蛋白缓冲液中电透析，收集蛋白液，超滤浓缩，得到纯化后的重组蛋白。取部分进行SDS-PAGE检测，如图10所示可知，该方法得到的蛋白纯度较高，图10中M：低分子量蛋白质标准、1：未纯化的VP3重组蛋白、2：纯化后的VP3重组蛋白。
重组蛋白的Western blot分析：将含VP3重组蛋白的样品进行SDS-PAGE，电泳快结束时按要求剪合适大小的膜和滤纸并浸泡。按照正极“纤维垫-三层滤纸-PVDF膜-凝胶-三层滤纸-纤维垫”负极的顺序安装电转三明治，80V转印90min，完毕后将PVDF膜取出，加封闭液于37℃振动孵育1h，然后以1:100稀释的兔抗DHAV-1IgG 37℃振动孵育1h后取出，PBS洗涤3次，每次5min，随后以1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG于37℃振动孵育1h，PBS洗涤后按DAB显色试剂盒说明书显色，待目的条带清晰可见时以蒸馏水冲洗终止显色。将PVDF膜干燥避光保存。
用含VP3重组蛋白的样品作抗原，兔抗DHAV-1抗体作一抗，进行Western blot鉴定，结果产生了预期大小的特异性印记，而阴性兔血清对照未见特异性条带见图11所示，证明表达的VP3重组蛋白可被兔抗DHAV-1抗体识别，具有良好的反应原性，图11中，M：预染蛋白Marker；1：含VP3重组蛋白的样品孵育兔抗DHAV-1抗体；2：含VP3重组蛋白的样品孵育兔阴性血清。
步骤四：制备VP3重组蛋白多克隆抗体，检测血清效价并鉴定多克隆抗体的特异性；
1、多抗血清的制备：
事先对动物房进行甲醛熏蒸消毒，密闭熏蒸3d后，开窗通风2d，购回的雄兔适应性饲养1d，并于免疫前一天采集少量阴性血，分离血清，-20℃保存备用。预先用核酸蛋白仪估测VP3重组蛋白的浓度，并根据各免疫阶段所需的蛋白量确定好所需抗原量，然后按如下方法乳化抗原：将佐剂和重组蛋白等体积混合后，于冰浴中超声乳化，直至将乳化抗原滴于冰水中出现完整且10min内不散开的圆形油珠即可。免疫的程序包括：首免用0.5mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮内、皮下注射兔子；首免后11天用1mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，在兔子的颈背部皮下注射进行二免；二免后22天用1mg的VP3重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下注射兔子进行三免；首免后34和47天，用0.5mg的VP3重组蛋白耳缘静脉注射兔子进行四免和五免。
2、多抗血清琼扩效价的测定：四免6d后兔耳缘静脉少量采血，进行琼脂扩散试验。梅花孔的中间孔滴加0.2～0.3mg/mL的VP3重组蛋白，周围孔逐一加入阴性兔血清、1:2、1:4、1:8、1:16和1:32稀释的免疫兔血清，50μL/孔，37℃湿盒孵育24h后观察沉淀线。抗血清效价大于1:16时颈动脉放血，否则再加强免一次，直到达到要求。最后一次免疫后颈动脉放血(尽可能保证无菌操作)，收集血液37℃静置lh后，4℃冰箱过夜，第二天对析出血清进行分离，血凝块以5000r/min离心10min，再次分离析出血清，3mL/瓶分装于5mL的青霉素瓶，-20℃保存备用。
3、多抗血清的特异性鉴定：
以VP3重组蛋白作抗原，制备的多抗(1:100)作一抗，HRP标记的羊抗兔IgG(1:3000)作二抗，按上述Western blot方法，鉴定VP3重组蛋白多克隆抗体特异性。
步骤五：测定DHAV-1病毒株对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD50：ELD50的测定步骤如下：(1)在青霉素瓶或离心管中用灭菌生理盐水将DHAV-1的CH60株病毒液作连续10倍稀释，从10-4～10-8。(2)将稀释好的病毒接种9日龄鸡胚尿囊腔，5枚/稀释度，0.2mL/枚，以石蜡封口，37℃培养，弃24h之内死亡的胚，24h之后死亡的鸡胚置4℃保存。连续培养5d，记录结果。(3)设正常鸡胚对照(用灭菌生理盐水代替毒液，按上述方法接种5枚，0.2mL/枚)。(4)Reed-Muench法计算结果。
步骤六：测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价：多抗血清中和效价的测定采用固定病毒-稀释血清法，具体如下：(1)将VP3多抗血清用灭菌生理盐水作连续两倍倍比稀释(l:2～1:256)。(2)将已测过毒力的CH60病毒原液用生理盐水稀释为200TCID50/0.1mL后，与各个稀释度的待检血清等体积充分混匀，置37℃作用1h，其间摇动1～2次，进行中和。(3)将上述中和后的混合液接种9日龄鸡胚尿囊腔，5枚/稀释度，0.2mL/枚，37℃继续孵育。(4)设如下对照：空白对照组(用灭菌生理盐水替代中和液，如上步骤操作，鸡胚须全部健活)；病毒对照(单用100ELD50/0.2mL的CH60株如上步骤进行接种，鸡胚须全部死亡)。(5)连续观察5d，记录死亡情况，Reed-Muench法计算结果。
步骤七：VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定：
1、抗原表位的预测及肽段的合成：
根据VP3的B细胞表位预测结果，合成相应的表位肽段，1mg/管分装，分别命名为VP3a(131FNTGRYQMSWYPIADGEQSL150)、VP3b(200VNSSAPSNID209)。各取一管稀释成1mg/mL，将稀释液置于-20℃冻存备用。
2、抗原表位肽最佳稀释浓度的确定：
用纯化的VP3重组蛋白作抗原，前述制备的兔抗VP3重组蛋白多抗血清作一抗，HRP-羊抗兔IgG作二抗，设置兔阴性血清对照，以方阵滴定法进行间接ELISA，以确定抗原最佳工作浓度。具体步骤如下：
(1)包被：将VP3重组蛋白用碳酸盐缓冲液(pH9.6)进行1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280和1:2560梯度稀释并包被酶标板，100μL/孔，4℃过夜。
(2)洗板：取出酶标板，弃抗原液，洗涤缓冲液(pH7.4)洗板4次，每次5min，拍干反应板(洗板过程下同)。
(3)封闭：向微量反应孔中加入1％明胶溶液，200μL/孔，37℃孵育90min。
(4)加样：取出封闭好的酶标板，弃封闭液，洗板，拍干。将VP3多克隆血清和阴性血清分别进行1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560和1:5120连续倍比稀释，分别加入微量反应孔，100μL/孔，37℃孵育90min。
(5)加酶标二抗：取出酶标板，弃孔内血清稀释液，洗板，拍干。加入1:3000稀释的HRP-羊抗兔IgG二抗，100μL/孔，37℃作用45min。
(6)显色：取出酶标板，弃孔内液体，洗板，拍干，然后加入TMB工作液，100μL/孔，室温避光作用10min后，50μL/孔加入2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪以450nm-630nm双波长测定OD值。
(7)选择阳性孔的OD值为1.0左右、阴性对照的OD值0.1左右的抗原稀释度作为工作浓度。
3、抗原表位的鉴定：
以上述测定出的最适浓度稀释各抗原表位肽，兔抗VP3多克隆抗体作一抗(平行设置阴性兔血清对照)，进行1:20～1:2560连续两倍倍比稀释。HRP-羊抗兔IgG作二抗，进行间接ELISA检测，所述间接ELISA检测方法同上述抗原表位肽最佳稀释浓度确定的ELISA步骤，对人工合成的抗原表位肽段进行鉴定。
实施例2重组蛋白的表达分析和表达条件的优化
试验方法：
1、重组蛋白的表达分析
将重组表达质粒pGEX-VP3转化的大肠杆菌BL21(DE3)阳性菌接种LB(Amp+)液体培养基，37℃活化过夜。取活化的菌液按照1:100体积比接种LB(Amp+)液体培养基，37℃扩大培养3～4h，至A600约0.6。加入终体积0.4mmol/L IPTG，37℃诱导表达4h，结束后，菌液8000r/min离心5min收集菌体沉淀，并按体积比1:10(Tris-Cl溶液:菌液)加入20mmol/LTris-Cl(pH8.0)溶液悬浮，于冰水浴中超声波破碎菌体，超声60s，间隔60s，反复直至菌液清亮透明。超声破碎后的菌液10000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，沉淀用8mol/L尿素充分溶解。分别取破碎后的上清和溶解后的沉淀各80μL，与20μL 5×SDS Loadingbuffer混合，煮沸10min后SDS-PAGE检测。同时设“空质粒pGEX-4T-1诱导”、“重组pGEX-VP3未诱导”和“重组pGEX-VP3诱导”对照。
2、重组蛋白表达条件的优化
挑取含重组质粒pGEX-VP3的BL21(DE3)单菌落至50mL LB液体培养基(Amp+)中37℃活化过夜。次日按体积比1:100(菌液：LB培养基)比例接种于100mL LB液体培养基(Amp+)中扩大培养，200r/min、37℃培养3～4h至A600约0.6。接着参照文献做表达条件优化。
(1)IPTG浓度的优化：分别加入IPTG至终浓度为：0mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L和1.5mmol/L，诱导培养4h，离心收集菌体，超声破碎后溶解沉淀，对溶解的沉淀进行SDS-PAGE检测。
(2)时间的优化:同(1)的方法，加入最佳浓度的IPTG，分别诱导0h、2h、4h、6h、8h、19h和22h，破碎后对溶解的沉淀进行SDS-PAGE检测。
(3)诱导温度的优化:同(2)的方法，加入最佳浓度的IPTG和采用最佳诱导时间，分别在16℃、25℃、30℃和37℃下诱导表达，破碎后对溶解的沉淀进行SDS-PAGE检测。
试验结果：
1、重组蛋白的表达分析
含pGEX-VP3的阳性重组表达菌经诱导表达、超声破碎后的上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，如图2所示，1～5分别为空质粒诱导、重组质粒未诱导全菌、重组质粒诱导全菌、重组质粒诱导上清和重组质粒诱导包涵体沉淀；发现在54kD左右出现目的条带，表明VP3基因得到了表达，且几乎全部以包涵体形式存在。
2、重组蛋白表达条件的优化
重组蛋白表达条件的优化如图3～5所示，图3中1～8分别IPTG浓度0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5和0mmol/L；图4中1～4分别为16℃、25℃、30℃和37℃；图5中1～7分别为22h、19h、8h、6h、4h、2h和0h。对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间分别进行优化，结果显示诱导VP3表达的最适条件为0.2mmol/L IPTG，37℃诱导8h。
实施例3一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定实验结果
1、VP3重组蛋白多克隆抗体的制备及效价测定
以纯化的VP3重组蛋白免疫雄兔制备抗血清，具体步骤：首免用0.5mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮内、皮下多点注射兔子；首免后11天用1mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下多点注射兔子进行二免；首免后22天用1mg的VP3重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下多点注射兔子进行三免；首免后34和47天，用0.5mg的VP3重组蛋白耳缘静脉注射兔子进行四免和五免。用琼脂扩散试验检测最后一次免疫后7d的血清效价，发现1:16有明显沉淀线，1:32亦可见微弱线条，而兔阴性血清无沉淀线。
2、VP3重组蛋白多克隆抗体的特异性鉴定
将获得的VP3重组蛋白多克隆抗体与SDS-PAGE的VP3重组蛋白进行Western blot反应鉴定制备的多克隆抗体的特异性。结果VP3多克隆抗体可与VP3重组蛋白反应，产生预期大小的特异性印记，如图12所示，而兔阴性血清无特异性印记出现，证明制备的多抗具有较好的特异性，符合要求。其中图12中，M：预染蛋白Marker；1：VP3重组蛋白孵育VP3多抗；2：VP3重组蛋白孵育阴性兔血清。
3、VP3重组蛋白多克隆抗体的中和活性检测
(1)DHAV-1弱毒CH60株鸡胚半数致死量(ELD50)的测定
将CH60病毒液作连续10倍稀释并接种9日龄鸡胚尿囊腔，对接种后的鸡胚每天照蛋观察，统计各组鸡胚死亡情况如表4所示，采用Reed-Muench法计算该批病毒液的ELD50为10-7 . 3，即该病毒液作10-7 . 3稀释，接种0.2mL能使半数鸡胚发生死亡。
表4测ELD50的鸡胚死亡情况统计结果
距离比例＝(高于50％的百分数-50％)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)
＝(62.5％-50％)/(62.5％-25％)＝0.3
lg(ELD50)＝高于50％病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
＝-7+0.3×(-1)＝-7.3；即ELD50＝10-7.3
(2)VP3重组蛋白多克隆抗体中和效价的测定
用测过ELD50的病毒液，采用“固定病毒-稀释血清”法测定VP3多抗的中和效价，统计结果如表5所示，运用Reed-Muench法计算其中和效价为2-5.29，即2-5.29稀释的该血清可保护50％鸡胚不发生死亡。表明VP3重组蛋白可用于制备DHAV-1中和抗体并在可作为亚单位疫苗。
表5测中和效价的鸡胚死亡情况统计结果
距离比例＝(高于50％的百分数-50％)/(高于50％的百分数-低于50％的百分数)
＝(72.7％-50％)/(72.7％-40％)＝0.694
lg(中和效价)＝高于50％血清稀释度的对数-距离比例×稀释系数的对数
＝-1.8-0.694×(-0.3)＝-1.59，中和效价＝10-1.59＝1:39＝2-5.29，0.2mL
4、VP3蛋白B细胞抗原表位鉴定
(1)VP3蛋白B细胞抗原表位预测及肽段的合成
采用Karplus&Schulz、Emini及Parker方法分别对VP3蛋白氨基酸序列进行柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析。进一步结合DNAstar7.1中的Protean程序，采用Jameson-Wolf方法预测序列抗原性，综合各因素预测得到可能的B细胞表位为131～150位(FNTGRYQMSWYPIADGEQSL，命名为VP3a)、200～209位(VNSSAPSNID，命名为VP3b)。由吉尔生化(上海)有限公司合成相应的表位肽段。
(2)表位肽段样品最佳稀释浓度的确定
以VP3多克隆抗体作为检测试剂，采用间接ELISA，通过方阵滴定法，选择阳性孔OD值1.0左右、阴性对照OD值0.1左右的抗原稀释度，最终确定最佳抗原稀释度为0.174ng/μL(1:1280稀释)，其结果见表6。
表6表位肽段最佳稀释度的确定
注：粗体标示为最佳抗原浓度对应的P、N值。
(3)表位肽段的鉴定
以1:1280稀释各表位肽段并包被，以阴性血清作对照进行间接ELISA，结果见表7。VP3a和VP3b肽段的P/N表明VP3a(131FNTGRYQMSWYPIADGEQSL150)和VP3b(200VNSSAPSNID209)能明显与VP3多克隆抗体结合，他们为VP3的B细胞表位，如图14所示。
表7抗原表位筛选鉴定结果
注：粗体标示为符合要求的稀释度对应的P、N值。
制备多克隆抗体对重组蛋白的结构和活性有一定要求，即需要具有刺激机体产生特异性抗体的抗原表位，抗原蛋白以一级结构(线性表位)和高级结构形式(构象表位)展现出来的表位都能被机体识别，以包涵体形式表达的重组蛋白溶解复性后也可满足制备多抗的要求，因为其表位能被充分展现出来(特别是一级结构展现出来的线性表位)。本发明中Western blot证明VP3重组蛋白能与兔抗DHAV-1血清特异性结合，表明制备的VP3重组蛋白展现出了抗原表位，且动物试验结果也证明，经过数次免疫后，抗VP3重组蛋白兔血清的琼扩效价都能达到1:16以上，且VP3重组蛋白与DHAV-1血清、多克隆抗体与VP3重组蛋白均能特异性结合。本研究制备的兔抗VP3重组蛋白多克隆抗体经鉴定正确，可以作为VP3B细胞表位鉴定的一抗，为后续试验奠定基础。
本发明制备的VP3重组蛋白经Western blot验证表明具备结合DHAV-1血清的能力，然而是否具备产生有意义的中和抗体活性仍不得而知，小RNA病毒中，目前只有禽脑脊髓炎病毒(avian encephalomyelitis virus)的VP3被证明是有免疫原性的，因为通过重组真核载体作基因疫苗免疫小鼠后可检测到一定效价的特异性抗体。本发明采用实验室的DHAV-1鸡胚适应毒——CH60株检测VP3重组蛋白能否激发机体产生中和抗体，试验测得VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价为2-5.29(0.2mL)，说明由VP3重组蛋白激发机体所产生的抗体能够中和DHAV-1，表明VP3重组蛋白具备诱导机体产生中和活性的抗体，既说明VP3蛋白中含有B细胞抗原表位，具有开发亚单位疫苗的潜力，也说明VP3重组蛋白多克隆抗体可用于鉴定VP3蛋白中的B细胞抗原表位。
实施例4基于VP3重组蛋白及其B细胞抗原表位的间接ELISA检测方法
1、基于VP3重组蛋白的间接ELISA检测方法的建立
1.1、间接ELISA检测步骤：
(1)包被：抗原用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液稀释，100μL/孔加入酶标孔，4℃孵育过夜；
(2)洗板：弃抗原液，用含0.05％吐温20的PBS(pH7.4)洗板4次，5min/次，最后一次洗板结束后甩干，吸水纸上拍干孔内液体(以下洗板步骤相同)；
(3)封闭：向酶标孔中加入封闭液，200μL/孔，37℃孵育90min；
(4)加一抗：弃孔内封闭液，洗板并拍干。加待检血清稀释液，100μL/孔，37℃孵育90min；
(5)加酶标二抗：弃孔内血清稀释液，洗板并拍干。加入HRP标记的兔抗鸭IgG稀释液，100μL/孔，37℃孵育45min；
(6)显色：弃孔内液体，洗板并拍干。加入TMB工作液，100μL/孔，室温避光作用10min后，50μL/孔加入2mol/L H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm-630nm双波长下测定OD值。
判断标准参考文献：相应的阳性值(P)1.0左右(＞0.4)，阴性值(N)＜0.4，且P/N最大者作为最佳反应条件。
1.2、间接ELISA检测条件的优化：
(1)最佳抗原、血清稀释度(棋盘法)：VP3重组蛋白作1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280和1:2560系列倍比稀释，100μL/孔，每个稀释度加两孔(分别用作阴、阳性孔)，阴性板和阳性板分开。阴、阳性血清均作1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280系列倍比稀释。
(2)最佳酶标二抗浓度：以优化出的最佳抗原、抗体浓度分别包被和孵育，将酶标抗体作1:500、1:1000、1:2000和1:4000系列稀释。
(3)最佳封闭液的选择：以最佳抗原、抗体和酶标二抗浓度，分别包被和孵育，封闭液分别选择1％BSA、5％BSA、5％脱脂乳、1％明胶和5％明胶。
检测到VP3重组蛋白作为抗原的初始浓度为1.5mg/mL，根据方阵法的结果，见表8，确定抗原最佳稀释度为1:160(即要求最佳抗原稀释度为9.375ng/μL)，对应的血清稀释度为1:160。最佳封闭液的确定见表9，最佳封闭液为1％明胶。最佳二抗稀释度为1:2000见图13。注：表8中粗体标示为最佳抗原、血清稀释度对应的P、N及P/N值。表9中粗体标示为最佳封闭液对应的P、N及P/N值。
表8最佳抗原包被浓度、血清稀释度的确定
表9封闭液的优化
1.3、临界值的确定
取40份DHAV-1阴性鸭血清，按照上述建立的间接ELISA方法进行检测。将阴性样品OD值的平均值(X(—))和3倍标准方差(SD)之和作为阴性样品的临界值，即待检样品的OD值>(X(—)+3SD)时判定为阳性，反之为阴性。
对40份DHAV-1阴性血清进行检测，结果见表10，最大值为0.27，最小值为0.035，(平均值)为0.122，SD(标准偏差)为0.07，按照临界值计算公式：X+3SD＝0.122+3×0.07＝0.332。
表10检测40份阴性血清的OD值
注：粗体标示分别为OD最高值和最低值。
1.4、敏感性试验
将一份DHAV-1阳性血清1:80、1:160、1:320、1:640、l:1280和l:2560倍比稀释，设立DHAV-1阳性和阴性对照，然后用建立的间接ELISA方法进行检测，每份血清设3个重复。
对一份DHAV-1阳性血清由1:80～1:2560作连续梯度稀释，重复测定三次。结果最大1:1280倍稀释的阳性血清能被检出，如图15所示。
1.5、特异性试验
以最佳血清浓度分别稀释DHAV-1、DHAV-3、鸭瘟病毒、鸭流感病毒、鸭肿头败血症病毒、鸭疫里默氏杆菌、鸭源大肠杆菌、鸭沙门氏菌的阳性鸭血清，设立DHAV-1阴性血清(正常鸭血清)对照，每份血清3个重复，检验方法的交叉反应性。
分别将DHAV-1和DPV抗原与DHAV-1阳性血清按体积比10:1混合，另按同样方法将DHAV-1抗原与DHAV-3阳性血清混合。37℃下作用lh后，稀释至最佳血清浓度，用建立的间接ELISA方法检测。同时，以最佳稀释度稀释的DHAV-1阳性血清作未阻断对照，每份血清设3个重复，按如下公式计算阻断率：PI(％)＝100×[1-(测试血清的OD值/对照血清的OD值)]。
如图16所示，特异***叉试验结果发现，仅DHAV-1和DHAV-3阳性血清的OD值大于临界值，其平均OD值分别为1.347和1.232，而其他病原的阳性血清均小于临界值(0.332)，表明本研究建立的方法可成为同时检测DHAV-1和DHAV-3感染的通用方法，却不会与其他病毒的血清发生交叉反应。
将DHAV-1阳性血清分别同DHAV-1抗原和DPV抗原中和，DHAV-3阳性血清同DHAV-1抗原中和，如图17所示检测结果表明DHAV-1阳性血清能被DHAV-1特异性阻断，而不能被DPV抗原阻断，计算其阻断率达到82％，如图18所示检测结果表明DHAV-3阳性血清能被DHAV-1阻断，阻断率为56％。
1.6、重复性试验
取6份已知不同OD值(抗体水平不同)的阴、阳性血清，按最佳浓度稀释，加到同一批次制备的VP3重组蛋白作抗原包被的酶标板孔中，每份设4个重复，计算每份血清的平均OD值与标准差(SD)，进而计算出每份血清的变异系数(CV)，公式为
取不同批次制备的VP3重组蛋白作抗原包被的酶标板，检测上述6份血清，每份设4个重复，计算CV值，评价样品的批间重复性。
用不同批制备的VP3重组蛋白作抗原包被的酶标板，同时分别检测不同血清样(3份阳性样、3份阴性样)，每份样品重复检测4次，计算其变异系数CV％。
结果显示见表11，批内变异系数最大为8.64％，最小为0.73％，平均为5.36。批间变异系数最大7.68％，最小为3.35％，平均为5.53％。被测的6份血清中没有任何一份的CV％超过10％，表明该方法具有较好的重复性。
表11重复性分析
1.7、VP3I-ELISA的应用及与DHAV-1I-ELISA之间符合率的评估
全病毒的间接ELISA方法(DHAV-1I-ELISA)参照文献【Zhao X L,Phillips R M,LiG D,et al.Studies on the detection of antibody to duck hepatitis virus byenzyme-linked immunosorbent assay[J].Avian diseases,1991,35(4):778-782.】，改进如下：(1)增殖DHAV-1并进行纯化；(2)用5％脱脂乳作封闭液，并于37℃下作用1.5h；(3)二抗作用时间调整为45min；(4)用商业化TMB显色液作替代；(5)OD450nm-OD630nm下读数。
以VP3重组蛋白建立的间接ELISA方法(VP3I-ELISA)和DHAV-1作抗原的间接ELISA(DHAV-1I-ELISA)方法分别同时检测60份疑似DHAV-1感染的临床鸭血清，比较两种方法的检测结果，并按如下公式计算两种方法的符合率：(共阳性和共阴性样品数之和)/待测样品总数。
结果见表12，用DHAV-1作抗原的间接ELISA与建立的VP3I-ELISA方法分别同时检测60份疑似DHAV-1感染的鸭血清样本，阳性率分别为86.7％(52/60)和83.3％(50/60)。有一份DHAV-1I-ELISA检测阴性的血清，VP3I-ELISA检测呈阳性。有3份DHAV-1I-ELISA呈阳性的血清，VP3I-ELISA检测出来呈阴性。依据公式计算得到VP3I-ELISA与DHAV-1I-ELISA的符合率为93.3％[(49+7)/60]。
表12VP3I-ELISA和DHAV-1I-ELISA方法的符合率
注：粗体标示分别为两种方法检测的共阳、阴性样本数。
2、VP3蛋白B细胞表位的间接ELISA检测
分别以VP3a单肽、VP3b单肽和纯化的VP3重组蛋白作抗原，200ng/孔包被酶标板；取10份已知不同抗体水平的DHAV-1鸭血清样(以DHAV-1作抗原预先做过ELISA检测)作1:40稀释，同时设阴性鸭血清对照；以HRP标记的兔抗鸭IgG(1:1000)作二抗，参照实施例1中B细胞抗原表位鉴定的步骤的ELISA检测步骤进行检测。
10份不同抗体水平的DHAV-1鸭血清的检测结果见图19，VP3a和VP3b表位肽同VP3重组蛋白一样可以区分不同DHAV-1抗体水平，而且对于检测结果所反映的抗体水平的高低规律三者是一致的。但VP3重组蛋白作抗原的间接ELISA检测值显著高于VP3a和VP3b表位肽分别作抗原的间接ELISA检测值，而VP3a表位肽与VP3b表位肽的值之间没有显著差异。
VP3是小RNA病毒主要的结构蛋白之一，位于病毒粒子衣壳的外部，在诱导机体免疫应答方面具备独特优势，因而具有研制诊断试剂和亚单位疫苗的潜力。然而目前对DHAV结构蛋白的研究还很少，免疫学研究的深入开展依赖于各种特异性的抗体，对于DHAV-1的VP3的研究也是一样。本发明对DHAV-1的VP3进行原核表达，获得VP3重组蛋白，为制备用于深入DHAV免疫学研究的抗体(如用于表位鉴定等)以及建立基于VP3重组蛋白的间接ELISA检测方法奠定基础。临床上对DHAV的控制需要因地制宜的制定免疫程序，而这需要一种灵敏、简便、高效的方法对特定群体进行抗体水平监测。由于本发明证明VP3蛋白上具有B细胞表位，因此用原核表达的VP3重组蛋白作抗原，建立一种间接ELISA方法和制备检测1型鸭甲肝病毒的ELISA试剂盒，检测鸭血清中的DHAV-1抗体。通过对所建立的方法进行指标评估，并初步应用于临床样品的检测，具有很好的临床应用潜力；本发明进而利用生物信息学软件综合分析，并通过间接ELISA方法检测表明，第131aa～150aa和200aa～209aa能与兔抗VP3重组蛋白多抗产生特异性反应。为了评估VP3蛋白B细胞表位在检测诊断中的潜在价值，以鉴定出的B细胞表位肽和VP3重组蛋白分别作抗原，用间接ELISA检测了10份不同抗体水平的DHAV-1鸭血清样本，结果发现表位肽与VP3重组蛋白一样可识别DHAV-1的鸭血清，而VP3重组蛋白可用以检测DHAV-1抗体，这表明表位肽与VP3重组蛋白一样具有检测DHAV-1抗体的潜力。本研究中，尽管表位肽也能识别DHAV-1血清，但反应原性不及VP3重组蛋白强，可能是因为本实施例中采用的是经优化后的VP3重组蛋白的检测条件，没有另对表位肽检测DHAV-1抗体的条件进行优化；也有可能是表位肽分子量太小，包被时未能很好地吸附到ELISA板上；还有可能VP3上包含了比本研究中更多的B细胞表位，这需要进一步研究确认。这也启示我们对DHAV表位诊断试剂及疫苗的研究需考虑多表位重叠或偶联载体等技术手段。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。

Claims (9)

1.一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示或SEQ ID NO:5所示。
2.权利要求1所述一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：获取VP3目的片段：确定1型鸭甲肝病毒VP3截断基因酶切位点和特异性引物，上游引物为5'-GGATCCGCAATGGACAATCAGGGAAAGAGA-3’，下游引物为5'-CTCGAGAACTGGCTAATCATCCCCTA-3’；增殖DHAV-1病毒株，并提取DHAV-1病毒株的RNA，利用随机引物对1型鸭甲肝病毒的RNA为模板进行cDNA合成后以特异性引物进行PCR扩增，得到VP3目的片段；
步骤二：构建重组表达质粒pGEX-VP3：将所述VP3目的片段T-A克隆至pMD19-T(Simple)载体中，构建重组T质粒pMD19-VP3，用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切空质粒pGEX-4T-1和鉴定正确的阳性重组质粒pMD19-VP3，回收、连接、鉴定，得到重组表达质粒pGEX-VP3；
步骤三：制备VP3重组蛋白：将所述重组表达质粒pGEX-VP3转化至大肠杆菌BL21 DE3中，进行重组蛋白诱导表达，结束后，将菌液纯化、鉴定，得到1型鸭甲肝病毒VP3重组蛋白，所述VP3重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
步骤四：制备VP3重组蛋白多克隆抗体，检测血清效价并鉴定多克隆抗体的特异性；
步骤五：测定DHAV-1病毒对鸡胚或鸭胚的半数致死量ELD50；
步骤六：测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价；
步骤七：VP3蛋白上B细胞抗原表位鉴定：预测VP3蛋白B细胞抗原表位，人工合成表位肽，以VP3重组蛋白多克隆抗体和阴性血清进行间接ELISA。
3.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述VP3重组蛋白多克隆抗体制备步骤包括：以纯化的VP3重组蛋白免疫雄兔制备抗血清，用琼脂扩散试验检测最后一次免疫后7d的血清效价，获得VP3重组蛋白多克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述免疫的程序包括：首免用0.5mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮内、皮下注射兔子；首免后11天用1mg的VP3重组蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，在兔子的颈背部皮下注射进行二免；二免后22天用1mg的VP3重组蛋白与等体积弗氏不完全佐剂乳化为油包水状态后，颈背部皮下注射兔子进行三免；首免后34和47天，用0.5mg的VP3重组蛋白耳缘静脉注射兔子进行四免和五免。
5.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述测定DHAV-1病毒对鸡胚的半数致死量ELD50步骤包括：将DHAV-1弱毒株的病毒液作连续10倍稀释并接种9日龄鸡胚尿囊腔，对接种后的鸡胚每天照蛋观察，统计各组鸡胚死亡情况，采用Reed-Muench法计算病毒液的ELD50。
6.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价步骤包括：用测过ELD50的DHAV-1弱毒株的病毒液，按固定病毒-稀释血清法测定VP3重组蛋白多克隆抗体的中和效价，运用Reed-Muench法计算其中和效价。
7.根据权利要求2所述的一种1型鸭甲肝病毒VP3蛋白B细胞表位的鉴定方法，其特征在于，所述测定B细胞抗原表位鉴定步骤包括：先分别对VP3蛋白氨基酸序列的柔韧性、表面可及性及亲水性进行分析；进一步预测序列抗原性，预测得到VP3蛋白的B细胞表位，人工合成表位肽段样品，然后以纯化的VP3重组蛋白作抗原，VP3重组蛋白多克隆抗体作为检测试剂，采用间接ELISA通过方阵滴定法，选择阳性孔OD值1.0左右、阴性对照OD值0.1左右的抗原包被浓度作为最佳抗原稀释度，最后以最佳抗原浓度稀释各抗原表位肽，以倍比稀释的兔抗VP3重组蛋白多克隆抗体作一抗，平行设置阴性兔血清对照，HRP-羊抗兔IgG作二抗，按照间接ELISA方法对人工合成的抗原表位肽段进行鉴定。
8.一种权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位在制备检测1型鸭甲肝病毒感染的试剂盒或制备1型鸭甲肝病毒抗体检测试剂盒中的用途。
9.一种权利要求1所述的1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位的用途，其特征在于，所述1型鸭甲肝病毒VP3蛋白的B细胞表位在制备预防1型鸭甲肝病毒基因工程疫苗中应用。
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