CN105188739B - 用于癌症治疗的具有减弱的对adi‑peg 20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶 - Google Patents

Abstract

本发明一般涉及分离的精氨酸脱亚胺酶(ADI)蛋白、包含所述ADI蛋白的组合物、以及治疗精氨酸依赖性疾病或相关疾病如癌症的相关方法，所述ADI蛋白与ADI‑PEG 20相比具有减弱的与抗‑ADI‑PEG 20抗体的交叉反应性，但其可具有相当于或优于ADI‑PEG 20的功能特征。

Description

用于癌症治疗的具有减弱的对ADI-PEG 20抗体的交叉反应性 的精氨酸脱亚胺酶

相关申请的交叉引用

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关于序列表的声明

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发明背景

技术领域

本发明一般涉及精氨酸脱亚胺酶(ADI)蛋白，其包括具有减弱的与ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的ADI蛋白。此类ADI蛋白用于治疗精氨酸依赖性或相关疾病(如癌症)。

相关技术描述

氨基酸阻断治疗可为一些形式的癌症的有效治疗。到目前为止，已知与此方法相关的一例临床实例，其应用了天冬酰胺酶来降低天冬酰胺的循环水平并抑制蛋白合成。此治疗对于急性淋巴细胞白血病尤其有效(Avramis 2005，Viera Pinheiro 2004)。急性淋巴细胞白血病细胞的生长和增殖需要氨基酸天冬酰胺。相比之下，大多数正常人类细胞能够合成天冬酰胺而不受天冬酰胺消耗影响。因此，利用天冬酰胺酶减少血清天冬酰胺可选择性地杀死癌细胞而不会伤害正常细胞、组织和宿主。一种大肠杆菌源的天冬酰胺酶已被证明可用于人体使用。然而，仅于微生物中发现天冬酰胺酶；这就使其在人体中有强烈的免疫原性，而且在注射后具有短的血清半衰期(Avramis 2005)。为了使天冬酰胺酶成为更有效的药物，通过将大肠杆菌源天冬酰胺酶与聚乙二醇(PEG)一起配制来减弱此酶的免疫原性和相关的过敏反应来最大程度地降低这些不足。此外，PEG极大地延长了天冬酰胺酶的循环半衰期，这减少了治疗频率和治疗总费用。PEG配制的天冬酰胺酶被批准使用并以商品名(2011、Avramis 2005、Viera Pinheiro 2004、Fu 2007、Zeidan2008)出售。

精氨酸是人和小鼠中的另一个非必需氨基酸(综述参见Rogers1994)。在人体内，可由瓜氨酸通过Krebs(克雷布斯)(尿素)循环酶精氨琥珀酸合成酶(ASS，L-瓜氨酸：L-天冬氨酸连接酶[AMP-生成]，EC6.3.4.5)和精氨琥珀酸裂解酶(ASL，L-精氨琥珀酸精氨酸-裂解酶，EC4.3.2.)分两步合成精氨酸(Haines 2011、Wu 2009、Morris 2006、Husson2003、Tapiero 2002、Rogers 1994)。ASS催化瓜氨酸和天冬氨酸至精氨琥珀酸的转化，然后精氨琥珀酸通过ASL转化为精氨酸和富马酸。人的精氨酸缺乏饮食既不会引起高血氨症、乳清酸尿，也不会改变成年人的全身一氧化氮(NO)合成速率(Tapiero 2002、Castillo 1995、Rogers 1994、Carey 1987、Barbul 1986、Snyderman 1959、Rose 1949)。尽管早产儿似乎需要精氨酸(Wu 2004)，但是在婴儿、儿童和青年中，精氨酸水平与年龄无关(Lücke 2007)。1992年，Takaku和Sugimura分别报道称人类黑色素瘤和肝细胞癌(HCC)细胞系的生长似乎需要精氨酸。其它研究显示聚乙二醇化的ADI有效地用于黑色素瘤和肝癌的治疗且副作用小。

ADI-PEG 20治疗在一段时间内需要多剂量。多次治疗后，抗-ADI-PEG 20抗体形成，该抗体可限制其后续的疗效。因此，本领域需要具有减弱的与抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的ADI用于治疗以便于改善和扩大精氨酸消耗治疗的疗效。本发明提供了用于癌症治疗的此优点及其它优点。

参考文献：Avramis VI，Panosyan EH.2005.Clin Pharmacokinet44：367-393；Barbul A.1986.J Parenteral Enteral Nutr 10：227-238；Carey GP，等1987.J Nutr117：1734-1739；Castillo L，等1995.Am J Physiol268(Endocrinol Metab 31)：E360-367；Fu CH，Sakamoto KM.2007.Expert Opin Pharmacother 8：1977-1984；Haines RJ，等2011.Int J Biochem Mol Biol 2：8-23；Husson A，等2003.Eur J Biochem270：1887-1899；Lücke T，等2007.Clin Chem Lab Med 45：1525-1530；Morris SM Jr.2006.Am JClin Nutr 83(增刊)：598S-512S；Rogers QR.1994.于表彰研讨会的论文集中WillardJ.Visek-来自Ammonia to Cancer and Gene Expression.特殊公开86-1994年四月，Agriculture Experiment Station，University of Illinois，211Mumford Hall，Urbana，IL61801，第9-21页；Tapiero H，等2002.Biomed Pharmacother 56：439-445，2002；VieraPinheiro JP，Boos J.2004.Br J Haematol 125：117-127；Wu G，等2009.Amino Acids 37：153-168；Wu G，等2004.J Nutr Biochem 15：442-451；Zeidan A，等2008.Expert OpinBiol Ther9：111-119)。

发明概要

本发明的一个方面提供了一种分离的精氨酸脱亚胺酶，其中所述分离的精氨酸脱亚胺酶具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性。也包括治疗或药物组合物，其包含分离的精氨酸脱亚胺酶或其具有ADI活性的片段，和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述组合物是无菌的和/或基本上无热原(如内毒素)。在一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶不是来自人型支原体(M.hominis)。在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶来自表1中所列的生物体。在某些实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有相当于或优于ADI-PEG20的一种或多种性质。就这方面来说，所述的一种或多种性质包括但不限于Kcat、Km、最适pH、稳定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子、或其任何组合。在一个实施方案中，与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有至少20个表面残基变化。在另一个实施方案中，与人型支原体的精氨酸脱亚胺酶相比，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶具有20个至135个之间的表面残基变化，40个至100个之间的表面残基变化，30个至60个之间的表面残基变化，80个至100个之间的表面残基变化，或100个至120个之间的表面残基变化。

在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶来自精氨酸支原体(M.arginini)、关节炎支原体(M.arthritidis)、海豹脑支原体(M.phocicerebrale)、猫支原体(M.gateae)、海豹支原体(M.phocidae)、鸽支原体(M.columbinum)、衣阿华支原体(M.iowae)、鳄鱼支原体(M.crocodyli)、短吻鳄支原体(M.alligatoris)、奥氏嗜热盐丝菌(H.orenii)、或牛分支杆菌(M.bovis)。具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的示例性精氨酸脱亚胺酶包含SEQ ID NO：2-32中任一个所示的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶已经被修饰以去除至少一个聚乙二醇化位点。在具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶的另一个实施方案中，至少一个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。就这方面来说，在某些实施方案中，至少5个赖氨酸残基、至少10个赖氨酸残基、或至少20个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

在另一个实施方案中，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶通过接头共价结合于PEG分子。就这方面来说，具有减弱的与患者抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性的精氨酸脱亚胺酶可共价结合于一个或多个PEG分子，例如约1个至约10个或约2至约8个PEG分子。所述PEG分子可为直链或支链PEG分子并可具有约1,000至约40,000的总重均分子量，或约10,000至约30,000的总重均分子量。在PEG通过接头共价结合于本发明的ADIr的那些实施方案中，所述接头可包含琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基、或其任何组合。在一个实施方案中，琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。

本发明的另一个方面提供了一种编码本文所述的分离的精氨酸脱亚胺酶的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体、以及含有所述载体的分离的宿主细胞。

本发明的另一个方面提供了一种组合物，其包含本文所述的具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述组合物还包含化疗剂。示例性化疗剂包括但不限于多西他赛、卡铂、环磷酰胺、吉西他滨、顺铂、索拉菲尼、舒尼替尼和依维莫司。

本发明的另一个方面提供了一种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含本文所述的具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体的组合物，从而治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展。在某些实施方案中，有此需要的患者已被确定具有抗-ADI-PEG 20抗体。在另一个实施方案中，所述癌症选自肝细胞癌、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、胰腺癌、***癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、淋巴瘤、肝癌、肉瘤、白血病、急性髓细胞样白血病、复发性急性髓细胞样白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃部癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞性肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、子***、睾丸癌和胃癌。

本发明的另一个方面提供了一种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG 20的组合物，以及一段时间后，向所述患者施用包含本文所述的具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶和生理学上可接受的载体的组合物，从而治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展。就这方面来说，例如，可通过检测患者中抗-ADI-PEG 20抗体的预定水平和/或测定或以其它方式观察患者中ADI活性来确定所述的一段时间，其中在检测所述的抗-ADI-PEG 20抗体的预定水平和/或测定或观察患者中ADI活性的预定水平后，施用包含具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的分离的精氨酸脱亚胺酶的组合物。

还包括用于制备或制造用于治疗癌症、缓解其症状，或抑制其进展的药物的本文所述的分离的精氨酸脱亚胺酶蛋白质。

发明详述

本发明的实施方案涉及选定的ADI酶，在一些实施方式中，其经工程化以具有少量的表面赖氨酸残基，并通过稳定的接头与PEG缀合。选定的ADI酶基于它们的有利性质选自来自不同生物体的大量ADI酶。这些性质包括酶通过ADI将精氨酸转化为瓜氨酸和氨来建立和维持人体血液中低精氨酸浓度的能力。此外，与ADI-PEG 20相比，选定的ADI分子具有减弱的对抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性，此类抗体可能产生于用ADI-PEG 20对患者进行的先前治疗。

在某些实施方案中，使本发明的酶聚乙二醇化以提供保护来应对肾清除和蛋白质水解，以及降低的免疫原性或抗原性。为了提高聚乙二醇化的效率，对酶的修饰可被工程化以减少表面赖氨酸残基的数量，并因此限制了可用的PEG附着位点的数量。此提供了剩余的赖氨酸附着残基的更彻底和均一的聚乙二醇化。

对经筛选以将甲氧基-PEG附着于ADI的PEG接头加以选择以提供化学稳定的连接。预期到，此将延长分子的生物活性有效期。化学稳定的接头也能消除水解和减轻免疫反应，其可能发生在附着于酶表面的脱聚乙二醇化的接头上。

这些累积说明产生有效地从患者血液中去除精氨酸并且不被来自先前精氨酸消耗治疗的抗-ADI-PEG 20抗体中和或清除的一个或多个分子。使分子聚乙二醇化以延迟其自身免疫原性所引起的中和和清除。这些因素将允许它们的使用来替代ADI-PEG 20或除ADI-PEG 20外(例如，作为仿制药(follow-on drug))以扩大精氨酸消耗治疗，并因此提高精氨酸消耗治疗作为抗癌疗法的效力。

因为正常细胞可由瓜氨酸以通过ASS和ASL催化的两步法合成精氨酸，所以它们的生长不需要精氨酸。相比之下，某些癌症不表达ASS。某些癌症不表达ASL，而其它癌症可弱表达，或可不表达ASS和/或ASL。因此，这些癌症是精氨酸营养缺陷型。可利用这种代谢差异以开发安全并有效的疗法来治疗这些形式的癌症。ADI通过精氨酸双水解酶途径催化精氨酸至瓜氨酸的转化，因而可用来清除精氨酸。

除非相反地特别说明，否则本发明的实践将使用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的传统方法，其中多个将在下文进行描述以用于说明目的。在文献中充分解释此类技术。参见，例如，Current Protocols in ProteinScience，Current Protocols in Molecular Biology or Current Protocols inImmunology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.(2009)；Ausubel等，Short Protocols inMolecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；Sambrook和Russell，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(第3版，2001)；Maniatis等Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；DNA Cloning：A Practical Approach，第I&II卷(D.Glover编)；OligonucleotideSynthesis(N.Gait编，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.Hames&S.Higgins编，1985)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins编，1984)；Animal CellCulture(R.Freshney编，1986)；Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)以及其它类似的参考文献。

如本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确指出。

在本说明书中，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”，或例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变化形式，否则应理解为表示含有所述的元素或整数或元素组或整数组，但不排斥任何其它的元素或整数或元素组或整数组。

“约”意指量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度在参考量、水平、值、数目、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度上变化多达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。

对于“统计上显著的”，其意指结果不可能是偶然发生的。统计显著性可通过本领域已知的任意方法来确定。常用的显著性测定包括p值，如果零假设为真，其为观察的事件发生的频率或概率。当所得的p值小于显著性水平，则零假设被拒绝。在简单情况下，显著性水平规定为0.05或更小的p值。

本说明书中每一个实施方案都可作必要修正后用于其它每个实施方案，除非另有明确说明。

标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔，脂质体转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或如本领域通常实现的或如本文所述来进行。这些及相关的技术和步骤一般根据本领域众所周知的以及如本说明书中所引述并讨论的多个一般性和更具体的参考文献中所述的常规方法进行。除非提供具体定义，否则连同本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学使用的命名法，以及其实验室步骤和技术是本领域众所周知并常用的那些。标准技术可用于重组技术、分子生物学合成、微生物学合成、化学合成、化学分析、药物制备、配制、和递送、以及患者的治疗。

“患者”或“受试者”是指动物，在某些实施方案中指哺乳动物，并且在特定的实施方案中指人类。

“生物相容的”是指对生物功能基本没有损伤并不会产生任何程度的不可接受的毒性(包括过敏和疾病状态)的材料或化合物。

术语“参考序列”一般是指核酸编码序列，或氨基酸序列，另一个序列与之进行比较。本文所述的所有多肽和多核苷酸序列包括在参考序列中，包括以名称描述的那些和在表格和序列表中描述的那些。

在本公开中，可以使用下列缩写；PEG，聚乙二醇；ADI，精氨酸脱亚胺酶；SS，琥珀酸琥珀酰亚胺酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰亚胺；SPA，丙酸琥珀酰亚胺酯；NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺；ASS1或ASS，精胺琥珀酸合成酶；ASL，精氨琥珀酸裂解酶。

在本发明中，编码ADI的多核苷酸可由任何来源(包括例如微生物、重组生物技术或其任何组合)衍生、克隆、分离、合成或产生。例如，精氨酸脱亚胺酶可由支原体属(Mycoplasma)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、疏螺旋体属(Borrelia)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、和/或贾第虫属(Giardia)微生物克隆得到。在某些实施方案中，精氨酸脱亚胺酶由关节炎支原体(Mycoplasma arthritidis)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、精氨酸支原体(Mycoplasma arginini)、酿脓链球菌(Steptococcus pyogenes)、肺炎链球菌(Steptococcus pneumoniae)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、阿氏疏螺旋体(Borrelia afzelii)、肠贾第虫(Giardiaintestinalis)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichneiformis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)、或其任何组合克隆得到。在其它实施方案中，精氨酸脱亚胺酶由表1中所列的物种克隆得到。具体地讲，本发明所用的ADI可包含SEQ ID NO：1-32中任一个的氨基酸序列，或其具有ADI活性(例如，能够将精氨酸代谢成瓜氨酸和氨)的变体或片段或延伸。序列表中提供的一些序列不能代表全长ADI蛋白序列。因而，在某些实施方案中，也可将额外的氨基酸残基加至本文所提供序列的末端以产生具有ADI活性的全长蛋白。可基于已知ADI序列的比对，由本领域技术人员确定待添加的特定氨基酸。可使用已知技术合成此类ADI分子。例如，以SEQ ID NO：26-32提供了示例性“延伸的”ADI(r)。

在某些实施方案中，将本文所述的ADI酶与来源于人型支原体的基准ADI-PEG 20分子进行对比。如本文所用，“ADI-PEG 20”是指本领域已知的ADI分子并例如在US6183738；US6635462；Ascierto PA等(2005)Pegylated arginine deiminase treatment ofpatients with metastatic melanoma：results from phase I and II studies，J ClinOncol23(30)：7660-7668；Izzo F等(2004)Pegylated arginine deiminase treatment ofpatients with unresectable hepatocellular carcinoma：results from phase I/IIstudies，J Clin Oncol 22(10)：1815-1822；Holtsberg FW等(2002)，Poly(ethyleneglycol)(PEG)conjugated arginine deiminase：effects of PEG formulations on itspharmacological properties，J Control Release 80(1-3)：259-271；Kelly等(2012)British Journal of Cancer 106，324-332中有所描述。如本领域技术人员所知，所述分子是来源于人型支原体的聚乙二醇化(PEG 20,000)ADI酶并与野生型人型支原体ADI酶相比，具有两个替换(K112E；P210S)。

本文所述的精氨酸脱亚胺酶是从大量的ADI酶中筛选得到的并具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的反应性水平。抗-ADI-PEG20抗体在经ADI-PEG 20治疗的受试者中出现并可利用已知方法来测定。可例如利用ELISA或本领域技术人员熟知的其它类似测定来确定与抗-ADI-PEG 20抗体的反应性。

就这方面来说，ADI-PEG 20可作为对照来评价与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性水平。在统计学上显著地低于ADI-PEG 20与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性水平的交叉反应性水平可用于本文。在某些实施方案中，本文所述的精氨酸脱亚胺酶与抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性较低或没有。在另一个实施方案中，与抗-ADI-PEG 20抗体的反应性相比于与ADI-PEG 20的反应性的任何减弱可以是有利的，因为ADI酶将改进需要精氨酸消耗治疗的患者的治疗选择。因此，相比于ADI-PEG 20与患者抗-ADI-PEG20抗体的反应性，本文所述的精氨酸脱亚胺酶具有减弱的与此类抗体的交叉反应性。

本文所用的“ADIr”是指本发明的ADI酶，其与抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性相比于ADI-PEG 20与所述抗体的反应性有所减弱。“ADIr”命名是用来区别本文识别的分子与本领域已知的ADI和ADI-PEG 20。

本发明ADIr酶具有相当于或优于ADI-PEG 20的特征或性质，以降低和维持低血液精氨酸水平来进行有效的癌症治疗。此类性质包括Kcat、Km、最适pH、稳定性、体内蛋白质水解稳定性，或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子，或其任何组合。在某些实施方案中，本文所述的ADIr具有ADI-PEG 20的相当性质的约或至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的性质。在其它实施方案中，本文所述的ADIr具有所对比的ADI-PEG 20的具体性质的约或至少约100％、105％、110％、120％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％、250％、260％、280％、300％、320％、340％、350％、360％、400％、420％、450％、460％、500％、520％、550％或更高的性质。

因此，在某些实施方案中，ADIr具有ADI-PEG 20的Kcat的约或至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的Kcat，或更好。在某些实施方案中，ADIr具有ADI-PEG 20Kcat的约或至少约100％、105％、110％、120％、125％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％、250％、260％、280％、300％、320％、340％、350％、360％、400％、420％、450％、460％、500％、520％、550％或更高倍数的Kcat。在某些实施方案中，本文所述的ADIr酶，或包含其的组合物的Kcat为约0.5sec^-1至约15sec^-1，并且在另一个实施方案中，为约1sec^-1至约12sec^-1，约1sec^-1至约10sec^-1，约1.5sec^-1至约9sec^-1，约2sec^-1至约8sec^-1或约2.5sec^-1至约7sec^-1。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约2.5sec^-1至约7.5sec^-1的Kcat。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约2.5sec^-1、约3sec^-1、约3.5sec^-1、约4sec^-1、约4.5sec^-1、约5sec^-1、约5.5sec^-1、约6sec^-1、约6.5sec^-1、约7sec^-1、约7.2sec^-1、约7.5sec^-1、约8sec^-1、约10sec^-1、约15sec^-1、约20sec^-1、约25sec^-1、约30sec^-1、约35sec^-1、约40sec^-1、约45sec^-1、约50sec^-1、约55sec^-1、约60sec^-1、约65sec^-1、约70sec^-1、约75sec^-1、约80sec^-1、约85sec^-1、约90sec^-1、约95sec^-1、或约100sec^-1的Kcat。

因此，在某些实施方案中，ADIr具有ADI-PEG 20的Km的约或至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的Km，或更好。因此，在某些实施方案中，ADIr具有ADI-PEG 20的Km的约或至少约100％、105％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、180％、200％、220％、240％、或250％的Km。在一个实施方案中，ADIr，或其聚乙二醇化制剂具有约0.5μM至约50μM，或约1.6μM至约48μM，或约0.5μM至约15μM的Km，并且在另一个实施方案中，为约1μM至约12μM，约1μM至约10μM，约1.5μM至约9μM，约1.5μM至约8μM或约1.5μM至约7μM。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约1.5μM至约6.5μM的Km。在一些实施方案中，ADIr或其聚乙二醇化制剂具有约1.5μM、约1.6μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、约7μM、约8μM、约9μM、约10μM、约12μM、约14μM、约15μM、约16μM、约18μM、约20μM、约22μM、约24μM、约25μM、约26μM、约28μM、约30μM、约32μM、约34μM、约35μM、约36μM、约38μM、约40μM、约42μM、约44μM、约45μM、约46μM、约48μM、或约50μM的Km。

在某些实施方案中，ADIr在接近于人体血液的生理pH的pH下发挥功能。因此，在一个实施方案中，ADIr在约4至约10.8，或约6至约8，或约6.5至约7.5的pH下发挥功能。在一个实施方案中，ADIr在约pH 7.4下具有良好的酶活性。

在某些实施方案中，ADIr在长期储存期间具有稳定性并且在人体中治疗期间具有温度及蛋白水解稳定性。在另一些实施方案中，ADIr的活性不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子。

在某些实施方案中，本文所述的ADIr通常具有与人型支原体足够不同的氨基酸序列以使表面残基改变将减少或消除抗-ADI-PEG 20抗体的抗原位点。在一个实施方案中，筛选的ADIr分子和受试者体内现有的抗-ADI-PEG 20抗体之间没有交叉反应性，并且受试者体内将产生全新的免疫反应，而不是引起对人型支原体ADI的现有反应的成熟化。因此，在一个实施方案中，本文所述的ADIr具有与如SEQ ID NO：1所示的人型支原体ADI的20％-85％序列同一性。在某些实施方案中，本文所述的ADIr具有与人型支原体ADI的甚至更低百分比的序列同一性，例如10％或15％同一性。在另一个实施方案中，本文所述的ADIr具有与人型支原体ADI的20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％或甚至83％同一性，并仍具有减弱的对抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性。

在一个实施方案中，与人型支原体ADI相比，本文所述的ADIr具有约25-140个表面残基变化。表面残基可由人型支原体ADI的晶体结构识别，而其它生物体的ADI表面残基可通过序列同源性来确定。与人型支原体ADI(参见SEQ ID NO：1)相比，本文所述的ADIr可具有约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、或约140个表面残基变化。

在另一个实施方案中，与人型支原体ADI相比，本文所述的ADIr具有约25-140个残基变化。此类残基变化不必仅仅是表面氨基酸残基。此类残基变化(或增加或缺失)可发生在分子任一末端或ADI的任何残基，以使经修饰的ADI具有本文所述的预期的ADI活性。待改变的残基可由人型支原体ADI的晶体结构识别，而来自其它生物体的ADI的残基可通过序列同源性来确定。与人型支原体ADI(参见SEQ ID NO：1)相比，本文所述的ADIr可具有约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、或约140个氨基酸残基变化。

选自大量的ADI酶，表1以它们相对于人型支原体ADI的序列百分比同一性列出了24种ADIr酶。从文献可知，人型支原体、精氨酸支原体和关节炎支原体ADI的氨基酸序列密切相关并且这些酶都具有良好的催化性质。最近，额外的ADI酶被发现具有与这三种酶密切相关的序列。尽管对其知之甚少，但关联性较远的支原体ADI酶已被识别出。并且存在来自细菌及其它来源的关联性甚至更远的ADI酶。

在某些实施方案中，来自大量选定物种的本文识别的ADIr酶具有表面赖氨酸残基(在某些实施方案中，多达30个或更多)。然而，在某些实施方案中，ADIr酶可具有更少的表面赖氨酸残基，例如在牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)ADI情况下仅2个赖氨酸残基，或者甚至没有赖氨酸残基(参见，例如，来自分支杆菌属(Mycobacterium sp.)MCS的ADI；GenBank No.ABG10381)。因此，本文识别的具有减弱的与抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性的ADIr酶具有约0、1、2、3、4、5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、或更多个表面赖氨酸残基。

术语“多肽”，“蛋白质”和“肽”可相互替代地使用并意指不限于任何特定长度的氨基酸聚合物。该术语并不排除修饰例如豆蔻酰化、硫酸盐化、糖基化、磷酸化以及信号序列的增加或缺失。术语“多肽”或“蛋白质”意指氨基酸的一条或多条链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可包含非共价连接和/或通过肽键共价连接在一起的多条链，其具有天然蛋白质序列，即由天然存在的及确切地说非重组细胞，或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或天然序列中一个或多个氨基酸的缺失、增加和/或替换的分子。术语“多肽”及“蛋白质”具体地涵盖本发明的ADIr蛋白质，或ADIr蛋白质中一个或多个氨基酸的缺失、增加和/或替换的序列。在某些实施方案中，多肽为“重组”多肽，由包含一个或多个重组DNA分子的重组细胞产生，所述重组DNA分子通常由异源多核苷酸序列或否则在细胞中找不到的多核苷酸序列的组合制得。

本文中所指术语“分离的蛋白质”意指主体蛋白(1)不含在自然中通常与之一起发现的至少一些其它蛋白，(2)基本上不含来自同一来源，例如来自同一物种的其它蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，(4)已与自然中与之缔合的至少约50％多核苷酸、脂类、糖类、或其它材料分离，(5)不与自然中与“分离的蛋白质”缔合的蛋白的多个部分缔合(通过共价或非共价相互作用)，(6)可操作地与自然中不与之缔合的多肽缔合(通过共价或非共价相互作用)，或(7)在自然中不存在。此类分离的蛋白质可由可为合成来源的基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA，或其任何组合编码。在某些实施方案中，所述分离的蛋白质基本上不含在其自然环境中发现的将影响其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。

术语“变体”包括通过一个或多个替换、缺失、增加和/或***而不同于本文具体公开的参照多肽(例如，SEQ ID NO：1-32)的多肽。变体多肽具有生物活性，即它们继续具有参照多肽的酶活性或结合活性。此类变体可产生于(例如)基因多态性和/或人为操作。

在许多情况下，生物活性变体将含有一个或多个保守替换。“保守替换”为其中一个氨基酸被具有类似性质的另一个氨基酸替换的一种替换，以使肽化学领域的技术人员能够预测到多肽的二级结构和亲水性基本上未变。如上所述，可对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，并仍获得编码具有预期特征的变体多肽或衍生多肽的功能分子。

例如，在蛋白质结构中某些氨基酸可被其它氨基酸替换而与结构(诸如，例如，抗体的抗原结合区或底物分子的结合位点)的相互作用结合能力没有明显损失。因为其为限定蛋白质的生物功能活性的蛋白质的相互作用能力和性质，所以可在蛋白质序列，以及理所当然地其下方DNA编码序列中进行某些氨基酸序列替换，然而获得具有类似性质的蛋白质。因此可预期到，可以对所公开的组合物的肽序列，或者编码所述肽的相应的DNA序列作出各种变化，而它们的效用没有明显损失。

在作出这些变化时，可考虑氨基酸的亲水指数。在对蛋白质赋予相互作用的生物功能中亲水氨基酸指数的重要性通常为本领域所了解(Kyte&Doolittle，1982，以引用的方式并入本文)。人们认为，氨基酸的相对亲水特性导致所得蛋白质的二级结构，其继而限定蛋白质与其它分子(例如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。每个氨基酸基于其疏水性和电荷特征被分配亲水指数(Kyte&Doolittle，1982)。这些值为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天门冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。在本领域众所周知的是，某些氨基酸可被具有类似亲水指数或分数的其它氨基酸替换，并仍获得具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能等效的蛋白质。在作出这些变化时，其亲水指数在±2内的氨基酸的替换是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在±0.5内的那些是甚至更加特别优选的。

在本领域中也应了解，可基于亲水性有效地进行类似氨基酸的替换。美国专利4,554,101(其全文以引用的方式明确并入本文)，声明蛋白质的最大局部平均亲水性(由其相邻氨基酸的亲水性决定)与蛋白质的生物性质相关。如美国专利4,554,101中详述，将下列亲水值分配给氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天门冬酰胺(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应了解，一个氨基酸可被具有类似亲水值的另一个替换而仍获得生物等效物，并且具体地讲，免疫等效蛋白质。在此类变化中，其亲水性值在±2内的氨基酸的替换是优选的，在±1内的那些是特别优选的，并且在±0.5内的那些是甚至更加特别优选的。

如上所述，氨基酸替换通常因此基于氨基酸侧链取代基的相对相似度，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑到前述各种特征的示例性替换对于本领域技术人员来说是熟知的并包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似度进一步进行氨基酸替换。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且具有类似亲水性值的带有不带电的极性头基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。可代表保守变化的其它氨基酸组包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。

变体也可(或可选地)含有非-保守变化。在一个优选的实施方案中，变体多肽因少于约10、9、8、7、6、5、4、3、2个氨基酸，或甚至1个氨基酸的替换、缺失或增加而不同于天然序列。也可(或可选地)通过(例如)对多肽的免疫原性、二级结构、酶活性、和/或亲水性的影响最小的氨基酸的缺失或添加来修饰变体。

一般而言，变体将显示出与参照多肽序列(例如，SEQ ID NO：1-32)的约或至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相似度或序列同一性或序列同源性。此外，预期到，因约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100个或更多个氨基酸的增加(例如，C-端增加，N-端增加，二者)、缺失、截断、***、或替换而不同于天然序列或亲本序列但保留了亲本或参照多肽序列的性质或活性的序列。

在一些实施方案中，变体多肽因至少一个但少于50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2个氨基酸残基而不同于参照序列。在其它实施方案中，变体多肽因约或至少0.5％或1％但小于20％、15％、10％或5％的残基而不同于参照序列。(如果此比较需要比对，应比对序列的最大相似度。缺失或***、或错配中“圈”出的序列被视为差异。)

术语“多肽片段”是指天然存在的或重组产生的多肽的氨基端缺失，羧基端缺失，和/或内部缺失或替换的多肽。在某些实施方案中，多肽片段可包含至少5至约400个氨基酸长的氨基酸链。值得注意，在某些实施方案中，片段为至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、或400个氨基酸长。特别有用的多肽片段包含功能域，该功能域包含本文所述ADIr的催化ADI结构域。在ADIr的情况下，有用的片段包含但不限于催化结构域和α-螺旋结构域。

许多用于与ADI缀合的活化PEG共价地结合于赖氨酸残基。通常，附着于ADI的PEG分子比赖氨酸残基要少很多。附着的数量和分布在分子之间是不均匀的。只有小部分的ADI分子中任何特定赖氨酸残基将被修饰。这种位点修饰的不均匀和低PEG占有率可导致关于药物表征和抗原位点的PEG屏蔽的有效性的问题。因此，在某些实施方案中，本文所述的筛选的ADIr酶经赖氨酸被其它残基类型置换以减少赖氨酸残基的数量而加以修饰。这样可以得到更均匀的聚乙二醇化的蛋白质并提高在剩余赖氨酸残基处的PEG占有率。将选定被选择变成其它残基的特定赖氨酸残基以保持酶活性。预期到此更均匀的聚乙二醇化会增强保护来应对血液中的蛋白质水解，并增强对抗原位点的屏蔽以免遭患者抗体。

在某些实施方案中，可如美国专利No.6,635,462所述对本发明的ADIr进行修饰。具体地讲，对ADIr中一个或多个天然存在的氨基酸残基的修饰可提供一种酶，该酶更容易复性并配制从而改进ADIr和包含其的组合物的制造。在一个实施方案中，对本发明的ADIr进行修饰以去除一个或多个赖氨酸残基(例如，赖氨酸可被另一个氨基酸或其类似物，或非天然氨基酸替换)。具体地讲，在一个实施方案中，对ADIr进行修饰以不含等效于SEQ IDNO：1(人型支原体ADI)的112、374、405或408的位置处的赖氨酸，或这些位置中一个或多个的组合。在另一个实施方案中，对ADIr进行修饰以不含一个或多个赖氨酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个，或更多个赖氨酸残基(它们存在的话)可被另一个氨基酸或其类似物，或非天然氨基酸替换。在一个实施方案中，ADIr具有5个被替换的赖氨酸，例如，在SEQ ID NO：1的位置7、88、137、209和380的等效位置处。在另一个实施方案中，ADIr具有10个被替换的赖氨酸，例如，在SEQ ID NO：1的位置7、9、59、88、115、116、137、178、209和380的等效位置处。在又一个实施方案中，ADIr具有15个被替换的赖氨酸，例如，在SEQ ID NO：1的位置7、9、59、66、88、91、93、115、116、137、141、178、209、279和位置380的等效位置处。在一个实施方案中，ADIr包含21个被替换的赖氨酸，例如，在SEQ IDNO：1的位置7、9、56、59、66、88、91、93、96、115、116、137、141、178、209、254、279、325、326、380和406的等效位置处。

天然ADIr可在微生物中发现并具有免疫原性，它会在患者中通过循环被迅速地清除。可通过修饰ADIr来克服这些问题。因此，本发明提供通过修饰剂修饰的ADIr，所述修饰剂包括但不限于高分子聚合物、蛋白质、肽、多糖、或其它化合物。本文所述的精氨酸脱亚胺酶和修饰剂可通过共价键或非共价相互作用连接以形成稳定的缀合物或稳定的组合物从而达到预期的效果。在某些实施方案中，经修饰的ADIr保留了未经修饰的ADIr的生物活性并具有比未经修饰的ADIr更长的体内半衰期和更低的抗原性。在某些实施方案中，经修饰的ADIr保留了未经修饰的ADIr的至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的生物活性。一般地，经修饰的ADIr保留了足以用于治疗用途的生物活性。

在一个实施方案中，修饰剂可为生物相容的并可增加ADIr在血液中的半衰期的聚合物或蛋白质或其片段。修饰剂可以化学方式偶联于ADIr或适用时，通过融合蛋白表达连接于ADIr。

高分子聚合物可包括非肽高分子聚合物，其在某些实施方案中，可具有其自身的生物活性。合适的聚合物包括但不限于聚烯醇化合物、聚醚化合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、乙烯醚和马来酸酐的共聚物、N-(2-羟丙基)-甲基丙烯酰胺、多糖、聚氧乙烯多元醇、肝素或其片段、聚-烷基-乙二醇及其衍生物、聚-烷基-乙二醇与其衍生物的共聚物、聚(乙烯基***)、a，P-聚[(2-羟乙基)-DL-天冬酰胺]、聚羧酸酯、聚氧亚乙基-氧亚甲基、聚丙烯酰吗啉、氨基化合物和氧烯烃的共聚物、聚透明质酸、聚环氧乙烷、乙二酸和丙二酸的共聚物、聚(1，3-二氧戊烷)、乙烯和马来酰肼共聚物、聚唾液酸、环糊精等。在某些实施方案中，所述聚合物是聚乙二醇。

本文中所用的聚烯醇化合物包括但不限于聚乙二醇(包括单甲氧基聚乙二醇、单羟基聚乙二醇)、聚乙烯醇、聚烯丙基醇、聚丁烯醇等等，及它们的衍生物，例如脂类。

聚醚化合物包括但不限于聚亚烷基二醇(HO((CH2)_xO)_nH)、聚丙二醇、聚氧乙烯(HO((CH₂)₂O)_nH)、聚乙烯醇((CH₂CHOH)_n)。

聚氨基酸包括但不限于一种类型氨基酸的聚合物或两种或更多种类型氨基酸的共聚物，例如，多聚丙氨酸或多聚赖氨酸，或其嵌段共聚物。

多糖包括但不限于葡聚糖及其衍生物，例如硫酸葡聚糖，纤维素及其衍生物(包括甲基纤维素和羧甲基纤维素)，淀粉及其衍生物，聚蔗糖等。

在本发明的一个特定实施方案中，通过与蛋白质或肽偶联来对ADIr进行修饰，其中一个或多个蛋白质或肽直接或间接地连接于ADIr。蛋白质可为天然存在的蛋白质或它们的片段，包括但不限于天然存在的人类血清蛋白质或它们的片段，例如甲状腺素结合蛋白、甲状腺转运蛋白、a1-酸性糖蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白、Ig Fc区、白蛋白、以及其片段。“片段”意指蛋白质的任何部分，该部分小于全蛋白但保留蛋白质的所需功能。本文所述的ADIr可通过共价键直接或间接地连接于蛋白质。直接连接意指ADIr的一个氨基酸通过肽键或二硫键直接连接于修饰蛋白的一个氨基酸。间接连接是指ADIr与修饰蛋白之间通过其间起初存在的化学基团或经生物或化学方法添加的特定化学基团的连接，或者上述连接的组合。

在一个特定实施方案中，ADIr通过与PEG共价连接而被修饰。经PEG共价修饰(通过或不通过接头)的ADIr在下文中可被称为“ADIr-PEG”。与未经修饰的ADIr相比时，ADIr-PEG保留了其大部分酶活性，少得多的免疫原性或抗原性，具有极大延长的循环半衰期，并在肿瘤的治疗中更加有效。

“聚乙二醇”或“PEG”是指环氧乙烷和水的呈支链或直链的缩聚物的混合物，由通式H(OCH₂CH₂)nOH表示，其中n为至少4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀组合使用以表示其近似的重均分子量。例如，PEG5,000是指具有约5,000的总重均分子量的PEG；PEG12,000是指具有约12,000的总重均分子量的PEG；以及PEG20,000是指具有约20,000的总重均分子量的PEG。

在本发明的一个实施方案中，PEG具有约1,000至约50,000的总重均分子量；在一个实施方案中，约3,000至约40,000，并且在另一个实施方案中，约5,000至约30,000；在某些实施方案中，约8,000至约30,000；在其它实施方案中，约11,000至约30,000；在额外的实施方案中，约12,000至约28,000；在又其它实施方案中，约16,000至约24,000；以及在其它实施方案中，约18,000至约22,000；在另一个实施方案中，19,000至约21,000，以及在一个实施方案中，PEG具有约20,000的总重均分子量。一般来讲，具有30,000或更高的分子量的PEG难于溶解，并且配制产物的产量将降低。PEG可为支链或直链。一般来讲，增加PEG的分子量降低ADIr的免疫原性。具有该实施方案中所述的分子量的PEG可与ADIr以及任选的生物相容的接头共同使用，以治疗癌症，包括，例如，急性髓细胞样白血病，例如复发性急性髓细胞样白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃部癌、神经胶质瘤、多形成性胶质细胞瘤、非小细胞性肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、子***、睾丸癌、胃癌和食管癌。

在本发明的另一个实施方案中，PEG具有约1,000至约50,000的总重均分子量；在某些实施方案中，约3,000至约30,000；在其它实施方案中，约3,000至约20,000；在一个实施方案中，约4,000至约12,000；在另其它实施方案中，约4,000至约10,000；在额外的实施方案中，约4,000至约8,000；在又其它实施方案中，约4,000至约6,000；在另一个实施方案中，约5,000。PEG可为支链或直链，并且在某些实施方案中为直链。具有该实施方案中所述的分子量的PEG可与ADIr以及任选的生物相容的接头共同使用，以治疗移植物抗宿主病(GVHD)或癌症。

尽管ADIr-PEG为本文所述的示例性经修饰的ADIr，但技术人员应明白，ADIr可经其它聚合物或合适的分子修饰以获得所需效果，特别是降低免疫原性和增加血清半衰期。

虽然ADIr可通过或不通过接头共价结合于修饰剂(例如PEG)，但是一个优选的实施方案使用了接头。

用于将ADIr共价地附着于修饰剂(如PEG)的接头可为任何生物相容的接头。如上所述，“生物相容的”是指化合物或基团是无毒性的并可体外或体内应用而不会导致伤害、病症、疾病、或死亡。修饰剂(例如PEG)可结合于接头，例如，通过醚键、硫醇键、或酰胺键。接头基团包括，例如，琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基、以及其组合。在一个实施方案中，生物相容性接头的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)。接头的其它合适的来源可包括氧羰基咪唑基团(包括，例如，羰基咪唑(CDI))、硝基苯基基团(包括，例如，碳酸硝基苯酯(NCP)或碳酸三氯苯酯(TCP))、三氟乙磺酸酯(trysylate)基、醛基、异氰酸酯基、乙烯砜基、或伯胺。在另一个实施方案中，接头来源于SS、SPA、SCM、或NHS；在某些实施方案中，使用SS、SPA、或NHS，并且在其它实施方案中，使用SS或SPA。因此，在某些实施方案中，潜在的接头可由甲氧基-PEG琥珀酸琥珀酰亚胺酯(SS)、甲氧基-PEG戊二酸琥珀酰亚胺酯(SG)、甲氧基-PEG碳酸琥珀酰亚胺酯(SC)、甲氧基-PEG羧甲基琥珀酰亚胺酯(SCM)、甲氧基-PEG2N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、甲氧基-PEG丁酸琥珀酰亚胺酯(SBA)、甲氧基-PEG丙酸琥珀酰亚胺酯(SPA)、甲氧基-PEG琥珀酰亚胺戊二酰胺、和甲氧基-PEG琥珀酰亚胺琥珀酰胺形成。

可选地，ADIr可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接偶联于修饰剂，如PEG(即不通过接头)。

ADIr可通过生物相容性接头共价结合于PEG，利用本领域的已知方法，如例如，Park等，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；和Zaplipsky及Lee，Polyethylene GlycolChemistry：Biotechnical and Biomedical Applications，J.M.Harris编，Plenum Press，NY，第21章(1992)所述，其公开内容的全文以引用的方式并入本文。

PEG附着于ADIr增加了ADIr的循环半衰期。一般来讲，将PEG附着于ADIr的伯胺。PEG或其它修饰剂在ADIr上的附着位点的选择通过蛋白质的活性结构域中每个位点的作用来确定，如技术人员所知。PEG可附着于ADIr的伯胺而酶活性基本上没有损失。例如，ADIr中存在的赖氨酸残基都是可能的点，在这些点，本文所述的ADIr可通过生物相容性接头(例如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS)附着于PEG。PEG也可附着于ADIr的其它位点，这根据本发明对于本领域技术人员来说是显而易见的。

1至约30个PEG分子可共价地结合于ADIr。在某些实施方案中，ADIr经一个PEG分子修饰。在其它实施方案中，ADIr经一个以上的PEG分子修饰。在一个实施方案中，ADIr经约1个至约10个，或约7个至约15个PEG分子修饰，并且在一个实施方案中，约2个至约8个或约9个至约12个PEG分子。在另一个实施方案中，ADIr经2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个PEG分子修饰。在一个特定实施方案中，ADIr经4.5-5.5个PEG分子/ADIr修饰。在另一个实施方案中，ADIr经5±1.5个PEG分子修饰。

在另一个实施方案中，ADIr中约15％至约70％的伯胺基经PEG修饰，在一个实施方案中，约20％至约65％，约25％至约60％，或者在某些实施方案中，约30％至约55％，或45％至约50％，以及在其它实施方案中，精氨酸脱亚胺酶中约50％的伯胺基经PEG修饰。当PEG共价结合于ADIr末端时，理想的是只使用1个PEG分子。增加ADIr上PEG单元的数量增加酶的循环半衰期。然而，增加ADIr上PEG单元的数量会降低酶的特异活性。因此，二者之间需要达成平衡，这根据本发明对于本领域技术人员来说是显而易见的。

在本发明中，生物相容性接头的一个共同特征是它们通过琥珀酰亚胺基附着于精氨酸脱亚胺酶的伯胺。一旦与ADIr偶联，SS-PEG具有紧邻PEG的酯键，这可使得该位点对于血清酯酶敏感，血清酯酶可从体内中ADIr中释放PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS不具有酯键，所以它们对血清酯酶不敏感。

在某些实施方案中，生物相容性接头用于本发明。附着于蛋白质的PEG可为直链PEG，如SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG，或支链PEG，如PEG2-NHS。

在某些实施方案中，对位于或邻近酶的催化区的与ADIr相关的聚乙二醇化位点进行修饰。对于本发明的目的，短语“聚乙二醇化位点”可被定义为ADI或ADIr的可经聚乙二醇共价修饰的任何位点或位置。“聚乙二醇化位点”可被认为位于或邻近酶的催化区，其中位点的聚乙二醇化导致酶催化活性的显著下降。此类位点的聚乙二醇化通常会导致酶的失活。例如，来源于人型支原体的ADI在112位置具有一个赖氨酸，该位置被认为位于或邻近酶的催化区。在112位置PEG附着于此赖氨酸可使酶失活。此外，来源于人型支原体的ADI在397位置具有一个半胱氨酸，该位置被认为位于或邻近酶的催化区。在397位置的半胱氨酸的氨基酸替换可使酶失活。具体地讲，在397位置以丙氨酸、组氨酸、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸或酪氨酸替换半胱氨酸可导致所有可测定的酶活的损失。来源于人型支原体的ADI还具有位于此保守半胱氨酸附近的三个赖氨酸，具体是Lys374、Lys405和Lys408。PEG附着于Lys374、Lys405、Lys408或其组合可使酶失活。

应了解，来源于其它生物体的ADIr也可具有对应于来自人型支原体的ADI的112位置的聚乙二醇化位点。此外，来源于一些生物体的ADI可具有对应于与来自人型支原体的ADI的112位置相同的广义位置的赖氨酸。来自此类生物体的ADI中的赖氨酸的位置对于本领域技术人员来说是熟知的并如美国专利No.6,635,462所述。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了在ADIr的多肽链中的某些氨基酸替换。这些氨基酸替换提供修饰的ADIr，其经修饰剂如经聚乙二醇化修饰后的活性损失较小。通过消除位于或邻近酶催化区的聚乙二醇化位点或其它已知的修饰位点，可实现最佳的修饰例如聚乙二醇化，而活性没有损失。

应了解，本发明的其它实施方案基于以下理解：即精氨酸脱亚胺酶的某些结构特征在通过重组技术制备时可阻止或干扰适当和快速的复性。具体地讲，这些结构特征会妨碍或阻止酶在重组制备过程中呈现活性构象。对于本发明的目的，短语“活性构象”可被定义为一种三维结构，其允许通过未经修饰或经修饰的精氨酸脱亚胺酶的酶活性。具体地讲，所述活性构象对于催化精氨酸向瓜氨酸的转化可能是必不可少的。短语“结构特征”可被定义为由特定氨基酸或氨基酸组合导致的多肽链的任意特点、品质或性质。例如，精氨酸脱亚胺酶可含有导致正常肽链弯曲或扭结并因此阻止酶在酶复性期间呈现活性构象的氨基酸。具体地讲，来自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶在210位置具有一个脯氨酸，这可导致肽链弯曲或扭结，使得重组制备期间更难于使酶复性。应了解，来源于其它生物体的精氨酸脱亚胺酶也可具有对应于来自人型支原体的精氨酸脱亚胺酶的210位置的位点。

本发明因此还提供了在野生型精氨酸脱亚胺酶的多肽链中的某些氨基酸替换。此类氨基酸替换可消除精氨酸脱亚胺酶多肽链中有问题的结构特征。此类氨基酸替换提供了经修饰的精氨酸脱亚胺酶的复性的改善。这些氨基酸替换可利用减量的缓冲液使快速地复性经修饰的精氨酸脱亚胺酶成为可能。这些氨基酸替换也可提供经修饰的精氨酸脱亚胺酶复性后的产量增加。在本发明的一个实施方案中，经修饰的精氨酸脱亚胺酶在P210或等效残基上具有一个氨基酸替换。如上所述，来源于人型支原体的精氨酸脱亚胺酶在210位置具有一个氨基酸脯氨酸。然而并非限制本发明，目前认为，在210位置的氨基酸脯氨酸的存在导致增加精氨酸脱亚胺酶复性(即重折叠)难度的正常多肽链的弯曲或扭结。在210位置的脯氨酸的替换可利用减量的缓冲液使快速地复性经修饰的精氨酸脱亚胺酶成为可能。在210位置的脯氨酸的替换还可提供经修饰的精氨酸脱亚胺酶复性后的产量增加。在一个实施方案中，在210位置的脯氨酸被丝氨酸替换。应了解，根据本发明的此方面，可在210位置进行其它替换。其它替换的实例包括Pro210替换为Thr210、Pro210替换为Arg210、Pro210替换为Asn210、Pro210替换为Gln210或Pro210替换为Met210。通过消除与野生型精氨酸脱亚胺酶的210位置的氨基酸相关的那些结构特征，可实现酶的适当重折叠。

本发明方法可涉及体外或体内应用。在体外应用(包括细胞培养应用)的情况下，可将本文所述的化合物添加至培养物的细胞中，然后进行培养。利用本领域熟知的抗体生产技术，本发明化合物也可用于促进单克隆抗体和/或多克隆抗体的生产。单克隆抗体和/或多克隆抗体可随后用于多种诊断应用，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明化合物的体内施用方式将取决于所期应用。以纯净形式或以合适的药物组合物形式的本文所述的ADIr组合物的施用可通过用于起到类似作用的药剂的所接受的施用模式中任一种进行。药物组合物可通过将ADIr(如ADIr-PEG、ADIr-PEG 20)与合适的生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合而制备，并且可配制成呈固体、半固体、液体或气体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球剂和气溶胶。此外，其它药理学活性成分(包括如文中其它处所述的其它抗癌剂)和/或合适的赋形剂(例如盐、缓冲液和稳定剂)可以但不必存在于组合物中。施用可通过多种不同的途径来实现，包括经口、肠胃外、经鼻、静脉、皮内、皮下或局部。施用方式取决于需要治疗或预防的病状性质。因此，ADIr-PEG(例如ADIr-PEG 20)可经口施用、鼻内施用、腹膜内施用、肠胃外施用、静脉施用、***内施用、瘤内施用、肌内施用、间质施用、动脉内施用、皮下施用、眼内施用、滑膜内施用、经上皮施用和经皮施用。施用后，减少、抑制、阻止或延缓癌症的进展和/或转移的量被视为有效。在某些实施方案中，本文ADIr组合物使患者的中位生存期增加统计学上显著量。在一个实施方案中，本文所述的ADIr治疗使患者的中位生存期增加4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、15周、20周、25周、30周、40周或更长。在某些实施方案中，ADIr治疗使患者的中位生存期增加1年、2年、3年或更长。在一个实施方案中，本文所述的ADIr治疗使无进展生存期增加2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长。在某些实施方案中，本文所述的ADIr治疗使无进展生存期增加1年、2年、3年或更长。

在某些实施方案中，施用量足以导致肿瘤消退，如统计学上显著的存活肿瘤的减少量所指示，例如，肿瘤质量减少至少10％、20％、30％、40％、50％或更多，或者改变的(例如，统计学上显著减少)扫描尺寸所指示。在某些实施方案中，施用量足以使病情稳定。在其它实施方案中，施用量足以导致技术人员已知的特定疾病适应症的症状的临床相关性减轻。

在某些实施方案中，施用量足以抑制NO合成、抑制血管生成、和/或足以诱导肿瘤细胞凋亡或其任何组合。NO合成、血管生成和凋亡可利用本领域的已知方法来测定，参见，例如，Current Protocols in Immunology or Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sohs，New York，N.Y.(2009以及其更新)；Ausubel等，ShortProtocols in Molecular Biology，第3版，Wiley&Sons，1995；以及其它类似参考文献。在一个特定实施方案中，施用量抑制NO合成并且抑制黑色素瘤生长以及补充、增强、或协同增强本文所述的其它化疗法，例如顺铂。因此，本发明的一个实施方案提供了一种通过施用ADIr-PEG 20与顺铂的组合来治疗黑色素瘤的方法，其中该治疗消耗内源性一氧化氮(NO)。

精确剂量和治疗持续时间随治疗疾病而变并可根据经验采用已知测试方案或通过在本领域已知的模型***中测试组合物并由此推测而确定。也可以进行可控的临床试验。剂量也可随待缓解症状的严重程度而改变。通常配制和施用药物组合物以发挥治疗上有用的效果同时最大程度地降低不需要的副作用。所述组合物可一次性施用，或可分成多个更少剂量以在多个时间间隔点施用。对于任何特定的受试者而言，具体的给药方案将随着时间根据个体需求调整。

ADIr组合物可单独施用或与其它已知的癌症治疗组合施用，例如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力学疗法等。组合物也可与抗生素组合施用。

ADIr组合物也可单独施用或与ADI-PEG 20疗法组合施用。在某些实施方案中，本文所述的ADIr用于已经ADI-PEG 20治疗并产生抗-ADI-PEG 20抗体的患者。因为酶被抗体中和，所以此类患者不再受益于ADI-PEG 20治疗。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向有此需要的患者施用治疗有效量的包含ADI-PEG 20的组合物，并且一段时间后，向所述患者施用包含本文所述的ADIr的组合物，从而治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展。

在本方法的一个实施方案中，所述时间段通过检测患者中抗-ADI-PEG 20抗体的预定水平确定，其中在检测所述抗-ADI-PEG 20抗体的预定水平后，施用包含ADIr的组合物。在某些实施方案中，可建立在需经本发明的ADI-PEG 20和ADIr治疗的患者中的抗-ADI-PEG 20抗体的阈值水平或预定水平。所述抗-ADI-PEG 20抗体的“预定的阈值水平”(也称为“预定水平”或“预定的临界值”)，或有时被称为预定的临界，可使用本领域已知方法来确定，例如，使用受试者工作特征曲线或“ROC”曲线。在一个实施方案中，甚至非常低水平的抗-ADI-PEG 20抗体被认为足以保证将治疗由ADI-PEG 20转换到本发明的ADIr-PEG。在某些实施方案中，决定何时终止ADI-PEG 20治疗并开始本发明的ADIr-PEG治疗的抗-ADI-PEG20的适当水平可由熟练的临床医生确定。

在一些实施方案中，所述时间段通过检测或否则观察患者的ADI活性确定，其中在检测或观察到ADI活性的预定水平后施用组合物。在特定实施方案中，在检测或观察到患者的ADI活性水平降低后施用组合物。ADI活性可直接测定，例如，通过测定生物样品的至少一种ADI活性的指示剂，或间接测定，例如，通过观察ADI-PEG 20治疗的需要或预期效果。在某些实施方案中，决定何时终止ADI-PEG 20治疗并开始本发明的ADIr-PEG治疗的ADI活性的适当水平可由熟练的临床医生确定。

施用这些及相关药物组合物的典型途径因此包括但不限于，经口施用、局部施用、经皮施用、吸入施用、肠胃外施用、舌下施用、口腔施用、直肠施用、***施用和鼻内施用。文中所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉注射、肌内注射、胸骨内注射或输液技术。

配制根据本发明的某些实施方案的药物组合物以允许其中含有的活性成分向患者施用组合物后为生物有效的。向受试者或患者施用的组合物可呈一种或多种剂量单位形式，其中例如，片剂可为单剂量单位，而呈气溶胶形式的本文所述的ADIr组合物的容器可容纳多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法，对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的；例如，参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版(Philadelphia College of Pharmacy and Science，2000)。所施用组合物在任何情况下将含有治疗有效量的本发明的ADIr-PEG，例如ADIr-PEG 20，以根据本文教义治疗所关注的疾病或病症。在某些实施方案中，所述药物组合物或治疗组合物是无菌的和/或无热原的。

药物组合物可呈固体或液体的形式。在一个实施方案中，使载体微粒化，以使组合物例如呈片剂或粉剂形式。载体可为液体，则组合物为例如口服油，注射液或用于例如吸入施用的气溶胶。当旨在用于经口施用时，药物组合物通常呈固体或液体形式，其中半固体，半液体，悬浮液和凝胶形式均包括在本文视为固体或液体的形式中。

对于经口施用的固体组合物，可将药物组合物配制成粉末、颗粒、压片、丸剂、胶囊、咀嚼胶、薄片等等。此类固体组合物通常含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。此外，可存在如下的一种或多种：粘合剂如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄耆胶或明胶；赋形剂如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂如海藻酸、海藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等等；润滑剂如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精；芳香剂如薄荷、水杨酸甲酯或橙香精；和着色剂。当药物组合物呈胶囊(如明胶胶囊)形式时，除上述类型的材料外，其还可含有液体载体如聚乙二醇或油。

药物组合物可呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可用于经口施用或注射递送。当旨在用于经口施用时，除本发明化合物以外，优选的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和风味增强剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。

液体药物组合物，无论以溶液，悬浮液还是其它类似形式，都可包括下列佐剂中的一种或多种：无菌稀释剂如注射用水、盐溶液，在某些实施方案中为生理盐水、林格氏液(Ringer′s solution)、等渗氯化钠、不挥发油如合成的甘油一酯或甘油二酯(其可作为溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及调节渗透压的试剂如氯化钠或葡聚糖。肠胃外制剂可封装于安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量瓶中。生理盐水是一种优选的佐剂。注射用药物组合物优选是无菌的。

旨在用于肠胃外施用或经口施用的液体药物组合物应含有一定量的本文公开的ADIr，例如ADIr-PEG 20，以获得合适的剂量。通常，此量为组合物中至少0.01％的ADIr。当旨在用于经口施用时，此量可介于组合物重量的0.1％与约70％之间变化。某些口服药物组合物含有约4％至约75％的ADIr-PEG。在某些实施方案中，制备根据本发明的药物组合物和制剂以使肠胃外剂量单位在稀释前含有0.01重量％至10重量％的ADIr-PEG。

药物组合物也旨在用于局部施用，在这种情况下，载体可适当地包括溶液、乳液、软膏剂或凝胶基质。所述基质，例如，可包括如下的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂如水及醇、和乳化剂以及稳定剂。增稠剂可存在于用于局部施用的药物组合物中。如果旨在用于经皮施用时，组合物可包括经皮贴剂或离子电渗装置。药物组合物可旨在用于直肠施用，例如以栓剂的形式，其在直肠中溶解并释放药物。用于直肠施用的组合物可含有油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可油和聚乙二醇。

药物组合物可包括多种材料，这些材料修饰固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包括包裹活性成分形成包衣外壳的材料。形成包衣外壳的材料通常为惰性的，并可选自，例如，糖、虫胶、和其它肠包衣剂。或者，活性成分可装入明胶胶囊中。呈固体或液体形式的药物组合物可包括与ADIr-PEG结合的药剂，从而辅助化合物的递送。具备上述性能的合适的药剂包括单克隆抗体或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。药物组合物可基本上由可以气溶胶形式施用的剂量单位组成。术语气溶胶用于表示多种***，范围从具有胶体性质的那些***到由加压包装组成的***。递送可通过液化气体或压缩气体或通过分散活性成分的适宜泵***进行。气溶胶可以单相、两相、或三相***递送以递送活性成分。气溶胶的递送包括必要的容器、活化剂、阀、子容器等，这些在一起可形成药盒。本领域的普通技术人员不进行过度试验则可确定优选的气溶胶。

药物组合物可通过药学领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的药物组合物可通过将包含本文所述的ADIr-PEG和任选地，盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种的组合物与无菌蒸馏水组合以形成溶液而制备。可添加表面活性剂以促进均相溶液或悬浮液的形成。表面活性剂为与ADIr-PEG组合物非共价相互作用以促进ADIr-PEG在水性递送***中溶解或均匀悬浮的化合物。

组合物可以治疗有效量施用，其将随多种因素变化，所述因素包括所用具体化合物(例如ADIr-PEG)的活性；化合物的代谢稳定性和作用长短；患者的年龄、体重、健康状况、性别和日常饮食；施用模式和时间；***速率；药物组合；特定病症或病状的严重程度；以及患者正在接受的治疗。

一种本发明化合物的治疗有效量指用于抑制肿瘤生长的有效量。一般来讲，以小剂量开始治疗，可以小增量增加，直至在这种情况下达到最佳疗效。一般来讲，本发明化合物的治疗剂量可为约1至约200mg/kg，每周2次至每2周约1次。例如，所述剂量可为约1mg/kg，每周1次，2ml静脉注射至约20mg/kg，每3天1次。在另一个的实施方案中，剂量可为约50IU/m²至约700IU/m²，每3天约施用1次，每周约一次，每周约两次，或每两周约一次。在某些实施方案中，剂量可为约50IU/m²、60IU/m²、70IU/m²、80IU/m²、90IU/m²、100IU/m²、110IU/m²、120IU/m²、130IU/m²、140IU/m²、150IU/m²、160IU/m²、170IU/m²、180IU/m²、190IU/m²、200IU/m²、210IU/m²、220IU/m²、230IU/m²、240IU/m²、250IU/m²、260IU/m²、270IU/m²、280IU/m²、290IU/m²、300IU/m²、310IU/m²、约320IU/m²、约330IU/m²、340IU/m²、约350IU/m²、360IU/m²、370IU/m²、380IU/m²、390IU/m²、400IU/m²、410IU/m²、420IU/m²、430IU/m²、440IU/m²、450IU/m²、500IU/m²、550IU/m²、600IU/m²、620IU/m²、630IU/m²、640IU/m²、650IU/m²、660IU/m²、670IU/m²、680IU/m²、690IU/m²、或约700IU/m²，每3天约施用1次，每周约一次，每周约2次，或每2周约1次。在某些实施方案中，剂量可由熟练的临床医生根据需要进行调整。

ADIr-SS-PEG5,000的最佳剂量可为每周约2次，而ADIr-SS-PEG20,000的最佳剂量可为每周约1次至每2周约1次。在某些实施方案中，ADIr-SS-PEG20,000的最佳剂量可为每周约2次。

ADIr-PEG在注射前，可与磷酸盐缓冲盐溶液，或本领域技术人员熟知的任何其它的合适溶液混合。在一个实施方案中，包含ADIr-PEG的液体组合物在约6.6至约7的pH下；在适量的注射用水(例如，约1ml或约2ml)中包含约10至约12mg ADIr，约20至约40mg聚乙二醇，1.27mg+5％磷酸二氢钠，USP；约3mg+5％磷酸氢二钠，USP；7.6mg+5％氯化钠，USP。在一个实施方案中，包含ADIr-PEG的液体组合物包含组氨酸-HCl，并且在某些实施方案中，组合物缓冲液为约0.0035M组氨酸-HCl至约0.35M组氨酸-HCl。在一个特定实施方案中，使组合物在包含0.035M pH 6.8组氨酸-HCl和0.13M氯化钠的缓冲液中配制。在另一个实施方案中，使组合物在包含0.02M pH 6.8磷酸钠缓冲液和0.13M氯化钠的缓冲液中配制。

在一个实施方案中，包含ADIr或ADIr-PEG的组合物具有约5至约9、约6至约8、或约6.5至约7.5的pH。在一些实施方案中，包含ADIr的组合物具有约6.8±1.0的pH。

在一个实施方案中，在包含ADIr-PEG的组合物中的游离PEG为全部PEG的1-10％，并且在另一个实施方案中，小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％或小于1％。在某些实施方案中，在包含ADIr-PEG的组合物中的未经修饰的ADIr为小于约1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或小于0.1％。一般来讲，包含ADIr-PEG的组合物具有小于或等于约4％、3％、2％、1.5％、1％或0.5％的全部杂质。在一个实施方案中，内毒素限值满足USP规定的要求，即≤50EU/mL。

在一个实施方案中，在包含ADIr或ADIr-PEG的组合物中的游离巯基大于约90％。在一些实施方案中，在包含ADIr或ADIr-PEG的组合物中的游离巯基为约91％、约92％、约93％、约94％或约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多。

在一个实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约0.1μM或0.5μM至约15μM的Km，并且在另一个实施方案中，约1μM至约12μM、约1μM至约10μM、约1.5μM至约9μM、约1.5μM至约8μM或约1.5μM至约7μM。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约1.0μM至约10μM或约1.5μM至约6.5μM的Km。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约，至少约，或小于约0.1μM、约0.5μM、约1.0μM、约1.5μM、约2μM、约2.5μM、约3μM、约3.5μM、约4μM、约4.5μM、约5μM、约5.5μM、约6μM、约6.5μM、或约7μM、或约8μM、或约9μM、或约10μM的Km。

在一个实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约0.5sec^-1至约80sec^-1、或约0.5sec^-1至约70sec^-1、或约0.5sec^-1至约60sec^-1、或约0.5sec^-1至约50sec^-1、或约0.5sec^-1至约40sec^-1、或约0.5sec^-1至约30sec^-1、或约0.5sec^-1至约20sec^-1、或约0.5sec^-1至约15sec^-1的Kcat，并且在另一个实施方案中，约0.5sec^-1至约80sec^-1、或约1sec^-1至约80sec^-1、或约5sec^-1至约80sec^-1、或约10sec^-1至约80sec^-1、或约20sec^-1至约80sec^-1、或约30sec^-1至约80sec^-1、或约40sec^-1至约80sec^-1、或约50sec^-1至约80sec^-1、或约60sec^-1至约80sec^-1、或约70sec^-1至约80sec^-1、或约1sec^-1至约12sec^-1、约1sec^-1至约10sec^-1、约1.5sec^-1至约9sec^-1、约2sec^-1至约8sec^-1或约2.5sec^-1至约7sec^-1。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约2.5sec^-1至约7.5sec^-1的Kcat。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约或至少约2.5see^-1、约3sec^-1、约3.5sec^-1、约4sec^-1、约4.5sec^-1、约5sec^-1、约5.5sec^-1、约6sec^-1、约6.5sec^-1、约7sec^-1、约7.5sec^-1或约8sec^-1、约10sec^-1、约15sec^-1、约20sec^-1、约25sec^-1、约30sec^-1、约35sec^-1、约40sec^-1、约45sec^-1、约50sec^-1、约55sec^-1、约60sec^-1、约65sec^-1、约70sec^-1、约75sec^-1、约80sec^-1、约85sec^-1、约90sec^-1、约95sec^-1、或约100sec^-1的Kcat。

在一个实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约5mS/cm至约20mS/cm的电导率(本领域也称作比电导)，并且在另一些实施方案中，约5mS/cm至约15mS/cm、约7mS/cm至约15mS/cm、约9mS/cm至约15mS/cm或约10mS/cm至约15mS/cm。在一些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约9mS/cm、约10mS/cm、约11mS/cm、约12mS/cm或约13mS/cm、约14mS/cm或约15mS/cm的电导率。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约13mS/cm±1.0mS/cm的电导率。

在一个实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约50mOsm/kg至约500mOsm/kg、约100mOsm/kg至约400mOsm/kg、约150mOsm/kg至约350mOsm/kg、约200mOsm/kg至约350mOsm/kg或约250mOsm/kg至约350mOsm/kg的渗透压。在某些实施方案中，组合物中的ADIr或ADIr-PEG具有约300±30mOsm/kg的渗透压。

在一个实施方案中，蛋白浓度为约11.0±1.0mg/mL。在某些实施方案中，蛋白浓度为约8至约15mg/mL。在另一个实施方案中，蛋白浓度为约8、9、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、或15mg/mL。

在一个实施方案中，酶比活性为约5.0至90IU/mg或约5至55IU/mg，其中1IU被定义为在37℃下，1分钟内将1μmol精氨酸转化成1μmol瓜氨酸和1μmol氨的酶量且效价为100±20IU/mL。在另一个实施方案中，酶比活性为约5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5、27、27.5、28、28.5、29、29.5、30、30.5、35、40、45、50、55、55、60、65、70、75、80、85、90、95、或100±2.0IU/mg。在一个特定实施方案中，酶比活性为9±2.0IU/mg。

包含本发明ADIr-PEG的组合物的施用也可与一种或多种其它治疗剂(包括ADI-PEG 20)的施用同时进行，先于进行，或之后进行。此组合疗法可包括单药物剂量制剂(该制剂含有本发明的化合物和一种或多种额外的活性剂)的施用、以及包含本发明ADIr-PEG(例如ADIr-PEG 20)的组合物的施用以及每种活性剂以其自身单独的药物剂量制剂的施用。例如，本本文所述的ADIr-PEG和其它活性剂可以单剂量口服组合物(例如片剂或胶囊)一起施用于患者，或每种制剂以单独的剂量口服制剂施用。类似地，本本文所述的ADIr-PEG和其它活性剂可以肠胃外单剂量组合物例如在盐溶液或其它生理学上可接受的溶液中一起施用于患者，或者每种药剂以单独的肠胃外剂量制剂通过相同或不同的途径(例如，一个通过注射，一个通过口服)施用。在使用单独的剂量制剂的情况下，包含ADIr-PEG的组合物以及一种或多种额外的活性剂可基本上在同一时间(即同时)施用，或在单独的交错时间(即按照顺序以及以任意顺序)施用；组合疗法被认为包括所有这些方案。

因此，在某些实施方案中，也预期到，本发明的ADIr组合物与一种或多种其它治疗剂组合施用。此类治疗剂在本领域被认为用于本文所述的特定疾病状态的标准治疗，例如特定癌症或GVHD。所预期的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、消炎药、化疗剂、放疗剂、自噬抑制剂、或其它活性辅助剂。

在某些实施方案中，本文公开的ADIr组合物可与任何数量的化疗剂共同施用。化疗剂的实例包括烷化剂例如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷例如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仓(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、罗莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类例如阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、多柔比星(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶罗呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤类似物如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺药例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；磷胺氮芥(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK.RTM.；丙亚胺(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogerma nium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；胞核嘧啶(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；紫杉烷类化合物，例如，紫杉醇(Brisrol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(Rhne-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；诺安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物例如Targretin^TM(贝沙罗汀(bexarotene))，Panretin^TM(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAK^TM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他滨(capecitabine)；以及以上任一种的药学上可接受盐、酸或衍生物。此定义也包括用于调节或抑制针对肿瘤的激素作用的抗激素药，例如抗***药包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(法乐通)；和抗雄激素药例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)。其它化疗剂包括索拉菲尼(sorafenib)和其它蛋白激酶抑制剂例如阿法替尼(afatinib)、阿西替尼(axitinib)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、克唑替尼(crizotinib)、达沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、福他替尼(fostamatinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、乐伐替尼(lenvatinib)、木利替尼(mubritinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕尼单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、哌加他尼(pegaptanib)、兰尼单抗(ranibizumab)、鲁索利替尼(ruxolitinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、凡德他尼(vandetanib)、维罗非尼维罗非尼(vemurafenib)和舒尼替尼(sunitinib)；西罗莫司(sirolimus)(雷帕霉素(rapamycin))、依维莫司(everolimus)以及其它mTOR抑制剂。以上任一种的药学上可接受盐、酸或衍生物也预期用于本文中。

在某些实施方案中，本文公开的ADIr组合物可与任何数量的自噬抑制剂共同施用。在一些优选实施方案中，所述自噬抑制剂选自以下：氯喹、3-甲基腺嘌呤、羟氯喹(Plaquenil.TM.)、巴弗洛霉素A1、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷(AICAR)、冈田酸(okadaicacid)、抑制2A型或1型蛋白磷酸酶的自噬抑制藻类毒素、cAMP类似物、以及提高cAMP水平的药物、腺苷、N6-巯嘌呤核苷、渥曼青霉素(wortmannin)和长春碱。此外，还可使用反义或siRNA来抑制自噬必需蛋白的表达，诸如例如ATG5。

在一个实施方案中，ADIr-PEG与一种或多种治疗剂的组合作用互补、相加、或协同。在这方面，本文所述的互补剂或协同剂，包括治疗剂(例如，化疗剂、自噬抑制剂、mTOR抑制剂、或用于治疗本文所述的癌症、GVHD、或炎症性肠道疾病的任何其它治疗剂)，其能够与本文提供的ADIr-PEG互补或协同作用，其中此互补或协同表现为可检测到的效果幅度大于(即以相对于适当的对照条件的统计学上显著的方式)当化疗剂存在而ADIr-PEG组合物不存在，和/或当ADIr-PEG存在而化疗剂不存在时可检测到的效果。用于测定协同和互补的方法在本领域是已知的(参见，例如，Cancer Res，2010年1月15日70；440)。

包含ADIr和任选如本文所述的其它治疗剂的组合物可用于癌症治疗的治疗方法和防止癌症扩散的方法。因此，本发明提供了可用于治疗多种癌症，缓解其症状，或抑制其进展或预防癌症的方法。在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗GVHD，缓解其症状，或抑制其进展的方法。具体来讲，本发明提供用于治疗患者的癌症或GVHD，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括任选地，在经ADI-PEG 20治疗后，特别是患者产生抗-ADI-PEG 20抗体时，向患者施用治疗有效量的本文所述的ADIr组合物，从而治疗癌症或GVHD，缓解其症状，或抑制其进展。因此，可将本文所述的ADIr组合物施用于受以下疾病折磨的个体：炎症性肠道疾病(例如，克罗恩病(Grohn′s disease)；溃疡性结肠炎)、GVHD或癌症，包括但不限于肝细胞癌、白血病(例如急性髓系白血病和复发性急性髓系白血病)、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、肉瘤(包括但不限于，转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、***癌(例如，但不限于，激素难治性***癌)、间皮瘤、淋巴白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃部癌(包括但不限于，胃腺癌)、神经胶质瘤、多形胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌(包括但不限于，头颈部鳞状细胞癌、舌癌)、***、睾丸癌、胆囊胆管癌和胃癌。

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗患者的癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向所述患者施用包含ADIr，和可选地，一种或多种本文所述的其它治疗剂的组合物，其中所述癌症缺少ASS、ASL、或两者。在这方面，ASS或ASL缺陷可为由mRNA表达或蛋白表达测定的表达的降低，或可为蛋白活性的降低，并通常包含技术人员确定的表达或活性的统计学上显著的降低。与已知没有癌症的适宜的对照样品的表达或活性相比，降低的ASS或ASL表达或活性可为约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、或更多的表达或活性的降低。在某些实施方案中，与非癌症对照样品的表达或活性相比，ASS或ASL表达或活性可降低至少2倍。

在某些实施方案中，降低的ASS或ASL表达或活性是由于ASS或ASL启动子的甲基化或ASS或ASL启动子受到抑制。在另一个实施方案中，ASS或ASL表达或活性的降低是由于DNA突变(例如，一个或多个点突变、小缺失、***等)或导致基因缺失的染色体异常。在一个实施方案中，癌症为ASS或ASL阴性，意思是观察不到表达或活性。

ASS或ASL表达或活性的降低可通过本领域已知的任意方法来测定，例如但不限于，定量PCR、免疫组织化学、酶活性测定(如测量胱氨酸向精胺琥珀酸的转化或精胺琥珀酸向精氨酸和富马酸的转化的测定)等等。

因此，本发明提供了用于治疗患者的癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向所述患者施用包含本文所述的ADIr的组合物，其中所述癌症显示出ASS或ASL表达或活性的降低，或二者，其中所述癌症包括但不限于，肝细胞癌、白血病(例如急性髓细胞样白血病和复发性急性髓细胞样白血病)、黑色素瘤(包括转移性黑色素瘤)、肉瘤(包括，但不限于，转移性肉瘤、子宫平滑肌肉瘤)、胰腺癌、***癌(例如，但不限于，激素难治性***癌)、间皮瘤、淋巴白血病、慢性粒细胞白血病、淋巴瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胃部癌(包括但不限于，胃腺癌)、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤多形、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾癌(包括但不限于肾细胞癌)、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌(包括但不限于，头颈部鳞状细胞癌；舌癌)、***、睾丸癌、胆囊胆管癌和胃癌。

文献中的各种研究表明，ASS在下述肿瘤中是缺陷的：急性髓细胞性白血病(AML)、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃部癌、胶质母细胞瘤、HCC、淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、***癌、肾脏癌、肉瘤和小细胞肺癌。因此，本文中可具体地预期到这些ASS缺陷型癌症的治疗，只使用ADIr-PEG或与其它治疗组合，包括先利用ADI-PEG 20治疗。

本发明还提供了用于治疗患者的癌症，缓解其症状，或抑制其进展的方法，其包括向所述患者施用包含如本文所述的ADIr(例如，ADIr-PEG且具体地讲ADIr-PEG 20)，与自嗜抑制剂的组合的组合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患者癌症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包含本文所述的ADIr和自嗜抑制剂的组合的组合物，其中所述癌症为胰腺癌或小细胞肺癌。

在某些实施方案中，本发明提供了治疗方法，其中包含本文所述的ADIr的组合物的施用消耗血浆中的精氨酸至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗方法，其中在检测到抗-ADI-PEG 20抗体而终止用ADI-PEG 20的治疗后，包含本文所述的ADIr的组合物的施用消耗血浆中的精氨酸至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长。

实施例

实施例1

与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性较低的ADI酶的筛选和选择

本实施例描述了与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性较低的ADI酶的筛选和选择。

从大量ADI酶中，表1列出了针对它们相对于人型支原体ADI的序列百分比同一性所筛选的24种ADI酶。从文献可知，人型支原体、精氨酸支原体和关节炎支原体ADI氨基酸序列相关性密切并且这些酶具有良好的催化特性。最近，发现了具有与这三个密切相关的序列的额外的ADI酶。虽然已识别出相关性较远的支原体ADI酶，但关于它们的了解不多。存在来源于细菌和其它来源的相关性甚至更远的ADI酶。

公共数据库中可用的一些蛋白质序列并非全长ADI序列。在那些情况下，公开可用的序列在需要时基于已知的ADI序列延伸以制备全长ADI。在某些情况下，在别处对ADI蛋白进行修饰(例如，C251S替换)。这些合成的ADI序列以SEQ ID NO：26-32提供并对应于精氨酸支原体(C251S)、关节炎支原体(C251S)、海豹脑支原体、猫支原体、海豹支原体、奥氏嗜热盐丝菌和牛分支杆菌的延伸和/或修饰的ADI序列。

对来源于各种生物体的大量ADI酶进行表征以确定哪个酶期望被去除并维持精氨酸在患者血液中的低浓度，甚至在抗-ADI-PEG 20抗体存在下。表2(如下)列出了所研究的来自表1的ADI酶的选定的子集。具体如下，这些研究数据表明，来自基于序列同一性与人型支原体密切相关的多种物种的ADI具有足够好的酶催化性质并具有减弱的与抗-ADI-PEG20抗体的交叉反应性。

ADI的制备。对重组ADI酶进行克隆、表达和纯化以根据如下所述的标准方案进行试验，例如，Gallego等，PLOS One，7(10)：e47886，2012；Monstadt和Holldorf，Biochem.J.273：739-745，1990；Joo Noh等，Molecules and Cells.13：137-143，2002；以及Sugimura等，Infectiion and Immunity.58：2510-2515，1990。

人抗-ADI-PEG 20抗体的纯化。抗-ADI-PEG 20抗体是由在临床研究期间接受过ADI-PEG20的患者的血浆样品纯化得到的。将来自8个不同患者的总共60ml的血浆汇集在一起，这些患者已经达到了通过ELISA测定确定的对ADI-PEG 20的高滴度(滴度＞/＝4)。使用两步纯化，先进行蛋白“A”色谱(GE Healthcare)，然后进行ADI亲和色谱。得到～20mg纯化抗体并以多份储存在-80℃下，直至需要。

ADI酶测定。精氨酸脱亚胺酶(ADI)催化L-精氨酸向L-瓜氨酸和氨的转化。L-瓜氨酸的量可通过比色终点测定(参见，例如，Knipp和Vasak，Analytical Biochem，286：257-264，2000)检测并与已知量的L-瓜氨酸的标准曲线对比以计算出ADI的比活性，以IU/mg蛋白质表示。1IU酶活性被定义为在所测试的pH和温度下，每分钟产生1μmol瓜氨酸的酶量。标准测定条件在37℃下于HEPES生理缓冲液(PHB)50mM HEPES、160mM NaCl pH7.4(Lang和Zander，Clin Chem Lab Med.37：563-571，1999)加上0.1％BSA中进行。所有样品和标准在条件允许的情况下一式两份或一式三份进行。

通过采用上述活性测定的变型确定Km和Kcat值。对于活性测定，所有反应均在37℃下于PHB加上0.1％BSA中进行。对ADI或ADIr结构体中每一个进行酶浓度、反应时间、以及底物浓度范围的调整以导致它们活性差异。一般来讲，2nM酶、5分钟反应时间以及0-160μM精氨酸被用作初始条件。条件优化时，需特别注意消耗的底物量占加入反应的全部底物的百分比。瓜氨酸的检测下限为1μM，且定量下限为2μM。对每块板进行瓜氨酸标准曲线并用于量化通过酶反应产生的瓜氨酸。

活性测定也用于评价在抗-ADI-PEG2存在下的酶活性(抗体中和情况)。这些测定如上所述并在800nM、400nM、200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM和0nM抗-ADI-PEG20抗体存在下进行。

计算。利用瓜氨酸标准曲线计算并平均化每个反应孔中产生的瓜氨酸浓度(μM)。然后，以μM/min/50nM ADI计算每个反应的速率。通过将该值乘以“IU”因子(IU因子是通过ADI的分子量和反应体积计算得到的)计算比活性(IU/mg或μmol产物/min/mg ADI)。所得结果总结于下表2中。

这些数据表明与人型支原体ADI高度同源的(约50-100％同一性)ADI酶保持了非常好的催化活性。它们也显示出，通过在抗-ADI-PEG 20抗体存在下的酶活性测定的对患者抗-ADI-PEG 20抗体的亲和力例如相对于人型支原体有所减弱。因此，这些ADI酶可具有用于治疗癌症的疗法的治疗效用，单独使用或在ADI-PEG 20治疗后使用，以延长和/或增强精氨酸消耗疗法的效果。

可组合上述的各种实施方案以提供进一步的实施方案。在本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布案、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公布案的全文以引用的方式并入本文中。可对实施方案的多个方面进行修改，必要时可使用多个专利、申请和公开案的概念，以提供更进一步的实施方案。

可根据以上详述的具体方式对实施方案进行这些及其它改变。一般来讲，在以上权利要求中，所用术语并不视为将权利要求限制于说明书和权利要求中所公开的具体实施方案，但应解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求受权的等效项的全部范围。因此，权利要求不受限于公开内容。

Claims (45)

1.一种治疗组合物，其包含具有ADI活性的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，和药学上可接受的载体，其中所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶具有减弱的与患者抗-ADI-PEG 20抗体的交叉反应性，其中所述精氨酸脱亚胺酶通过接头连接于至少一个PEG分子，且其中该聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶包含如SEQ ID NO:8、2、6或14中任一个所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶具有相当于或优于ADI-PEG 20的一种或多种性质。

3.如权利要求2所述的治疗组合物，其中所述一种或多种性质为Kcat、Km、最适pH、稳定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子、或其任何组合。

4.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶已经被修饰以去除至少一个聚乙二醇化位点。

5.如权利要求1所述的治疗组合物，其中至少1个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

6.如权利要求5所述的治疗组合物，其中至少5个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

7.如权利要求5所述的治疗组合物，其中至少10个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

8.如权利要求5所述的治疗组合物，其中至少15个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

9.如权利要求5所述的治疗组合物，其中至少20个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

10.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于一个以上的PEG分子。

11.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于平均1个至10个PEG分子。

12.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于平均2个至8个PEG分子。

13.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述PEG分子为直链或支链PEG分子。

14.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述PEG具有1,000至40,000的总重均分子量。

15.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述PEG具有10,000至30,000的总重均分子量。

16.如权利要求1所述的治疗组合物，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团，亚甲基、或其任何组合。

17.如权利要求16所述的治疗组合物，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。

18.一种具有ADI活性的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶与患者的抗-ADI-PEG 20抗体具有减弱的交叉反应性，其中所述精氨酸脱亚胺酶通过接头连接于至少一个PEG分子，且其中该聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶包含如SEQ ID NO:8、2、6或14中任一个所示的氨基酸序列。

19.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶具有相当于或优于ADI-PEG 20的一种或多种性质。

20.如权利要求19所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述一种或多种性质为Kcat、Km、最适pH、稳定性、体内蛋白质水解稳定性、或不需要已经不存在于血液中的离子或辅因子、或其任何组合。

21.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶已经被修饰以去除至少一个聚乙二醇化位点。

22.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中至少1个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

23.如权利要求22所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中至少5个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

24.如权利要求22所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中至少10个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

25.如权利要求22所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中至少15个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

26.如权利要求22所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中至少20个赖氨酸残基已经被氨基酸替换所修饰。

27.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于一个以上的PEG分子。

28.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于平均1个至10个PEG分子。

29.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述精氨酸脱亚胺酶共价结合于平均2个至8个PEG分子。

30.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG分子为直链或支链PEG分子。

31.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG具有1,000至40,000的总重均分子量。

32.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述PEG具有10,000至30,000的总重均分子量。

33.如权利要求18所述的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述接头为琥珀酰基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团、亚甲基、或其任何组合。

34.如权利要求33所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶，其中所述琥珀酰基的来源为琥珀酸琥珀酰亚胺酯。

35.如权利要求1所述的治疗组合物，其还包含化疗剂。

36.如权利要求35所述的治疗组合物，其中所述化疗剂选自多西他赛、卡铂、环磷酰胺、吉西他滨、顺铂、索拉菲尼、舒尼替尼和依维莫司。

37.如权利要求1-17或35-36中任一项所述的治疗组合物在制备用于在有此需要的患者中治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的药物中的用途。

38.如权利要求37所述的用途，其中所述有此需要的患者已被确定具有抗-ADI-PEG 20抗体。

39.如权利要求37所述的用途，其中所述癌症选自肝细胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、***癌、小细胞肺癌、间皮瘤、淋巴瘤、肉瘤、白血病、乳腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、神经胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、非小细胞性肺癌(NSCLC)、肾癌、膀胱癌、子宫癌、食管癌、脑癌、头颈癌、子***、睾丸癌和胃癌。

40.如权利要求1-17或35-36中任一项所述的治疗组合物在制备用于在有此需要的患者中治疗癌症，缓解其症状，或抑制其进展的药物中的用途，其中所述患者之前被施用过治疗有效量的包含ADI-PEG20的组合物。

41.如权利要求40所述的用途，其中所述患者被检测为具有预定水平的抗-ADI-PEG 20抗体。

42.如权利要求40所述的用途，其中所述患者被检测为具有预定或降低水平的ADI活性。

43.权利要求39所述的用途，其中所述黑色素瘤是转移性黑色素瘤。

44.权利要求39所述的用途，其中所述白血病是淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、或急性髓细胞样白血病。

45.权利要求44所述的用途，其中所述急性髓细胞样白血病是复发性急性髓细胞样白血病。